Caractérisation de l`interface hôte-pathogène

Année 2016-2017 - Demande d’allocation doctorale
ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549
1. Informations administratives :
Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Caroline Denesvre
Unité : UMR ISP 1282
Equipe (si unité multi-équipes): Biologie des Virus Aviaires (BioVA)
Email de l’encadrant : [email protected]
Co-encadrant éventuel : David Pasdeloup
2. Titre de la thèse :
Caractérisation de l’interface hôte-pathogène responsable de l’excrétion d’un
herpèsvirus aviaire
3. Résumé :
Contexte Scientifique. La maladie de Marek est une maladie hautement contagieuse de la
poule due à un alphaherpesvirus, du genre mardivirus, le virus de la maladie de Marek (MDV)
à l'origine d'une immunosuppression transitoire et de lymphomes T mortels. Les vaccins
actuels contrôlent bien la formation des lymphomes mais pas l'infection et l'excrétion virale à
partir de l’épithélium des follicules plumeux (EFP). Or depuis 40 ans que la vaccination est
pratiquée en élevage, on voit apparaître des souches de plus en plus virulentes. La circulation
silencieuse de virus pathogènes est considérée comme un facteur essentiel à l'accroissement
de virulence.
Objectifs. Ce projet vise à identifier et caractériser la spécificité cellulaire et moléculaire de
l’excrétion de particules virales infectieuses au niveau de l’EFP, site unique de l’excrétion
virale. A ce jour, il n’est pas possible d’obtenir de virus extracellulaire à partir de culture
cellulaire. Par conséquent, les vaccins actuellement disponibles sont des vaccins vivants
composés de cellules infectées. Ils sont coûteux à produire et difficiles à conserver. Une fois
que les facteurs cellulaires spécifiques de l’EFP permettant l’excrétion virale seront identifiés,
nous envisageons de développer une lignée cellulaire permettant la production de vaccins
constitués de particules virales infectieuses libres ou associées aux lysats cellulaires. Ces
vaccins alors lyophilisables seraient à la fois plus économiques à produire et auraient une
meilleure innocuité.
Méthodologie. La base moléculaire de la permissivité cellulaire à l’excrétion du MDV sous
forme extracellulaire est totalement inconnue. Nous posons l’hypothèse qu’elle repose sur
l’interaction de protéines virales importantes dans l’assemblage avec une ou plusieurs
protéines cellulaires spécifiquement présentes dans l’EFP.
Sur la base de données publiées pour le virus de la Varicelle et du Zona (VZV), un
herpèsvirus humain biologiquement proche de MDV également excrété au niveau de la peau,
nous avons choisi plusieurs protéines virales (pUL47, pUL48 et pUL51) pouvant être
impliquées dans le tropisme de MDV pour la peau et la transmission entre oiseaux. L’étude
du tropisme in vitro et in vivo de virus invalidés pour ces trois gènes est en cours au
laboratoire. Durant cette thèse, l’étudiant(e) devra valider et caractériser fonctionnellement
une ou plusieurs interactions entre les protéines pUL47, pUL48 ou pUL51 et leurs partenaires
cellulaires respectifs préalablement identifiés au laboratoire par crible double-hybride en
levures.
Partie 1 : Validation des interactions préalablement identifiées
> Test des interactions par co-immunoprécipitation en cellules de poule transfectées et/ou
infectées
> Identification des domaines d’interaction sur les deux partenaires (viral et cellulaire)
Partie 2 : Caractérisation fonctionnelle des interactions identifiées
> Invalidation des partenaires cellulaires identifiés (shRNA, CRISPR/Cas9) dans les types
cellulaires d’intérêt (cellules primaires de peau de poulet, kératinocytes aviaires) et évaluation
de l’impact sur la multiplication virale.
> Surexpression des partenaires cellulaires identifiés (expression transitoire ou stable) et
mesure de l’impact sur la multiplication et l’excrétion virales
> Construction de virus mutants invalidés pour les interactions avec les partenaires cellulaires
identifiés et caractérisation de la croissance et du tropisme de ces virus en cellules relevantes
(voir ci-dessus).
Faisabilité : Le présent projet repose sur la possibilité d’obtenir des partenaires cellulaires
pertinents par la méthode de double-hybride en levures. Cette méthode est maintenant
maîtrisée au laboratoire. De plus, les banques d’expression des tissus d’intérêt sont prêtes et
les premiers cribles ont commencé. Un étudiant de M2 validera les interactions positives,
éliminera les faux-négatifs et entamera la validation en cellules le cas échéant.
La variété des banques d’expression (Thymus, Bourse de Fabricius, pulpe de plumes,
épithélium plumeux) conjuguée à la variété des cibles virales pouvant être testées (UL47,
UL48, UL51), rend improbable la possibilité de n’obtenir aucun partenaire cellulaire.
Toutefois, dans l'hypothèse où aucun partenaire cellulaire ne serait validé par double-hybride
d’ici à Octobre 2017, nous aurons recours à une méthode alternative : la co-purification de
partenaires cellulaires avec nos cibles virales in vitro (culture de cellules) ou in vivo (après
infection expérimentale) par une approche biochimique. Les virus recombinants codant pour
nos cibles virales avec une étiquette de purification (TAP) sont déjà disponibles au laboratoire
(UL47TAP, UL48TAP), ainsi que le virus-contrôle correspondant (TK_TAP). Pour
l’approche in vitro, les types cellulaires d’intérêt (kératinocytes différenciés disponibles au
laboratoire, cellules primaires de peau de poule, lymphocytes) seront infectés par ces virus
recombinants. L’étiquette TAP permettra leur purification à partir de lysats cellulaires, ainsi
que la co-purification des partenaires cellulaires associés qui seront identifiés par
spectrométrie de masse (plateforme PAIB2 sur le site INRA). Pour l’approche in vivo, nous
purifierons les complexes protéiques à partir de la pulpe de plumes de poulets infectés
expérimentalement.
4. Résumé en anglais : Characterization of the host-pathogen interactions involved in
the shedding of an avian herpesvirus
Marek's disease is a highly contagious disease of chickens caused by an alphaherpesvirus: Marek's disease virus (MDV). This disease is associated with lethal T-cell
lymphoma. The current live vaccines efficiently control lymphoma formation but not
infection nor shedding from the feather follicles. Despite forty years of vaccination, new
strains with increasing virulence have emerged. The silent circulation of pathogenic MDV
appears to be an essential factor of virulence. The objective of this thesis is to identify viral
and cellular determinants favoring or controlling the replication and shedding of MDV in the
skin. The results of this thesis should contribute to the development of new vaccines as well
as new strategies to block the excretion of pathogenic viruses into the environment.