B) Comment diagnostiquer une infection virale
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Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien Virologie : Généralités 1 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien Virologie : Généralités Plan I. Structure A) Matériel génétique B) Enveloppe C) Capside II. Cycle de multiplication dans une cellule A) Absorption B) Pénétration C) Décapsidation D) Réplication du génome E) Assemblage III. Comportement de l’infection virale A) Infections aigues isolées B) Infections aigues avec récurrence C) Infection chronique D) Infection lente E) Cinétique d’apparition des Ac IV. Diagnostic en virologie A) Pourquoi diagnostiquer une infection virale ? B) Comment diagnostiquer une infection virale ? C) Le prélèvement D) Les techniques en particulier Remarque : je suis désolé pour le plan, mais word n’a pas voulu recommencer la numérotation des grands paragraphes, comme vous allez vous en rendre compte… 2 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien V. Structure Un virus a une structure assez simple, mais les formes sont d’une grande variété comme nous allons le voir. Un virus, c’est également très petit, on ne peut le voir qu’au microscope électronique. Ainsi, un virus c’est de l’extérieur vers l’intérieur : une enveloppe (si elle est présente), une capside et du matériel génétique. A) Matériel génétique Les virus sont répartis en deux grandes classes : les virus à ADN et les virus à ARN, selon que leur génome est composé de l’une ou de l’autre de ces molécules. Pour ceux que ça intéresse (c'est-à-dire ni moi ni le prof), il existe une exception, le virus de l’hépatite B qui contient les deux types. Parmi ces deux grandes classes, on peut faire des sub-divisions (ouah trop cool j’ai réussi à placer ce mot !!) : Virus à ADN : - monocaténaire - bi caténaire Exemples de virus à ADN 3 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien Virus à ARN : - bi caténaire - monocaténaire positif (sens) négatif (anti-sens) ambi sens (contient un morceau positif et un morceau négatif, les deux n’étant pas complémentaires…) Exemples de virus à ARN Remarque de vos ronéistes attentionnés : Il faut aussi garder en tête qu’un virus ne possède aucun matériel moléculaire pour transcrire et traduire en protéines toutes les informations contenues par son génome. C’est pour cela qu’un virus est un parasite cellulaire obligatoire, sans cellule hôte il ne peut rien faire. (Cela va sans dire, mais ça va mieux en le disant…) B) Enveloppe Celle-ci peut ne pas être présente chez un virus, c’est pour cela qu’elle permet également de scinder les virus en deux grandes classes : - Les virus enveloppés : ils possèdent une enveloppe !! et contrairement à ce que l’on peut penser dans un premier temps, ils sont plus fragiles que leurs collègues non enveloppés, car l’enveloppe va contenir des motifs de reconnaissance qui vont permettre la reconnaissance par le système immunitaire. Petite remarque : les virus de la famille du virus de la variole sont enveloppés mais très résistants, ils constituent donc l’exception à cette règle (ne pas retenir…) - Les virus nus : ils sont tous très résistants. Remarque : la fragilité d’un virus correspond à la perte de son pouvoir infectieux quand il se retrouve dans le milieu extérieur. 4 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien C) Capside La capside entoure le matériel génétique, cela de façon plus ou moins étroite selon sa forme, qui est très variée, et on peut en retenir deux : - Forme d’icosaèdre : forme très géométrique (exemple : adenoviridae, retroviridae, à voir sur les images de la page précédente)) - Forme hélicoïdale : suit la forme de la molécule du génome, ces virus sont toujours enveloppés. (exemple : paramyxoviridae) VI. Cycle de multiplication dans une cellule On peut retenir un cycle type pour tous les virus, même si selon le genre, ce schéma peut varier. Schéma générale d’un cycle de multiplication d’un virus A) Adsorption (ou attachement en anglais) Les éléments protéiques de la surface du virus vont interagir avec des récepteurs cellulaires, ce qui explique la spécificité des virus, par exemple, le virus de l’hépatite ne peut interagir qu’avec les hépatocytes. B) Pénétration C’est en virologie, l’entrée du virus par divers mécanismes comme l’endocytose par exemple. Cette étape peut aussi ne pas avoir lieu. C) Décapsidation C’est la libération du matériel génétique. Cette étape peut avoir lieu à différents moments et endroits. 5 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 - - GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien Certains virus vont libérer leur génome après la phase d’adsorption, dans ce cas ils vont simplement se « coller » à la cellule hôte, et libérer depuis l’extérieur le génome. D’autres virus, en particulier les virus enveloppés, peuvent perdre leur enveloppe dans le cytoplasme, puis la capside va se diriger au contact d’un pore nucléaire, où elle va libérer le matériel génétique directement dans le noyau de la cellule. Dans ce cas, on n’a pas d’acide nucléique viral dans le cytoplasme. C’est par exemple le cas du VIH. Ou bien comme sur le schéma d’exemple, la décapsidation a lieu dans le cytoplasme. D) Réplication du génome Ce terme est exclusivement employé pour les virus !! C’est le recopiage du matériel génétique, de façon assez importante (plusieurs centaines ou milliers de fois). Remarque de vos ronéistes : Divers mécanismes existent, comme on peut s’y attendre selon le type de virus. Le prof ne s’est pas étendu dessus. Cette phase comprend également la synthèse des protéines virales, donc l’utilisation de ce matériel génétique. E) Assemblage A ce stade, on a tous les ingrédients nécessaires pour faire plein de nouveaux virus, mais les morceaux sont dispersés… Cette étape comprend également la phase de sortie du virus, qui reste en fait la plus intéressante partie de cette dernière étape. On a deux mécanismes différents, très importants à bien connaître et à savoir différencier dans sa petite tête de carabin. - Par bourgeonnement : Les virus s’assemblent au fur et à mesure de la production de matériel génétique et de protéines virales, puis sortent de la cellule hôte par exocytose. La production de virus est donc continue, et la sortie des virus ne détruit pas la cellule hôte. (C’est, pour les plus observateurs d’entre nous, le mode d’assemblage que l’on voit sur le schéma de ce paragraphe.) - Par éclatement : ici on a un stockage important de virus, qui stationnent dans le cytoplasme de la cellule. Une fois qu’ils occupent un volume trop important, la cellule hôte explose, et on a une libération très importante de virus dans le milieu extracellulaire. Exemple de cycle : Les entérovirus Ils appartiennent à la famille des picornaviridae (qui signifie petit virus à ARN). Tous les virus de cette famille possèdent des génomes très différents mais cependant organisés de la même façon, avec notamment un seul cadre de lecture, ce qui rend leur analyse plus simple. - En amont du cadre de lecture (en 5’), on remarque plusieurs motifs importants : Une « feuille de trèfle » : va permettre la réplication du génome 5 motifs de type « tige boucle » : c’est le motif IRES ce qui donne en français le site interne d’entrée des ribosomes. En effet, ces motifs permettent l’appariement du ribosome. - En aval (en 3’), on retrouve un motif « tige boucle » qui contrôle la réplication. 6 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien On remarque donc qu’une fois l’ARN traduit, on va obtenir une seule protéine pour tout le virus, appelée poly protéine. Toutes les protéines virales vont se détacher les unes après les autres de ce bloc initial par un processus autonome. Cela est possible grâce à une catalase autoprotolytique contenue dans la poly protéine de départ. A terme on aboutit à des protéines virales fonctionnelles que l’on peut répartir en deux catégories : - Protéines structurales : elles vont constituer la capside. Dans notre exemple, ces protéines vont s’assembler de façon autonome pour former des capsomères, brique fondamentale de la capside. - Protéines non structurales : comprend des hélicases, des catalases… Elles vont permettre l’interaction avec les éléments de la cellule hôte. Dernière remarque, les entérovirus sont un exemple de virus qui ne pénètrent pas dans leur cellule hôte, la décapsidation se produit au contact de la membrane cellulaire. VII. Comportement de l’infection virale A) Infections aigues isolées On voit ce type d’infection lorsque le système immunitaire est efficace et parvient à éradiquer le virus. Il y a établissement d’une mémoire immunitaire, et lors de la prochaine infection au même virus, la réponse sera encore plus efficace. Exemple type : la grippe. B) Infections aigues avec récurrence Ici, on retrouve également une guérison de la primo infection, mais le système immunitaire est incapable d’éradiquer totalement le virus. Le virus se « stocke » et reste latent. Il peut donc se produire de nouvelles poussées avec signes cliniques associés. Ces récurrences sont des manifestations de la même maladie, mais avec des signes cliniques différents. Exemple type : tous les virus du groupe herpès, tel celui donnant la varicelle comme primo infection, et qui, en forme de récurrence, va donner le zona. C) Infection chronique Dans ce cas, le système immunitaire est incapable de se débarrasser du virus. On retrouve plusieurs phases. La primo infection reste contrôlée, on voit une diminution du virus, mais celui-ci n’est jamais éradiqué. Une fois la primo infection dépassée, le processus est inéluctable, le système immunitaire ne peut plus contrôler la suite de l’infection. Exemple type : le VIH D) Infection lente Chez l’homme, aucun virus ne se comporte de la sorte, on le retrouve chez l’animal. On a une absence totale de réaction du système immunitaire au début, l’installation est progressive. Exemple : infection au prion, même si ce n’est pas une infection virale (ne me demandez pas pourquoi le prof a détaillé ce schéma…) 7 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien E) Cinétique d’apparition des Ac Il faut tout d’abord souligner le fait qu’en virologie la réponse immunitaire humorale est très importante. On a deux types de réponse : Réponse primaire : correspond à une primo infection à un virus. On a d’abord la production d’IgM puis de IgG, avant que les IgM diminuent. Réponse secondaire : se voit lors de réinfection. La production d’Ac est plus rapide et plus importante, et directement on produit des IgG (ainsi que des IgM d’ailleurs). Applications : (pour voir un diagramme, se rapporter aux cours d’immuno ou de bactério où on déjà vu tout ça, même si il y a quelques notions en plus pour une infection virale) - Si les résultats d’une sérologie ne renvoient que la présence d’IgG, on se trouve dans une réinfection. C’est important à savoir dans le cas par exemple de la rubéole lors de la grossesse, ou bien pour les infections lentes, et dans ce cas la présence d’Ac signe l’infection au virus (d’où la notion de séropositif pour le VIH par exemple). - Dans une situation d’infection aigue rapide, la sérologie est inutile, on va tomber avant la production d’Ac. Il faudrait faire une deuxième sérologie, une dizaine de jours après, et là on va trouver des Ac (mais c’est totalement inutile en pratique). C’est ce que l’on appelle la séroconversion. (à ne pas confondre avec une première sérologie où l’on trouve des IgM, et une deuxième où l’on trouve IgM et IgG) - Si la sérologie renvoie seulement des IgM, on se trouve au début d’une primo infection. - Si la sérologie renvoie des IgM et IgG, on ne peut pas dire si on se trouve dans une réponse primaire ou secondaire. VIII. Diagnostic en virologie A) Pourquoi diagnostiquer une infection virale ? Car diagnostiquer une infection c’est bien, mais savoir pourquoi, c’est mieux ! On va ainsi retrouver globalement trois situations pour lesquelles le diagnostic est intéressent : - Dans le cas de dons (de sang par exemple), où il serait dommage de refiler un virus au patient qui va se faire transfuser (déjà qu’il est pas en forme…). Pour le diagnostiquer, on va faire une sérologie. - Dans le cas d’infections virales chroniques, où l’on va mesurer la charge virale, et non faire une sérologie. En effet, il s’agit ici de voir si l’infection est contenue, et la production d’Ac n’est pas proportionnelle au taux de virus dans l’organisme. Il s’agit ici de voir si le traitement est efficace, auquel cas on doit avoir une charge virale indétectable. - Dans le cadre d’une prophylaxie. L’exemple typique est la séparation dans les services de pédiatrie des enfants infectés par le VRS (donne la bronchiolite) des 8 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien enfants infectés par un rotavirus (diarrhées à rotavirus). On va dans ce cas limiter la contagion en séparant ces deux populations. B) Comment diagnostiquer une infection virale ? Maintenant que l’on est convaincu du bien-fondé de notre cause, encore faut-il savoir comment diagnostiquer une infection virale… On a deux types d’approche : - Le diagnostic indirect, c’est la sérologie, car l’on ne détecte pas la présence de virus mais celle des stigmates qu’il laisse dans l’organisme, sous la forme des Ac produits par le système immunitaire. Voir le paragraphe précédent. - Le diagnostic direct : ici on va chercher directement la présence du virus. On a deux choix : détecter tout le virus ou seulement un de ses composants. Si l’on veut trouver un élément protéique, on fait une immunofluorescence, si on veut trouver son génome, on fait une PCR. Ces deux approches sont complémentaires selon le virus et la clinique. C) Le prélèvement 1. Choix des prélèvements à effectuer Selon la clinique (toute lésion accessible doit être prélevée) Porte d’entrée, sites de multiplication et/ou d’excrétion des virus recherchés Pour faire un bon prélèvement, on doit connaître la porte d’entrée du virus concerné. En effet, cette méconnaissance peut conduire à quelques problèmes, l’exemple typique étant le prélèvement par LBA d’un enfant en phase terminale de bronchiolite, où l’enfant est en insuffisance respiratoire (et dans ce cas on risque fortement de le noyer). Si on avait bien appris sa virologie, on aurait tout de suite su qu’il fallait prélever le nez par écouvillonnage, car ce virus se situe dans les voies respiratoires hautes. Petit conseil de vos ronéistes : retenez cet exemple. 2. Réalisation des prélèvements Importance +++ de la qualité du prélèvement Doit être réalisé le plus tôt possible du début des signes cliniques (multiplication +++ pendant phase d’incubation) 3. Acheminement des prélèvements au laboratoire Milieux de transport pour virologie (+++ pour conserver l’infectiologie du virus) Transport rapide ou Conservation (congélation) selon techniques envisagées Importance des renseignements cliniques transmis au virologue avec le prélèvement. 9 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien L’interprétation du résultat ne va pas être difficile, car contrairement à la bactério, on n’a pas de notion de virus contaminants, car on ne possède pas de flore virale, il n’existe pas de notion de porteur sain en virologie…. Et de même, la relation cause à effet n’est pas difficile à établir, si on a les signes cliniques et que le virus est découvert sur le prélèvement, c’est ce virus qui est responsable de la maladie. Attention, il faut tout de même que la biologie et la clinique correspondent, donc il faut quand même apprendre ses cours de viro ! D) Les techniques plus particulièrement 1- Le diagnostic direct - Pour détecter les protéines virales : Techniques simples et rapides à mettre en oeuvre mais manque de sensibilité Mise au point des anticorps monoclonaux en 1975-1980. Immunofluorescence : elle peut être direct ou indirect. L’indirect est plus spécifique. Il faut environ 2h pour avoir un résultat. On va ici repérer les Ag dans les cellules. IF direct IF indirect ELISA : il s’agit ici d’une prise en sandwich. Il faut 25 minutes pour avoir un résultat. On va ici repérer les Ag libres. 10 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien Test ELISA Pour détecter le virus entier, on effectue des cultures. C’est l’isolement et l’identification des virus sur cultures de cellules C’est la technique de référence car les virus sont des parasites intracellulaires obligatoires. Ils ne peuvent se multiplier que dans des cellules vivantes - animal (Coxsackievirus A types1 à 6) - oeuf de poule embryonné (virus de la grippe, poxvirus) - cellules en culture in vitro Importance d’un transport rapide jusqu’au laboratoire pour conserver la viabilité des virus Dans milieu de transport = MEM + protéines (SVF) + tampon + ATB (ne pas se tracasser pour retenir cette ligne, le prof ne l’a pas détaillé en cours) On utilise un matériel spécifique, car la manipulation doit être faite en milieu stérile. - Choix des lignées cellulaires : Origine : humaine ou animale (singe, chien…) Nature : Lignées diploïdes (durée de vie limitée) Lignées continues hétéroploïdes On va prendre des cellules épithéliales ou fibroblastiques. Choix des cellules à inoculer Un virus ne va pas pouvoir pénétrer dans toutes les cellules. Une lignée cellulaire ne va pas pouvoir recevoir tous les virus. C’est pour cela qu’il faut au moins 2 ou 3 types de cellules différentes. Dépends du type de prélèvement (respiratoire, selles, sang, etc.) respiratoire : grippe, VRS, parainfluenza selles : rotavirus, adénovirus, entérovirus (polio) sang : cytomégalovirus On va traiter les prélèvements avec des antibiotiques avant inoculation sur cellules. Détection Examen des cellules au microscope pour détection cytopathique (ECP), qui est caractéristique d’un virus et d’une lignée cellulaire Identification par les anticorps monoclonaux : IF, ELISA Caractérisation du virus : différenciation des souches vaccinales et sauvages (polio / rougeole). Car on peut très bien avoir la présence d’un virus, alors qu’il s’agit en fait des traces d’une vaccination récente (en cas de vaccin vivant). 11 Virologie Dr Bruno Lina 30 novembre 2007 GB- DCEM1 EOM Bauvent Yann et Cungi Pierre-Julien On va étudier la sensibilité aux antiviraux. A l’heure actuelle, la culture est moins utilisée car c’est un processus fastidieux et moins spécifique que la PCR. - Pour détecter le génome, on utilise la PCR, qui permet d’obtenir de très nombreuses copies du génome, que l’on va révéler par électrophorèse. 2- Le diagnostic indirect Concernant le diagnostic indirect, constitué de la sérologie, on va ici aussi utiliser la technique ELISA : Comme nous l’avons déjà souligné, la sérologie est particulièrement intéressante pour : - le diagnostic des primo-infections = apparition des Ac entre deux sérums d’un patient (ou séroconversion) - définir le statut immunitaire vis-à-vis d’un virus = savoir si un patient a déjà rencontré un virus précis (Ac pos) ou non (Ac neg) (dans le cas d’infections chroniques). 12
