ETUDE DE L`INTERACTION ENTRE UNE PROTEINE DU

ZAMORANO Natalia
Université Joseph Fourier – L1
Rapport sur le stage effectué du 21 Mai 2012 au 20 Juin 2012
A l’Institut de Biologie Structurale (IBS)
Au sein du groupe Réponse Immunitaire aux Pathogènes et au Soi Altéré (IRPAS)
A Grenoble
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CH HO OL LI IN NE E B BI IN ND DI IN NG G P PR RO OT TE EI IN N E E
Discipline : Biologie Structurale
Maître de stage : Émilie STERMANN

REMERCIEMENTS
Je tiens à remercier Nicole Thielens de m’avoir accueillie dans son laboratoire au cours de ce stage
et Philippe Frachet, sans qui je n’aurais pas eu l’opportunité d’être ici.
Je remercie Emilie Stermann, mon maître de stage, pour avoir bien voulu m’encadrer, pour son
expertise et pour tous les enseignements qu’elle m’a transmis au cours de ce stage. Je lui suis
extrêmement reconnaissante pour la confiance qu’elle m’a accordée, pour tous ses conseils, ses
explications et ses remarques. Grâce à elle, cette expérience a été plus qu’enrichissante.
Je remercie chaudement Monique Lacroix, Evelyne Gout, Mickaël Jacquet, Mélanie Verneret, Sarah
Ancelet, Jean-Pierre Andrieu et Anne-Marie Di Guilmi pour m’avoir permis de m’investir dans
différentes expériences.
Je tiens également à remercier toutes les personnes qui font partie du laboratoire et de l’institut et
qui, d’une façon ou d’une autre, ont fait de ce stage une expérience inoubliable.

SOMMAIRE
ABREVIATIONS
I INTRODUCTION
1. L’IBS et l’IRPAS
2. Généralités sur l’immunité
2.1 L’immunité innée
2.2 La ficoline L
2.3 La Choline Binding Protein E
3. Le projet de stage
II PRODUCTION ET PURIFICATION DES CBPS RECOMBINANTES ET INTERACTION AVEC LA
FICOLINE L
1. Principe des techniques utilisées
1.1 La chromatographie d’affinité
1.2 L’électrophorèse SDS-PAGE
1.3 La dialyse
1.4 Le test ELISA
2. Matériel et méthodes
2.1 Production de la ficoline L
2.2 Cultures bactériennes et production des protéines
2.3 Purification des protéines par chromatographie d’affinité
2.4 Dialyse
2.5 Le test ELISA
3. Résultats et discussion
3.1 Production et purification du domaine de liaison à la choline Cbd et du domaine
catalytique Pce de CbpE
3.1.1 Chromatographie d’affinité du domaine Cbd
3.1.2 Analyse électrophorétique de la purification du domaine Cbd
3.1.3 Chromatographie d’affinité du domaine catalytique Pce
3.1.4 Analyse électrophorétique de la purification du domaine catalytique Pce
3.2 Élimination de l’Imidazole par dialyse
3.3 Analyse des interactions entre la ficoline L et le domaine catalytique Pce par ELISA
III CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
APPRECIATIONS PERSONNELLES
BIBLIOGRAPHIE

ABREVIATIONS
AA Acides Aminés
Cbps Choline-binding Proteins
CbpE Choline-binding Protein E
Cbd Choline binding domain
CEA Commissariat à l'énergie atomique et aux énergies alternatives
CNRS Centre national de la recherche scientifique
Da Dalton
DO Densité optique
DTT Dithiothreitol
IBS Institut de Biologie Structurale
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyrannoside
IRPAS groupe Réponse Immunitaire aux Pathogènes et au Soi Altéré
LB Luria-Bertani (LB) (Milieu de culture)
LTA Acide lipotéichoïque
MASP MBL associated serine protease
MBL Mannan Binding Lectin
Pce Phosphorylcholine Esterase
PCho Phosphocholine
PM Poids Moléculaire
Rpm Rotations par minute
SDS Dodécylsulfate de sodium
SDS-page Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS
TA Acide téichoïque
TEMED N,N,N,N’-tétraméthyléthylènediamine
Tris Tris-hydroxyméthyl-aminométhane
UJF Université Joseph Fourier
WT Wild Type/souche sauvage

I INTRODUCTION
1. L’IBS et l’IRPAS
L’institut de Biologie Structurale (IBS) est un centre de recherche dont l’objectif principal est la
compréhension des mécanismes biologiques fondamentaux. A partir de 1999, il est considéré
comme une unité mixte de recherche CEA-CNRS-UJF.
Le groupe Réponse Immunitaire aux Pathogènes et au Soi Altéré (IRPAS) fait partie des quinze
groupes de recherche à l’IBS. C’est au sein de ce laboratoire que j’ai réalisé mon stage, plus
précisément, dans l’équipe Protéines de l’immunité innée à l’interface hôte-pathogène.
L’objectif principal de l’équipe est d’approfondir les connaissances et la compréhension des
interactions moléculaires de C1q, de la MBL et des ficolines à l’interface hôte-pathogène.
2. Généralités sur l’immunité
L’immunité est l’ensemble de moyens de protection d’un organisme multicellulaire contre les
agressions externes (agents pathogènes) et internes (cancers, par exemple) ; l’ensemble de
cellules, tissus et molécules impliqués dans ces mécanismes de défense est appelé système
immunitaire.
Les mécanismes de défense se composent de l’immunité naturelle ou innée, retrouvée dans tous
les organismes multicellulaires et de l’immunité adaptative, apparue beaucoup plus récemment et
présente uniquement chez les mammifères, oiseaux, poissons, batraciens et reptiles (Thèse de
doctorat de Florence Teillet, UJF, 2006).
2.1 L’immunité innée
L’immunité innée est constituée de barrières naturelles de l’organisme, de protéines sériques et
d’un ensemble de cellules résidant dans les tissus ou dans le sang. Ces acteurs interviennent dans
les premières heures de l’infection. La reconnaissance des cibles par les acteurs de l’immunité
innée permet la mise en place de deux systèmes effecteurs : le système du complément et la
phagocytose. Par la suite, on se focalisera sur le système sérique du complément.
Le système du complément est considéré comme un système sophistiqué de destruction des
microorganismes à l’interface entre immunité innée et adaptative (Thèse de doctorat de Virginie
Garlatti, UJF, 2008). Trois voies différentes mènent à l’activation du complément : la voie classique,
la voie alterne et la voie lectine. Cette dernière est très similaire à la voie classique et son complexe
d’activation est composé de protéines multimérique de reconnaissance (MBL ou ficoline) associée
à une protéase à sérine appelée MASP.
Les ficolines sont des protéines de défense. Elles possèdent un domaine de reconnaissance de type
fibrinogène et sont capables de discerner des signaux de danger, tels que des molécules exprimées
à la surface de certains pathogènes. Il existe trois ficolines humaines : L, H et M. Notre intérêt se
portera sur la ficoline L.