version imprimable pdf
publicité
Controle de l'activite cellulaire - principes generaux BC4223 Mécanismes moléculaires Mise à jour: CONTROLE DE L'ACTIVITE CELLULAIRE 4.1 PRINCIPES GÉNÉRAUX 15 03 07 Pour aller directement à la page: Controle activite cell OK . SIGNAUX ET REPONSES . Types de signaux . Modes de comunication intercellulaire . Types de réponses . - MESSAGERS CHIMIQUES . solubilité des messagers . Hormones . Médiateurs locaux . Autres signaux externes Siganux internes -RECEPTEURS . Interaction hormone-récepteur . Affinité des agonistes et antagonistes . Mesure de l'affinité des récepteurs (KD) . file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (1 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux SIGNAUX ET REPONSES 4.1.1 = . Types de signaux . Les cellules doivent répondre à de nombreux signaux . ● - environnement ❍ lumière ❍ son . . ● . activités électriques d'autres cellules ❍ contraction musculaire ❍ transmission nerveuse . ● -. . . messagers chimiques ❍ induire une réponse de la cellule-cible ■ croissance ■ prolifération ■ différentiation ■ activité métabolique spécifique ■ activité spécialisée (contraction, sécrétion, fonctionnement d'un canal ionique etc) ❍ hormones ❍ médiateurs locaux . --. les principes de communication intercellulaires de ce chapitre concerne ce dernier point mais beaucoup de principes s'appliquent aux autres . . . ---. > file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (2 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux Modes de comunication intercellulaire < . . Autocrine et paracrine: ● ● . ● - Endocrine . ● ● . . . -- relargage du signal chimique dans le milieu extracelllulaire cible: cellule qui a sécrété le messager (autocrine) ou cellule voisine (la plupart du temps du même type) (paracrine) médiateur local ● relargage du signal chimique dans le sang cibles: cellules éloignées de type différents hormone Neurotransmission ● ● ● relargage du signal chimique par une neurone présynaptique dans l'espace synaptique cibles: neurone post-synaptique neurotransmetteur . . Neuroendocrine . ● . ● ● relargage du signal chimique par une neurone dans la circulation sanguine cibles: cellules éloignées neurohormone --. . . . contact-dépendante: ● contact avec un autre cellule Phéromones ● autre animal de la même espèce ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (3 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux Types de réponses < . . Croissance cellulaire ● ● prolifération différentiation . Activité cellulaire spécialisée . ● . ● ● contraction musculaire impulsion électrique sécrétion . . -. Stimulus interne . ● ● . ● ouverture d'un canal ionique activation/inactivation d'enzymes phosphorylation (activation/inactivation) de protéines . --. Activité métabolique . . . Activation génique ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (4 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux Temps d'action < . Médiateurs locaux . très court (quelques secondes): NO, . court (quelques minutes): prostaglandines . Hormones . long (jours) estrogènes, thyroxine . . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (5 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux 4.1.2 . MESSAGERS CHIMIQUES Ces mécanismes exigent que le messager chimique interagisse avec un récepteur . . - agoniste: messager original ou autre molécule ayant une conformation similaire qui peut se lier et activer le récepteur . . antagoniste: molécule ayant une conformation similaire au messager et se lier au récepteur sans l'activer . => blocage de l'action du récepteur et compétition pour le site du récepteur . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (6 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux solubilité des messagers < . hydrophile: . solubles dans la circulation et le milieu extracellulaire . diffusent librement - ne peuvent pas traverser la membrane plasmique . ont besoin d'un recepteur membranaire => second messager et/ou cascade de réactions . souvent activation enzymatique (transduction) . ex. messagers locaux, hormones polypeptidiques . -hydrophobe . peu/pas solubles dans la circulation et le milieu extracellulaire . . doivent s'associer à des protéines de la circulation (non spécifiques: albumine, certaines globulines) . peuvent traverser la membrane plasmique --- ont besoin d'un recepteur cytoplasmique . souvent activation génique . ex. hormones stéroïdiennes . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (7 of 24)19 03 2007 11h30h10 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < Hormones . . demi-vie longue (heures) . action à distance . . se déplace via la circulation sanguine Nom nature chimique origine Action Adrénaline dérivé de tyr (ac. aminé) surrénale pression artérielle, rythme cardiaque, métabolisme de base -- Cortisol stéroide surrénale métabolisme . Estradiol stéroide ovaire caract. sexuelles femelles glucagon peptide pancréas endocrine (cell. α) métabolisme pour augmenter la glycémie insuline peptide pancréas endocrine (cell. β) métabolisme pour diminuer la glycémie testostérone stéroide testicule caract. sexuelles mâles thyroxine dérivé de tyr thydoide métabolisme . . . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (8 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < Médiateurs locaux . . demi-vie courte (secondes, quelques minutes) . relargage par exocytose (rapide sur une courte période de temps) - action à proximité . diffuse dans le milieu extracellulaire . Nom nature chimique origine action EGF protéine diverses cell. prolifération et croissance PDGF protéine plaquettes et autres cell. prolifération et croissance NGF protéine divers cell. innervées survie et croissnce de neurones histamine dérivé de his mastocytes dilatation vaisseaux sanguins, inflammation NO cell. nerveuses et endothéliales dilatation des cell. musculaires lisses . . -. . . . gaz soluble --. . EGF (epidermal growth factor): facteur de croissance épidermique . PDGF (platelet derived growth factor): facteur de croissance paquettaire . NGF (neuronal/nerve growth factor): facteur de croissance nerveux ---> Autres signaux externes Signaux internes file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (9 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux Production et relargage des messagers chimiques < . . Stimulus induisant la sécrétion: ● nerveux ❍ . ex. adrénaline sécérétée dans une situation de stress (fuite ou combat: "flight or fight") . ● . hormonal ❍ axes hormonaux: certaines hormones induisent la sécrétion d'autres hormones: cerveau -(neurotransmetteur)-> hypothalamus -(neurohormone)-> hypophyse (hormone)-> gonades -(hormone)-> c. cibles . . -. ● . chimique ❍ . ❍ concentration d'un produit chimique dans le sang ou dans la celllule Ca (calcitonine), glucose (insuline ou glucagon), . --- ● condition physiologique ❍ présence de nourriture dans l'intestin (cholécystokinine) . . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (10 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . . Relargage . exocytose: fusion de vésicule de stockage sur la membrane plasmique - implique souvent la présente de Ca intracellulaire . . signal -> augmentation de Ca -> sécrétion . permet de faire correspondre l'intensité du signal avec celui de la sécrétion . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (11 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux 4.1.3 . RECEPTEURS . Interaction hormone-récepteur . Interaction hormone-récepteur est très spécifique et l'hormone a une très grande spécificité pour son récepteur R+H . . . . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (12 of 24)19 03 2007 11h30h11 H•R Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . 50% de la réponse est obtenu quand 20% des récepteurs sont occupés peu de récepteur activés peuvent provoquer une réponse significative . . - quand [H] = KD (50% des récepteurs sont occupés) => on obtient plus de 75% de la réponse une très petite concentration d'hormone peut donner une grande réponse . . . remarque; la courbe [Hormone] vs fraction des récepteurs liant l'hormone est une courbe hyperbolique => on ne peut simplement déterminer KD d'après cette courbe (il faut dériver la courbe par régression non linéaire ou méthode graphique comme un diagramme de Scatchard) . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (13 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < Affinité des agonistes et antagonistes . . Le récepteur contient un site (ou plus) sur lequel se fixe le messager . Agoniste = molécule pouvant se lier sur le site actif du récepteur et déclencher son activation . antagoniste = molécule pouvant se lier très fortment sur le site actif du récepteur SANS déclencher son activation , peut donc bloquer de façon compétitive le site actif et empêcher un agoniste de s'y lier . . . Affinité de l'hormone pour l'agoniste naturel (hormone, messager local, neurotransmetteur, etc.) est très grande (KD très petit) -. ● KD = 5 x 10-6 dans le cas l'adrénaline pour son récepteur (récepteur β-adrénergique) . . Agonistes artificiels sont choisis pour leur affinité très forte (souvent supérieure à l'agoniste naturel) . --- isoprotérénol (agoniste de récepteur β-adrénergique): KD = 4 x 10-7 . . Antagonistes ont très souvent des affinités plus forte que l'agoniste naturel . ● propanonol (antagoniste du récepteur β-adrénergique): KD = 3.4 x 10-9 . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (14 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux Transduction et seconds messagers < . La plupart des messagers ne traversent pas la membrane . Pour avoir un effet ils se lient sur un récepteur membranaire qui doit rester dans la membrane plasmique. . . Le message doit donc être transmis à l'intérieur de la cellule (transduction) pour modifier le comportement de protéines intracellulaire: transduction ● . . récepteurs couplés aux protéines G: ❍ stimule la production (ou l'apparition) d'un (ou plusieurs) seconds messagers dans le cytoplasme par un mécanisme enzymatique ou via un tunnel ❍ AMPc ❍ PIP 3 ❍ . ❍ ❍ -- Ca2+ ces seconds messagers activent generalement des kinases causant la phosphorylation de protéines protéines Gs, Gi, Gq, Go..... . . ● . le récepteur lui-même a une activité de phosphorylation ou s'associe a une protéine causant une phosphorylation ❍ activité tyr kinase ❍ récepteur tyrosine kinase . --- ● le récepteur peut déclencher l'ouverture d'un canal ionique (ou est lui-même un canal ionique (Ca, K) qui modifie la [ ] de l'ion, ce qui déclenche certaines activités . . Récepteur intracellulaire (génique) . facteurs de transcription . éléments de réponse ---. > file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (15 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux 4.1.4< Mesure de l'affinité des récepteurs (KD) . . . - Sachant que . . . . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (16 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . . . . . . . -. . . On peut rearranger cette equation pour obtenir la proportion de récepteurs ayant lié l'homone (la fraction liée = B) . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (17 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . . . - Cette courbe hyperbolique est utilisée pour déterminer KD . On peut utiliser les données directement et faire une régression non linéaire pour la résoudre, ce qui prend malheureusement des logiciels assez avancés. . . . -. . . . --- On peut également utiliser un diagramme de Scatchard qui donne une droite facile à représentée et qui peut permettre de dériver KD par méthode graphique. Ces deux approches s'appliquent a toute situation où on doit mesurer l'affinité d'un "recepteur" pour son "ligand exemples anticorps pour son antigene lectine pour son sucre ligand pour son récepteur hormone pour son récepteur . . = cinétique enzymatique de type Michaelis-Menten . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (18 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < Diagramme de Scatchard (forme générale) . . . B= ligand lié => mesuré directement - F = ligand libre (non lié) => mesuré directement ou calculé en soustrayant ligand total (valeur conue) - ligand lié . . . KL = constante du ligand ( = constante de dissociation = KD) => déterminé par le diagramme en tracant la courbe B total vs B/F, on obtient la droite suivante et KL peut facilement etre calculé . -. . . . --. . . . ---- calcul de Kd en solutionnant une courbe de type hyperbolique carrée > file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (19 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < remarque: ces calculs pour etre valides doivent tenir compte de la liaison non spécifique du ligand sur d'autres "récepteurs" non spécifiques . exposition de la préparation à l'hormone radioactive . . . . séparation des récepteurs ayant liés l'hormone (B) de l'hormone libre (F) . . -. mesure de la radioactivité B et F . . . --- construction du diagramme de Scatchard . . . . diminution du bruit de fond (soustraction des sites de faibles afinnités contirbués par les autres protéines membranaires ayant une affinité non spécifique) ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (20 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . . . - Mesure de l'interaction hormone récepteur et détermination de la liaison non spécifique L'hormone (radioactive) peut se lier à des sites spécifiques de haute affinité très peu nombreux, donc facilement saturables (les vrais récepteurs) et à de très nombreux sites non spécifiques de faible affinité, donc très difficilement saturables. . . . L'adsorption totale observée est donc la somme de deux adsorptions. Pour obtenir la mesure de l'adsorption sur ces vrais récepteurs, il faut donc soustraire l'adsorption non spécifique de l'adsorption totale pour obtenir l'adsorption spécifique. . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (21 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . . . - On mesure dans un premier temps l'adsorption totale simplement en mettant des quantités croissantes d'hormones radio-actives en présence de membranes (ou de récepteurs plus ou moins puritfiés) et en mesurant la radioactivité qui se lient aux membranes (incluant récepteurs spécifiques et non spécifiques). Pour obtenir l'adsorption non spécifique, on incube des quantités croissantes d'hormones radioactives avec une quantité fixe d'hormones non radoactives (froides) (e.g. 100 X plus). Les récepteurs spécifiques ayant une très grande affinité et étant très peu nombreux seront saturés tandis que les sites non spécifiques (très nombreux quoique de faible affinité, donc très difficiles à saturer)) lieront de plus les molécules radioactives. . . . . -. . . . --. . . . ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (22 of 24)19 03 2007 11h30h11 Controle de l'activite cellulaire - principes generaux < . Purification des récepteurs par chromatographie d'affinité . . Récepteur représente souvent seulement un sur 10-5-10-6 des protéines membranaires . Préparation d'une colonne de résine sur laquelle on a fixé de façon covalente un agoniste ou un antagoniste (colonne d'affinité) . . . Préparation d'un mélange susceptible de contenir le récepteur (membranes solubilisées avec un détergent doux comme Triton X-100). -. . Application de la préparation sur la colonne: adsorbtion du récepteur sur l'agoniste ou l'antagoniste, . . --- Lavage pour éliminer par élution des protéines sans affinité pour le récepteur . . Elution du récepteur en faisant percoler un agent permettant de détacher le récepteur de sur la colone . détergent doux . agoniste/antagoniste compétitif ---> file:///Fichiers/site%20internet/dg/bc4223/sgn/sgn1Cpge.html (23 of 24)19 03 2007 11h30h11
