Chouinard_Guillaume_2012_memoire

Université de Montréal
Localisation et fonction de CHK2 en mitose
par
Guillaume Chouinard
Programmes de Biologie Moléculaire
Faculté de Médecine
Mémoire présenté à la Faculté de médecine
en vue de l’obtention du grade de M.Sc
en Biologie moléculaire
29 Octobre 2012
© Guillaume Chouinard, 2012

ii
RÉSUMÉ
Les centrosomes dont le rôle principal est d’organiser le cytosquelette de
microtubules et le fuseau mitotique servent aussi de sites d’interaction pour plusieurs
protéines régulatrices du cycle cellulaire et de la réponse aux dommages à l’ADN. Une de
ces protéines est la kinase CHK2 et plusieurs publications montrent une sous-population de
CHK2 localisée aux centrosomes dans les cellules en interphase et en mitose. Toutefois, la
localisation de CHK2 aux centrosomes demeure controversée, car des doutes subsistent en
ce qui concerne la spécificité des anticorps utilisés en immunocytochimie. En utilisant des
lignées cellulaires du cancer du côlon, les cellules HCT116 sauvages et HCT116 CHK2-/-
ainsi que différentes lignées d’ostéosarcome humain dans lesquelles l’expression de CHK2
a été inhibée par ARN interférence, nous montrons que les anticorps anti-CHK2 qui
donnent un signal centrosomal sont non spécifiques et reconnaissent un antigène inconnu
sur les centrosomes. Cependant, par des expériences d’immunofluorescence réalisées avec
des cellules U2OS qui expriment les protéines de fusion GFP-CHK2 ou FLAG-CHK2,
nous révélons une localisation centrosomale de CHK2 dans les cellules en mitose, mais pas
en interphase. Ce résultat a été confirmé par vidéomicroscopie dans les cellules vivantes
exprimant GFP-CHK2. Pour déterminer le ou les rôles potentiels de CHK2 en mitose nous
avons réalisé des expériences pour explorer le rôle de CHK2 dans la progression de la
mitose, la nucléation des microtubules aux centrosomes et la progression de la mitose en
présence de problèmes d’attachement des chromosomes où de lésions génotoxiques. Nos
données suggèrent que CHK2 n’est pas impliquée dans la régulation de la mitose dans les
cellules U2OS.
Mots-clés : CHK2, mitose, centrosomes, cycle cellulaire.

iii
ABSTRACT
Centrosomes function primarily as microtubule-organizing centres and play a
crucial role during mitosis by organizing the bipolar spindle. In addition to this function,
centrosomes act as reaction centers where numerous key regulators meet to control cell
cycle progression. One of these factors involved in genome stability, the checkpoint kinase
CHK2, was shown to localize at centrosomes throughout the cell cycle. Here, we clarify
that CHK2 only localized at centrosomes during mitosis. Using wild-type and CHK2-/-
HCT116 human colon cancer cells, or human osteosarcoma U2OS cells depleted for CHK2
with small hairpin RNAs, we show that several CHK2 antibodies are non-specific for
immunofluorescence and cross-react with an unknown centrosomal protein(s). To analyse
further CHK2 localization, we established cells expressing inducible GFP-CHK2 and Flag-
CHK2 fusion proteins. We show that CHK2 localizes to the nucleus in interphase cells but
that a fraction of CHK2 associates with centrosomes in mitotic cells, from early mitotic
stages until cytokinesis. In contrast to previous data obtained by A. Stolz and colleagues
with the human colon carcinoma HCT116 cell line, our experiments exploring the possible
functions for CHK2 during mitosis did not support a role for CHK2 in the bipolar spindle
formation and the timely progression of mitosis in human osteosarcoma U2OS cells.
Keywords : CHK2, mitosis, centrosomes, cell cycle.

iv
TABLE DES MATIÈRES
RÉSUMÉ ............................................................................................................................... ii
ABSTRACT .......................................................................................................................... iii
TABLE DES MATIÈRES .................................................................................................... iv
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................ viii
LISTE DES ABBRÉVIATIONS .......................................................................................... ix
REMERCIEMENTS ............................................................................................................ xv
INTRODUCTION ................................................................................................................. 1
La réponse cellulaire aux dommages à l’ADN (RDA) ...................................................... 1
Nature des dommages à l’ADN ..................................................................................... 3
La détection des dommages à l’ADN ............................................................................ 3
Les voies de transduction de la réponse aux dommages à l’ADN ................................. 4
Le cycle cellulaire ............................................................................................................ 10
Les phases du cycle cellulaire ...................................................................................... 12
Régulation du cycle cellulaire ...................................................................................... 15
La Mitose ......................................................................................................................... 18
Description ................................................................................................................... 18
Régulation de l’entrée en mitose .................................................................................. 19
Points de contrôle du cycle cellulaire............................................................................... 23
Le point de contrôle à la transition G1/S ...................................................................... 26
Le point de contrôle Intra-S ......................................................................................... 28
Le point de contrôle à la transition G2/M .................................................................... 29
Le point de contrôle en mitose ou « spindle assembly checkpoint » (SAC)................ 32
Les points de contrôle du cycle cellulaire et le cancer ................................................. 37
La kinase CHK2 ............................................................................................................... 38
CHK2 et le cancer ........................................................................................................ 39
Structure et activation de CHK2 .................................................................................. 40
Fonctions et substrats de CHK2 ................................................................................... 42
Les centrosomes ............................................................................................................... 45

v
Anatomie et structure du centrosome ........................................................................... 45
Le cycle de duplication des centrosomes ..................................................................... 47
Les centrosomes et la régulation de l’entrée en mitose ................................................ 49
Les centrosomes et le cancer ........................................................................................ 49
Signalisation croisée entre la réponse aux dommages à l’ADN et la mitose ............... 50
La réponse des cellules aux dommages à l’ADN en mitose ........................................ 51
Problématiques et objectifs .............................................................................................. 54
ARTICLE ............................................................................................................................. 56
ABSTRACT ..................................................................................................................... 57
INTRODUCTION ........................................................................................................... 58
RESULTS AND DISCUSSION ...................................................................................... 60
CHK2 is localized in the nucleus but not at the centrosomes in interphase cells ........ 60
CHK2 localizes at the centrosomes in mitotic cells ..................................................... 62
Polo-like kinase 1 is required for CHK2 localization at centrosomes ......................... 64
CHK2 function in mitotic cells .................................................................................... 65
FIGURES ......................................................................................................................... 68
Figure 1. Centrosomes stain positive for CHK2 in human colon cancer cells deficient
in CHK2. ...................................................................................................................... 68
Figure 2. Centrosomal staining for CHK2 antibodies persists in cells expressing CHK2
targeting shRNAs. ........................................................................................................ 69
Figure 3. CHK2 localizes at centrosomes in mitotic cells but not in interphase. ........ 70
Figure 4. GFP-CHK2 localizes at centrosomes and spindle in mitotic living cells. .... 71
Figure 5. Polo kinase 1 is required for CHK2 localization at centrosomes. ................ 72
Supplementary Figure 1. The exogenous GFP-CHK2 and Flag-CHK2 fusion proteins
are functional kinases. .................................................................................................. 73
Supplementary Figure 2. During mitosis the localisation of CHK2 at the centrosomes
is microtubules independent. ........................................................................................ 73
Supplementary Figure 3. GFP, GFP-CHK1 and Flag-CHK1 do not localize at the
centrosomes. ................................................................................................................. 74