BCPST-Véto 1 – Vendredi 2 juin 2007 - Devoir n°9 – Durée 3h30 Épreuve de type A : Sujet de synthèse Les polymérases et leur intervention au cours de la réplication et de la transcription de l'ADN Les polymérases d'origine virale ne sont pas attendues. Corrigé du devoir n°9 – 2 juin 2007 – Partie de type A noté sur 100 Introduction Présentation générale du sujet Présentation de l'ADN, support de l'information génétique. Définition de la réplication et place dans le cycle cellulaire. Définition et rôle de la transcription. Notion d'enzyme. Présentation du plan I. l'intervention des polymérases à l'échelle moléculaire A. L'activité catalytique des polymérases : l'élongation d'une chaîne polynucléotidique A partir de nucléosides triphosphates schéma d'un nucléoside triphosphate Dans les sens 5'3' brins orientés sur un schéma Par établissement d'une liaison ester en récupérant l'énergie de la liaison phosphate. Schéma Énergie récupérée pour estérification et pour processivité En respectant la complémentarité des bases et l'antiparallèlisme avec le brin matrice ou transcrit liaison faibles entre bases complémentaires / schémas /5'3' face à 3'5' L'intervention de Mg2+ , cation activateur B. Les particularités des ARN et ADN polymérases Nécessité ou non d'une amorce Amorce d'ARN (ext.3' OH libre) pour ADNpol., mise en place d'un nucléoside triphophate pour ARN pol. Différences entre les nucléosides triphosphates polymérisés. Bases U /T, ribose/ désoxyribose II. L'intervention des ADN (et ARN) polymérases lors de la réplication A. Les observations mettant en évidence les caractéristiques générales de l'activité des polymérases chez les procaryotes et les eucaryotes Une localisation différentes de la réplication et donc des enzymes procaryote association au mésosome lié à membrane (schéma) /euc. dans le noyau Intervention au niveau de fourches de réplication, extrémités des yeux de réplication un oeil( proc), plusieurs (euc.) /schéma proc. euc./ progression de part et d'autre symétrique / Une activité en continu ou non selon les branches de la fourche schéma montrant fragments d'Okazaki / longueur des fragments 1000 à 2000n. proc et 100 à 200n chez euc. Réplication à vitesse différentes 1000 pdb.s-1 pour les proc.=> 40 min pour E.Coli, 100 chez les euc; B. Une mise en place conditionnée par une phase d'amorçage Un amorçage en un ou plusieurs sites en fonction de l'existence d'une ou plusieurs origines de réplication exemple du site OriC chez E.Coli un seul site également pour ADN des organites semi-autonomes plusieurs sites chez les eucaryotes Un déroulement de l'ADN et un étirement par des enzymes action des ssb et hélicases /schéma La synthèse des amorces par une ARN polymérase = primase schéma La mise en place de l'ADN polymérase III sous-unités β permettant fixation sur ADN schéma C. Le déroulement de la réplication avec intervention de plusieurs ADN polymérases chez les bactéries Un complexe holoenzyme polymérase III relié au mésosome chez les bactéries schéma L'intervention de l'ADN polymérase I pour remplacer les amorces d'ARN schéma / nécessité d'un ligase Une correction des erreurs grâce à l'activité exonucléasique des ADN polymérases taux d'erreur = 10-6 / due à tautomères /site particulier /schéma / efficacité 99% *=1 pt * * * * * * * * * * * * ** * ** * ** * ** ** ** *** ** ** * * * * ** * * * * * * * ** * *** La mise en action de polymérases lors des corrections des mésappariements contrôlés par un brin déformations de l'hélice / reconnaissance du brin néosynthétisé / efficacité => mutation = 10-9 III. L'intervention des ARN polymérases lors de la transcription A. Les observations mettant en évidence les sites d'intervention des ARN polymérases Chez les procaryotes l'observation de figures en « arbre de Noël » la transcription simultanée d'un gène par plusieurs ARN pol / schéma Chez les eucaryotes, le cas particulier des chromosomes polyténiques /schéma d'une boucle de chromatine avec ARN encours de synthèse ou image montrant les transcrits de préARNm avec splicéosomes sur une molécule d'ADN La localisation particulière au niveau de l'euchromatine et les nucléoles chez les eucaryotes B. Une fixation déterminée par l'existence de promoteurs Les promoteurs, des séquences consensus situés en amont du gène chez les procaryotes, 2 séquences consensus / schéma chez les eucaryotes, boîte TATA / schéma Déterminant le brin à transcrire promoteurs sur les deux brins (fonction des gènes chez les procaryotes)/ schéma un seul promoteur par brin pour les ADN des organites semi-autonomes toujours sur le même brin chez les eucaryotes = un seul des brins est transcrit Déterminant le site de début de la transcription Reconnu par une ARN polymérase associée à des facteurs d'initiation procaryotes : facteur sigma / schéma / ouverture du double brin eucaryotes : facteurs généraux de la transcription / schéma /nécessité de facteurs activateurs C. Une régulation intervenant dans la fixation de la polymérase Fixation autorisée ou non par l'intervention ou non d'un répresseur sur un opérateur chez les procaryotes exemple de l'opéron lactose : en absence de lactose, blocage par répresseur de l'opérateur / schéma notion de gène inductible exemple de l'opéron tryptophane : gène répressible par le tryptophane Fixation autorisée par des interventions d'activateurs (ou de répresseurs) agissant sur l'état de condensation de la chromatine chez les eucaryotes schéma montrant activation du complexe de remodelage et décondensation schéma montrant l'activation des histones acétylases (cas des répresseurs activant les désacétylases) D. Une régulation intervenant au niveau de la mise en action Démarrage de la transcription grâce à une activation chez les procayotes en présence de lactose et absence de glucose , activation par protéine CAP-AMPc Par des interventions d'activateurs (ou de répresseurs) sur le complexe de préamorçage chez les eucaryotes existence de séquences régulatrices = amplificateurs (ou atténuateurs) / fixation d'activateurs (ou de répresseurs) rôle intégrateur du complexe médiateur multiprotéique / schéma E. Le déroulement de la transcription et la libération de l'ARN synthéthisé L'organisation fonctionnelle d'une ARN polymérase un seul type 4 sous-unités / 3 types ARNpolI (ARN)II (ARNm)III (ARN5S et ARNsn et autres petits ARN), 10 sous unités pour polII eucaryotes Schéma (exemple de la polymérase bactérienne) montrant ouverture du double brin par activité intégrée de l'ARN polymérase / tunnel des ribo nucléosides triphosphates / courte double hélice ADN-ARN/.... vitesse 50 à 100n.s-1/ 20 n.s-1 pour la polymérase eucaryote Les erreurs de transcription et leurs conséquences possibilité de « marche » arrière et de correction du dernier nucléotide / taux d'erreur 10-4 > ADN pol mais peu de csq. La dissociation de l'ARN polymérase de l'ADN en fin de transcription séquence symétrique + paires AT (A-U/ A-T) => séparation facilitée facteur rho pour certains procaryotes Conclusion Bilan : Beaucoup de points communs entre les fonctionnements deux enzymes Régulation de la transcription importante pour la différenciation cellulaire conditionnée par des facteurs externes et internes à la cellule. C'est le cas aussi de la régulation de la réplication située en amont de l'intervention de l'ADN polymérase. Ouverture : Intervention de polymérases aussi lors des processus de conservation de l'ADN (lors des réparations des séquences modifiées lors du stockage) Existence d'autres polymérases d'origine virale : ARN polymérase - ARN dépendantes et ADN polymérase - ARN dépendantes. Utilisation d'une polymérase particulière = Taq pol. pour la PCR, technique clef dans l'étude et les manipulations du génome Plan, qualité des transitions soin apporté à la présentation et à la rédaction et à l'orthographe *** * ** ** * * ** ** * * * * * ** ** ** * * * * * * ** ** ** *** * * ** ** * ** ** ** ** ** **