recherche de marqueurs genetiques lies a la tolerance a la salinite

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEURE ET DE LA
RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE D’ORAN ES- SENIA
FACULTE DES SCIENCES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
Laboratoire de Biotechnologie des Rhizobiums et Amélioration des Plantes
Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de Magister
Spécialité : Amélioration des plantes
Option : Sélection
Intitulé ;
RECHERCHE DE MARQUEURS
GENETIQUES LIES A
LA TOLERANCE A LA SALINITE CHEZ DES
ECOTYPES
D’ESPECES ANNUELLES DE MEDICAGO
Présenté par : Melle Hammou Bakhta
Devant la commission du jury :
Président : Pr. BEKKI .A Professeur Université d’Es-Senia Oran
Rapporteur : Pr. FYAD F.Z Professeur Université d’Oran Es- Sénia
Examinateur : Dr. BENBAYER .Z Docteur Université d’Oran Es- Sénia
Examinateur : Pr. AOUES .A Professeur Université d’Oran Es- Sénia
Année Universitaire : 2009-2010
Sommaire
Remerciement
Dédicace
Résumer.
INTRODUC TION ................................................................................................................. 01
PREMIERE PARTIE : REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Chapitre I : Présentation de la plante .................................................................................... 05
I. 1. Le genre Medicago : Taxinomie, aire de répartition et domestication: ............................... .05
I. 1. 1. Medicago truncatula .................................................................................................. .08
I. 1. 2. Medicago aculeata..................................................................................................... .08
I. 2. Medicago plante modèle pour l’étude des interactions plante- stress ................................. .10
I. 2. 1. Importance des légumineuses cultivées. ......................................................................... .10
I. 2. 2. Le genre Medicago comme modèle génétique................................................................ .11
Chapitre II : Les stress chez les plantes ................................................................................. 15
II. 1. Qu’est qu’un stress ? ....................................................................................................... 15
II. 2. Le stress abiotique ......................................................................................................... 16
II. 3. La perception du stress et les différents types de senseurs................................................. 16
II. 4. Transduction du signal : ................................................................................................... 18
II. 4. 1. Le calcium................................................................................................................ 18
II. 4. 2. La voie SOS ............................................................................................................. 19
II. 4. 3. Les protéines kinases dépendantes du calcium (CDPKs) ........................................... 19
II. 4. 4. Les vois de MAPKinas ........................................................................................... 19
II. 4. 5. Les phospholipases ..................................................................................................... 20
II. 5. La salinité ........................................................................................................................ 21
II. 5. 1. Origine de la salinité ................................................................................................. .22
II. 5. 1. 1. Origine primaire ............................................................................................... .22
II. 5. 1. 2. Origine secondaire. ........................................................................................... 22
II. 5. 2. Le stress salin .......................................................................................................... 23
II. 5. 2. 1. Les réponses des plantes au stress. .................................................................. 23
II. 5. 2. 2. Tolérance au stress salin chez le « Medicago ». ................................................. 27
II. 5. 3. Les modifications métaboliques suite aux signaux du stress. .................................... 28
II. 5. 3. 1. Synthèse des protéines. ......................................................................................... 29
II. 5. 3. 2. Synthèse des enzymes........................................................................................... 32
Chapitre III : Les marqueurs isoenzymatiques. .................................................................... 36
III. 1. Définition d’un marqueur ............................................................................................... 36
III. 2. Les isoenzymes ............................................................................................................. 38
III. 2. 1. Les estérases. ........................................................................................................... 39
III. 2. 2. Les peroxydases .................................................................................................... 40
III. 2. 2.1 Définition
......................................................................................................... 40
III. 2. 2. 2. Historique. ......................................................................................................... 41
III. 2. 2. 3. Structure chimique ............................................................................................. 41
III. 2. 2. 3. Localisation et mobilité des peroxydases. ........................................................... 42
III. 2. 2. 5. Rôle physiologique ............................................................................................ 42
DEUXIEME PARTIE : PARTIE EXPERIMENTALE
Chapitre IV : Matériel et Méthodes. ...................................................................................... 46
IV. 1. Matériel végétal ............................................................................................................. 46
IV. 2. Protocole expérimental ................................................................................................... 47
IV. 3. Séparation des isoenzymes (estérases et peroxydases) par électrophorèses PAGE : ........ 47
IV. 3. 1. Extraction des estérases et des peroxydases........................................................ 48
IV.3. 2. Préparation du gel pour les estérases et les peroxydases ...................................... 48
IV. 3.3. Condition de migration des estérases et les peroxydases ...................................... 48
IV. 3.4. Révélation des estérases ....................................................................................... 49
IV. 3.5. Révélation des peroxydases .................................................................................. 49
Chapitre V : Résultats et interprétation ................................................................................ 51
V. 1. Résultats relatifs aux estérases ....................................................................................... 51
V. 2. Résultats relatifs aux Peroxydases ................................................................................... 58
V. 2. 1. Changements des profils des peroxydases chez les deux espèces Truncatula et
Aculeata.et une population sauvage (inconnue)......................................................................... 58
V. 2. 2. Changements des profils des peroxydases chez la population sauvage de Medicago. .... 62
VI. Discussion .......................................................................................................................... 65
VI. 1. Modification des estérases sous un stress salin. .............................................................. 65
VI. 1. Modification des peroxydases sous un stress salin .......................................................... .71
Conclusion et perspective ....................................................................................................... 77
- Références bibliographiques
Au nom de Dieu je dédie ce modeste travail :
La mémoire de ma mère, qui M’a appris la patience, la volonté….
Mon père pour ses prières et son sacrifice.
Mes sœurs et mes frères
AISSAM
Mes collègues et amis
Et a toutes les personnes qui portent le nom Hammou et Yagoubi
Ma profonde gratitude s’adresse en premier lieu à Dieu dont l’aide et l’assistance
m’ont permis de suivre ma formation au sein de ce laboratoire afin de réaliser ce travail.
Merci au Laboratoire Génétique et amélioration des plantes en nommant sa directrice
Madame Fyad-Lameche F-Z pour m’avoir accueillie pendant ces 4 années de travail.
Mes remerciements s’adressent également aux différents membres du jury :
Monsieur BEKKI .A professeur à l’université d’ES_SENIA d’Oran pour avoir
accepter d’honorer la présidence du jury.
Madame BENBAYER .Z Docteur à l’université des Sciences d’Oran pour avoir
accepter d’examiner ce travail.
Monsieur AOUES .A Professeur à l’université d’ES_SENIA d’Oran qui a bien
voulue participer au jury en tant qu’examinateur.
Merci à Monsieur YAHIA.N collaborateurs au laboratoire de génétique et
d’Amélioration des plantes pour m'avoir appris les techniques d’électrophorèse, pour m'avoir
soutenue au cours de l'élucidation des mystères peroxydasiques et Pour son aide précieuse
durant mes années de thèse.
J'adresse mes remerciements les plus chaleureux à Melle Lachheb Fayrouse pour sa
première correction de thèse, pour sa gentillesse et pour son amitié, qui s’est muée en
fraternité, ainsi que pour tous les moments partagés autour d’un repas de midi ou d’une tasse
de thé à discuter de tout et de rien…
Je tiens à adresser ma vive reconnaissance à tous mes professeurs de collège, de CEM, de
Lycée en particulier Mr Mahdi et Madame Khaldi.
Ce travail étant le fruit de nombreuses collaborations et contributions, J’exprime
mes remerciements à toutes les personnes et à l'ensemble des membres du laboratoire de
génétique et d’amélioration des plantes. Merci encore à ceux que je n'ai pas cité et qui ont
également contribué à rendre ces quatre années distrayantes, mouvementées et
particulièrement enrichissantes.
Je remercie enfin spécialement mes parents, mes sœurs et mes frères pour leur présence
et leur soutien immuables dans les moments les plus durs pour tout cela, je leur Témoigne
mon affection éternelle.
Résumé :
L‘Algérie représente l‘une des zones de diversité génétique les plus riches, où l‘on peut
recenser une grande variété de milieux agro-écologiques ; néanmoins la caractéristique
aléatoire des précipitations annuelles et les stress abiotiques imprévisibles et sévères viennent
souvent aggraver la situation de l‘agriculture algérienne, qui connaît un déficit fourrager
énorme, et les animaux sont souvent soumis à des périodes de disettes alimentaires fréquentes.
Cet état de fait a amené les décideurs à opter pour augmenter le nombre de forages, donc une
sollicitation plus accrue des nappes littorales.
La salinisation des sols qui recensée parmi les stress abiotiques représente un facteur limitatif
majeur de la production agricole de plusieurs pays méditerranéens, en particulier l’Algérie. Ce
qui fait l’objectif de cette étude, c’est l’identification des marqueurs isoenzymatiques en
particulier les estérases et les peroxydases liés à la tolérance au stress salin chez des espèces
annuelles de Medicago.
Les résultats de notre expérimentation montrent des profils isoenzymatiques de peroxydases
présentant par rapport aux témoins deux zones avec des variations quantitatives et
qualitatives. Le stress salin semble altérer le métabolisme normal de ces enzymes en le
retardant davantage chez les écotypes sensibles que les écotypes tolérants. De plus une
apparition de nouvelles bandes isoenzymatiques a été mentionné chez les écotypes sensibles
que chez les tolérants. De même, les profils des estérases présentant entre deux et trois zones
d’activités selon l’espèce, nous remarquons là aussi l’apparition de variations d'ordre
quantitatif et qualitatif. Outre de ces variations, une expression différentielle liée au stade de
développement de la plante au niveau du témoin est notée, alors que chez les traitées en plus
de bandes constitutives, des bandes spécifiques au stress apparaissent.
Mots Clés: Stress slain - Medicago - Estérases – Peroxydases.
Abstract:
Algeria represents one of the richest genetic diversity zones, where one can count a big
variety of agro-ecological surroundings; nevertheless the characteristic uncertain of the yearly
precipitations and the unforeseeable and abiotic stress comes to aggravate the situation of the
Algerian agriculture, that knows an enormous fodder deficit often, where the animals are
often submitted to periods of frequent food scarcities. This actual position brought the
decision-makers to opt to increase the number of forage, therefore a solicitation more
increased of the coastal tablecloths.
Salinity in sol is one of the major stress can severely limit crop production of many
Mediterranean countries, in particular Algeria.
Esterase and peroxidase isoenzymatiques pattern associated with salt tolerance in Medicago
were studied in this work. The results show two major zones of peroxidases with quantitative
and qualitative variation. We noted the presence of the novels bands exclusively in sensible
ecotypes.
Esterase activity shows 2 and 3 zone according to the species. Whereas at treated in addition
to the bands constitutive the specific bands to the stress appears to different salt
concentrations.
Key word: Salt Stress - Medicago - Estérases – Peroxydases.
‫ﻣﻠﺨﺺ‬
‫اﻟﺠﺰاﺋﺮ ھﻲ واﺣﺪة ﻣﻦ أﻏﻨﻲ اﻟﻤﻨﺎﻃﻖ ﻣﻦ ﺣﯿﺚ اﻟﺘﻨﻮع اﻟﻮراﺛﻲ اﻟﻨﺒﺎﺗﻲ ‪ .‬ﻏﯿﺮ أن ﺗﻘﻠﺒﺎت اﻟﻤﻨﺎخ و ﻧﺬرت‬
‫اﻷﻣﻄﺎر ﺗﻌﺘﺒﺮ ﻋﻮاﻣﻞ ﻗﺎﺳﯿﺔ ﻋﻠﻰ ﻣﺮدود اﻹﻧﺘﺎج اﻟﻨﺒﺎﺗﻲ اﻟﺠﺰاﺋﺮي و ﺑﺎﻟﺘﺎﻟﻲ ﻧﻘﺺ اﻟﻌﻠﻒ اﻟﺤﯿﻮاﻧﻲ أﺣﯿﺎﻧﺎ‪.‬‬
‫اﻟﻤﻠﻮﺣﺔ ھﻲ اﺣﺪ اﻟﻌﻮاﻣﻞ اﻟﺘﻲ ﺗﺆﺛﺮ ﻋﻠﻰ اﻟﻤﺤﺼﻮل اﻟﺰراﻋﻲ ﻓﻲ ﺑﻠﺪان اﻟﺒﺤﺮ اﻷﺑﯿﺾ اﻟﻤﺘﻮﺳﻂ ﺧﺼﻮﺻﺎ‬
‫اﻟﺠﺰاﺋﺮ ‪ ،‬ھﺬا ﻣﺎ ﺟﻌﻠﻨﺎ ﻧﻘﻮم ﺑﮭﺬا اﻟﺒﺤﺚ ﻹﯾﺠﺎد ﻋﻼﻗﺔ ﺑﯿﻦ ﻧﻮﻋﯿﻦ ﻣﻦ اﻻﯾﺰواﻧﺰﯾﻤﺎت ) اﯾﺴﺘﺮاز و ﺑﯿﺮو‬
‫ﻛﺴﯿﺪاز( و ﺑﯿﻦ درﺟﺔ ﺗﺤﻤﻞ ﻧﺒﺎت اﻟﺒﺮﺳﯿﻢ ﻟﻠﻤﻠﻮﺣﺔ‪.‬‬
‫اﻟﻨﺘﺎﺋﺞ أﻇﮭﺮت أن ھﻨﺎك اﺧﺘﻼف ﻛﻤﻲ و ﻧﻮﻋﻲ ﻣﺮﺗﺒﻂ ﺑﯿﻦ إﻧﺘﺎج ھﺬﯾﻦ اﻟﻨﻮﻋﯿﻦ ﻣﻦ اﻷﻧﺰﯾﻤﺎت و ﺑﯿﻦ‬
‫درﺟﺔ ﺗﺮﻛﯿﺰ اﻟﻤﻠﻮﺣﺔ‪.‬‬
‫ﻛﻠﻤﺎت اﻟﻤﻔﺘﺎح ‪ :‬اﻹﺟﮭﺎد ﺑﺎﻟﻤﻠﻮﺣﺔ – اﻟﻔﺼﺔ– اﺳﺘﺮاز‪ -‬ﺑﯿﺮوﻛﺴﯿﺪاز ‪.‬‬
Introduction
Introduction :
L’amélioration des plantes se définit comme la recherche des meilleures voies permettant
de réaliser, à partir d’une constitution imparfaite, une structure génétique adaptée aux critères
et aux besoins des populations humaines (Demarly, 1977) cité par Baudoin (1995). Cette
amélioration des plantes pour la tolérance et/ou la résistance aux stress abiotiques, dans le but
d’augmenter, de stabiliser la productivité des plantes cultivées, et d’en élargir leur culture aux
régions marginalisées, a vu un succès indéniable à travers les techniques conventionnelles
d’amélioration. Au delà de la sélection classique, différentes techniques biotechnologiques
peuvent être utilisées pour améliorer la tolérance ou la résistance aux stress
environnementaux.
L’on sait que la faiblesse des superficies et de la production fourragère et pastorale, ainsi
que les périodes de disettes alimentaires constituent des obstacles majeurs au développement
de l’élevage des ruminants en Algérie. Citées comme solution les luzernes, de par leur facilité
d'utilisation, assurent l'amélioration de la flore et de la jachère et entrent en rotation avec les
céréales grâce à leurs graines dures
(Abdelguerfi, 1987).
En effet, elles permettent
l'enrichissement du sol en azote, sa protection contre l'érosion et l'amélioration de ses
propriétés physico-chimiques en rétablissant les réserves de matières organiques disparues.
Cependant, la production de semences constitue un frein à l'utilisation des luzernes annuelles
au niveau des jachères et des parcours.
L’Algérie se trouve parmi les pays qui présentent un besoin réel en fourrage. Le
remplacement de la jachère par une culture fourragère assurera sans aucun doute une
meilleure intégration de l’élevage à l’agriculture. Hormis le rôle de fixation de l’azote
atmosphérique, ces espèces possèdent un système racinaire très puissant qui permet
l’utilisation des éléments fertilisants sur une profondeur rarement atteinte par d’autres
1
Introduction
cultures. De ce fait, la luzerne est considérée comme une culture améliorante de la structure et
de la texture du sol (Amouri, 2006).
Chaque année, les surfaces perdues à cause de la salinité des sols varient autour de 20
millions d'hectare dans le monde. Ainsi, ces surfaces sont passées de 48 millions à 265
millions d'ha de terres agricoles touchées par la salinité et aujourd’hui, les surfaces agricoles
affectées dans le monde seraient de 340 millions d'ha soit 23% des terres cultivées dans le
monde (Cheverry, 1995). Selon Szabolcs (1994), un milliard d’ha est menacé dont 3,2
millions d’ha en Algérie (Belkhodja et al., 2004).
Il est avéré que la salinité constitue l’un des stress abiotiques des sols les plus répandus
au niveau de la planète limitant fortement leurs rendements (Khales et al., 2006). Par
conséquent, l’emploi de cultivars de Medicago tolérant le stress salin présente un avantage
d’autant plus viable du point de vue technico-économique.
Le genre Medicago est un genre qui renferme 34 espèces annuelles et 21 espèces
pérennes. Ces dernières présentent un intérêt agro-économique du fait de leur excellente
qualité fourragère et de l’enrichissement de la fertilité du sol qu’elles assurent (Lalaoui-Kamal
et al., 1997). C’est ainsi que dans le but de valoriser les ressources phytogénétiques en
Algérie, la connaissance des espèces à intérêt fourrager et pastoral représente une
préoccupation essentielle (Abdelguerfi et al., 1988).
Au cours de ces dernières décennies, ces propriétés ont trouvé des applications
agronomiques notamment dans la pratique des assolements légumineuses-Blés. C’est dans
une telle perspective qu’en Algérie, l’institut de développement des grandes cultures
(I.D.G.C.) s’intéresse à la recherche de cultivars adaptés à nos régions principalement semiarides ou les hivers sont rigoureux et où les sols sont souvent salés. C’est dans le but de
valoriser les luzernes sauvages d’Algérie que des travaux portant sur leur écologie et sur des
essais de sélection d’écotypes locaux ont été réalisés par plusieurs auteurs (INA collectif,
2
Introduction
1974; Adem, 1974; Abdelguerfi, 1976, 1978). La première évaluation génétique des
« médics » à l’échelle nationale est réalisée en utilisant les marqueurs iso-enzymatiques
comme moyen d’identification et de caractérisation génétique (El mousadik, 1991).
L’objectif de cette étude est d’identifier les marqueurs isoenzymatiques impliqués dans la
tolérance d’espèces du genre Medicago à un stress salin modéré et d’évaluer la diversité
génétique existant entre les espèces étudiées grâce à ces marqueurs. Pour cela, il a été
convenu d’opter pour l’approche d’analyse de l’expression des peroxydases ( PERs) et des
estérases ( ESTs).
3
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
Chapitre I : Présentation de la plante
I. 1. Le genre Medicago : Taxonomie, aires de répartition et domestication :
La plupart des espèces du genre Medicago sont connues depuis le XVIéme siècle, ainsi
dans « species plantarum » plus de 9 espèces sont décrites dont certaines avec plusieurs
variétés botaniques. Plusieurs travaux importants réalisés au cours du XIXéme siècle, mais mal
reliés entre eux, ont abouti à une description complète du genre Medicago menant à un grand
nombre de synonymes.
Un premier effort de synthèse – relativement incomplet – a été effectué par Urban
(1872). Ce n’est que vers le milieu du XXème siècle que ces espèces ont été réellement
étudiées. Aujourd’hui encore, des homonymies ou ressemblances peuvent prêter à confusion
et plusieurs limites d’espèces sont incertaines.
Le genre Medicago appartient à la famile des Fabaceae, sous famille des papilionoideae.
Il est proche des genres Melilotus et Trigonella, ainsi Medicago radiata L. est placée par
certains auteurs dans le genre Trigonella. Les caractéristiques principales du genre Medicago
L. (1754), peuvent être ainsi résumées : plantes annuelles ou pérennes, herbacées ou
arbustives, possédant une corolle papilionacée constituée d’un étendard, de pétales formant
deux ailes libres, d’une carène formée par les deux pétales inférieurs soudés ; neuf étamines
soudées forment la colonne staminale, une dixième étamine est libre. La corolle et la colonne
staminale constituent le dispositif de déclenchement de la fleur, caractéristique du genre,
retrouvé chez les espèces autogames. Le calice est formé de cinq sépales soudés. Les feuilles
sont trifoliées non terminées par une vrille. Le stipule est collé au pétiole. Les inflorescences
pédonculées portent de 20 à 30 fleurs libres. (Prosperi M, 1995). Ce genre comprend des
espèces diploïdes, tétraploïdes, exceptionnellement hexaploides (M. cancellata, M. saxatilis et
certaines populations de M. arborea). Le nombre chromosomique de base est de 7 ou 8. Les
5
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
ouvrages de références sont peut nombreux, on peut en citer deux : Negre (1956), Lesins et
Lesins (1979).
D’après Lesins et Lesins (1979), les formes les plus anciennes auraient été pérennes,
probablement ligneuses, préférentiellement allogames. Les formes annuelles se seraient
différenciées, il y a 6 à 7 millions d’années, au Miocène, à l’occasion des transgressions
marines du bassin méditerranéen. L’évolution du genre s’est accompagnée de modifications
morphologiques et biologiques. Les formes annuelles sont strictement
autogames, très
souvent diploïdes et ont généralement des graines plus grosses (poids de 1000 graines
supérieures à 4g) que les espèces pérennes (pois de 1000 graines de 2 à 3 g) avec néanmoins
des exceptions notables.
Les aires d’origine de toutes les espèces du genre Medicago sont « le croissant fertile »,
recouvrant les pays ou régions actuelles de Turquie, Iran, Irak, sud du Caucase et le pourtour
méditerranéen. Ces espèces ont ensuite conquis l’ensemble de la zone méditerranéenne et les
steppes avoisinantes (voir Fig. 1). Au cours du XIXème siècle, elles ont ensuite envahi
d’autres parties du monde, en particulier les continents américain et australien à l’occasion
des différents courants de colonisation humaine.
6
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
M Truncatula
M Littoralis
M Italica
Figure 1. Distribution du genre Medicago truncatula, Medicago littoralis et Medicago italica
par pays de provenance d’après Delalande, 2007.
7
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
I.1.1. Medicago truncatula :
C’est une espèce de taille intermédiaire, 60 cm maximum, poilue, à port variable,
souvent prostrée, présente sur des sols lourds, marneux ou argileux. L’inflorescence porte de
1 à 5 fleurs. Les gousses sont cylindriques, en forme de tronc, glabres, très dures, à spires
jointive et serrées, aux épines recourbées, souvent perpendiculaires au plan des spires ( Fig. 4)
. Elles contiennent de 3 à 12 graines. Le poids de 1000 graines varie de 3.3 à 6 g. C’est une
espèce diploïde (2n=16).
M .truncatula est une espèce localisée principalement dans les zones méditerranéennes
chaudes et de basse altitude. On peut la classer parmi les espèces colonisatrices (Cockos et al.,
1980). Elle présente une adaptabilité et une variabilité importante vue la gamme de milieux
dans lesquels elle évolue.
Depuis quelques années, deux espèces-modèles, Medicago truncatula et Lotus japonicus
suscitent un intérêt croissant sur la scène internationale. De nombreux laboratoires, les
utilisent pour étudier divers aspects des interactions plantes-microorganismes. M. truncatula
est plus proche d'un point de vue phylogénétique de la plupart des légumineuses cultivées. En
Europe : elle fait partie du groupe des Galégoïdes qui contient les tribus des Trifoliées
(luzernes, trèfles) des Viciées (pois, féveroles, lentilles, vesces) et des Cicerées (pois
chiches)… Par ailleurs, aux USA, des institutions comme la NSF, l'USDA, et la Noble
Fondation ont opté pour M. truncatula comme modèle. C’est ce qui a axé notre choix sur M.
truncatula comme légumineuse-modèle.
I.1.2. Medicago aculeata:
Cette espèce ne diffère essentiellement des autres variétés que par les gousses, munies
sur leur suture d’aiguillions très courts, inégaux, un peu épais, sans tubercules ; elles ont
d’ailleurs la même forme, roulées cinq à six fois sur elles-mêmes, un peu comprimées à leur
deux extrémités, le poids de 1000 graines est élevé (souvent supérieur à 8 g) (Prosperi M,
8
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
1995), les fleurs sont aussi plus nombreuses, réunies au nombre de trois ou quatre à
l’extrémité d’un pédoncule plus long que les pétioles. Les folioles sont en ovale renversé, un
peu rhomboïdales, quelque fois plus allongées, les stipules dentées et un peu ciliées à leur
base ; les tiges très anguleuses, légèrement pubescentes et rameuses.
Figure 2. Différents modèles de la gousse du genre Medicago (Prosperi, 1995)
figure 4. Medicago Truncatula (feuilles,
gousses, fleur) (Besancon, 2009)
Figure 3. Medicago Aculeata (feuilles, gousses,
fleur) (forage.okstate, 2008)
9
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
I. 2. Medicago plante modèle pour l’étude des interactions plante-stress
environnementaux :
I. 2. 1. Importance des légumineuses cultivées
Les légumineuses (Fabaceae) sont définies par leur structure florale spécifique, la cosse
de leur fruit et surtout par l'aptitude (88% des espèces examinées) à former des symbioses
fixatrices d'azote avec les bactéries de la famille des Rhizobiaceae (de Faria et al., 1989). Ces
plantes viennent au deuxième rang après les graminées pour la satisfaction des besoins
alimentaires de l'homme (Graham et al., 2003). Les légumineuses comptent 670 à 750 genres
et 18000 à 19000 espèces différentes (Polhill et al., 1981). Elles comprennent d’importantes
espèces à graines, de pâturage et forestières.
Au niveau mondial les légumineuses à graines et de fourrage occupent près de 180
millions d’hectares représentant 12 à 15% de la surface des terres arables (F.A.O. 2007).
D’une part les légumineuses à graines couvrent 33% des besoins humains en protéines
alimentaires. Cette part est fournie, essentiellement, par les cultures du haricot, petit pois, pois
chiche et fève (Vance et al., 2000). Les graines de ces légumineuses contiennent
généralement 20 à 30% de protéines et sont particulièrement riches en Lysine (acide aminé
essentiel pour la croissance). Elles sont, de ce fait, complémentaires des profils nutritionnels
des céréales (Duranti et al., 1997), et représentent les principales sources de protéines dans les
pays en voie de développement et dans les régions subtropicales. Parmi les légumineuses, le
soja (Glycine max) et l'arachide (Arachis hypogea) fournissent plus de 35% des besoins
mondiaux en huiles végétales (F.A.O. 2007).
D’autre part, Les légumineuses fourragères, telles que la luzerne (M. sativa) et le trèfle
(Trifolium spp.) constituent une base importante de l’alimentation des productions animales
laitières et à viande en raison de leur faible coût, et de leurs qualités nutritives (richesse en
10
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
azote, énergie et fibre) améliorant la production de viande et de lait dans le monde (Russelle
2001), vu leurs richesses en protéines, fibres et énergie.
Enfin, les espèces ligneuses ont également montré une aptitude à séquestrer le carbone, ce qui
suggère aussi la possibilité de les utiliser pour s'opposer à l'augmentation du taux de dioxyde
de carbone dans l'atmosphère (Resh et al., 2002).
Par ailleurs, outre les bénéfices qu’elles entraînent pour l’alimentation et l’environnement, les
légumineuses peuvent être utiles dans diverses industries alimentaires (lait et dérivés, pain,
tourteau) et chimiques (plastique biodégradable, huile, bio-diésel, colorants, gomme, textile,
papier…) (Graham et al., 2003). Plusieurs légumineuses ont été utilisées dans l'industrie
pharmaceutique (Duke 1992; Kindscher 1992), en effet, les isoflavones du soja et d'autres
légumineuses ont été pressenties pour diminuer les risques de cancer et les effets du
cholestérol (Kennedy 1995; Molteni et al. 1995).
Bien qu’importantes sur les plans économique, écologique et industriel, les légumineuses
cultivées présentent des caractéristiques biologiques qui retardent leur amélioration génétique.
Elles possèdent en général un grand génome, sont souvent polyploïdes et leur transformation
par Agrobacterium est délicate voire impossible. C’est pourquoi, il a été décidé d’identifier
une espèce légumineuse modèle qui serait plus facile à manipuler et à étudier, et qui
permettrait, via sa synthénie avec les légumineuses cultivées, d’accélérer les recherches
fondamentales et l’amélioration génétique concernant les traits agronomiques d’intérêt : c’est
le genre Medicago truncatula.
I. 2. Le genre Medicago comme modèle génétique :
Les luzernes annuelles ou « médics » dont la culture a été développée par les australiens
dans le cadre du "ley farming system" (système céréale-médics), semblent constituer à cet
égard une solution intéressante (Puckridge et al., 1983). Diverses tentatives d’implantation de
ce système (Halse, 1993) ont été entreprises en Afrique du Nord (Doolette, 1980. ; Jaritz et
11
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
Amine, 1993 ; Maatougi, 1993). Une dizaine d’espèces parmies les 55 espèces de Medicago
recensés par Lesins & Lesins (1979) sont cultivées, la plupart sont présentes dans les
pâturages ou parcours, notamment méditerranéens.
La plus connue est sans conteste la luzerne cultivée (Medicago sativa L.). Cette espèce
constitue, avec les trèfles la principale ressource en légumineuses fourragères. Elle est
cultivée dans le monde entier : dans les années 1980 on comptait plus de 33 millions
d’hectares dont la majorité aux Etas Unis (13 millions d’hectares) et en Europe (8 millions
d’hectares) (Hanson et al, 1988). Le rôle agricole des espèces annuelles du genre Medicago a
été reconnu dès les années Trente quand Trumble et Donald (1938) ont recommandé la
culture de Medicago truncatula sur les sols calcaires de l'Australie du sud-ouest. Dans cette
région, les medics ont été utilisées en rotation avec les céréales et ont eu un grand impact sur
la production agricole (Cocks et al., 1980).
Medicago truncatula est actuellement une plante modèle pour la génétique moléculaire .
Historiquement, le choix de Medicago truncatula résulte d’un programme INRA (1985-1986)
dont l’objectif était de définir une espèce modèle à l’intérieur du genre Medicago, afin de
l’associer à Shinorhizobium melilloti, le microsymbiote bien étudié de la luzerne et constituer
ainsi un système symbiotique modèle plante-bactérie. En outre elle présente, comme
Arabidopsis une grande facilité de culture et un petit génome (Wollmen F-A 2004) d’environ
500 méga-bases/ cellule, c'est-à-dire trois à quatre fois supérieure à celle de Arabidopsis
thaliana et équivalente à celle du riz. La biodiversité de l’espèce M. truncatula est
caractérisée par une forte variabilité morphologique et génétique intra et inter populations et
par une importante homozygotie au niveau individuel.
Cette plante a été proposée comme légumineuse modèle (Barker et al., 1990; Cook
1999) en raison de ses nombreux atouts aux niveaux de la biologie, de la génétique et des
différents outils génomiques qu’elle offre (Huguet et al., 1996; Young et al. 1995). De plus,
12
Partie I : Revue bibliographique
Généralité sur le Medicago
Medicago truncatula présente une grande synthénie avec beaucoup de légumineuses cultivées
tels que le pois et la luzerne pérenne (Zhu et al., 2005), permettant ainsi le transfert des acquis
sur cette plante modèle vers ces légumineuses. Ces avantages sont mis à profit pour des
études de génomique fonctionnelle et structurale en vue de l’identification des gènes
agronomiques intéressants, ainsi que l’étude des interactions légumineuses-agents pathogènes
et symbiotes (Cook 1999, Cook et al., 2000).
13
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
Chapitre II : Le stress chez les plantes
Les plantes sont souvent confrontées à des conditions environnementales défavorables
qu’on peut dénommer ‘stress’ et qui ont pour conséquence une diminution de la croissance.
Tous les stress impliquent des réactions de signalisation capables d’aboutir à la mise en place
de défenses ou de déclencher une mort cellulaire programmée.
II.1. Qu’est qu’un stress ?
Le mot stress est apparu autour de 1940. Il s’agissait d’un mot anglais, employé en
mécanique et en physique, qui voulait dire «force, poids, tension, charge ou effort».
Le français Claude Bernard fut le premier à dégager une notion physiologique du stress
en 1868. Selon lui, les réactions déclenchées par le stress visent à maintenir l’équilibre de
notre organisme. L’ensemble de ces réactions internes a été nommé homéostasie par le
physiologiste américain C.W. Bradford (1915), à partir du grec « stasis » (état, position) et
homoios (égal, semblable à). Il y inclura en outre la notion de stress. Le lien stresshoméostasie-adaptation va perdurer jusqu'à nos jours et les recherches menées concernant ces
processus sont à la base d’une littérature abondante. L’association de ces trois notions
constitue l’approche biologique du stress et permet notamment d’expliquer dans certaines
limites, l’adaptation à l’environnement, et donc au maintien de la vie (Roeder, 2006).
Selon Wang et al., 2001, les stress se traduisent chez les plantes par des changements
morphologiques et moléculaires qui affectent leur croissance et leur productivité.
D’une façon plus générale, on peut dire qu’au niveau cellulaire, un stress est causé par
la variation d’un paramètre environnemental qui entraine la mise en place des mécanismes de
régulation de l’homéostasie.
15
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
II. 2. Le Stress abiotique :
Lorsque les conditions environnementales sont susceptibles de provoquer chez une
espèce végétale une réduction de la croissance des individus ou une augmentation du taux de
mortalité de la population, ces conditions peuvent être assimilées à des conditions stressantes
(Tal, 1984).
Le stress peut être induit par une substance chimique ou une contrainte physique, de
manière réversible ou permanente, selon que les altérations provoquées dans ces conditions
disparaissent ou non, après retour à des conditions de croissance normale (Chrétien, 1992).
En effet les plantes se trouvent rarement dans des conditions environnementales optimales,
mais elles se trouvent souvent dans des conditions extrêmes de potentiel hydrique, de
température, de salinité ainsi que d’autres facteurs qui amènent les organismes à la limite de
la survie (Hopkins et al., 2003). Les stress abiotiques sont connus depuis longtemps chez les
plantes cultivées comme étant des facteurs limitant majeurs de la productivité (Boyer, 1982 ;
Balarathinasnasabathi, 2002), ils peuvent également affecter le fonctionnement de la plante en
perturbant les flux ioniques (Knight et al., 2001) ou en altérant les parois ou membranes
cellulaires (Zhu, 2001 ; Wang et al., 2003). Les organismes qui vivent dans ces habitats ou
ces facteurs prédominent, ont développé plusieurs adaptations.
II. 3. La perception du stress et les différents types de senseurs :
Les conditions du stress abiotique constituent une source de signaux complexes pour les
cellules. Un seul type de stress correspond à des variations physiques et/ou chimiques, ces
composantes représentant pour la plante des informations différentes. Les cellules végétales
ne possèdent pas un récepteur spécifique d’un stress donné, mais plutôt un ensemble de
récepteurs qui vent être sollicités par les différentes composantes du stress (Figure 5).
16
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
Stress secondair:
Stress oxidatif
Stress osmotique
stress
Perturbation de l’équilibre
osmotique et de
l’homéostasie ionique
Dommages sur les
protéines et les membranes
Perception du
signal
Senseur, canaux Ca2+, HK
Transduction
du signal
2 nd messagers, MAPK, SOS, CDPK
Contrôle de la
transcription
Facteurs de transcription, (CBF,HSF)
Mécanismes
de réponse au
stress
H2O et
mouvement d
ions
(transporteurs)
Chaperonnes
Activation
de
gènes
Détoxification
Osmoprotection
Résistance ou tolérance au stress
Figure 5 : Représentation générale de réponse au stress chez les plantes (D’après Wang
et al., 2003).
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
Parmi les récepteurs identifiés se trouvent les canaux Ca2+. En condition de stress
thermique ou salin, il a été observé chez les plantes un influx de calcium dans le cytoplasme.
Ce calcium provient soit de l’extérieur de la cellule, soit de stocks internes (Knight et al. ;
2000). Cet influx résulterait d’une activation des canaux calciques induite par les
changements structuraux de la cellule. Cette supposition résulte des études de Pieth ( 1999)
montrant les liens entre les flux de Ca2+ et la température, considérant que la réorganisation
du cytosquelette et la fluidité de la membrane plasmique sont les premiers changements
structuraux liés au froid ( Orvar et al., 2000 ; Sangwan et al., 2001 et Wang et al., 2001) cité
par ( Roeder, 2006).
Les histidines kinases (HK) représentent un autre récepteur du stress identifié chez les
bactéries et les plantes. Ces enzymes transmettent un signal externe vers l’intérieur de la
cellule par un système de phospho-relais à 2 composants ( Urao et al., 2000). La protéine
AtHK1 est fortement suspectée d’être un capteur osmosensible chez A. thaliana ( Urao et al.,
1999)
II. 4. Transduction du signal :
Suite à la perception du stress, le signal crée par les récepteurs doit être transmis à
l’intérieur de la cellule. Cette transduction du signal est assurée par les «seconds messagers »
qui vont activer des voies enzymatiques assurant le fonctionnement de la cascade de réactions
et permettant à la cellule de répondre au stress perçu.
II.4.1. le calcium :
L’entrée de Ca2+ dans les cellules végétales a été observée en condition de stress
abiotique, mais également lors de stress hormonaux (ABA : acide abscissique), biotiques ou
lors de processus liés au développement. Cette augmentation transitoire de la concentration
interne de calcium est due soit à un influx de calcium extracellulaire soit à une libération des
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
stocks intracellulaires (Knight et al., 2000, Sanders et al., 1999). La libération interne de Ca2+
est contrôlée par des canaux dépendant de ligands. Ces ligands sont les seconds messagers
décrits chez les cellules animales ( inositol polyphosphates, ribose ADPcyclique), qui ont une
action similaire chez les plantes ( Schroeder et al., 2001).
II. 4. 2. la voie SOS :
Parmi les voies métaboliques activées par le calcium et participant à la transduction du
signal, l’une des plus étudiées à l’heure actuelle est la voie SOS (Salt Overly Sensitive).
L’analyse du mutant SOS chez A. thaliana a permis l’identification de 3 protéines (SOS1,
SOS2, SOS3), impliquées dans la réponse au stress salin ; le processus impliquant les SOS
débute après la fixation de calcium sur la protéine SOS3 qui contient 3 sites de fixation du
calcium et un site de N-myristilysation ( Ishitani et al., 2000).
II. 4. 3. les protéines kinases dépendantes du calcium ( CDPKs) :
Les CDPK (Protéines Kinases dépendantes du Calcium) interagissent directement avec
le calcium. Trente quatre gènes codants des CDRKs ont été identifiés chez A. thaliana. Les
recherches menées sur ces enzymes ont montré leur implication dans une variété de voies de
réponses à différents stress. Par exemple, la surexpression chez le riz (Oryza sativa)
d’OsCPKS7 entraîne une augmentation de la tolérance au froid, à la sécheresse et au stress
salin ( Saijo et al., 2000).
II. 4. 4. Les voies de MAPKinases :
La cascade type de la voie des MAPKinases (mitogen actived proteine kinases) est
constituée du système MAPKKK-MAPKK-MAPK. Cette cascade est activée soit par une
interaction physique directe entre le récepteur et une MAPKKK soit par la phosphorylation de
médiateurs externes ou de MAPKKKK intermédiaires, provoqué par ces mêmes récepteurs.
Les MAPKKK sont des serine / thréonines kinases qui activent les MAPKK par la
phosphorylation de 2 résidus serine / thréonine placés au sein d’un motif conservé ST-X3-519
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
S/T. Ces MAPKK sont des kinases à spécificité double qui procèdent à) la phosphorylation
des thréonines et tyrosines des MAPK sur le motif TXY. Chez les végétaux supérieurs, les
MAPKs interviennent également dans la transduction du signal suite à un stress osmotique.
Un stress hyper-osmotique peut entraîner l’activation de kinases apparentées aux MAPKs
chez le tabac (Usami et al., 1995 ; Tena et al., 1998). Récemment, l’équipe de Munnik (1999)
a montré que, chez la luzerne, des concentrations de sels comprises entre 100 et 500 mM
entraînaient l’activation de la voie de SIMK (salt stress-induced MAPK). De manière
surprenante, des concentrations plus élevées de sels n’activaient non pas SIMK mais une
kinase de 35 kDa. Ces travaux révèlent l'existence probable de deux osmosenseurs chez la
luzerne, un pour des pressions osmotiques modérées, l’autre pour des pressions osmotiques
élevées.
En outre, il existe d’autres protéines kinases associées au cytosquelette. Suite au
séquençage complet du génome d’A. thaliana, 20 MAPK, 10 MAPKK et 60 MAPKKK ont
été identifiées. Des protéines similaires ont été aussi isolées chez d’autres végétaux
(Nakagami et al., 2005). Les MAPKKK son les premières kinases intervenant dans la cascade
de phosphorylation des MAPKK. Ainsi, il a été confirmé que les kinases de type MEKK sont
des kinases dont le rôle est identique à celui de MAPKKK, tandis que celui-ci reste à vérifier
pour les kinases de type RAF (MAPK Groupe, 2002).
II.4.5. Les phospholipases :
Une autre forme de la transduction du signal résulte de l’action des phospholipases. Les
phospholipase D (PLD) hydrolysent les phospholipides et produisent de l’acide
phosphatidique (PA), jouant ainsi un rôle important dans les mécanismes de la réponse au
stress, mais ce rôle varie d’une PLD à une autre. Par exemple, la suppression de PLDα chez
A. thaliana entraîne une baisse de la tolérance au froid tandis que sa sur-expression entraine
20
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
une meilleure tolérance chez ce même organisme (Li et al., 2004). Par comparaison, la
suppression de PLDα1 entraîne une meilleure résistance au froid (Weltri et al., 2002).
Un certain nombre de travaux montre que la quantité de phospholipides s’accroît
généralement dans les plantes exposées au froid. Il en est ainsi, par exemple, pour les tiges de
bouleau ou de peuplier (endurcies au froid jusqu’à résister à la température de l’azote liquide),
les céréales d’hiver, les semences de céréales ou les racines de luzerne (Willemont, 1979).
II. 5. La salinité :
Les terrains salés sont fréquents au Maghreb, aussi bien en situation littorale que
continentale, (Chotts, Sebkhas) et leur végétation est encore relativement en bon état, même
s’ils constituent des pâturages très appréciés pour les ovins et les camelins. Leurs structures
s’organisent en fonction de la teneur en sels du sol (Quzel, 2000).
La salinité peut entraîner des effets nocifs conséquents en raison de la fixation des
chlorures de sodium par les colloïdes du sol. De plus, les sels causent des changements dans
la structure du sol (sur sa perméabilité et son aération) affectant directement le développement
de la plante (Derradji et al., 2004).
Après des siècles d’irrigation et d’exploitations intensives, beaucoup de zones agricoles
importantes de notre planète ont souffert des changements de la composition chimique de
leurs sols. L’accumulation des sels est l’une de ces
modifications. De plus le fort
ensoleillement et la faible pluviométrie ont obligé les agriculteurs de ces régions à irriguer en
quantité importante et, souvent, avec une eau saumâtre ( Haouala et al., 2007).
Les sols salés, fréquemment associés à la contrainte hydrique dans les zones arides et
semi-arides du Maghreb, constituent l’un des principaux problèmes pour le développement
des plantes. Ils entrainent une réduction des surfaces cultivables et, combinées à d’autre
facteurs, ils représentent une menace pour l’équilibre alimentaire de ces régions (Jean et al,
1998, Cheverry 1995). La salinité touche actuellement environ 25 % des terres irriguées et
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
concerne plus particulièrement les zones arides et semi-arides des région méditerranéennes,
ainsi que les régions tropicales. Dans ces conditions, la culture des espèces florales, connues
pour leur forte sensibilité à la salinité, peut être sérieusement compromise (Maas, 1986).
II. 5. 1. Origine de la salinité :
II. 5. 1. 1. Origine primaire :
Cette salinité provient de l’altération de la roche mère saline par les facteurs d’érosion.
La dissolution, par les eaux de ruissellements des roches sédimentaires qui sont riches en
chlorures, sulfate et carbonates contribuent ainsi à la salinisation des sols. En effet, l’altération
de la roche mère qui fournit les sels responsables de la salinisation primaire est provoquée par
l’eau de pluie souvent acide (H2CO3) mais aussi par des agents physiques. (Aubert, 1975)
II. 5. 1. 2. Origine secondaire :
Un autre processus ne faisant pas appel à la roche mère, peut avoir comme origine soit
les eaux d’irrigation qui sont chargées en sels ou une fertilisation chimique excessive
(Mouhouche et al., 1999).
Par ailleurs, dans un sol irrigué, la remontée capillaire se réalise lors des intervalles
entre les irrigations et lors d’une période jachère quand il n’y a pas un mouvement descendant
par la percolation d’eau. Selon Eilers et al., 1995, dans la zone d’alimentation qui reçoit des
précipitations, l’eau pénètre dans le sol et, si elle n’est pas absorbée par les végétaux, elle
atteint les eaux souterraines, celles-ci dissolvent les sels et les transportent dans les zones
d’émergence ou l’apport en eau souterraine fait élever la nappe phréatique jusqu'à la frange
capillaire telle une éponge, faisant ainsi remonter l’eau à la surface du sol qui s’évapore
permettant au sel s’accumuler.
II. 5. 2. Stress salin :
Le stress salin est défini comme étant le processus pédologique suivant lequel, le sol
s’enrichit anormalement en sels solubles acquérant ainsi le caractère salin. ( Eilers et
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
al.,1998). Ainsi, sont appelé sols salés ceux qui sont caractérisés par la présence d’un excès de
l’ion sodium échangeable dans le profil (Da Silva, 1982).
II. 5. 2. 1. Les réponses des plantes au stress salin :
Les plantes peuvent répondre au stress par diverses réactions. Certaines d’entre elles
peuvent subir des lésions, ce qui signifie qu’elles peuvent montrer des disfonctionnement
métaboliques, d’autre plantes comme les éphémères ne sont jamais confrontées réellement à
la sécheresse ou au froid -on dit qu’elles échappent au stress- d’autres plantes possèdent la
capacité de résister aux stress par des mécanismes d’évitement ou de tolérance. La tolérance
signifie que les conditions qui règnent dans la plante sont en équilibre avec les conditions de
l’environnement externe. (Hopkins, 2003).
Le stress salin a un accent ionique aussi bien qu'osmotique sur les plantes. Ce stress
peut être distingué à plusieurs niveaux (Tester et al., 2003). La racine et l'augmentation de la
pousse sont réduites abruptement chez les plantes sensibles au sel et cet effet ne paraît pas
dépendre de la concentration des ions dans les tissus en croissance, mais c'est plutôt une
réponse à l'osmolarité de
la solution externe (Munns, 2002). Les contraintes dues à
l’accumulation spécifique de Na+ dans les tissus des feuilles se caractérisent par la nécrose
des feuilles les plus anciennes, en commençant par le bout de celles-ci et en progressant vers
les marges, puis continue vers la partie basale de la feuille. Les effets spécifiques du Na+
s’ajoutent à l’effet osmotique du NaCl (Munns 2002). Il est rapporté aussi que l’insuffisance
des éléments nutritifs dans le sol est due à la haute concentration de Na+ qui réagit
réciproquement avec les autres facteurs de l'environnement, telle la sécheresse (Silberbush et
al., 2001).
La toxicité métabolique du Na+ est en grand partie un résultat de sa capacité à
concurrencer l’ion k+, le potassium étant essentiel pour les fonctionnements cellulaires. Plus
de cinquante enzymes sont activées par l’ion K+, et le Na+ ne peut pas remplir ce rôle. Ainsi
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
des niveaux élevés de Na+, ou des rapports Na+/K+ importants peuvent perturber divers
processus enzymatiques dans le cytoplasme. D’ailleurs, la synthèse des protéines exige des
concentrations élevées de K+ , ceci étant dû à la nécessité de la présence de l’ion K+ pour
l’adhésion de l’ARNT aux ribosomes ainsi qu’à d’autres aspects du fonctionnement des
ribosomes (Blaha et al., 2000).
La tolérance des plantes au NaCl varie d’une espèce à l’autre,( jusqu'à 100 mM de NaCl
dans l’eau du sol) en effet, les rendements de l’orge, de la canne à sucre et du coton sont peu
affectés, mais le maïs, les haricots et la luzerne présentent déjà des limitations importantes
dans la production de matière sèche. Les plantes halophiles ou halophytes qui fréquentent les
sols salés ou « halomorphes », c'est-à-dire chargé de chlorure de sodium et accessoirement
d’autres sels, présentent des adaptations morphologiques «xéromorphoses» et des adaptations
physiologiques (Laval-Martin et al., 1995).
La plupart des espèces d’intérêt agronomique sont rangées dans le groupe des
glycophytes, plantes dites sensibles au sel parce que leur croissance est diminuée en présence
de sel dans le sol. Il n’ y a pas de distinction précise entre les concentrations extrêmes de sel
tolérées par les plantes de l’un ou de l’autre groupe, bien qu’une frontière arbitraire de
concentration extrême en chlorure de sodium de l’ordre de 6g/L soit souvent citée ( Flowers,
1983).
Errabii (2006) a étudié l’effet du sel à l’échelle cellulaire chez une variété de canne à
sucre. Les résultats obtenus ont montré la présence d’une similitude entre la réponse «in
vivo » et «in vitro» de variétés de canne à sucre. Il s’est avéré que le stress salin provoque des
altérations et des perturbations très importantes et très sévères chez toutes les variétés aussi
bien au stade plante qu’au stade cal. Cette réaction se traduit par une réduction de la
croissance (Yang et al 2005), de la teneur en eau ainsi que de la teneur en éléments essentiels
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
tels que le K+ et le Ca2+. En contrepartie, il a remarqué des augmentations importantes en ions
toxiques principalement Na+ et Cl- ainsi que de la teneur en proline et en sucres solubles.
Afin d’évaluer d’une manière rapide et efficace la tolérance à la salinité de la vigne, on a
analysé « in vitro » le comportement de différentes variétés autochtones et porte-greffes vis-àvis du stress salin. À cet égard, des micro-boutures issues de matériel végétal homogène
prélevé en plein champ ont été cultivées « in vitro » et soumises durant 45 jours à différentes
concentrations salines (0, 20, 50, 80, 100, 150 et 200 mM de NaCl). Les différents paramètres
de croissance mesurés concernent la capacité de survie, l’allongement des pousses, la
formation des bourgeons et l’aptitude à l’enracinement. Les résultats montrent que la salinité
affecte la croissance et le développement de la vigne « in vitro ». Les premiers symptômes du
stress (nécroses foliaires) sont apparus après 10 jours de traitement à 80 mM NaCl, et peuvent
atteindre un dessèchement total des vitroplants. Par ailleurs, une variabilité de la réponse a été
mise en évidence selon le génotype testé et les doses de NaCl appliquées. En effet, les variétés
Séjnène et Asli sont relativement plus tolérantes que Saouadi, Sakasly et Razegui, alors que
les porte-greffes se sont avérés les plus sensibles par rapport aux variétés testées. En fait, la
capacité d’adaptation à la salinité semble être corrélée à la vigueur du génotype. Il semblerait
ainsi que la tolérance relative de certaines variétés soit due essentiellement à une composante
génétique (Hamrouni et al., 2008).
Les travaux d’Almansouri et al., 2001, portant sur l’effet des stress osmotiques et
salins sur la germination des graines chez trois cultivars de blé dur (Triticum durum Desf.)
différents par leur résistance à la salinité et à la sécheresse, ont montré que les stress
d’intensité modérées retardent seulement la germination, tandis que les fortes concentrations
de NaCl et PEG réduisent le pourcentage final de germination, et que les effets délétères du
NaCl et du PEG sont supérieurs lorsque les stress sont appliqués sur des embryons isolés mis
à germer dans des milieux adéquats in vitro que ceux obtenus sur les graines. Ces travaux ont
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
permis de conclure que l’inhibition de la germination par les stress peut ne pas être attribuée à
une inhibition du métabolisme des réserves de la graine, et l’effet principal du PEG observé
par l’inhibition de l’absorption de l’eau, alors que l’effet nuisible du NaCl peut être lié à
l’accumulation des ions toxiques à long-terme.
Chez la pomme de terre (salanum tuberons L.) la présence de sel dans l’eau d’irrigation
provoque la réduction du diamètre des tubercules, la diminution du nombre d’yeux par
tubercule, et des fissurations de l’épiderme du tubercule (Hannachi et al., 2004).
La plante selon Polevoï (1989) cité par Laarabi (2006) réagit par :
1. Une augmentation de la perméabilité membranaire et une dépolarisation de son
potentiel électrique.
2. Un influx du Ca2+ dans le cytoplasme. Ces ions viennent de la paroi squelettique et
des compartiments internes : vacuole, mitochondries, etc.
3. Une acidification du cytoplasme.
4. Un montage de microfilaments.
5. Une accélération de l’absorption d’O2, de la consommation de l’ATP et de la
libération de radicaux libres.
6. Une augmentation des processus hydrolytiques.
7. Une activation de la synthèse des protéines du stress.
8. Une activation de la pompe à protons.
9. Une activation de la teneur en éthylène et en acide abscissique. Ces deux substances
arrêtent le métabolisme.
II. 5. 2. 2. Tolérance au stress salin chez les espèces du genre Medicago
Boughanmi et al (2008) ont étudié, chez une espèce fourragère vivace autochtone des
oasis tunisiennes (Medicago sativa cv Gabès), l’effet d’un stress salin de forte intensité (150
mM) et de longue durée (4 semaines) sur les aspects ioniques et structuraux des feuilles
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
assimilatrices. Une attention particulière a été portée au complexe phloémien des veines
mineures et de la nervure principale respectivement impliquées dans la collecte et le transport
à longue distance des
assimilas/solutés. Les modifications structurales des cellules de
transfert phloémiennes et l’accumulation du Na+ dans le complexe phloémien plaide en
faveur de l’implication de telles cellules dans la tolérance à la salinité de Medicaco sativa cv
Gabès. La localisation des transporteurs de sodium au niveau de leur membrane élargie sous
l’effet du sel confirmerait leur rôle dans la recirculation du Na+.
En outre, Zhao et al., (2008) ont montrés que l’activité totale d’ascorbate peroxydase de
la peroxydase et de la catalase est généralement augmentés, sous un stress toxique du mercure
chez la Luzerne (Medicago sativa).
Aussi Rabhi et al., 2007 ont-ils étudié les effets de l'interaction salinité-déficience
ferrique sur l'acquisition du fer et l'acidification racinaire induite par le manque de fer chez
Medicago ciliaris L à partir de quatre traitements :
- C, milieu complet (MC) contenant 30 μM Fe
- S, traitement salin (MC) additionné de 75 mM NaCl
- D, milieu déficient en fer (MC), contenant 1 μM Fe seulement
- DS, traitement combiné, (MC) contenant 1 μM Fe et additionné de 75 mM NaCl.
Les résultats ont montré que la croissance et la teneur en chlorophylle des plantes sont
beaucoup plus affectées par les effets conjugués de la salinité et de la déficience en fer que par
leurs effets individuels, indiquant un effet additif des deux contraintes chez les plantes DS.
Ces résultats s’expliquent par l'accumulation du sodium dans les parties aériennes, ainsi que
par la limitation de l'acquisition d'éléments indispensables, comme Fe et K en condition de
salinité, de déficience en fer et, surtout, en conditions d'interaction de ces deux effets. L'étude
a montré également que l'acidification racinaire induite par la limitation en Fe a été fortement
réduite en présence du sel. Ce résultat, qui est concomitant avec la diminution de l'absorption
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
.du fer, suggère que l'activité de la pompe à protons racinaire peut être inhibée par le stress
salin.
Chebouti et al., 2000 avaient déjà noté que quelle que soit la phase où le stress a été
imposé, il provoque une chute de la production de gousses et de graines chez les trois espèces
de Medicago (M. aculeata, M. orbicularis, et M. truncatula.) étudiées. Mais la réduction a été
plus importante lorsque le stress est appliqué lors de la phase floraison (Abbad et al., 2004)
que lorsqu‘il est appliqué lors de la phase végétative.
II. 5. 3. les modifications métaboliques suite aux signaux du stress :
Les stress environnementaux (ou abiotiques), comme la sécheresse, la salinité et les
basses températures sont des conditions de stress qui affectent la croissance et le rendement
des plantes. Contrairement aux animaux, qui peuvent se déplacer lorsque les conditions de vie
ne leur sont plus favorables, les plantes ont développé des stratégies d’adaptation pour
répondre aux changements de leur environnement en contrôlant et en ajustant leurs systèmes
métaboliques. Ces perturbations entraînent une faible production d’énergie par la
phosphorylation et la photo transpiration, une assimilation de l’azote perturbée, et un
dérèglement de nombreuses voies métaboliques. Si la concentration en sel excède le niveau de
la tolérance de la plante, des perturbations fonctionnelles apparaissent au niveau de la
photosynthèse, par effet de sel dans le stroma des chloroplastes qui perturbent le transport des
électrons. La glycolyse et le cycle de Krebs sont aussi affectés (Calu, 2006).
Les réponses cellulaires et moléculaires des plantes aux conditions de stress ont fait
l’objet de nombreuses études. Les mécanismes par lesquels elles perçoivent les signaux
environnementaux et les transmettent à la machinerie cellulaire pour activer des mécanismes
de réponses adaptées, déterminent chaque jour leur survie. Le NaCl affecterait la croissance et
les paramètres de l'impédance par les changements négatifs dans l'activité enzymatique
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Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
(Roxas et al., 2000), dans la synthèse protéique (Mattioni et al., 1997; Ashraf et al., 1999;
Simon-Sarkadi et al., 2002) ou dans la perméabilité cellulaire (Tang et al., 1999).
Pour un ensemble d’espèces on constate souvent que les plantes qui peuvent tolérer les
environnements modérément salins montrent une plus grande capacité d’exclure l’ion Na+
par la partie aérienne ou au moins les limbes des feuilles elles maintiennent concurremment
des niveaux élèves
de k+ (ZHU et al., 2001).
La plante peut rétablir l’équilibre
homéostatique dans le nouvel environnement stressant, l’homéostasie se définit comme la
capacité d’autorégulation d’un organisme pour maintenir un état d’équilibre dynamique
constant entre les conditions extérieurs et les différentes composantes de son milieu interne,
suite à cette adaptation, la croissance peut reprendre et se trouve probablement réduite
relativement aux conditions antérieures moins stressantes (Yeo, 1983 et Zhu, 2001)
Berthomieu et al., 2003 ont montré chez Arabidopsis thaliana une troisième stratégie à
l’intermédiaire entre l’exclusion et l’inclusion : la recirculation. Le Na+ est absorbé et
parvient jusqu’aux parties aériennes mais il est aussitôt « re-pompé » et reconduit par les
vaisseaux du phloème vers les racines qui peuvent excréter les ions à l’extérieur.
II. 5. 3. 1. Synthèse des protéines :
Parmi les approches biochimiques visant à décrire, quantifier et analyser les mécanismes
de tolérance aux stress chez les plantes, les changements qualitatifs et quantitatifs des
protéines sont d’un avantage particulier pour l’amélioration des plantes, en plus de leur
utilisation comme marqueurs pour la sélection.
L’existence du NaCl dans le sol a toujours préoccupé les agro-biologistes à cause de
son action négative sur le rendement des plantes cultivées. Chez les plantes non tolérantes aux
sels, le NaCl, en particulier, facilite l’accumulation d’éléments minéraux dans la plante,
diminue la teneur en eau de celle-ci et par conséquent baisse l’hydratation des protéines,
29
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
augmente la viscosité et diminue l’activité enzymatique (Slayter, 1967). Selon Oknina (1953)
le NaCl provoque la destruction du contenu cellulaire.
L’une des voies protéiques par lesquelles la plante répond au stress, est la production de
protéines spécifiques, qui peuvent être impliquées dans l’esquive au stress, dans la réparation
des dommages, ou dans la protection des mécanismes cellulaires ; les protéines de cette
dernière catégorie comprennent les protéines LEA (late embryogeny abundant)qui
s’accumulent pendant la maturation des graines et dont certaines peuvent également être
induites dans les tissus végétatifs lors d’un stress hydrique. Ces protéines semblent jouer un
rôle de protection contre les stress osmotiques, et il a pu être démontré que certaines
pouvaient protéger des systèmes enzymatiques. Cependant, pour la plupart, leur mode
d’action est encore peu connu. (Virginie, 2008).
La teneur en protéines est plus prononcée chez les écotypes tolérants que chez les
écotypes sensibles des jeunes plantes de différentes espèces du genre Medicago (Yahia et al.,
2003).
Singh et al., 1985 ont étudié l’expression génique induite par le sel dans des cultures de
cellules en suspension et dans des systèmes racinaires intacts, les racines étant les premiers
organes confrontés aux augmentations de salinité. Il a été observé que des concentrations
importantes de plusieurs polypeptides s’accumulent dans des cultures de cellules de tabac
soumises à de fortes concentrations de NaCl et de polyéthylène glycol (PEG). Un polypeptide
de 26 KDa en particulier est induit à la fois par le NaCl et le PEG. Ce polypeptide a été appelé
osmotine, en raison de son apparition dans des conditions de faible potentiel hydrique, ou de
chocs osmotiques provoqués par toute une série de facteurs.
Une protéine kinase (BGH009N22) dont les homologues du riz ou du blé sont
différentiellement régulés par l'ABA (Anderberg et Walker-Simmons, 1992 ; Kobayashi, Y. et
al., 2004) cité par (Grimlet, 2004) , voit son niveau d'expression augmenter au cours de la
30
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
maturation de l’espèce Bergeron. Il est extrêmement surprenant, que l'expression de ce gène
soit inhibée chez Moniqui au stade mûr. Cependant, chez le riz, aucun membre de cette
famille multigénique n'est contrôlé uniquement par l'ABA. Le niveau d'expression d'un autre
isogène (PA269TC1) de cette protéine kinase déposé aussi sur les lames de microarray,
augmente jusqu'au stade mi-mûr et chute ensuite. Il est sous-exprimé chez Moniqui au stade
mi-mûr et surexprimé dans cette même variété au stade mûr par rapport à Bergeron, ce qui
pourrait signifier qu'il est probablement constitutif dans cette variété entre ces deux stades.
Les observations sur blé et riz suggèrent que l'expression de ces protéines kinases pourrait être
liée au stress hydrique (Grimlet, 2004).
Les teneurs en amidon, protéines et huile sont des critères majeurs de qualité. Une
variation forte est enregistrée sous l’effet du climat interannuel ou géographique. Par
exemple, dans les conditions chaudes et sèches de l’année 2003, François et al., 2003 ont
enregistré une teneur supérieure en protéines chez le blé et une diminution de la teneur en
huile chez le tournesol. Chez cette espèce, 41% des échantillons ont eu des teneurs en huile
qui n’ont pas satisfait la norme de commercialisation. Ces résultats sont une conséquence de
la relation négative rendement - teneur en protéines enregistrée à différents niveaux
d'investigation (Triboi et al., 2002, 2003).
Zid et al., 1991 ont conclu que Le sel induit des modifications qualitatives et
quantitatives dans la synthèse des protéines, détectables par électrophorèse sur gel de
polyacrylamide. L’application de cette technique à deux variétés d’orge permet de mettre en
évidence une différence de comportement entre la variété sensible au sel (Prato) et la variété
résistante (California Mariout). Cette différence se manifeste seulement au niveau des feuilles.
Dans ces organes, le sel induit la synthèse de cinq nouvelles protéines : trois d’entre elles sont
spécifiques de la variété sensible et les deux autres communes aux deux variétés. Au niveau
des racines, six nouvelles protéines sont synthétisées par les deux variétés (Ramagopal, 1987)
31
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
Tableau 1. Les changements des protéines solubles vis-à-vis de la salinité chez différentes espèces.
Espèces
réponses au salinité
Références
Vicia faba
diminue
Gadallah (1999)
Amaranthus tricolor
diminue
Wang and Nil (2000)
Bruguiera parviflora
diminue
Parida et al., (2002)
Pancratium maritimum
Khedr et al., (2003)
augmente à basse salinité; diminue à une forte salinité
Arabidopsis thaliana
Fragaria × ananassa cv. Camarosa
augmente
augmente
Quintero et al., (1996)
El-Baz et al., (2003)
II .5.3.2. Synthèse des enzymes :
De nombreux travaux montrent que des enzymes telles que des superoxide dismutases
(SOD), des ascorbate peroxydases (APX), des catalases (CAT), des glutathion-S-transférases
(GST) et des glutathion peroxydases (GPX) s’accumulent pendant le stress hydrique. La
capacité du système antioxydant est déterminante pour maintenir l’intégrité du système
photosynthétique lors d’une contrainte hydrique (Reddy et al., 2004).
Les travaux menés par Botella et al., (1994), travaillant sur la caractérisation in situ des
transcrits de peroxydases chez la tomate en présence d’une faible concentration de Na Cl ( 50
mM), ont montré que cette dose induit l’accumulation des peroxydases.
Une étude concernant l’activité de la peroxydase dans le milieu de culture des cellules de
tomate, a montré que le milieu dans lequel les cellules sont adaptées à la croissance en
présence de 15% de NaCl présente, une activité peroxydase plus élevée que le milieu dans
lequel les cellules ne se sont pas adaptées à la croissance en présence de NaCl. Une
augmentation de la teneur en protéine a été également observée dans le milieu des cellules
32
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
adaptées comparé au milieu des cellules non adaptées. Apparemment, les valeurs élevées de
l’activité peroxydase dans le milieu des cellules adaptées au sel, reflètent les changements des
propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, qui à son tour peut être associée au processus
d’adaptation (Sancho et al., 1996).
Dans le but d’étudier le système de défense antioxydant, les changements induits par
le stress salin sur les enzymes antioxydantes sont examinés dans les feuilles de mûrier (Morus
sp.) chez une variété tolérante au sel, « Pei ». L’activité de l’enzyme peroxydase guaïacolspécifique augmente remarquablement avec l’augmentation du NaCl à 150 mM. De plus, les
activités de la superoxyde dismutase, l’ascorbate peroxydase et la glutathione réductase
augmentent légèrement à 150 mM de NaCl. Par contre, l’activité catalase n’est pas corrélée
avec le contenu du peroxyde d’hydrogène lors d’une augmentation de sel. Les résultats
suggèrent que sous des concentrations élevées de sel, l’activité peroxydase primaire,
accentuée, semble jouer un rôle actif dans le nettoyage des types d’oxygène réactif chez cette
variété (Harinasut et al., 2003).
Un autre facteur du stress, les basses températures font que certaines enzymes sont
spécifiquement inactivées par le froid. C’est le cas des enzymes multimériques, pour
lesquelles les interactions hydrophobes entre monomères sont affaiblies aux basses
températures (Mazliak, 1981).
L’effet de la température peut aussi induire des changements réversibles dans la
conformation de l’enzyme sans entraîner la dissociation de la protéine en sous unités, comme
dans le cas de la RuBP carboxylase. La stabilité de cette enzyme à basse température semble
d’ailleurs déterminée par les liaisons –S-S-. En effet, la RuBP carboxylase isolée des plantes
endurcies au froid, présente généralement une grande quantité de groupe –SH exposés à la
surface de la molécule, et ses propriétés cinétiques suggèrent une meilleure adaptation au
fonctionnement à des températures inférieures à I0°C (Challet et al., 1977).
33
Chapitre II/ revu bibliographique
le stress chez les plantes
34
Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
Chapitre III : Les marqueurs isoenzymatiques
III. 1. Définition :
Le terme marqueur génétique est un synonyme de locus marqueur. Un locus marqueur
est un locus polymorphe qui renseigne :
-sur le génotype de l’individu qui le porte ; c’est à ce titre que les marqueurs sont utilisés
en génétique des populations.
-sur le génotype d’un (de) locus voisin(s) ; les applications vont ici du clonage
positionnel à la sélection assistée par des marqueurs
Les plus courants de ces marqueurs génétiques sont, selon une terminologie consacrée,
les marqueurs morphologiques, les marqueurs moléculaires (au niveau de l’ADN), et les
marqueurs biochimiques (isozyme, protéine).
Avec les marqueurs biochimiques, il est aujourd‘hui possible de cartographier
conjointement dans une même descendance de très nombreux locus, jusqu'à en «saturer» le
génome, c’est-à-dire jusqu’ à ce que tout point du génome soit génétiquement lié à au moins
un marqueur. Dans de telles cartes, il y a donc autant de groupes de liaisons que de
chromosomes.
En sélection classique, chaque lignée est examinée à travers son aspect phénotypique, soit
la résultante de l’expression de ses gènes dans un milieu donné. Ces observations se faisant
dans des conditions d’interaction entre le génotype et le milieu, il est important pour le
sélectionneur de connaître l’aspect purement génétique du caractère étudié, indépendamment
de son expression. A cet effet, de nombreux marqueurs biochimiques ou moléculaires ont été
développés pour le blé depuis une vingtaine d’années. Cependant, un saut technologique est
nécessaire pour valoriser les acquis sur les connaissances individuelles des gènes lors de leur
intégration dans les schémas de sélection (Moulai et al., 2009).
36
Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
Pare ailleurs, la sélection assistée par marqueurs est d’une part utilisée pour repérer les
caractères ergonomiquement intéressants comme le rendement ou la résistance aux
contraintes environnementales. Actuellement, les marqueurs les plus utilises sont les
microsatellites (répétition de courtes séquences d'ADN mises en évidence par PCR).
L'utilisation des marqueurs moléculaires, aujourd'hui largement répandue, intervient dans
divers programmes axes sur l'amélioration de la résistance aux stress biotiques et abiotiques.
Et d’autre part, cette sélection correspond à toute forme possible d’utilisation des marqueurs
dans le processus d’amélioration. Les principales applications pour le sélectionneur sont :
l’identification du matériel, la gestion des ressources génétiques, la conduite des
rétrocroisements, la construction de génotypes, la prédiction de l’hétérosis, la prédiction des
valeurs génotypiques et la conduite de la sélection récurrente. L’intérêt des marqueurs pour
l’identification du matériel est évident (Galias, 1994).
L’analyse des systèmes enzymatiques par l’électrophorèse qui fournit des marqueurs iso
enzymatiques, reste toujours fiable pour la sélection. Cette méthode est une technique
permettant de mesurer la vitesse et le sens de déplacement des molécules organiques en
réponse à un champ électrique. La vitesse et la direction du déplacement des protéines sur un
gel d’amidon ou d’agar ou d’acrylamide dépendront de la charge superficielle nette de la
protéine, de sa taille et de sa forme.
L’électrophorèse est particulièrement utile pour l’étude des populations d’une même
espèce ou d’espèces étroitement apparentées, et les caractères taxonomiques qui en résultent
(répartition des bandes) sont généralement soumis à une analyse phénétique ( Grawford and
julian 1967. ; Grawford 1979 – 1983). La sélection et les programmes d’amélioration sont
basés sur la recherche des marqueurs génétiques. L’électrophorèse des isoenzymes est un outil
pour ce but. Les ressources génétiques estimées par les techniques moléculaires doivent êtres
considérées dans les stratégies de protection des plantes. (Hannachi et al., 1998).
37
Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
III. 2. Les isoenzymes :
Dès 1950 le problème des isoenzymes a été appréhendé au cours de l’étude de la lactase
déshydrogénase partiellement purifiée révèlent la présence de 5 constituants différents
possédant cette activité enzymatique. Il s’agit de protéines très voisines par leurs propriétés et
qui ne sont séparées que grâce au pouvoir de résolution élevé des méthodes
électrophorétiques. L’explication a été fournie par un nouvel examen de ces 5 protéines à
l’état dénaturé. Par électrophorèse du mélange des 5 enzymes en présence d’urée (maintenant
avec le SDS) on ne trouve plus que 2 constituants. Les différentes isœnzymes semblent donc
différer les unes des autres par des propriétés de détail, notamment par leurs paramètres
cinétiques et leurs spécificités. La synthèse des différentes sous-unités d’un tissu à l’autre
résulte d’adaptations physiologiques. L’enzyme est apparemment optimisée dans chaque cas
pour répondre aux exigences. Les isoenzymes s’observent sous forme de bandes multiples
après une séparation qui est le plus souvent une électrophorèse. (Jean, 1993).
L’analyse par isozyme est relativement aisée, bon marché, rapide et ne nécessite pas un
équipement de laboratoire sophistiqué mais l’inconvénient majeur consiste dans le nombre
réduit de variante électrophorétiques (Oléo et al., 1993).
C’est chez le maïs (Zea mayas .L) peut être plus que chez aucune autre plante, qu’il y eut
des études sur les isoenzymes. Elles sont passées des études purement biochimiques, étude
des propriétés enzymatiques, aux études de sélection concernant le contrôle et le maintien de
la qualité durant la production de graines. De plus, la plupart des gènes de structure codant
pour les isoenzymes du maïs étudiées, ont été localisés sur des sites chromosomiques
spécifiques ( Godman et Stuber, 1983 cité par Fyad Lameche , 1999).
Les marqueurs isoenzymatiques sont largement utilisés dans la recherche biologique, ne
causent aucun changement délétère dans le phénotype par récessivité ou pléiotropie et
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Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
s’expriment généralement de façon codominante relativement simple en stocks de plusieurs
marqueurs (Tansley et Rick, 1980).
Puisque l'activité catalytique des enzymes peut être l’action de plusieurs protéines, le
terme "isoenzymes" a été adopté pour les distinguer par les différences dans leur activité
(Subden et al., 1987).
III.2.1 Les estérases:
Les estérases mises en évidence par cette réaction de révélation catalysent la réaction
suivante :
Aryl-acetate + H2o
Aryl alcool+acetate
Les estérases cathodiques et les estérases anodiques constituent deux grands groupes. Ce
sont des enzymes très variables en fonction des espèces et des populations, et beaucoup plus
en fonction des stades de développement (FYAD-LAMECHE.F.Z., 1999).
En effet, il existe chez le Maïs des estérases que l’on trouve à tous les stades de
développement et d’autres qui sont spécifiques de certains stades de développement. Le
nombre d’allèles identifiés à chaque locus estérase varie de 2 à 9. (Godman et Stuber, 1983)
cité par (Fyad-Lameche.., 1999).
L’activité des estérases qui est liée au stade physiologique et métabolique de la cellule,
peut être affectée par les facteurs environnementaux tels que la température de culture, le
stress hydrique et les agents polluants. (Bilkova et al, 1999).
Les estérases ont été les premiers isozymes dont le déterminisme génétique a été analysé
(Desborough et Peloquin ,1967). D’autre systèmes se sont peu à peu développés aussi bien en
utilisant les gels de polyacrylamide que les gels d’amidon (Staub et Kuhns, 1979 ;
Desborough, 1983). A ce jour, environ une cinquantaine de systèmes sont connus de façon
plus ou moins précise au niveau de la technique de séparation ou de leur déterminisme
génétique.
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Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
L’analyse de différents profils d’estérases chez l’espèce Hydysarum coronarium
(légumineuse) permet de révéler l’existence de 13 bandes isoenzymatique (Trifi N et
al.,1989).
Reyes et al., ( 1998) avaient détecté un total de 14 bandes réparties en 5 zones d’activité
enzymatique en analysant les feuilles de 15 clones de l’écotype Musa( variété de bananier)
provenant de culture «in vitro», ce qui indiquerait que ces bandes pourraient être activées au
cours d’autres phases de développement de plante.
III.2.2. Les peroxydases :
III.2.2.1. Définition :
Les peroxydases des plantes, appelées aussi peroxydases de classe III, catalysent
l’oxydation de plusieurs substrats dont les phénols en présence du peroxyde d’hydrogène
(H2O2). (Baaziz, 2006). Elles jouent des rôles importants dans la croissance, le
développement et le système de défense des plantes contre les stress biotique et abiotique
(Gaspar et al., 1985). Elles sont codées par des familles multigéniques, regroupant par
exemple 73 gènes chez Arabidipsis thaliana ou 138 chez le riz (Oryza sativa japonica). Il a
été montré que la plupart des gênes sont exprimés chez Arabidopsis, certains
constitutivement, d’autres en réponse à divers stimuli. Bien que leur fonction soient connues
en général, il est très difficile d’assigner un rôle précis a chaque isoforme (Penel et al., 2004).
Les peroxydases sont comme la catalase des protéines héméniques à haut spin. Elles sont
particulièrement répandues chez les plantes. Il est très facile de mettre en évidence celle du
radis qui broyé dans un peu d’eau oxygénée diluée, constitue un mélange pouvant changer
rapidement la couleur des produits organiques variés par exemple la benzidine ou le gaïacol.
Les peroxydases sont en général peu spécifiques des produits oxydés, leur
fonctionnement rappelle celui de la catalase en passant par un composé I, obtenu après perte
de 2 électrons. (Jean, 1993).
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Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
Ces oxydoréductases très répandues chez les plantes, sont souvent utilisées comme
marqueurs de la tolérance à de nombreux stress biotiques et abiotiques. (Aouad et al., 1997).
II.2.2.2. Historique :
En 1810, Planche décrit l’apparition d’une couleur bleue, sur des morceaux de racine de
raifort incubé dans de la teinture de gaïac. En 1818, Thenard fut le premier à décrire les
propriétés d’eau oxygénée (H2O2) et Schönbein, en 1855, décrit l’oxydation de certains
composés organiques, catalysée par des extraits issus de plantes ou d’animaux, en présence de
solutions diluées de peroxyde d’hydrogène (H2O2). Le nom de peroxydase fut donné en 1898
par Linossier, a un extrait de pus humain présentant une telle activité (Saunder et al., 1964).
Les fameuses peroxydases de raifort furent l’outil de base des premiers travaux
moléculaires sur les peroxydases végétales (Theorell, 1942) et c’est en 1976, grâce aux
travaux de Braithwaite, d’une part et de Welinder, d’autre part, qu’on a pu avoir une première
image cristalline d’une de ces enzymes, ainsi que la première séquence protéique. Il a fallu
attendre ensuite plus de 10 années pour voir publier la première séquences nucléotidique d’un
messager codant pour une peroxydase du tabac (Lagrimini et al., 1987). C’est principalement
sur la base de ces travaux, qu’aujourd’hui les données moléculaires concernant les
peroxydases végétales ont pu s’accumuler de manière plus que significative.
III.2.2.3. Structure chimique des peroxydases :
Les peroxydases sont des enzymes à hèmes constituant une très grande famille
multigénique, dans laquelle on distingue trois classes différentes (Passardi et al., 2005) : la
classe I strictement intracellulaire (EC 1.11.1.5.6/.11), la classe II excrétée par les
champignons (EC 1.11.1.13/.14), et la classe III constituée par les peroxydases végétales (EC
1.11.1.7).
Les peroxydases sont de petites glycoprotéines (40.000 à 50.000 daltons) combinées
avec une ferriporphyrine (figure. 5).
41
Chapitre III : revue bibliographique
Protoporpherine
marqueurs isoenzymatiques
Fe3+
Apoprotéine
Protohaematine IX
Glycosylation (RE)
Glycoprotéine
Peroxydase
Figure. 6 : Représentation schématique de la constitution des peroxydases végétales (Thierry,
2002).
III.2.2.4. Localisation et mobilité des peroxydases :
Le nombre croissant de peroxydases connues, ainsi que les investigations de plus en
plus poussées concernant leurs rôles physiologiques chez les plantes, obligent à déterminer de
manière plus précise leur localisation subcellulaire. Globalement, les peroxydases peuvent se
trouver au niveau des parois cellulaires et dans les vacuoles. Les peroxydases pariétales sont
connues pour être impliquées dans les processus de lignification (Thierry, 2002).
III.2.2.5. Rôle physiologique :
Le nombre possible de substrats pour les peroxydases est énorme, et il peut être admis
que chaque réaction peroxydasique ayant lieu joue un rôle spécifique dans le maintien ou
l’adaptation des structures et des fonctions des cellules végétales dans leur environnement.
Les interactions des peroxydases dans les processus de croissance, de différenciation et de
développement, sont plutôt limitées et concernent plusieurs opérations, à savoir la régulation
de la teneur en auxine, le contrôle possible de la dernière étape de la biosynthèse de
42
Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
l’éthylène, la participation dans l’établissement du potentiel redox de la membrane plasmique,
la formation de la H2O2 et la construction, la rigidification et éventuellement la lignification et
la subérisation des parois cellulaires.
Ce rôle intervient à partir de la régulation du taux circulant de l’acide indole-3-acétique
(AIA) par le biais de son catabolisme oxydatif ; mais les peroxydases interviennent aussi dans
la perte de la plasticité des parois cellulaires, en formant des ponts phénoliques entre les
polymères de la paroi (Biggs, 1987). Ce dernier processus conduit à une rigidification
irréversible de la paroi qui empêche une expansion cellulaire par l’augmentation de la
pression de turgescence. Ainsi les peroxydases réguleraient le taux endogène d’un des
principaux facteurs de croissance, l’AIA, et les derniers stades de la croissance cellulaire.
Les peroxydases ont longtemps été considérées comme des enzymes impliquées dans
des réactions réduisant la croissance des cellules végétales, grâce à la destruction de l’auxine
et la formation de liaisons covalentes au sein des parois (Penel et al., 1992).
Depuis les travaux pionnier de Ven overkeek dans les années 30 sur le nanisme végétal,
un grand nombre d’études ont été réalisées dans le but de mettre en relation les travaux
endogènes de l’activité peroxydasique avec la croissance cellulaire (Gasper et al., 1982). Le
nanisme végétale, est généralement associé a une augmentation de l’activité peroxydasique
dans la fraction pariétale (Evans 1990, Jupe et Scott 1989). La croissance normale chez des
plantes naines peut être restaurée par des applications exogènes de gibbérelline : la
restauration de la croissance est concomitante avec une inhibition de la sécrétion des
peroxydases ( Fry, 1980). Des résultats similaires proviennent d’applications exogènes d’AIA
sur des tissus végétaux. Ainsi la stimulation de la croissance par l’AIA est associée sur une
courte période à une rapide diminution du niveau des peroxydases extracellulaires (Jones,
1986 Ros Barcelo et al., 1989) bien que par la suite on observe une stimulation de la sécrétion
Ca 2+ dépendante des peroxydases (Gaspar et al., 1983).
43
Chapitre III : revue bibliographique
marqueurs isoenzymatiques
Pour l’instant, aucun résultat ne permet de dire clairement si les peroxydases sont à
l’origine ou la conséquence des processus biochimiques qui conduisent à l’arrêt de la
croissance. Dans le premier cas, les peroxydases auraient une influence sur le potentiel de
croissance des cellules, dans le deuxième cas, elles interviendraient dans la perte irréversible
de ce potentiel (Thierry, 2002).
44
Expérimentation
Matériel et méthodes
Chapitre IV : Matériel et méthodes
IV.1. Matériel végétal :
Le choix des variétés modèles pour l’étude d’expression des PERs et ESTs a été guidé
par une caractérisation physiologique de la tolérance et la sensibilité à la salinité de quatre
écotypes de Medicago déjà réalisé en laboratoire. Le matériel végétal utilisé dans ce travail
comprend deux écotypes tolérants et deux sensibles appartenant à des espèces annuelles de
Medicago Ainsi que des medics sauvages récoltés sur le campus de l’EGMO (tableau 2).
Espèces
écotypes
Comportement physiologique
M.aculeata
Acu 80
sensible
Acu 209
tolérant
Tru 40
sensible
Tru 32
tolérant
Ecotype sauvage
inconnu ( ?)
M.truncatula
Medics
Tableau 2 : Les différents écotypes étudiés avec leur comportement aux stress salins (Source
ITGC., Fyad F.Z., 1999 ; Yahia N., 1998 ; Amouri A., 2005).
IV. 2. Protocole expérimental
Les essais ont été conduits en laboratoire sur une durée de 9 jours. Pour chaque écotype,
les grains ont été désinfectés pendant quelques minutes dans une solution de CaCl2
(hypochlorite de calcium) 6%, puis rincés à l’eau distillée et enfin scarifier. Durant les 6
premiers jours les grains ont été placés à raison de 30 grains dans des boites de Pétri sur du
papier filtre imbibé avec, soit de l’eau distillée (témoin T0), soit des solutions salines
contenant respectivement 86.6mMol/l (T1), 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3) de
46
Expérimentation
Matériel et méthodes
chlorure de sodium ( NaCl). Dans les trois jours de germination restants, les jeunes plantules
ont été transférées dans la chambre de culture dans d’autres boites de Pétri arrosées avec une
solution nutritive Knop en plus des quatre concentrations de NaCl, sous une intensité
d’éclairage de 6762 lx et une photopériode de 8 heures.
Ces traitements peuvent être résumés comme suit :
Les Concentrations des 6 premiers jours
Les Concentrations des 3 derniers jours
T0 : 100 ml eau distillée + 0g de NaCl
T0 : 100 ml du Knop + 0g de NaCl
T1 : 100 ml eau distillée+ 86.6mMol/l de NaCl
T1 : 100 ml du Knop + 86.6mMol/l de NaCl
T2 : 100 ml eau distillée+102.9mMol/l de NaCl
T2 : 100 ml du Knop + 102.9mMol/l de NaCl
T3 : 100 ml eau distillée + 137.2 mMol/l de NaCl
T3 : 100 ml du Knop + 137.2 mMol/l de NaCl
IV.3. Séparation des isoenzymes (estérases et peroxydases) par
électrophorèses de gel de polyacrylamide (PAGE) :
Pour mettre en évidence d’éventuelles modifications biochimiques induites par le stress
salin Une analyse qualitative des isoenzymes a été réalisée par PAGE.
Le principe de cette méthode d’analyse, consiste à séparer les deux isoenzymes selon leur
charges ionique et à comparer les profils électrophorétiques des individus traités par le stress
salin (T1, T2 et T3) avec les témoins (T0).
IV. 3. 1. Extraction des estérases et peroxydase :
L’extraction des ( ESTs) et ( PERs) est menée à froid dans un mortier à partir des jeunes
plantes issues de la germination pendant 09 jours pour les lots traités ( T1 , T2 , T3 ) , et le 1er
, 3eme , 5eme , 7eme , et le 9eme jour pour les lots témoins (To), afin de prélever 04 plantules (
0.20 g ) pour chaque extraction . Les jeunes plantules sont broyées dans un tampon
47
Expérimentation
Matériel et méthodes
d’extraction tris –KCL 1mM (pH = 7), Puis elles sont centrifugées pendant 30 minutes à
13 000 tr/min (a+4°C) ; le surnagent est récupéré et conservé dans un cryoconservateur
contenant de l’azote liquide pour être soumis ensuite à l’électrophorèse, pour ce faire, huit
extraits sont alors déposés par plaque et la quantité d’extrait enzymatique déposée par puits de
trente microlitre ( 30 Ml).
Pour les Medics sauvages l’extraction des peroxydases se fait quotidiennement pour les
lots témoins et chaque lot traité durant neuf jours.
IV. 3. 2. Préparation du gel des estérases et peroxydases:
Pour les estérases le support électrophorétiques est constitué d’un gel discontinu (4% à
8%) de polyacrylamide et pour les peroxydases d’un gel gradient contenant (4% à 10%) de
polyacrylamide dans un tampon tris-borate EDTA à pH= 8.3 avec du NP10, du TEMED et
persulfate d’ammonium.
IV. 3. 3. Condition de migration des estérases et des peroxydases :
Le tampon cuve pour les estérases est le même que celui utilisé dans la préparation du gel
à savoir tris-Borate EDTA pH= 8.3 dilué 10 fois ; mais pour les peroxydases, le tampon cuve
est le tris-glycine 0.0685 M (ph 8.6) dilué 10 fois.
La migration se déroule à 4°C pendant 7 h sous une intensité de 25 mA la première heure et
30 mA pour le reste du temps et sous une tension permanente de 150 V.
IV. 3. 4. Révélation des estérases :
Après démoulage du gel, la révélation des activités estérases est effectuée dans un tampon
phosphate de sodium (NaH2 PO4) 0,1 M, pH = 6,2, additionné du substrat (α- Naphtylacetate)
et du révélateur (Fast Blue RR Salt). Suite à l’apparition des bandes, le gel est fixé dans une
solution d’acide acétique à 7%.
IV. 3. 5. Révélation des peroxydases :
48
Expérimentation
Matériel et méthodes
La révélation des peroxydases est réalisée à l’aide d’une solution de substrat de
l’odianozidine préparée dans le tampon acétate de sodium 0.2M (pH- 4.6). Pour déclencher la
réaction 0.2 ml de H2O2 à 30% est ajoutée, dans l’obscurité et à 25°C; suite à l’apparition des
bandes, le gel est fixé dans une solution d’acide acétique à 7%.
49
Expérimentation
résultats et interprétation
Chapitre V : Résultats et interprétation
Afin d’évaluer la tolérance et la sensibilité à la salinité d’une population de genre
Medicago, une analyse par électrophorèse d’isoenzymes est entreprise. Cette étude permettrait
de
mettre en évidence un marqueur génétique utile dans l’évaluation des ressources
génétiques et l’amélioration des plantes vis-à-vis de stress. En effet, la réponse des plantes
aux stress environnementaux est souvent liée à des changements biochimiques. Les travaux de
Fyad Lamech et al., 2008, sur la tolérance et la sensibilité au stress salin, chez certains
écotypes de Medicago, ont montré que les écotypes Tru 32 et Acu 209 sont les plus tolérants
par contre Tru 40 et Acu 80 sont les plus sensibles. Sur cette base, ces quatre écotypes ont été
retenus pour l’analyse de deux systèmes enzymatiques dont le premier est une hydrolase
(estérase) et le deuxième une oxydoréductase (peroxydase). Les changements des systèmes
enzymatiques chez les écotypes tolérants et sensibles ont été évalués par la présence ou
l’absence de bande identifiée par leur Rf. Chaque écotype possède son propre profil et des
bandes qui lui sont spécifiques.
V.1. Résultats relatifs aux estérases
Les profils d’estérases sont suivis durant 9 jours de germination chez les quatre écotypes
traités ainsi que leurs témoins. De nombreuses bandes apparaissent
avec une mobilité
différente d'un écotype à l’autre. L’analyse des différents profils, au niveau des différents
écotypes, a permis de révéler l’existence d’une variabilité isoenzymatique intrapopulation et
interpopulation.
Au niveau de l’espèce Truncatula, les résultats montrent chez l’écotype tolérant Tru 32,
11 bandes isoenzymatiques, réparties en 3 zones, une zone à migration lente (ZI), une autre à
migration rapide (ZIII), et enfin, une intermédiaire (ZII). Alors que, chez l’écotype sensible
51
Expérimentation
résultats et interprétation
Tru 40, seulement 9 bandes sont affichées, représentant chacune une estérase, réparties en
2 zones. (Figures. 6a et 6b).
Par contre au niveau de l’espèce Aculeata, les écotypes tolérants Acu 209 et Acu 80 sensible
leurs profils exhibent 5 à 6 bandes d’estérases réparties en 2 zones. (Figures 8 et 9).
D’autre part, les résultats montrent que l’expression des estérases en ce qui concerne le
témoin, est de deux types : un type constitutif qui se révèle dans tous les stades de
développement chez les individus traités ou témoins, et un type spécifique à chaque stade de
croissance. Cette expression différentielle diffère d’un écotype à un autre que ce soit chez les
écotypes tolérants ou sensibles.
Au niveau de l’écotype tolérant (Tru 32), au premier jour de croissance le profil des
estérases exhibe quatre bandes (Est-3, Est-7, Est-8 et Est-9) avec des Rf compris entre 0.34, et
0.78, alors que, pour le troisième jour de développement, nous constatons une différence dans
l’activité estérasique par rapport au premier jour. En effet, d’après la figure (6 (a) et 7 (a) ) et
leur phénotype électrophoretique du Rf, il y apparait cinq bandes Est-1, Est-2, Est-5, Est-6 et
Est-10 avec des Rf de 0.12, 0.14, 0.43, 0.50, et 0.81 avec l’absence d’Est-3 et Est-7. Au 5eme
jour, on note une diminution progressive de cette activité, de sorte que les bandes estérasiques
précédentes disparaissent (Est-8, Est-9, Est-10). Au bout du 7eme jour de croissance le profil
présente la révélation de deux nouvelles bandes moins intenses (Est-4 et Est-11) avec des Rf
de 0.37 et de 0.89 respectivement. Après neuf jours de croissance, on observe une
augmentation de l’activité esterasique avec la réapparition de certaines bandes disparues au
niveau des stades précédent (Est-3, Est-6, Est-7, Est-8, Est-9, et Est-10). Donc, il semble bien
que l’expression de certaines bandes et leurs disparition est en relation avec chaque stade de
développement de la plante, alors que d’autres s’expriment tout le temps durant toute la phase
de croissance du végétale (figure 6a).
52
Expérimentation
résultats et interprétation
Quant à l’écotype sensible Tru40, le premier jour de germination présente deux bandes
Est-7 et Est-8 avec des Rf de 0.62 et de 0.68. Cette activité augmente avec la croissance de la
plante. Dans le troisième jour, on note l’existence de six bandes Est-1, Est-4, Est-5, Est-7, Est-8
et Est-9 avec des Rf compris entre 0.15 et 0.75. Après le cinquième jour cette activité diminue
et présente quatre bandes seulement (Est-3, Est-6, Est-7 et Est-8) avec des Rf de 0.35, 0.51,
0.62 et 0.75. La situation au septième jour est identique à celle du premier jour, par contre,
au niveau du neuvième jour de croissance l’activité estérasique augmente. En plus des bandes
(constitutives) (Est-6, Est-7, Est-8), une estérase spécifique à ce stade est nouvellement
exprimées (Est-2) ( Figure 6 (b) et 7 ( b) ).
Lorsque la plante est soumise au stress, l’expression des estérases est différente d’un
traitement à un autre et d’un écotype à un autre. Pour une concentration de sel de 86.6
mMol/l (T1) le profil de l’écotype Tru32 correspond au profil du cinquième jour du témoin,
donc il s’est révélé un ralentissement de 4 jours, alors que, pour les traitements T2 et T3 les
profiles ressemblent au profil du neuvième jour (Figure 6 (a) et 7(a)) donc l’activation des
estérases ne s’est pas modifiée pour le type tolérant à ce niveau de concentration de sel.
En ce qui concerne l’écotype Tru 40, quelque soit la concentration du sel, les profils des
estérases sont identiques au profil du 1er jour de croissance du contrôle ; en conséquence il est
apparu un ralentissement de 8 jours avec la révélation de la bande Est-9 (bande révélée au
3eme jour seulement) (Figure 6 (b) et 7(b)).
53
Expérimentation
1j
3j
5j
résultats et interprétation
7j
9j
T1
T2
1j
T3
3j
5j
7j
9j
T1
Est-1 (0.12)
Est-2 (0.14)
Est-1( 0.15)
Est-2 (0.31)
Est-3( 0.34)
Est-5(0.43)
Est-3 (0.35)
Est-4 (0.37)
Est-4( 0.41)
Est-6 (0.50)
Est-5 (0.48)
Est-6 (0.51)
Est-7 (0.56)
Est-8 (0.67)
Est-7 (0.62)
Est-9 (0.78)
Est-8 (0.68)
Est-9 (0.75)
Est-10(0.81)
Est-11 (0.89)
a)
b)
Figure 6: zymogramme et Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Tru 32 (a)
et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour, 3jours,
5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités ( T1, T2, T3)
ZI
ZI
ZII
ZII
ZIII
1j 3j
5j
7j
9j
T1 T2 T3
+
a)
b)
Figure 7: phénotypes électrophoretiques du Rfs des différentes Estérases, chez
l’écotype Tru 32 et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance :
1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et le lot traité ( T1, T2, T3).
54
T2
T3
Expérimentation
résultats et interprétation
En ce qui concerne l’espèce Aculeata, les résultats montrent aussi une certaine
variabilité dans l’expression des estérases chez le témoin, ceci pour les différents stades de
développement de la plante, et chez les plantes traitées à différentes concentration de sel.
Cette variabilité enzymatique diffère aussi chez les deux écotypes de cette espèce.
Pour l’écotype Acu 209, cinq bandes Est-1, Est-2, Est-3, Est-4 et Est-5 avec des Rf de 0.12,
0.18, 0.25, 0.32 et de 0.50, sont observées dans la zone I (figure 8 (a) et 9 (a) ), correspondant
à une vitesse de migration lente chez la variété tolérante . Le profil du 1er jour présente trois
bandes d’activité Est-3, Est-4 et Est-5 avec des Rf de 0.25, 0.32 et de 0.50. Cette activité
augmente dans le deuxième profil qui correspond aux plantules âgées de trois jours par la
révélation d’Est-2 avec un Rf de 0.18. Le 5eme et le 9eme jour expose les mêmes bandes avec la
révélation d’une nouvelle bande nommée Est-1et la disparition d’Est-2 et Est-3, tandis que le
7eme jour de germination montre deux bandes seulement Est-4 et Est-5 qui sont révélées
régulièrement durant tous les jours de germination, avec une nette intensité (figure 8 (a) et 9
(a) ).
Sous les conditions stressées, le lot (T1) correspondant à la concentration 86.6mMol/l
présente deux zones d’activité des estérases Est-5 et Est-6 et ce lot est semblable au 7eme jour
du lot témoin, par conséquent, il est apparu un ralentissement de deux jours, par contre pour
(T2) et (T3) les lots sont identiques à ceux du 1er jour et donc le stress à provoqué un
ralentissement de 9 jours (figure 8 (a) et 9 (a) ).
Le profil des estérases chez l’écotype sensible Acu 80 présente un nombre plus élevé de
bandes que chez l’écotype tolérant Acu 209. En effet, 6 bandes estérasiques ont été révélées.
Le premier jour, ce dernier exhibe trois bandes Est-3, Est-4 et Est-6 avec des Rf 0.28, 0.34 et
0.56. Les deux bandes Est-4 et Est-6 persistent jusqu’au 5eme jour de germination, le troisième
jour est caractérisé par les deux bandes précédentes avec la révélation d’une nouvelle bande
(Est-2) de Rf 0.20. Pour le cinquième jour, on note la disparition d’Est-2 et Est-3 et la
55
Expérimentation
résultats et interprétation
révélation d’Est-1 avec un de Rf 0.15. Les lots du 7eme et du 9eme jour présentent le même
nombre de bandes Est-5 avec un Rf de 0.40 nouvellement synthétisé et Est-6.
Dans les profils des plantules traitées par T1, T2 et T3, l’intensité des bandes est très forte, le
même nombre de bandes est présent dans le profil du lot témoins âgé de 1 J de germination et
par conséquent le sel a provoqué un retard de 9 jours (figure 8 (a) et 9 (a) ).
56
Expérimentation
1j
3j
5j
résultats et interprétation
7j
9j
T1
T2
T3
1j
Est-1 (0.12)
Est-1( 0.15)
Est-2 (0.18)
Est-2 (0.20)
Est-3 (0.25)
Est-3 (0.28)
3j
5j
7j
9j
T1
T2
Est-4( 0.34)
Est-4 (0.32)
Est-5 (0.40)
Est-5 (0.50)
Est-6 (0.56)
a)
b)
Figure 8: zymogramme et Rfs des différentes Estérases, chez l’écotype Acu 209
(a) et Acu 80 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour,
3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités ( T1, T2, T3).
-
ZI
ZI
ZII
ZII
1j 3j
5j 7j 9j
1j 3j 5j 7j
T1 T2 T3
9j
T1 T2 T3
+
a)
b)
Figure 9: phénotypes électrophoretiques du Rfs des différentes Estérases, chez
l’écotype Acu 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de
croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2,
57
T3
Expérimentation
résultats et interprétation
V.2. Résultats relatifs aux peroxydases (PER).
V.2.1. Changements des profils des peroxydases chez les deux espèces Truncatula,
Aculeata et une population sauvage (inconnue).
Les profils des peroxydases sont aussi suivis durant 9 jours de germination chez les
quatre variétés traitées et leurs témoins par des extractions alternées. Par contre chez le Medic
sauvage des extractions journalières sont effectuées pour tous les lots T0, T1, T2, T3.
L’analyse des différents profils des peroxydases permet de révéler l’existence de 15
bandes d’activité enzymatique. En absence de stress, cette activité des peroxydases diffère
dans le temps, c’est-à-dire chaque stade de développement de la plante présente des bandes
spécifiques. Certaines bandes apparaissent pendant les premiers jours de croissance pour
disparaître les jours suivants.
Chez l’espèce Truncatula, en absence de stress, l’écotype tolérant Tru 32, montre une bande
enzymatique (PER-3 de Rf 0.20) au niveau du 1er et du 5eme jour, puis celle-ci disparait au
niveau des autres jours. En outre la PER-1 (Rf 0.08) révélée le 2eme jour persiste jusqu’au 9eme
jour de germination. Au niveau du 7eme et 9eme jour, le même nombre de bandes ont été
observées PER-1 et PER-2 avec un Rf de 0.08 et 0.10 (Figure 10 (a), 11 (a) ).
Chez l’écotype sensible Tru 40, cinq bandes peroxydasiques ont été observées. Le lot du 1er
jour de germination exhibe une seule bande PER-3 avec un Rf de 0.26. Le 3eme, le 5eme et le
7eme jour révèle une seule bande aussi PER-1 ( Rf 0.08) migrant dans la zone (I). Ont trouve
toujours une disparition des bandes et une révélation des autres. En effet le lot du 9eme jour a
exhibé une nouvelle bande PER-2 avec un Rf de 0.15 et la disparition des bandes précédentes.
En conditions de stress pour une concentration de 86.6Mm/l (T1), l’effet du sel active la
synthèse des nouvelles bandes d’intensité moyenne migrant avec un Rf de 0.32 (PER-3) chez
l’écotype tolérant Tru 32, alors que chez l’écotype sensible Tru 40 elle est de Rf de 0.39
58
Expérimentation
résultats et interprétation
(PER-5). Pour des concentrations de 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3), le sel entraîne
une inhibition de synthèse de cette bande chez l’écotype tolérant, par contre l’écotype sensible
présente toujours cette bande pour qu’elle disparaisse sous le traitement (T3) avec la
révélation ou la synthèse d’une nouvelle bande PER-3 avec un Rf de 0.19. (Figure 10 (a), 11
(a) et 10 (b), 11 (b)).
59
Expérimentation
1j
3j
5j
7j
résultats et interprétation
9j
T1
T2
1j
T3
PER-1 (0.08)
3j
5j
7j
9j
T1
T2
PER -1 (0.08)
PER -2(0.10)
PER -2 (0.15)
PER -3 (0.19)
PER -3 (0.22)
PER -4(0.26)
PER -4 (0.32)
PER -5(0.39)
a)
b)
Figure 10: Zymogramme et Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype Tru
32 (a) et Tru 40 ( b) , pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour,
3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lot traités (T1, T2, T3).
-
ZI
ZI
ZII
ZII
1j 3j
5j 7j 9j
T1 T2 T3
1j 3j
5j 7j 9j
T1 T2 T3
+
a)
b)
Figure 11: phénotypes électrophorétiques du Rfs des différentes Estérases, chez
l’écotype Tru 32 (a) et Tru 40 (b), pour le lot témoin (différents stades de
croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3).
: Flèche indiquant une isoenzyme de stress (PER-4 et PER-3).
60
T3
Expérimentation
résultats et interprétation
Chez l’espèce Aculeata, en absence de stress, l’écotype tolérant Acu 209 montre différente
formes peroxydasiques, au niveau des plantules issues de post-germination pour les différents
jours (1er, 3eme, 5eme ,7eme et 9eme). Après une croissance de 1 jour, nous notons seulement la
présence d’une seule bande PER-3 (Rf 0.32). Après 3 jours de croissance, une bande (PER-1
avec un Rf de 0.07) est nouvellement synthétisée en plus de celle du premier jour. Le profil
reste inchangé le 5eme jour. Au bout de 7 jours de croissance, le profil révèle une bande (PER2 avec un Rf de 0.12 et la disparition des deux autres bandes. Enfin, après neuf jours de
croissance, une bande nouvellement synthétisée PER-4 (0.39) est révélée. En conclusion,
l’activité peroxydasique, en condition naturelle, semble évoluer quantitativement avec le stade
de croissance de la plante (figure 12 (a) et 13 (a)).
Quant à l’écotype sensible Acu 80 (figure 12 (b), 13 (b) ) il’ a révélé aussi une seule
bande de Rf 0.30 après 24heurs de germination. Au bout de 3 jours de germination, nous
constatons la synthèse de deux bandes de peroxydase PER-1 et PER-4 avec des Rf de 0.10 et
de 0.30 respectivement, le 7eme jour présente une faible activité, et enfin, les lots du 9eme et du
5eme jour ont exhibé une nouvelle bande PER-2 avec un Rf de 0.12.
La séparation èlèctrophorétique des peroxydases des jeunes plantules cultivées en
présence de NaCl (86.6mMol/l (T1), 102.9mMol/l (T2) et 137.2 mMol/l (T3)), a permis de
révéler des changements dans la synthèse des peroxydases. En effet, après 9 jours de stress
salin, le lot traité T1, révèle une seule bande (PER-3) d’activité peroxydasique chez l’écotype
tolérant Acu 209 et cinq bandes chez l’écotype sensible Acu 80 (PER-2, PER-3, PER-4, PER-5
et PER-6). Chez ce dernier, l’activité des PERs semble diminuer en fonction de la
concentration du stress. De plus, les profils sont semblables au profil du 3eme jour du témoin.
Il est probable que le stress entraine un retard d’activité de 6 jours (figure 12 (b) et 13 (b)).
Pour l’écotype Acu 209, l’intensité des deux bandes (PER-2 et PER-3) augmente avec
61
Expérimentation
résultats et interprétation
l’intensité du stress. Les profils de T2 et de T3 correspondent au 5éme jour témoin et par
conséquent nous remarquons un ralentissement de 4jours.
V.2.2. Changements des profils des peroxydases chez la population sauvage de
Medicago.
D’après la figure (14), le profil de l’activité des peroxydases montre que la distribution des
bandes de peroxydases varie en fonction de la croissance. C’est-à-dire que cette activité est
beaucoup plus importante pendant les 6eme, 7eme et 8eme jours, par la révélation de 5 bandes.
Alors que cette activité est faible durant les premiers jours de croissance ou on peut noter la
présence de deux bandes seulement.
Le profil du lot témoin pendant les croissances des neuf jours, montre la synthèse de 5 bandes
peroxydasiques : deux bandes sont synthétisées pendant les différents stades de croissance
(PER-1 et PER-3), alors que les trois autres sont spécifiques à des stades différents (PER-2,
PER-4 PER-5).
La bande PER-2 est synthétisée seulement au niveau du 7eme, et 8eme jour, et semble être
inhibée durant les autres jours de croissance. Les bandes PER-4 et PER-5 quant à elles, elles
sont synthétisées à partir du 6 eme jour.
En présence du sel, la bande PER-1 est synthétisée avec un retard de 5 jour au niveau du lot
traité T1. L’augmentation de la concentration a accéléré l’activation de cette bande ; en effet,
elle a été révélée à partir du 2eme jour au niveau du traitement T2 et à partir du 1er jour au
niveau du traitement T3 (Figure 14, 15,16 et 17).
62
Expérimentation
1j
3j
5j
résultats et interprétation
7j
9j
T1
T2
1j
T3
PER-1 (0.05)
PER-1(0.10)
PER-2 (0.12)
PER-2(0.12)
3j
5j
7j
9j
T1
T2 T3
PER-3 (0.17)
PER-4 (0.30)
PER-3(0.32)
PER-4 (0.39)
PER-5(0.40)
PER-6 (0.45)
a)
b)
Figure 12: Zymogramme et Rfs des différentes Peroxydases, chez l’écotype Acu
209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de croissance : 1jour,
3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3).
ZI
ZI
ZII
ZII
1j
3j
5j 7j 9j
T1 T2 T3
1j 3j
5j 7j 9j
T1 T2 T3
+
a)
b)
Figure 13: phénotypes électrophorétiques du Rfs des différentes Peroxydases,
chez l’écotype 209 (a) et Acu 80 (b), pour le lot témoin (différents stades de
croissance : 1jour, 3jours, 5jours, 7jours, et 9 jours) et les lots traités (T1, T2, T3).
: Flèche indiquant des iso enzymes de stress (PER-3, PER-5, PER-6).
63
Expérimentation
1j
2j
3j
résultats et interprétation
4j 5j
6j
7j
8j
9j
1j
2j
3j 4j
5j
6j
7j
8j
9j
PER-1
PER-2
PER-3
PER-4
PER-5
PER-6
Fig 14. Profile électrophorétiques des PERs,
systèmes PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype
Sauvage de Medicago. Puits 1 à 9 témoins : 1jr,
2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et 9 jrs de
croissance respectivement.
1j
2j
3j
4j
5j
6j
7j
8j
Fig 15. Profile électro phorétiques des PERs,
système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype
Sauvage de Medicago.Puits 1 à 9 traités (T1
86.6mMol/l) : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs,
8jrs, et 9 jrs de croissance respectivement.
9j
1j
Fig 16. Profile électro phorétique des PERs,
système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype
Sauvage de Medicaco. Puits 1 à 9 traités, T2 (102.9
mMol/l) : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs,
et 9 jrs de croissance respectivement.
2j
3j
4j
5j
6j
7j
8j
9j
Fig 17. Profile électro phorétique des PERs,
système PAGE-TBE (gradient 4-10%) d’écotype
Sauvage de Medicago. Puits 1 à 9 traités, T3 (137.2
mMol/l). : 1jr, 2jrs, 3jrs, 4jrs, 5jrs, 6jrs, 7jrs, 8jrs, et
9 jrs de croissance respectivement.
Fleche indiquant des bandes peroxydasique.
64
Expérimentation
résultats et interprétation
VI. Discussion.
Les mécanismes de résistance des plantes aux stress abiotiques sont extrêmement compliqués,
cette résistance est quantitativement contrôlée par plusieurs gènes codant, par l’activité des iso
enzymes. Les études sur les iso enzymes ont été appliquées dans les recherches de génétique
et d'écophysiologie. Beaucoup de chercheurs ont conclu que ces iso enzymes jouent un rôle
considérable dans la taxinomie, la phylogénétique et la variabilité des populations (Shannon,
1968 ; Gottlieb, 1982 ; Schmitz et al., 1986). Les isoenzymes ont été examinés aussi par
rapport au stress environnementaux. Ces chercheurs ont rapporté aussi que les modifications
de l’activité des isozymes chez les plantes étaient considérablement liées à la tolérance et à la
sensibilité au stress salin. Donc, les isozymes pourraient être considérées ; comme un
marqueur biochimique pour la tolérance au stress salin chez les plantes ( Foolad et al., 1993 .;
Basu et al., 1997 ) .
VI. 1. Modifications des estérases sous un stress salin :
L’électrophorèse des isoenzymes représente un bon outil pour établir des marqueurs
génétiques utiles dans l’évaluation des ressources génétiques et l’amélioration des plantes.
Leurs variabilités intra et inter spécifiques ont été étudiées par plusieurs chercheurs, Bingham
et Yeh (1971), chez Medicago sativa, Frankel et Garber (1965), chez Pisum sativa, et
Desborough et Peloquin (1968), chez Solanum tuberosum.
La plupart des estérases ont, en général, une gamme de substrats, et elle n’ont aucune
sans une fonction biologique spécifique connue. Car, depuis longtemps elles ont été utilisés
comme des marqueurs enzymatiques d'embryogenèses et organogenèses somatiques (Chibbar
et al., 1988, Coppens et al., 1990). Les estérases ont été associées aussi à la résistance, chez
l’orge vis-à-vis du mildiou (Hwang et al. 1982), ainsi que dans la symbiose et la fixation de
l’azote (Pringle et al., 2004). Ces auteurs montrent que le gène codant pour l’activité des
65
Expérimentation
résultats et interprétation
'estérase s’exprimé tôt dans le développement du nodule. Dans la paroi cellulaire la pectinemethylesterases est responsable de la démethylation de la polygalacturonase. Cette réaction
affecte le pH d'apoplast et la concentration ionique réglant ainsi plusieurs enzymes
hydrolytiques et la rigidité des parois cellulaires (Micheli, 2001). De même, Bordenave et al.,
1995, ont rapporté que l'acétyle estérase joue un rôle important dans les modifications de la
paroi cellulaire. En outre, leur rapport avec le développement des plantes en fait un marqueur
convenable de développement. Plusieurs auteurs utilisent le système des estérases pour
l’identification des espèces (Krulíková et al., 2002 ; Tsanev et al., 2004 ; Stoilova et al.,
2006).
Plusieurs travaux effectués sur différentes espèces ont montré l’existence d’une forte
relation entre la réponse enzymatique et le stress salin (waked ferreira, 2002; Amal, 2005) et
dans le but de mieux quantifier cette relation, nous avons entrepris l’étude du polymorphisme
enzymatique en relation avec le stress salin chez quatre populations de Medicago appartenant
à deux espèces différentes (M. truncatula et M. aculeata ).
A partir de l’ensemble des données obtenues en analysant les différentes espèces annuelle
de Medicago, nous avons pu mettre en évidence une importante variabilité intra et inter
population. En effet, pour différentes concentrations de NaCl, la réponse électrophoretique de
l’activité des estérases diffère d’une espèce à une autre et à l’intérieur même de la même
espèce. Les écotypes des 2 espèces étudiées montrent une richesse allozymique.
Les profils électrophorétiques du système estérase chez les écotypes tolérants (Tru 32 et
Acu 209), et les écotypes sensibles (Tru 40 et Acu 80), montrent une activité d’expression
variable pendant les neuf jours de développement en condition normal et sous stress salin. En
effet, ces profils ne se répètent pas de la même façon entre les écotypes. Certaines bandes sont
synthétisées pendant les premiers jours de croissance pour qu’elles se voient inhibées lors des
66
Expérimentation
résultats et interprétation
stades les plus avancés, contrairement à d’autres qui ne sont synthétisées qu’à des stades
avancés.
Une étude envisagée chez les graines oléagineuses sur l’activité amylasique a permis de
penser que durant la phase de repos et dans les premières heures de germination de la
plantule, les graines oléagineuses tirent leurs réserves énergétiques de l’action première de
cette amylase (Jridi et al., 1999), après l’hydrolyse des lipides par des estérases. (Heller et al.,
1993). Cela laisse penser que les mêmes mécanismes peuvent se produire chez les
protéagineuses.
Ram et al., (1977) ont travaillé sur la germination des graines de Lettuce (Lactuca sativa.
L), et ont trouvés que l’activité des estérases est stimulée après 24h de germination et que
cette activité augmente jusqu'à 3 fois au bout de 48h de germination.
Chez le Maïs, Godman et al., (1983) cité par ( Fyad-Lameche, 1999) ont démontré qu’ il
existe des estérases présentes à tous les stades de développement et d’autres qui sont
spécifiques de certains stades de développement .
Yurenkova et al., (1995) montrent bien que l’activité des estérases est en fonction du stade
de développement de la plante. Ces auteurs montrent que les premières heures de germination
sont accompagnées par la formation de nouvelles estérases qui étaient inhibée pendant la
phase dormante de la graine. Ils en concluent que la transition entre la phase d’imbibition de
la graine et la phase post-germinative est suivie par un rapide réarrangement du système
enzymatique. Au bout de 24h seulement de germination, de nouvelles estérases sont formées
au niveau plantule, et celles qui étaient synthétisées pendant la phase d’imbibition de la graine
(levée de dormance) se sont considérablement réduites en intensité ou inhibées complètement.
En analysant l’activité des estérases sur 5 génotypes de bananier, soumis à différentes
concentration de sel, waked Ferreira Gomes et al., (2002) montrent que les profils des
estérases ne présentaient pas de bandes consistantes pour aucun traitement. Par contre, Reyes
67
Expérimentation
résultats et interprétation
et al., (1998) avaient détecté un total de 14 bandes réparties en 5 zones d’activité
enzymatique, en analysant les feuilles de 15 clones du genre Musa provenant de culture in
vitro, ce qui indiquerait que ces bandes pourraient être activées au cours d’autres phases de
développement de la plante.
Zou et al., (2007) présentent une étude sur le système d’estérase en relation avec un stress
de froid, montrant que chez deux variétés de Brassica napus L, l’une tolérante AS-3 et l’autre
sensible CON, l’activité des estérases s’accroit sous l’effet de stress chez les deux variétés.
Mais cette suractivité est plus importante chez la variété tolérante que chez la variété sensible.
Les mêmes résultats ont été trouvés par
Puneva et al., (1995) qui ont constaté que
l’augmentation de l’activité des estérases dans les cellules du tabac traité est liée à un stress de
basse température (froid et gèl) relativement à 4°C et 10°C.
Tamas et al., (2005) étudiant les effets d’un stress par l’Aluminium, au niveau de
système racinaire de l’orge, ont montré que des concentrations de 2 et 4 mM d’Aluminium
engendrent une augmentation de l’activité estérasique en comparaison avec le témoin. Ces
mêmes auteurs stipulent aussi que sous stress deux isoenzymes d’estérase sont synthétisées
avec une augmentation considérable de cette activité par rapport au témoin.
D’autre part, ils ont conclu que la variation des estérases constitue un marqueur potentiel pour
étudier la pollution par l’Aluminium.
Par ailleurs, l’effet du sel sur l’activité enzymatique des estérases apparait plus nettement
lorsqu’on compare l’intensité des bandes des lots traités avec celles des témoins (Moulai,
2009).
Dans notre étude, L’expression des estérases durant 9 jours de germination des écotypes
d’Aculéata est similaire à celle de l’écotype de Truncatula avec une différence dans les Rf, du
nombre de bandes et de leur intensité. Cette différence est due aux polymorphismes
génotypiques des espèces annuelles de Medicago. Des études de diversité réalisées à l’aide
68
Expérimentation
résultats et interprétation
des isozymes ont révélé un polymorphisme très élevé chez la canne à sucre, fournissant une
méthode d’identification des variétés cultivées (Eksomtramage et al., 1991). L’analyse des
différentes espèces a suggéré que l’essentiel du polymorphisme existant entre les clones
cultivés, est dû à des bandes caractéristiques que l’on pourrait suivre à l’aide d’un petit
nombre de marqueurs spécifiques (Seguin, 1993).
L’expression de l’activité des estérases est lié au stade de développement de la plante
certaines bandes ont été révélées dans le premier jour de germination et disparaissent dans les
jours suivants telle que les deux bande de troisième jour (EST-1 et EST-2) de l’écotype Tru
32, EST-1 chez l’écotype Tru 40, EST-3 chez l’écotype Acu 209 et l’écotype Acu 80. Ce sont
des bandes spécifiques qui caractérisent ce jour, ou ce stade de ces écotypes par rapport aux
autres jours. Ce résultat est similaire à celui de Yurenkova et al., (1995) Ram et al., (1977).
Par contre, on trouve des bandes constitutive qui apparaissent pendant tous les jours de
croissance et même sous le stress salin tel que EST-8, EST-9, EST-10, chez l’écotype Tru 32
Figure (6(a), 7 (a) ) et EST-7 , EST-8 chez Tru 40 ( Figure 6 (b), 7 (b) ).
La comparaison intrapopulation des profils traités aux profils témoins des écotypes âgés
de 9 jours,
montre des
différences qualitatives et quantitatives. Ces différences sont
résumées dans un retard de croissance en fonction de la concentration, en fonction de la
tolérance et de la sensibilité des écotypes étudiés. En effet l’écotype Tru 32 présente un
nombre élevé d’activité enzymatique (11 bandes) par rapport à l’écotype Tru 40 (9 bandes).
Sous un régime de stress salin de 86 mM /l (T1), Tru 32 a révélé 3 bandes esterasiques, donc
l’augmentation de stress a entraîné une augmentation de l’activité esterasique. En
conséquence, les lots traités (T2 et T3) ont exhibé deux bandes en plus (Est-3et Est-4)
respectivement les mêmes bandes ont été trouvées dans le lot du 9eme jour avec des variations
quantitatives seulement. Par contre, l’écotype sensible a révélé l’existence de trois bandes
69
Expérimentation
résultats et interprétation
(Est-7, Est-8 et Est-9) quelle que soit la concentration de stress ; les mêmes résultats ont été
trouvés par Tamas et al., (2005).
L’écotype tolérant Aculeata 209 a montré l’existence de 2 zones d’activité estérasique
sous une concentration de 86Mm/ l le même phénomène est remarqué chez Tru 32. Cette
activité est accrue par l’augmentation de la concentration de NaCl avec l’existence de 3 zones
d’activité des estérases similaire à celle du 1er jour témoin, et par conséquent
nous
remarquons un retard de 9 jours. Pour l’écotype sensible Acu 80 nous notons l’existence de 2
zones d’activités seulement. Les profils observés chez les plantules traitées par T2 et T3
durant 9 jours, montrent une intensité des bandes légèrement plus importante que celles
observées chez les plantules témoins avec la disparition EST-1, EST-2, EST-3 et EST-4. Cette
observation nous permet de suggérer qu’il est possible que des modifications quantitatives
soient survenues comme réponse à ces niveaux sévères de stress salin. Ces résultats sont
similaires à ceux d’Amal, (2005) qui a conclus qu’une forte activité des isoformes estérases
est liée à une concentration élevé de NaCl. Au contraire, les résultats trouvés par Hassanein,
(2004), lors de la régénération des cals de L.esculentum, sous un stress salin, montrent que
l’activité des estérases diminue sous l’effet de sel, et cette diminution est accompagnée aussi
d’une disparition des autres bandes estérasiques.
Si l’on considère une comparaison inter population entre les quatre écotypes étudiés
sous le terme de la quantité d’estérases révélée après les trois traitements par le stress salin on
remarque que l’activité des estérases est plus élevée chez Tru 32 que chez Acu 209 et cette
même activité est plus élevée chez Acu 80 que chez Tru 40. Par conséquent, Tru 32 est plus
tolérante qu’Acu 209, Tru 40 est plus sensible qu’Acu80. Nous n’avons pas trouvé de travaux
similaires aux nôtres, de sorte que, nous ne pouvons les comparer aux résultats d’autres
auteurs qui ne concernent que l’apparition ou/et la disparition des estérases chez d’autres
variétés de plantes.
70
Expérimentation
résultats et interprétation
Les résultats obtenus à l’aide de ce système, montrent d’une part, la possibilité de
l’identification phénotypique entre les deux écotypes extrêmes âgés de 9 jours, d’autre part
d’évaluer l’effet du stress salin sur l’activité enzymatique durant 9 jours d’extraction. Ainsi,
l’étude des Rfs permet de déceler des bandes discriminantes en fonction de l’écotype, des
traitements et du stade de prélèvement pour l’extraction qui correspond à l’âge des plantules.
Finalement, on peut conclure que les profils observés chez les plantules traitées durant 9
jours par les concentrations T1, T2 et T3, montrent une intensité plus importante que celle
observée chez les plantules des lots témoins avec une disparition des bandes d’estérases de Rf
0.12, 0.16, 0.37, 0.43 et 0.89 les même résultats obtenus par Hassanien, 1999 qui a trouvé que
l’ activité des estérases augmente par l’augmentation de stress salin . Cette observation permet
de supposer qu’il est possible d’avoir des changements quantitatif (par rapport à l’intensité de
bandes) qui surviennent comme réponse lors du stress.
VI. 2. Modifications des peroxydases sous un stress salin.
Les peroxydases sont des enzymes hémoprotéiques très répandues chez les être vivants.
Chez les plantes, elles catalysent l’oxydation de différents substrats (des amines aromatique
des phénols,…….), elles interviennent ainsi dans différents phénomènes physiologiques tels
que l’enracinement, la lignification, et la résistance aux stress biotiques et abiotiques (Gaspar
et al., 1991. ; Aouad et al., 1997).
La méthode d’extraction par solubilisation permet d’avoir accès à la totalité des
peroxydases (PER) contenues dans le matériel végétal et renseigne mieux sur la diversité de
ces oxydoréductases, tout en concervant leur propriétés physico-chimiques (Bazziz, 1990 et
Majourhat, 2002).
Waked.E et al., 2002 ont établi trois types de traitements en faisant varier les
concentrations du NaCl additionné à la solution nutritive: 0 ; 50 et 100 mol/m3 ;il en a résulté
degré de polymorphisme plus élevé, soit 15 bandes au total chez des variétés de bananier.
71
Expérimentation
résultats et interprétation
D’autres chercheurs (Jarret et al., 1986 ; Bhat et al., 1992), en travaillant sur d’autres
génotypes, ont enregistré diverses zones d’activité très polymorphique chez le bananier.
Irié Z et al., 1999 ont affiché l’existence de quatre à six bandes d’activité peroxidasique
chez la variété haricot de L’ima, et ont conclu qu’au moins deux gènes contrôlent cette
isoenzyme.
Abdel-Baki et al., 2003 ont trouvé l’existence d’une seule bande d’activité
peroxydasique chez trois variétés d’oignon ( Allium ceba L.) La densité et l’intensité de cette
bande sont plus fortes sous des concentrations élevées (2000, 4000, 6000 ppm) du sel, ils ont
conclu que le stress salin a augmenté l'accumulation de la peroxydase et que le gène codant
pour cette isoenzyme a accéléré son expression en réponse à ce stress.
L’électrophorèse des peroxydases chez le Maïs (Zea mays L) soumise à des concentrations
différentes de NaCl, a montré quatre zones d’activité peroxydasique (Amel, 2005). Les
résultats contrastés entre les génotypes étudiés sont en relation avec leur capacité d’adaptation
et de croissance en milieu salin, laquelle, à son tour, est contrôlée par des facteurs génétiques.
Errabii (2006) a également étudié l’effet de NaCl sur l’activité enzymatique à l’échelle
cellulaire d’une variété de canne à sucre. Ses résultats ont montré une réduction importante de
l’activité catalase et peroxydases solubles.
Karray-Bouraoui, 2008 a étudiée les réponses physiologiques et biochimiques de deux
provenances de la Mentha. pulegium L. (Lamiaceae) « Soliman et Takelsa » vis-à-vis du
stress salin. Les deux provenances du nord tunisien ont été traitées par le NaCl (0 et 35 mM)
Après deux semaines de traitement, le sel a entraîné une réduction de la croissance, de 16 %
par rapport à celle du témoin chez la première provenance, et de 25 % chez la seconde.
L’activité de la Gaïacol peroxydase n’est pas modifiée par le traitement salin de courte durée
(15 jours) dans les feuilles, et elle est même diminuée à plus long terme, chez les deux
provenances. Par contre, une stimulation de cette activité par le traitement salin est notée dans
72
Expérimentation
résultats et interprétation
les racines, et elle est légèrement plus marquée chez la provenance « Soliman » surtout après
une longue durée de traitement (45 jours).
Chakroun et al., 2007 ont constaté que l’activité peroxydasique n’est détectable qu’en
présence de NH4NO3 (agent de stress aux doses de 500, 1000 et 1500 mg.l-1) ajouté au
milieu nutritife de deux variétés de fraisier « Chandler » et « Sweet Charlee » respectivement
sensible et tolérante). L’activité chute toutefois de plus de la moitié de sa valeur lorsque la
quantité de sel passe de 500 mg.l-1 à 1500 mg.l-1 dans le milieu de culture, la supériorité de
l’activité peroxydasique chez la variété « Sweet Charlee » est plus évidente. L’analyse du
profil électrophorétique de cette activité peroxydasique montre que l’addition de nitrate
d’ammonium dans le milieu de culture induit l’apparition d’isoformes anodiques
non
détectables en l’absence de nitrate d’ammonium.
L’extraction par solubilisation progressive des peroxydase
des 5 écotype d’O.f.i(
Opuntia Ficus Indica L.) traités par le stress salin, menée par Bazziz, 2006, a permis de
révéler que le stress salin provoque une augmentation des peroxydases dans les fractions
solubles et ioniques préparées à partir d’écotypes tolérants. Ces changements sont reflétés au
niveau des profils électrophorétiques par l’apparition d’isoformes acides et basiques chez les
écotypes dont la croissance n’est pas affectée par le sel. Ce même auteur a enregistré des
changements quantitatifs dans l’activité des peroxydases. L’augmentation significative de
l’activité de cette isoenzyme est enregistrée chez tous les écotypes, tolérants et sensibles, en
condition de stress. Le degré d’augmentation de cette activité dépend de la sévérité et de la
durée du stress.
Des travaux de Rodrigué et al., (2000) ont rapporté que l’augmentation du niveau d’une
isoperoxydase anionique induite par la salinité peut-être reliée à l’augmentation de la fermeté
du melon, en conditions salines.
73
Expérimentation
résultats et interprétation
Les travaux de Zou et al., (2007) ont montré que l’activité des peroxydases, s’accroit
sous l’effet de stress froid chez les deux variétés étudiées. Mais cette augmentation est plus
importante chez la variété tolérante que shez la variété sensible.
Amal, 2005 a trouvé aussi une forte activité des peroxydases chez des variétés tolérantes
de maïs soumis à une concentration de 150 mM de NaCl.
En examinant l’effet du stress salins modéré (50, 100, 150,200 Mm) sur l’activité des
peroxydases chez des variétés de blé durant leur stade de développement (96h, 168h, 240h)
Lacramioar et al., (2008), ont trouvé que l’activité des peroxydases est faible dans des
concentrations faible de NaCl, et forte sous des concentrations forte de NaCl. Ils ont conclus
que le stress salin a modifié l’activité des peroxydases, cette modification dépend des variétés
du blé, de l’âge des plantules et de la concentration de NaCl.
Chez le coton, le stress salin a causé une augmentation considérable dans l’activité de
peroxidase chez les variétés tolérants, alors qu’ elle est faible, ou reste inchangeable chez les
variétés sensibles( Gossett et al., 1996). Dans une autre étude, Mitova et al., 2002 ont
comparés le comportement de quelque variétés de tomate vis-à-vis le stress salin, ont trouvés
que la variétés ( L.pennelli) présente la meilleure vigueur de tolérance avec une augmentation
de l’activité peroxydasique par apport au variétés sensibles. En contraste Dionososese et al.,
(1998) ont rapporté une augmentation dans l’ activités peroxydasique sous un regime de stress
salin, chez les variétés sensibles du riz que les variétés tolérantes.
Les résultats des électrophorèses des peroxydases n’apparaissant pas bien nets malgré
plusieurs tentatives, nous exposons dans cette partie les meilleurs résultats obtenus que nous
tenterons d’interpréter. 19 bandes au total ont été révélées (4 bandes chez les variétés Tru 32
et 5 bandes chez Tru 40, 4 bandes chez Acu209 et 6 bandes chez Acu 80).
D’après les figures (10, 11, 12 et 13), les profils
électrophorétiques du système
Peroxydase, chez les écotypes tolérants (Tru 32 et Acu 209), et les écotypes sensibles (Tru 40,
74
Expérimentation
résultats et interprétation
et Acu 80), nous remarquerons une activité d’expression variable pendant les neuf jours de
développement. Cette activité différera dans le temps, certains bandes apparaissent pendant
les premiers jours et disparaissent par la suite pour que d’autres prennent le relai.
Le nombre de bandes varie chez le génotype Tru 32 de 1 à 2 bandes par profil. La bande
PER-3 du le 1er jour de germination a disparu au cours des autres jours et réapparait le 5eme
jour avec une faible intensité. Le lot 3j, celui des plantules âgées de 3 jours, montre la
présence d’une nouvelle bande PER-1 d’une faible intensité. Les deux bandes précédentes
apparaissent dans le 5eme jour de croissance ce qui fait un total de 2 bandes dans cette zone.
La bande correspondant au PER-1 persiste jusqu’au 9eme jour.
Parmi les bandes de peroxydase détectées, trois (PER-1, PER-4 et PER-3) ont été
respectivement observées chez Tru40 et Tru32 et des bandes du Rf 0.05, 0.32 et 0.10,
respectivement chez Acu209 et Acu80 indépendamment du traitement auquel avaient été
soumises les plantes. C’est seulement dans le traitement par le sel que s’est révélée la bande
PER-4 chez Tru 32 et PER-3, PER-5 chez Tru 40, elles sont peut être dues à une enzyme
marqueur de stress.
Chez Acu 209 ne présente pas des bandes nouvellement synthétisées, par contre chez Acu 80
nous avons la révélation de nouvelles bandes (PER-3, PER-5 et PER-6), donc d’une part, le sel
a induit l’activation de ces bandes et d’autre part, il a entrainé un retard dans l’expression de
cet enzyme ; en effet, chaque profil traité des quatre écotypes ne correspond pas au profil du
neuvième jour du témoin.
Le stress salin a induit l’activation de nouvelles bandes sous des concentrations de 68.6
mMol/l, 102.9 mMol/l chez les écotypes sensibles (Tru 40 et Acu 80) contrairement aux
écotypes tolérantes, ces résultats sont similaire aux résultats de Dionososese et al., 1998
pressedament décrite, et sont contraste aux résultats des autres chercheurs qui ont trouvé que
l’élévations des activités des peroxydases est plus importante chez les écotypes tolérants.
75
Expérimentation
résultats et interprétation
Les résultas de l’extraction journalière des peroxydases durant les neuf jours de
germination des graines traitées et témoins, chez l’écotype sauvage de Medicago nous a
amené à suggérer que d’une part l’augmentation de l’intensité des bandes peroxydasiques est
liée à l’augmentation de la concentration du sel (T1, T2 et T3).
D’autre part, nous avons observé que le neuvième jour traité des trois concentrations (T1,
T2, T3) ressemble beaucoup au 6eme jour témoin, ce qui nous permet de conclure que le stress
a entraînée un retard d’activité enzymatique de 3jours.
Par ailleurs, la bande PER-2 qui a été révélée au 7eme jour témoin montre une plus forte
intensité dans les trois lots traités (T1, T2, T3) ainsi qu’une accélération précoce de son
expression par rapport aux jours des lots témoins. En fonction de la concentration de sel, elle
a été révélée au 5eme jour de T1, au 3eme jour de T2 et T3. Alors elle est peut être due à une
enzyme liée au stress salin. (abdel-baki et al., 2003). Le stress a accéléré aussi l’activation de
la bande PER-1.
76
Conclusion
Conclusion et Perspective :
La résistance au sel apparaît comme un caractère polygénique contrôlé à différents
niveaux d’organisation, de la cellule à la plante entière. La grande variabilité manifestée par
les espèces et les variétés pour ce caractère, permet d’envisager la sélection de génotypes
particulièrement bien adaptés au stress salin. Par ailleurs, la diversité des effets du sel offre
une gamme étendue de critères physiologiques et biochimiques qui peuvent être à la base de
tests rapides, utilisables pour un tri à grande échelle.
En effectuant un grand nombre de techniques d’électrophorèse, sur les deux espèces, M.
truncatula et M. aculeata, des différences interpopulation et intrapopulation importantes sont
relevées, ce qui offre des possibilités de sélection de certaines populations pour une meilleure
adaptation à la salinité. Il serait peut-être intéressant d‘utiliser des techniques basées sur la
description du comportement, l‘analyse génétique des caractères et la recherche des
marqueurs moléculaires pour une amélioration de la tolérance au stress salin.
La présente étude, basée sur les données recueillies au cours de plusieurs années, est réalisée
dans le but de rechercher des marqueurs génétiques liés à la tolérance à la salinité chez des
espèces annuelles de Medicago, et de déterminer s’il existe une différence d’activité
enzymatique entre les plantes témoin et traitée, sensible et tolérants.
Au terme des résultats trouvés, nous pouvons conclure que la présence du stress salin
semble altérer le métabolisme normal des deux isoenzymes (estérases et peroxydases) en
retardant leur activité. D’une part le stress a induit l’activation de nouvelles peroxydases, chez
les écotypes sensibles par rapport aux tolérants (changements qualitatifs et quantitatifs) et à
accéléré la synthèse des autres ; d’autre part, les profils des estérases présentent des variations
d’ordre qualitatif se traduisant par une forte intensité des bandes chez les individus traités.
En général, les aspects quantitatifs et qualitatifs des peroxydases et des estérases peuvent être
utilisé comme des marqueurs de résistance des plantes à plusieurs contraintes biotiques et
77
Conclusion
abiotiques. Leurs activités peuvent être un bon indicateur pour la sélection des génotypes
tolérants au stress. Au-delà de ces résultats, le rôle exact joué par ces enzymes demande
encore plus d’investigations.
Enfin, la recherche des marqueurs iso enzymatiques liés à la tolérance à la salinité peut être
exploitée dans la sélection de nouvelles lignées tolérantes au stress salin. En repérant ces
marqueurs de tolérance, il est possible de remonter au niveau des gènes correspondants afin
de localiser les zones du génome impliquées dans la variation de ce caractère de tolérance au
stress salin.
78
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