amplification et séquençage (révisé)

8.3.3 Réactifs
1. ADN polymérase:
™
La polymérase catalyse la synthèse de brins complémentaires
d’ADN.
™
Des polymérases qui sont résistantes à la chaleur sont utilisées,
telles que la Taq polymérase (Thermus aquaticus),
la Tth polymérase, la Pwo polymérase et la Pfu polymérase.
™
L’enzyme doit être capable de synthétiser des longues séquences
d’ADN (i.e. bonne activité de polymérisation).
™
De plus, les polymérases de type Pwo et Pfu exhibent une activité
exonucléase 5’-3’; des mauvais nucléotides sont reconnus, enlevés
et remplacés par les bons nucléotides. L’activité exonucléase 5’-3’
augmente la fidélité de réplication de l’ADN.
305
2. Amorces:
™ Des amorces sont des courts oligonucléotides, dont les séquences de
nucléotides sont complémentaires aux bouts des régions ciblés de
l’ADN à amplifier.
™ Deux amorces distincts sont utilisés pour l’ACP: un amorce qui
synthétise de gauche à droite et un autre qui synthétise de droite à
gauche.
™ Chaque amorce se lie à un brin de l’ADN original.
amorces
306
™ La synthèse d’ADN procède toujours dans la direction 5’ à 3’. Le 1er
nucléotide à être incorporé réagit avec l’OH-3’ libre de l’amorce.
Le bout 5’ de l’amorce est bloqué.
™ La paire d’amorces doit être
choisie spécifiquement pour
O
l’échantillon d’ADN.
5'
O P O CH2 O A
™ La longueur des amorces est
H 3' H
Ogénéralement entre 10 et 30
H
H
nucléotides et leur séquence doit
O
H
être complémentaire pour une
5'
O P O CH2 O T
section unique de l’ADN matrice.
H 3' H
O™Idéalement, chaque amorce
H
H
contient un nombre équivalent de
O
H
nucléotides.
5'
G
O P O CH2
™ Pour éviter la formation de
O
H3' H
Odimères entre les amorces, il ne
H
H
doit pas y’avoir de complémentarité
O
H
intra- ou intermoléculaire entre les
5'
O P O CH2 O C
amorces.
H 3' H
™ La température de dénaturation
OH
H
des amorces doit être similaire,
OH
H
ainsi qu’être située entre 55°C et
307
80°C.
3. Désoxynucléotides triphosphates:
™ Le mélange réactionnel doit contenir un excès des 4 désoxynucléotides
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) puisqu’ils sont consommés
durant l’ACP.
O
O
O
Base
-
O P O P O P O
O-
O-
O
OH
H
H
OH
H
H
dNTP
NH2
NH2
N
N
N
Cytosine
O
N
N
N
Adénine
O
O
H3C
NH
N
Thymine
O
N
N
NH
N
NH2
Guanine
™ La concentration de chaque désoxynucléotide doit être égale.
308
4. Tampon:
™ Le pH et la force ionique du tampon est choisi selon la polymérase
utilisée.
™ La force ionique a une influence importante sur la spécificité de l’ACP.
™ Une solution tampon typique possède une force ionique d’environ 50
mM, un pH de 8.3 et contient du Tris-HCl et du KCl ou du NaCl.
™ La solution tampon contient aussi du MgCl2 à une concentration entre
0.5 et 5 mM. Les ions Mg2+ forment un complexe soluble avec l’ADN et
la polymérase.
™ Le rôle des ions Mg2+ est d’amener la polymérase à proximité de l’ADN
et de balancer les charges négatives sur les molécules d’ADN. De plus,
les ions Mg2+ stimule l’activité de la polymérase. La [Mg2+] est liée à la
spécificité et au rendement de la réaction d’amplification. À des
concentrations faibles de Mg2+, l’activité enzymatique de la polymérase
est diminuée. Un excès de Mg2+ résulte en une dénaturation incomplète
de l’ADN puisque la forme double brins de l’ADN est stabilisée par ces
ions. De plus, une [Mg2+] élevée augmente la liaison des amorces aux
mauvais sites, résultant en une perte de spécificité.
309
8.4. L’ACP en temps réel
™ On peut suivre le progrès de la réaction d’amplification en chaîne
par polymérase en utilisant un marqueur fluorescent pour quantifier
les produits formés durant chaque cycle.
™ L’augmentation des produits de la réaction peut être quantifier en
mesurant l’augmentation de l’intensité de fluorescence.
™ Un graphique de l’intensité de fluorescence en fonction du nombre
de cycles d’amplification donne une idée plus précise de la cinétique
qu’une mesure de l’accumulation des produits après un nombre fixe
de cycles.
™ Deux différents types d’essaies peuvent être utilisés pour l’ACP en
temps réel: essaie par liaison d’un colorant et essaie basé sur des
sondes.
310
8.4.1 Essaie par liaison d’un colorant
™ Dans un tel essaie, on utilise un colorant qui fluoresce après liaison à
l’ADN à double brins.
™ Puisque de plus en plus de molécules d’ADN à double brins sont produites
après chaque cycle d’ACP, l’intensité de fluorescence augmente.
™ Les colorants se lient soit entre les bases appariées ou au sillon mineur de
la double hélice d’ADN.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
311
8.4.2 Essaie basé sur des sondes
™ Cette méthode est basée sur la
dégradation d’une sonde cible par
l’activité exonucléase 5’-3’ de la
polymérase.
™ La sonde est un court oligonucléotide
dont la séquence est complémentaire à
une région de l’ADN cible se trouvant
entre les deux amorces.
™ Un fluorophore est attaché au bout 5’ de
la sonde et l’extincteur est lié au bout 3’.
™ La proximité de l’extincteur réduit la
fluorescence du fluorophore.
™ La sonde est ajoutée au mélange
réactionnel et se lie à l’ADN dénaturé.
Sa fluorescence est éteinte.
™ Durant l’élongation des amorces, le
fluorophore est enlevé de la sonde due
à l’activité exonucléase de la
polymérase. Le fluorophore libéré
fluoresce dans le mélange réactionnel.
™ L’intensité de fluorescence est
directement proportionnel au nombre de
cycles d’amplification (i.e. nombre de
molécules amplifiées).
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
312
8.5 Transcription inverse de l’ARN
5'
3'
ARNm
72°C
5'
3'
amorce
42°C
5'
transcriptase
inverse
3'
3'
5'
5'
3'
5'
5'
3'
3'
5'
ARNm
ADN
94°C
ACP de l'ADN
313
8.6 Séquençage des acides nucléiques
™ Puisque la séquence des nucléotides dans une molécule d’ADN ou
d’ARNm détermine sa fonction, le séquençage des acides
nucléiques est une tâche bioanalytique importante.
™ Le développement de méthodes rapides et automatisées pour le
séquençage des acides nucléiques a attiré beaucoup d’intérêt dans
les dix dernières années, surtout dans le contexte du projet du
génome humain.
™ Méthodes de séquençage:
9 microréseaux d’ADN (pour des oligonucléotides courts)
- méthode de Maxam-Gilbert
- méthode de Sanger
314
8.6.1 L’usage d’enzymes de restriction
™ L’ADN extrait des cellules ou des
tissus est souvent trop long pour être
directement séquencé.
™ L’ADN doit avant être coupé en plus
petits fragments de jusqu’à 800 paires
de bases.
™ Les endonucléases de restriction sont
employées.
™ Ces enzymes reconnaissent une
séquence spécifique de 4 à 8 bases
dans une molécule d’ADN à double
brins et coupent les deux brins à un
point spécifique prêt du site de
reconnaissance.
™ Une digestion (ou plusieurs digestions
séquentielles) avec des enzymes de
restriction produit une série de
fragments qui peuvent être dénaturés
et séparés par électrophorèse sur gel.
™ Après séparation, les fragments
d’ADN à simple brin peuvent être
séquencés.
315
8.6.2 Méthode de Maxam-Gilbert
™ Le séquençage des fragments d’ADN à
simple brin débute avec le marquage
radioactif du bout 5’ avec du phosphore32 (voir figure de droite).
5’
3’
™ Les fragments d’ADN sont ensuite traités
avec un réactif chimique qui coupe l’ADN
à un site spécifique.
™ La réaction chimique est effectuée dans
des conditions de rendement faible pour
que chaque molécule d’ADN est coupé
seulement une fois à un site donné.
™ Les fragments obtenus sont séparés
selon leur taille par SDS-PAGE. La
position des fragments sur le gel est
détecté par autoradiographie.
™ Pour un séquençage complet, un
échantillon d’ADN est généralement
séparé en quatre parties et chaque partie
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,316
est traitée avec un réactif différent.
Bioanalytical Chemistry, 2004)
1. Coupure de la guanine (G):
™ Traitement avec le diméthyl
sulfate (DMS) et la pipéridine.
O
7
8
N 5 6 NH
1
9N
2
4
N
3
NH2
Guanine
317
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
2. Coupure de la guanine (G) et de l’adénine (A):
NH2
7
™ L’adénine est aussi méthylée par le DMS à la position N3.
N
5
6
1N
4
3
N
2
8
9
™ Le traitement avec la pipéridine donne aussi lieu
à la coupure de la base d’adénine.
N
Adénine
™ La vitesse de coupure de l’adénine est un cinquième de celle de la guanine.
™ Par contre, si de l’acide (i.e. acide formique) est ajouté au mélange
réactionnel au lieu du DMS, la guanine et l’adénine sont hydrolysées à des
vitesses comparables.
™ Les positions des adénines dans une chaîne sont établies
en comparant les positions des guanines et des guanines + adénines.
318
3. Coupure de la cytosine (C)
et de la thymine (T):
™ Le traitement des fragments d’ADN
avec de l’hydrazine et de la
pipéridine libère des cytosines et
des thymines.
NH2
O
H3C
N
N
Cytosine
O
NH
N
O
Thymine
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)
319
4. Coupure de la cytosine (C):
™ Si la réaction avec l’hydrazine est effectué dans une solution de 1.5
M NaCl, l’ADN est coupé seulement avant une cytosine.
™ Une comparaison des positions des cytosines + thymines et des
cytosines permet de situer les thymines.
™ Les conditions des quatre réactions sont ajustées pour que les
bases sont relâchés en moyenne à une position aléatoire par
molécule d’ADN.
™ La base située à l’extrémité 5’ ne peut pas être identifié puisque le
nucléotide est détruit durant la réaction. De plus, la 2è base est
souvent impossible à résoudre par électrophorèse sur gel.
Les 1ère et 2è bases doivent être identifiées par séquençage du brin
complémentaire.
320
Exemple de séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode de Maxam-Gilbert
5’
Électrophorèse
sur gel
3’
321
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
8.6.3 Méthode de Sanger
(méthode didéoxy ou méthode de terminaison de chaîne)
™ La méthode de Sanger est basée sur la synthèse d’un brin complémentaire
de l’ADN en utilisant les oligonucléotides à séquencés comme matrices (tel
que pour l’ACP).
™ Contrairement à l’ACP, la synthèse du brin complémentaire est effectuée
en présence d’un nucléotide de terminaison de chaîne.
™ L’échantillon d’ADN à simple brin est divisé en 4 portions. Chaque portion
est incubé avec de l’ADN polymérase, les quatre désoxyribonucléotides
triphosphates (dATP, dGTP, dCTP, dTTP) et une amorce appropriée.
™ Le brin complémentaire synthétisé est marqué en incorporant du 32P, soit
dans l’amorce ou dans un des désoxyribonucléotides triphosphates.
™ Dans chacun des 4 mélanges réactionnels,
est ajouté un 2’,3’-didéoxynucléotide
triphosphate (ddNTP) en petite quantité.
O
-
O
O
O P O P O P O
O-
O-
O-
Base
O
H
H
H 3'
H
H
H
ddNTP
322
™ Dès que un ddNTP est incorporé dans la chaîne croissante, la
réaction se termine puisqu’il n’y aura pas de 3’-OH libre pour
l’incorporation d’un autre nucléotide.
™ L’incorporation d’un ddNTP résulte dans une série de chaînes
tronquées, chacune terminée par un analogue didéoxy dans la
position de la base correspondante.
™ Les produits de chacune des 4 réactions sont séparés selon leur
taille par électrophorèse su gel dans des voies parallèles.
™ La séquence du brin complémentaire d’ADN est déterminée par
autoradiographie. Cette séquence est ensuite utilisée pour identifier
la séquence de l’ADN original.
323
Exemple de séquençage d’un fragment d’ADN par la méthode de Sanger
Électrophorèse
sur gel
(D’après D.J. Holme, H. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998)
324