amplification et séquençage (révisé)

305
8.3.3 Réactifs
1. ADN polymérase:
La polymérase catalyse la synthèse de brins complémentaires
d’ADN.
Des polymérases qui sont résistantes à la chaleur sont utilisées,
telles que la Taq polymérase (Thermus aquaticus),
la Tth polymérase, la Pwo polymérase et la Pfu polymérase.
L’enzyme doit être capable de synthétiser des longues séquences
d’ADN (i.e. bonne activité de polymérisation).
De plus, les polymérases de type Pwo et Pfu exhibent une activité
exonucléase 5’-3’; des mauvais nucléotides sont reconnus, enlevés
et remplacés par les bons nucléotides. L’activité exonucléase 5’-3’
augmente la fidélité de réplication de l’ADN.
306
2. Amorces:
Des amorces sont des courts oligonucléotides, dont les séquences de
nucléotides sont complémentaires aux bouts des régions ciblés de
l’ADN à amplifier.
Deux amorces distincts sont utilisés pour l’ACP: un amorce qui
synthétise de gauche à droite et un autre qui synthétise de droite à
gauche.
Chaque amorce se lie à un brin de l’ADN original.
amorces

307
La synthèse d’ADN procède toujours dans la direction 5’ à 3’. Le 1er
nucléotide à être incorporé réagit avec l’OH-3’ libre de l’amorce.
Le bout 5’ de l’amorce est bloqué.
O
H
O
HH H
CH2
H
OP
3'
5'
OO
H
O
HH H
CH2
H
OP
O-3'
5'
OO
H
HH H
CH2
HO
OP
O-
OO
HOH
HH H
CH2
H
OP
O-
3'
5'
3'
5'
A
T
G
C
O
O-
O-
La paire d’amorces doit être
choisie spécifiquement pour
l’échantillon d’ADN.
La longueur des amorces est
généralement entre 10 et 30
nucléotides et leur séquence doit
être complémentaire pour une
section unique de l’ADN matrice.
Idéalement, chaque amorce
contient un nombre équivalent de
nucléotides.
Pour éviter la formation de
dimères entre les amorces, il ne
doit pas y’avoir de complémentarité
intra- ou intermoléculaire entre les
amorces.
La température de dénaturation
des amorces doit être similaire,
ainsi qu’être située entre 55°C et
80°C.
308
3. Désoxynucléotides triphosphates:
Le mélange réactionnel doit contenir un excès des 4 désoxynucléotides
triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) puisqu’ils sont consommés
durant l’ACP.
La concentration de chaque désoxynucléotide doit être égale.
N
N
N
N
NH2
NH
N
N
O
NH2
N
N
NH2
ON
NH
O
O
H3C
N
OBase
O
HOH
HH HH
OP
O-
O
dNTP
P
O
O-
OP
-OO
O-
Cytosine Adénine Thymine Guanine

309
4. Tampon:
Le pH et la force ionique du tampon est choisi selon la polymérase
utilisée.
La force ionique a une influence importante sur la spécificité de l’ACP.
Une solution tampon typique possède une force ionique d’environ 50
mM, un pH de 8.3 et contient du Tris-HCl et du KCl ou du NaCl.
La solution tampon contient aussi du MgCl2à une concentration entre
0.5 et 5 mM. Les ions Mg2+ forment un complexe soluble avec l’ADN et
la polymérase.
Le rôle des ions Mg2+ est d’amener la polymérase à proximité de l’ADN
et de balancer les charges négatives sur les molécules d’ADN. De plus,
les ions Mg2+ stimule l’activité de la polymérase. La [Mg2+] est liée à la
spécificité et au rendement de la réaction d’amplification. À des
concentrations faibles de Mg2+, l’activité enzymatique de la polymérase
est diminuée. Un excès de Mg2+ résulte en une dénaturation incomplète
de l’ADN puisque la forme double brins de l’ADN est stabilisée par ces
ions. De plus, une [Mg2+] élevée augmente la liaison des amorces aux
mauvais sites, résultant en une perte de spécificité.
310
8.4. L’ACP en temps réel
On peut suivre le progrès de la réaction d’amplification en chaîne
par polymérase en utilisant un marqueur fluorescent pour quantifier
les produits formés durant chaque cycle.
L’augmentation des produits de la réaction peut être quantifier en
mesurant l’augmentation de l’intensité de fluorescence.
Un graphique de l’intensité de fluorescence en fonction du nombre
de cycles d’amplification donne une idée plus précise de la cinétique
qu’une mesure de l’accumulation des produits après un nombre fixe
de cycles.
Deux différents types d’essaies peuvent être utilisés pour l’ACP en
temps réel: essaie par liaison d’un colorant et essaie basé sur des
sondes.

311
8.4.1 Essaie par liaison d’un colorant
Dans un tel essaie, on utilise un colorant qui fluoresce après liaison à
l’ADN à double brins.
Puisque de plus en plus de molécules d’ADN à double brins sont produites
après chaque cycle d’ACP, l’intensité de fluorescence augmente.
Les colorants se lient soit entre les bases appariées ou au sillon mineur de
la double hélice d’ADN.
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004)
312
8.4.2 Essaie basé sur des sondes
Cette méthode est basée sur la
dégradation d’une sonde cible par
l’activité exonucléase 5’-3’ de la
polymérase.
La sonde est un court oligonucléotide
dont la séquence est complémentaire à
une région de l’ADN cible se trouvant
entre les deux amorces.
Un fluorophore est attaché au bout 5’ de
la sonde et l’extincteur est lié au bout 3’.
La proximité de l’extincteur réduit la
fluorescence du fluorophore.
La sonde est ajoutée au mélange
réactionnel et se lie à l’ADN dénaturé.
Sa fluorescence est éteinte.
Durant l’élongation des amorces, le
fluorophore est enlevé de la sonde due
à l’activité exonucléase de la
polymérase. Le fluorophore libéré
fluoresce dans le mélange réactionnel.
L’intensité de fluorescence est
directement proportionnel au nombre de
cycles d’amplification (i.e. nombre de
molécules amplifiées).
(D’après A. Manz, N. Pamme & D. Iossifidis,
Bioanalytical Chemistry, 2004)

313
8.5 Transcription inverse de l’ARN
5' 3'
72°C
5' 3'
42°C
5' 3'
transcriptase
inverse
5' 3'
5' 3'
5'3'
5'
5'
3'
94°C
ACP de l'ADN
ARNm
amorce
ARNm
ADN
314
8.6 Séquençage des acides nucléiques
Puisque la séquence des nucléotides dans une molécule d’ADN ou
d’ARNm détermine sa fonction, le séquençage des acides
nucléiques est une tâche bioanalytique importante.
Le développement de méthodes rapides et automatisées pour le
séquençage des acides nucléiques a attiré beaucoup d’intérêt dans
les dix dernières années, surtout dans le contexte du projet du
génome humain.
Méthodes de séquençage:
9microréseaux d’ADN (pour des oligonucléotides courts)
- méthode de Maxam-Gilbert
- méthode de Sanger