Chapitre 2.2.2.

CHAPITRE 2.2.2.
MALADIE D’AUJESZKY
RÉSUMÉ
La maladie d’Aujeszky ou pseudorage est due à un alphaherpèsvirus qui infecte le système
nerveux central et d’autres organes, comme l’appareil respiratoire, de tous les mammifères sauf
l’homme et les grands singes. Elle atteint essentiellement le porc, son hôte naturel, qui demeure
infecté de façon chronique après guérison clinique. On peut lutter contre elle en bloquant les
troupeaux infectés, par l’élimination des animaux infectés et par la vaccination.
Un diagnostic de maladie d’Aujeszky peut être fait en mettant en évidence le virus (isolement du
virus ou amplification en chaîne par polymérase [PCR]) ou, chez les suidés vivants, par une
recherche d’anticorps.
Identification de l’agent pathogène : l’isolement du virus de la maladie d’Aujeszky peut se faire
en inoculant un broyat de tissu, par exemple de cerveau, d’amygdales ou d’écouvillonnage des
cavités nasales ou de la gorge, à une culture de cellules sensibles comme la lignée cellulaire issu
de rein de porc PK-15 ou SK6 ou à des cellules rénales mères ou secondaires. La spécificité de
l’effet cytopathogène (ECP) est vérifiée par immunofluorescence, immunoperoxydase ou
neutralisation par un sérum spécifique. Le virus peut également être identifié par PCR, mais cette
technique est encore récente.
Épreuves sérologiques : Les anticorps de la maladie d’Aujeszky peuvent être révélés par
séroneutralisation virale, agglutination au latex et par réaction immuno-enzymatique (ELISA). Des
coffrets ELISA sont disponibles dans le commerce dans de nombreux pays. Un sérum étalon
international de l’OIE définit le seuil de détectabilité que les laboratoires doivent atteindre en routine
pour le diagnostic sérologique de la maladie d’Aujeszky.
Depuis 1990 environ, il est devenu possible de distinguer les anticorps résultant d’une infection
naturelle de ceux induits par une vaccination à l’aide de vaccins délétés.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
Différents vaccins, à virus vivant modifié ou à base d’antigènes viraux, protègent contre la maladie
clinique et permettent de diminuer l’excrétion virale après épreuve virulente. A l’heure actuelle sont
surtout produits des vaccins à virus vivants délétés naturellement ou expérimentalement d’une
glycoprotéine (gG, gE ou gC).
A. INTRODUCTION
La maladie d’Aujeszky ou pseudorage est due à un alphaherpèsvirus de la famille des Herpesviridae. Il atteint le
système nerveux central et d’autres organes, comme l’appareil respiratoire, de tous les mammifères sauf
l’homme et les grands singes. Elle atteint essentiellement le porc, son hôte naturel, qui demeure infecté de façon
chronique après guérison clinique. On peut lutter contre elle en bloquant les troupeaux infectés, par l’élimination
des animaux infectés et par la vaccination.
L’isolement du virus de la maladie d’Aujeszky (VMA) est utilisé pour le diagnostic des formes cliniques de la
maladie, mais d’autres techniques sont nécessaires pour le diagnostic des infections latentes. Cependant, à part
les suidés, la plupart des espèces animales atteintes ne vivent pas suffisamment longtemps après l’infection pour
produire une quantité décelable d’anticorps.
Manuel terrestre de l’OIE 2005 333

Chapitre 2.2.2. — Maladie d’Aujeszky
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
a) Isolement du virus
Le diagnostic de la MA peut être confirmé par isolement du virus, chez les porcs vivants, à partir
d’écouvillonnages de la gorge ou des cavités nasales ainsi que de biopsies d’amygdales et, chez les
cadavres, à partir surtout de l’encéphale et des amygdales. Chez les bovins, lorsque du prurit est constaté,
un prélèvement de moelle épinière correspondant à la zone du prurit peut être utilisé. Chez les porcs
infectés de façon latente, le ganglion trijumeau est celui qui donne les meilleurs résultats, mais l’isolement
en culture à partir de ces animaux est difficile.
Les prélèvements sont homogénéisés dans de l’eau physiologique ou du milieu de culture cellulaire
contenant des antibiotiques et la suspension est clarifiée par centrifugation à 900 g pendant 10 min. Le
liquide surnageant est utilisé pour l’inoculation de la culture cellulaire. De nombreuses cultures cellulaires
(cellules mères ou lignées cellulaires) sont sensibles au virus de la MA, mais en général on utilise une lignée
de cellules de rein de porc (PK-15). Le milieu de culture des cellules doit contenir des antibiotiques (comme
200 UI/ml de pénicilline ; 100 µg/ml de streptomycine ; 100 µg/ml de polymyxine et 3 µg/ml de fungizone).
Le virus de la MA produit un effet cytopathogène (ECP) qui apparaît généralement en 24 à 72 h, mais les
cultures cellulaires doivent être incubées 5 à 6 jours. On voit apparaître des cellules réfringentes dans la
couche cellulaire, puis le tapis cellulaire se décolle. Des syncytiums d’aspect et de taille variables se
développent. En l’absence de tout ECP, il est recommandé de faire un passage aveugle. Une information
complémentaire peut être obtenue en colorant à l’hématoxyline-éosine des lamelles supportant la culture
cellulaire, en vue de mettre en évidence les inclusions acidophiles intranucléaires caractéristiques d’une
infection par herpèsvirus, avec margination de la chromatine. Le virus peut également être identifié par
immunofluorescence, immunopéroxydase ou neutralisation par un sérum spécifique.
L’isolement du virus de la MA permet de confirmer la suspicion, mais son échec ne permet pas de garantir
l’absence d’infection.
b) Identification du virus par amplification en chaîne par polymérase
Cette technique d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) peut être utilisée pour révéler la présence
du génome du virus dans des organes ou des secrétions. Comme cette technique est encore récente, il
n’est pas possible de recommander une procédure standardisée. On peut seulement donner quelques
informations générales.
Cette technique est fondée sur l’amplification sélective d’une partie spécifique du génome en utilisant
2 amorces situées à chaque extrémité de la séquence choisie. Dans un premier temps, l’ADN complet
est isolé à l’aide de techniques classiques (c’est-à-dire la digestion par protéinase K et l’extraction par
phénol-chloroforme). La séquence cible peut être amplifiée jusqu’à 106 fois à l’aide de cycles de
dénaturation de l’ADN pour donner des fragments d’ADN simple brin d’hybridation des amorces et de
synthèse des séquences complémentaires avec une ADN polymérase thermostable. Les amorces doivent
être choisies de façon à amplifier une séquence présente chez les souches de virus de la MA, par exemple
des fragments des gènes gB ou gD qui codent des glycoprotéines essentielles.
Le produit amplifié peut être identifié par son poids moléculaire, déterminé par migration en gel d’agarose, et
une confirmation peut être faite par la méthode d’hybridation Southern en utilisant une sonde
complémentaire. Des techniques plus récentes utilisent une hybridation avec des sondes marquées par
enzymes ce qui donne une réaction colorée après incubation avec un substrat approprié. Une amélioration
de la technique est la PCR « nichée » qui emploie deux jeux d’amorces, l’un étant localisé au sein de la
séquence amplifiée par le premier jeu. En utilisant des températures appropriées d’hybridation, dans une
réaction en deux temps, la sensibilité et la spécificité de la PCR peuvent être améliorées.
Dans tous les cas, le principal avantage de la PCR par rapport aux techniques classiques d’isolement du
virus est la rapidité car l’identification initiale peut se faire en un jour et la confirmation du produit PCR le
lendemain. Avec les équipements les plus modernes, le processus complet peut se faire en un jour.
Cependant, en raison de la nature de l’épreuve, de nombreuses précautions doivent être prises pour éviter
la contamination des échantillons avec de l’ADN étranger provenant de réactions antérieures ou d’une
contamination de l’environnement du laboratoire (voir le Chapitre I.1.5., « Contrôle de la stérilité ou de
l’absence de contamination des matériels biologiques »). Ceci peut limiter la valeur de l’épreuve dans de
nombreux laboratoires et, par suite, cette technique ne peut pas être pleinement recommandée pour le
diagnostic de routine, bien que des méthodes soient disponibles pour prévenir la contamination par de
l’ADN extérieur (c’est-à-dire le système d’UTP-UNG [d-uracil triphosphate/uracil-N-glycosylase]). Beaucoup
de laboratoires d’analyses limitent l’emploi de la PCR à la détection de l’infection latente.
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2. Épreuves sérologiques
Toute technique sérologique doit être suffisamment sensible pour donner une réponse positive avec le sérum
étalon international de l’OIE. Ce sérum est fourni par le Laboratoire français de référence de l’OIE pour la maladie
d’Aujeszky (se reporter à la liste de la partie 3 de ce Manuel terrestre) et doit être reconstitué avant l’emploi en
suivant les indications fournies. Pour les échanges internationaux, l’épreuve doit être suffisamment sensible pour
fournir une réponse positive avec la dilution au demi du sérum étalon.
La neutralisation virale a été reconnue comme la méthode sérologique de référence (4, 27), mais pour le
diagnostic et le dépistage, elle a été largement remplacée par la méthode ELISA qui permet une application sur
une bien plus grande échelle (2, 11, 15, 17). Les épreuves peuvent être réalisées aussi bien sur de l’exsudat de
muscle que sur du sérum.
Une épreuve d’agglutination au latex a été mise au point et peut être utilisé pour le dépistage. Des trousses de
diagnostic sont disponibles dans le commerce.
a) Séroneutralisation (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
La neutralisation virale en culture cellulaire peut faire appel à différentes techniques qui diffèrent en fonction
de la durée d’incubation du mélange virus/sérum (par exemple 1 h à 37°C ou 24 h à 4°C) et de la présence
ou de l’absence de complément. La plupart des laboratoires utilisent une durée de 1 h à 37°C, en l’absence
de complément, car c’est facile et rapide. Cependant, la sensibilité peut être améliorée en augmentant la
période d’incubation (24 h à 4°C), ce qui permet la détection de niveaux d’anticorps 10 à 15 fois plus faibles
que ceux révélés par la méthode de 1 h de contact. Pour les échanges internationaux, la méthode doit être
suffisamment sensible pour détecter la dilution au demi du sérum étalon international de l’OIE.
La séroneutralisation virale ne permet pas de distinguer les anticorps d’origine vaccinale des anticorps
d’origine infectieuse. Elle est l’une des deux épreuves répondant aux exigences du Chapitre du Code de la
santé des animaux terrestres de l’OIE quant il se réfère à « une épreuve de diagnostic du virus entier ».
Cellules : On utilise des cellules sensibles au virus de la MA ; il peut s’agir de lignées cellulaires (par
exemple, PK-15, SK6) ou de cultures de cellules mères ou secondaires.
Milieu de culture cellulaire : Le milieu dépend du type de cellules. Par exemple, le milieu pour les cellules
PK-15 est le milieu minimum essentiel d’Eagle (MEM) avec 10 % de sérum de fœtus bovin et des
antibiotiques (100 UI/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine ou, à la place, 50 µg/ml de
gentamicine).
Entretien des cellules : Les cellules sont cultivées dans des récipients, de 7,5 cm² de surface, par exemple.
Elles sont trypsinées 1 ou 2 fois par semaine. Pour une trypsination hebdomadaire, les cellules sont
cultivées dans 50 ml de milieu avec un taux de multiplication de cinq. Pour 2 trypsinations par semaine, les
cellules sont cultivées dans 30 ml de milieu, avec un taux de multiplication de 3.
Pour la trypsination, le milieu de culture est enlevé lorsque le tapis cellulaire est complet. Le tapis cellulaire
est lavé avec environ 5 ml de mélange trypsine/acide éthylène-diamine-tétra-acétique (EDTA)
(0,25 %) récemment décongelé. Le liquide de lavage est éliminé et la préparation est lavée de nouveau,
avec seulement quelques groupes de trypsine. La boîte est placée dans une étuve à 37°C pendant 5 à
10 min jusqu’à ce que les cellules se détachent. Quand le tapis est décollé et les cellules bien séparées,
elles sont suspendues dans 90 ml de milieu de culture et cette suspension est distribuée dans 3 flacons de
culture cellulaire de 75 cm² de surface.
Virus : Une souche adéquate de virus de la MA, comme la souche Kojnok ou la souche NIA-3, est
conservée à une température inférieure ou égale à –70°C ou, sous forme lyophilisée, à 4°C.
Préparation de la suspension de virus : Le liquide de culture est enlevé d’un flacon de culture cellulaire
contenant un tapis cellulaire complet. Environ 1 ml de la suspension virale de titre connu (environ
107 DICT50/ml [Dose de virus infectant 50 % de la culture tissulaire]) est ajouté et le flacon est incubé à 37°C
pendant 1 h. Puis, 30 ml de milieu de culture sont ajoutés et le flacon est de nouveau incubé à 37°C. Le
flacon est examiné fréquemment jusqu’à ce qu’il y ait environ 75 % de destruction cellulaire (après environ
36 à 48 h). Il est alors congelé à une température inférieure ou égale à –20°C pour faire éclater les cellules.
Le flacon est ensuite congelé et agité vigoureusement. Le milieu de culture est récolté et centrifugé à
1 500 g pendant 15 min. Le liquide surnageant est divisé en aliquots (d’environ 0,5 ml) distribués dans
de petits tubes identifiés (la date et la référence du virus), conservés à une température inférieure ou égale
à –70°C jusqu’au moment de l’emploi.
Manuel terrestre de l’OIE 2005 335

Chapitre 2.2.2. — Maladie d’Aujeszky
Titrage de la suspension virale : Ce titrage est effectué selon la méthode de Reed et Muench ou celle de
Kärber et le titre est exprimé par 50 µl et par ml.
La séroneutralisation virale nécessite l’emploi d’un sérum positif témoin de titre connu en anticorps
neutralisant le virus de la MA (il doit être ajusté par rapport au sérum étalon international ou un sous-étalon
préparé à partir de ce dernier) et d’un sérum négatif témoin (provenant d’un porc dépourvu d’anticorps de la
MA, c’est-à-dire présent dans un effectif officiellement indemne de cette maladie). Les sérums à étudier
doivent être de bonne qualité et séparés rapidement du caillot afin d’éviter toute toxicité.
On peut utiliser une technique qualitative ou quantitative de neutralisation virale, les deux étant décrites
ci-dessous.
• Technique qualitative
i) Le complément des sérums est inactivé par chauffage à 56°C pendant 30 min.
ii) Chaque sérum non dilué est placé dans 3 puits d’une microplaque pour culture cellulaire de 96 puits, à
raison de 50 µl par puits.
iii) 50 µl de suspension virale contenant 100 DICT50/50 µl (ou 2 x 103 DICT50/ml), obtenue en diluant la
suspension virale de titre connu dans du milieu MEM, sont ajoutés dans chaque puits.
iv) La microplaque est agitée et placée dans une étuve pendant 1 h à 37°C (CO2 optionnel).
v) 150 µl de suspension cellulaire contenant environ 150 000 cellules/ml sont ajoutés à chaque puits.
vi) La microplaque est couverte (pour une incubation en présence de CO2) ou un film plastique est
soigneusement appliqué sur les bords (pour une incubation en l’absence de CO2). La microplaque est
légèrement agitée pour obtenir une distribution des cellules sur le fond de chaque puits et elle est
placée à l’étude à 37°C (CO2 optionnel).
vii) Témoins : Chaque lot de plaques doit comprendre les témoins suivants :
Témoin viral : Il est destiné à vérifier la quantité de virus utilisée pour l’épreuve. La dose de virus
utilisée pour la neutralisation (titre prévu de 100 DICT50/50 µl) est diluée avec du MEM à 1/10, 1/100 et
1/1 000. 50 µl de chaque dilution sont placés dans au moins 8 puits et 50 µl de milieu sont ajoutés
avant une incubation de 1 h à 37°C. La suspension cellulaire est ajoutée de la même façon que pour
les sérums éprouvés.
Témoin cellulaire : 150 µl de suspension cellulaire et 100 µl de MEM sont placés dans au moins
2 puits.
Témoin sérum positif : Un sérum de titre connu en anticorps neutralisant le virus de la MA est utilisé.
Cinq dilutions sont préparées de la même façon que pour les sérums testés : une dilution
correspondant au titre du sérum, des dilutions 2 et 4 fois et des dilutions 2 et 4 fois moins (ce qui
équivaut à T, T/2, T/4, 2T et 4T, T étant le titre du sérum, c’est-à-dire le sérum non dilué pour l’épreuve
qualitative). A 50 µl des dilutions du sérum positif témoin, on ajoute 50 µl de la suspension virale
contenant 100 DICT50/50 µl. Les cellules sont incubées et la suspension cellulaire est ajoutée de la
même façon que pour les sérums éprouvés.
Témoin sérum : Il est destiné à vérifier l’absence d’effet cytotoxique des sérums. Les puits contenant
50 µl de chaque sérum sont incubés pendant une heure à 37°C en présence de 50 µl de milieu. Puis,
150 µl de suspension cellulaire sont ajoutés, de la même façon que pour les sérums soumis à
l’épreuve.
Témoin sérum négatif : Ceci est fait comme pour les sérums soumis à l’épreuve.
viii) Lecture des résultats : Un microscope à optique inversé (x100) est utilisé pour examiner les cellules en
vue de la recherche des effets cytotoxiques et cytopathogènes après 48 et 72 h. Les témoins doivent
fournir les résultats suivants pour que les résultats soient considérés comme valables :
Témoin virus : Le titre de la suspension virale doit être compris entre 30 et 300 DICT50/50 µl.
Témoin cellules : Le tapis cellulaire doit être intact.
Témoin sérum positif : Le titre obtenu doit être égal au titre prévu, à une dilution près.
Témoins sérum : La recherche de l’ECP doit prendre en compte une éventuelle cytotoxicité.
Témoin sérum négatif : Un ECP doit être présent.
ix) Pour les sérums à tester, on peut avoir les résultats suivants :
Présence d’ECP dans les 3 puits : résultat négatif ;
Absence d’ECP dans les 3 puits au 3e jour : résultat positif ;
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Chapitre 2.2.2. — Maladie d’Aujeszky
Présence d’ECP dans 1 seul puits : résultat douteux ; à refaire ;
Petites plaques indiquant un ECP au 3e jour : résultat douteux ; à refaire ;
Toxicité dans le témoin sérum et les puits du sérum éprouvé : résultat ininterprétable, l’épreuve doit
être refaite (N.B. : Le remplacement du milieu avec du nouveau milieu après 16 h d’incubation réduit la
toxicité sans modifier le titre des anticorps).
x) Interprétation des résultats : L’épreuve révèle la présence ou l’absence d’anticorps neutralisant le virus
de la MA. Il est incapable de distinguer les animaux vaccinés des animaux infectés.
La technique décrite (neutralisation virale pendant 1 h à 37°C) peut donner des résultats faussement
négatifs ou des résultats faussement positifs. La sensibilité peut être augmentée (conduisant à moins
de faux négatifs) en allongeant la durée du contact virus/sérum avant l’addition des cellules (24 h à
4°C).
Une technique qualitative de ce type, employant du sérum non dilué (dilution finale du ½) peut donner
dans certains cas des résultats faussement positifs à cause d’une neutralisation non spécifique du
virus. Cette difficulté peut être résolue en utilisant la technique quantitative comme épreuve de
confirmation (cf. ci-dessous).
• Technique quantitative
Elle est semblable à la technique qualitative, mais chaque sérum est étudié à la fois non dilué et après
plusieurs dilutions. En fonction de la précision désirée, de l’objectif de l’étude et du titre attendu, un ou
plusieurs puits sont utilisés pour chaque dilution de sérum et un plus ou moins grand nombre de dilutions.
Dans l’idéal, on peut décrire une méthode fondée sur 3 puits par dilution et pour des dilutions allant jusqu’à
1/256 comme dilution initiale.
i) Le complément des sérums à tester est inactivé par chauffage au bain-marie à 56°C pendant 30 min ;
ii) On ajoute 50 µl de milieu MEM aux puits A3 à A6 d’une microplaque de 96 puits pour culture cellulaire.
iii) On ajoute 50 µl de sérum pur à tester aux puits A1 à A3 et on continue de la même façon dans les
puits des rangées B, C, etc. pour les autres sérums à étudier ;
iv) A l’aide d’une pipette multicanaux, on mélange le contenu des puits de la colonne 3, puis on transfère
50 µl dans la colonne 4 et ainsi de suite jusqu’à la colonne 6 ou davantage, en utilisant les mêmes
embouts. On élimine 50 µl des puits de la 2e colonne ;
v) Les témoins sont préparés comme dans la technique qualitative ;
vi) On ajoute 50 µl de milieu MEM dans les puits de la colonne 1 à la place de virus. Ces puits
correspondent aux témoins sérums. La suspension virale est déposée dans tous les autres puits. Les
manipulations suivantes sont les mêmes que celles de la technique qualitative ;
vii) Lecture des résultats : Le titre neutralisant d’un sérum est exprimé par le dénominateur de la plus
grande dilution initiale qui entraîne une neutralisation de l’ECP viral dans 50 % des puits. Est
considérée comme positive une neutralisation à n’importe quelle dilution (même non dilué, ce qui
correspond à une dilution finale de ½). Si le sérum est neutralisant uniquement en l’absence de dilution
(avec multiplication virale et ECP à la dilution du demi et aux dilutions suivantes), il est souhaitable
d’utiliser d’autres épreuves (ELISA ou l’agglutination au latex) pour confirmer le résultat, ou de
demander un autre prélèvement sur le même animal, au moins 8 jours après le premier.
b) Méthode immuno-enzymatique (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
La sensibilité de la méthode immuno-enzymatique (ELISA) est généralement supérieure à celle de la
séroneutralisation virale avec 1 h de neutralisation et sans complément. Des sérums faiblement positifs
fournissent une meilleure réponse en neutralisation virale avec neutralisation pendant 24 h et d’autres avec
l’épreuve ELISA.
Des trousses de diagnostic utilisant une méthode ELISA sont disponibles dans le commerce, à base de
technique indirecte ou par compétition pour la recherche des anticorps. Ils diffèrent par leur mode de
préparation de l’antigène, le conjugué ou le substrat, la durée de l’incubation et l’interprétation des résultats.
Leur principal avantage est qu’ils permettent un traitement rapide de nombreux échantillons. Les
manipulations peuvent être automatisées et les résultats analysés par ordinateur. Certains coffrets
permettent de faire la différence entre des porcs infectés et des porcs vaccinés à l’aide d’un vaccin délété
(6, 20, 21). Par ailleurs, des ELISA non commercialisés peuvent être utilisés (2, 17) à la condition qu’ils
fournissent un résultat positif avec la dilution au ½ du sérum étalon international de l’OIE (sensibilité
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