table des matieres premiere partie etude bibliographique

9
TABLE DES MATIERES
TABLE DES MATIERES ....................................................................................9
TABLE DES ILLUSTRATIONS .......................................................................13
INTRODUCTION...............................................................................................17
PREMIERE PARTIE
ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE
I- L’infection par le VRSB................................................................................21
I-1. Epidémiologie .................................................................................21
I-1-1. Espèces sensibles......................................................................................21
I-1-2. Transmission du virus ..............................................................................22
I-1-3. Saisonnalité, persistance virale................................................................22
I-1-4. Facteurs favorisants..................................................................................22
I-2. Symptômes, lésions.........................................................................23
I-2-1. Signes cliniques........................................................................................23
I-2-2. Aspect lésionnel........................................................................................24
I-3. Pathogénie .......................................................................................25
I-3-1. Cibles cellulaires......................................................................................25
I-3-2. Mécanismes pathogéniques......................................................................26
I-4. Conséquences diagnostiques...........................................................29
I-4-1. Animal vivant............................................................................................30
¤ Sérologie : recherche indirecte...................................................................30
¤ Virologie : recherche directe ......................................................................30
I-4-2. Animal mort..............................................................................................31
I-5. La vaccination..................................................................................32

10
II- Le Virus Respiratoire Syncytial, un pneumovirus...................................33
II-1. Taxinomie.......................................................................................33
II-2. Propriétés physico-chimiques ........................................................34
II-3. Structure .........................................................................................35
II-4. Génome ..........................................................................................36
II-5. Protéines virales .............................................................................37
II-5-1. Les protéines non structurales : NS1 et NS2 ...........................................38
II-5-2. Les protéines de nucléocapside ...............................................................38
¤ la nucléoprotéine N.....................................................................................38
¤ la phosphoprotéine P ..................................................................................39
¤ la polymérase L...........................................................................................39
II-5-3. Les protéines de matrice..........................................................................40
II-5-4. Les protéines d’enveloppe.......................................................................40
¤ la protéine de fusion F ................................................................................40
¤ la glycoprotéine G.......................................................................................41
¤ la protéine SH (pour Small Hydrophobic)..................................................44
II-6. Cycle de réplication........................................................................44
II-7. Immunologie ..................................................................................45
II-7-1. Structures immunogènes.........................................................................45
II-7-2. Réponse immunitaire humorale..............................................................46
II-7-3. Immunité à médiation cellulaire.............................................................48
III- Variabilité du VRSB et notion de quasi-espèces.....................................49
III-1. Etude de la variabilité du VRSB...................................................49
III-1-1. Utilisation d’anticorps monoclonaux....................................................49
III-1-2. Analyse du génome viral........................................................................52
III-1-3. Conséquences ........................................................................................56
III-2. Mécanismes moléculaires de la variabilité génétique des virus à
ARN.....................................................................................................................57
III-2-1. Variabilité par recombinaisons.............................................................57
III-2-2. Variabilité par réassortiments...............................................................58
III-2-3. Variabilité par mutations.......................................................................58
III-3. Le concept de quasi-espèces.........................................................59
III-3-1. Naissance du concept de quasiespèces..................................................59
III-3-2. Evolution du concept.............................................................................60

11
DEUXIEME PARTIE
ETUDE EXPERIMENTALE
I- Matériels et méthodes ..................................................................................65
I-1. Cultures cellulaires..........................................................................65
¤ Passage des cellules sur cultures cellulaires :..............................................65
I-2. Souches virales................................................................................66
I-2-1. Isolement de la souche virale W2.............................................................66
I-2-2. Titrage viral..............................................................................................66
I-2-3. Clonage biologique..................................................................................67
I-3. Technique d’immunocytochimie.....................................................67
I-4. Expérimentation animale.................................................................68
I-5. RT- PCR ..........................................................................................69
I-5-1. Phase de reverse transcription.................................................................69
I-5-2. Phase d’amplification ..............................................................................70
I-5-3. Migration sur gel......................................................................................71
I-6. Clonage moléculaire........................................................................71
I-7. Extraction ADN plasmidique..........................................................72
I-8. Séquençage......................................................................................73
II- Résultats........................................................................................................73
II-1. Stratégie...........................................................................................73
II-2. Résultats du clonage moléculaire....................................................75
II-3. Résultats du séquençage..................................................................76
II-3-1. Les séquences consensus..........................................................................77
II-3-2. Les séquences des clones moléculaires....................................................78
¤ Les differentes mutations relevées.................................................................78
¤ Localisation préférentielle de ces mutations sur le gène G ..........................85
¤ Fréquences de mutations...............................................................................85
IV- Discussion....................................................................................................86

12
ANNEXES ..........................................................................................................89
REFERENCES ………………………………………….………………………………… 97

13
TABLE DES ILLUSTRATIONS
Figure 1: Modèle de l'immunopathogénèse du VRSH. Les facteurs médiateurs ou
modulateurs de la réponse immunitaire à l'infection par le VRS sont ici représentés, et
particulièrement le processus qui induit la réactivité des voies respiratoires (Graham,
2000).................................................................................................................................29
Figure 2: Photographie d'un pneumovirus...............................................................................35
Figure 3: Représentation schématique du génome du VRSB. ................................................36
Figure 4: Représentation schématique de la structure primaire de la glycoprotéine G du
VRSB (TM: transmembranaire) (Larsen, 2000). .............................................................42
Figure 5 : Représentation schématique de la structure secondaire de la protéine G. Les flèches
bleues montrent les deux régions variables (en rouge) et la flèche verte le domaine
conservé............................................................................................................................43
Figure 6: Arbre phylogénétique sur la glycoprotéine G de 87 isolats de VRSB, un isolat de
VRSO (Virus Respiratoire Syncytial Ovin) et 2 isolats de VRSH. .................................53
Figure 7: Séquence consensus pour chaque sous-groupe de VRSB entre les résidus
aminoacides 170 et 209 de la protéine G. Les flèches horizontales représentent les
épitopes linéarisés étudiés par Langedijk et al. (1998), les flèches verticales montrent les
mutations qui ont déterminé les sous-groupes d’antigènes et les rectangles indiquent la
localisation des hélices α. ................................................................................................54
Figure 8: Modélisation de la boucle à cystéine chez le VRSB, souche vaccinale (souche
391.2) à gauche et souches du sous-groupe VI à droite. Cette région contient deux ponts
disulfures (en jaune). Les hélices alpha sont en bleu et rouge. Les résidus 171 à 189 dans
la représentation de la souche 391.2 correspondent aux résidus 1 à 19 des souches du
groupe VI..........................................................................................................................55
Figure 9 : Matériel d'inoculation (nébullisateur DeVillbiss UltraNeb 99 et masque
d'inoculation)....................................................................................................................68
Figure 10: Schéma représentant le plasmide pCR4-TOPO utilisé et ses amorces (In
Vitrogen). .........................................................................................................................72
Figure 11: Schéma expérimental résumant les méthodes d’obtention des différentes
populations virales analysées dans cette étude.................................................................74
Figure 12: Photographie d’un gel d’électrophorèse. ...............................................................76
Figure 13: Alignement de la séquence consensus nucléotidique de la souche W2 avec la
souche de référence..........................................................................................................77