10/12/2013 GUIMERA Jordan L2 Génétique Médicale Pr

GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
10/12/2013
GUIMERA Jordan L2
Génétique Médicale
Pr. LEVY
Relecteur n°3
10 pages
Cytogénétique Moléculaire
Génétique et société : Levy nous remercie pour le téléthon !!!
A. Introduction
Ce cours fait suite au cours de génétique chromosomique du 06/11. Dans celui-ci on avait parlé des anomalies
chromosomiques et des différents caryotypes qui avaient une résolution de 5 Mb maxi, ici nous allons voir les
autres techniques qui permettent d'augmenter la résolution pour détecter de plus petites anomalies.
La cytogénétique conventionnelle étudie le caryotype standard et le caryotype à haute résolution et on est à 5
Mb au maximum. En cytogénétique moléculaire, on sera à des résolutions de l'ordre de la centaine de kb, et
c'est tout ce qu'on ne voit pas au niveau chromosomique dans un caryotype standard.
B. Hybridation in situ en fluorescence FISH.
I. Principe
Elle est basée sur l'hybridation moléculaire.
L'hybridation moléculaire est le principe le plus extraordinaire jamais découvert en biologie, et on ne sait
toujours pas comment il fonctionne.
Elle possède 2 propriétés :
–Dénaturation = séparation des 2 brins d'une molécule d'ADN, c'est pour que la sonde simple brin
reconnaisse sa séquence cible.
–Renaturation : ré-association spécifique d'une molécule d'ADN simple brin avec sa séquence
complémentaire.
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Plan
A. Introduction
B. Hybridation in situ en fluorescence
I. Principe
II. Les Sondes
III. Les Cibles
IV. Les étapes
V. Utilisation de la FISH
VI. Les limites
VII. Multi-fish
C. Hybridation génomique comparative métaphasique (CGH)
D. CGH sur microréseau d'ADN : ACPA
I. Principe
II. Les sondes
III. Analyse
IV. Interprétation
V. Intérêts
VI. Limites

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Cela se fait dans certaines conditions de température, de pH et de salinité.
Dans l'hybridation moléculaire, les molécules sont dénaturées, dé-associées, et à ce moment là, on obtient un
support où toutes les molécules sont simples brins, et notre fragment d'ADN va pouvoir ainsi s'hybrider. Si la
sonde que l'on veut voir s'hybrider est reconnue par une sonde fluorescente, on aura une hybridation in situ en
fluorescence car cette sonde marquée sera visible en microscopie à l'aide de filtres spéciaux.
II. Les Sondes
Ce sont des séquences d'acides nucléiques marquées par un ou plusieurs fluorochromes :
–Différents types :
–Séquences spécifiques d'ADN répétées (ex : centromère ou les télomères (TTAGGG) ou les
séquences des chromosomes acrocentriques correspondant aux séquences ribosomales)
–Séquences uniques : locus spécifique (analyse d'une petite partie du chromosome, un point) ou
peintures chromosomiques (permettant de marquer et d'analyser la totalité d'un chromosome).
–Marquage : introduction des fluorochromes dans un fragment d'ADN.
–Random priming
–Nick translation
Les deux derniers noms n'ont pas été traités mais étaient sur la diapo.
Les sondes centromériques sont de type ADN satellite. Il existe aussi des sondes télomériques et acrocentriques.
III.Les Cibles
Les cibles peuvent être plusieurs choses :
–Les chromosomes métaphasiques (les mêmes que ceux des caryotypes)
–Les noyaux (donc chromosomes interphasiques)
–Les fibres d'ADN étirées (peignage moléculaire)
Selon la cible que l'on choisit d'analyser, on ne recherche pas les mêmes choses :
- Sur les chromosomes métaphasiques, on va rechercher des anomalies de structure et des anomalies locus
spécifiques.
- Sur les chromosomes interphasiques, on va pouvoir repérer des anomalies de nombre car l'on peut quantifier
la quantité de fluorescence mais aussi des anomalies de structure comme des translocations mais également les
translocations réciproques.
De plus, il faut avoir en tête qu'une sonde peut s'hybrider de façon non spécifique avec une cible non voulue :
pour remédier à ça, on fait des lavages afin d'éliminer tout ce qui n'est pas spécifique. (Je suppose qu'au moins
c'est spécifique, au moins l'accrochage est solide)
IV. Les étapes
4 étapes :
–Dénaturation → ADN simple brin
–Hybridation → appariement si séquences complémentaires
–Lavage et révélation avec des conditions et paramètres de stringence particuliers pour éviter justement
ces problèmes d'hybridation non spécifique.
–Analyse avec un microscope équipé de filtres à fluorescence.
On peut avoir par exemple des sondes rDNA qui vont marquer alors la totalité des chromosomes acrocentriques
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ou alors une sonde télomérique.
V. Utilisation de la FISH
La FISH permet de faire des analyses ciblées :
Selon une orientation clinique, c'est à dire basée sur une anomalie clinique, un syndrome observé lors de la
consultation, et en fonction du diagnostic recherché, on va chercher telle ou telle anomalie. Cela peut être :
–Recherche d'une aneuploïdie en prénatal ou en postnatal (ex trisomie 21)
–Syndrome microdélétionnel/microduplication (il a dit tout plein de noms de maladie compliqués, mais
on s'en fou, car ils sont fous ces généticiens)
–Recherche de remaniement subtélomérique (avec des sondes spécifiques)
Selon une orientation cytogénétique : on fait suivre un caryotype standard/à haute résolution par une FISH pour
faire des analyses plus fines :
–Caractérisation d'une anomalie chromosomique
–Identification d'un chromosome surnuméraire
–Identification et évaluation d'une mosaïque cellulaire (si l'anomalie chromosomique clonale est
faiblement représentée)
–Contrôle des données issues de l'ACPA (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN): mécanique
chromosomique à l'origine du CNV (Copy Number Variation) observé.
VI. Les limites
–Expertise clinique, on ne connait pas la totalité des syndromes, et lorsqu'on est pas en mesure de porter
un diagnostic, dans ce cas là, on ne peut pas cibler l'analyse. Cette situation est très fréquente (presque
tous les jours) car il y a beaucoup de maladies rares.
–Connaissance des régions minimales critiques des syndromes suspectés.
–Etudes des régions subtélomériques : délicat car la composition chimique des séquences
subtélomériques ne permet pas de faire une analyse aisée, en plus, c'est coûteux → technique
abandonnée au profit de l'ACPA
–Microduplication (100 000 pb) : identification délicate, nécessite l'utilisation de techniques ayant une
résolution encore plus fine (on passe dans la génétique moléculaire … )
VII. Multi-fish
(note du prof : je l'ai mis parce que c'est joli) Même si vous n'aurez pas les couleurs sur le ronéos … hihi
Hybridation simultanée et spécifique de 24 peintures chromosomiques.
Combinaison de 5 fluorochromes.
Numérisation successive des différents signaux émis par les sondes et superposition de l'ensemble des signaux.
On obtient une couleur spécifique pour chacun des chromosomes. Si on remarque que sur un même
chromosome il y a plusieurs couleurs, c'est qu'il y a une anomalie (type translocation).
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Avantages :
–Analyse globale du génome avec une meilleure résolution que le caryotype standard
–Remaniements chromosomiques complexes
–Insertions chromosomiques
–Marqueurs chromosomiques
Limites :
–Niveau de résolution : 1,5-2 Mb au mieux
–Coût (les consommables sont chers : « En GM, on génère du déficit, et on le sait ! » )
On s'en fou de cette diapo.
Le caryotype haute résolution peut
trouver des anomalies de 4 à 5 Mb
donc des microdélétion sou des
microduplications.
FISH :
Résolution : 40 à 100 kb.
Inconvénient : analyse ciblée
–Orientation clinique
–Orientation cytogénétique
=> Nécessité de développer d'autres techniques d'identification d'anomalies chromosomiques de petite taille.
Sur cette image, on peut voir une trisomie 18 (3 chromosomes 18 sont marqués). Le marquage simultané des
chromosomes X a une valeur de CONTRÔLE (on marque un autre chromosome dont on sait qu'il a de très
faibles risques d'être anormal) : il fait office de témoin, de contrôle interne.
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C. Hybridation génomique comparative métaphasique (CGH)
Il ne nous en a pas trop parlé, car c'est plus trop utilisé.
Elle est basée sur de l'hybridation moléculaire. Le principe est qu'on mesure le rapport de fluorescence entre
l'ADN du patient et l'ADN témoin, et ceci en chaque point du chromosome. Le tout est sur un support solide,
c'est-à-dire une lame où sont étalés les chromosomes (avant on le faisait aussi sur des chromosomes
métaphasiques).
D'un coté, on a l'ADN d'un témoin qui va être utilisé comme sonde que l'on va marquer en rouge. On prend
l'ADN du malade que l'on marque d'une autre couleur. On va les combiner, et on va comparer le nombre de
copies des segments chromosomiques entre le patient et la référence.
On procède ainsi à la détection d'une perte ou d'un gain de matériel chromosomique.
- Lorsque le rapport de fluorescence est égal à 1, il y a la même quantité d'ADN, il n'y a ni perte ni gain, il y a
autant d'ADN chez le témoin que chez le patient.
- Lorsque le rapport P/T est égal à 0,5, il y a une perte de matériel génétique chez le patient, on a affaire à une
délétion.
- Lorsque le rapport P/T est égal à 1,5, il y a un gain de matériel génétique chez le patient, on a affaire à une
duplication.
Les délétions/duplications peuvent être visibles ou alors on peut s'aider de logiciels pour les repérer.
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