10/12/2013 GUIMERA Jordan L2 Génétique Médicale Pr

GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
10/12/2013
GUIMERA Jordan L2
Génétique Médicale
Pr. LEVY
Relecteur n°3
10 pages
Cytogénétique Moléculaire
Plan
A.
Introduction
B.
Hybridation in situ en fluorescence
I. Principe
II. Les Sondes
III. Les Cibles
IV. Les étapes
V. Utilisation de la FISH
VI. Les limites
VII.
Multi-fish
C.
D.
Hybridation génomique comparative métaphasique (CGH)
CGH sur microréseau d'ADN : ACPA
I. Principe
II. Les sondes
III. Analyse
IV. Interprétation
V. Intérêts
VI. Limites
Génétique et société : Levy nous remercie pour le téléthon !!!
A.
Introduction
Ce cours fait suite au cours de génétique chromosomique du 06/11. Dans celui-ci on avait parlé des anomalies
chromosomiques et des différents caryotypes qui avaient une résolution de 5 Mb maxi, ici nous allons voir les
autres techniques qui permettent d'augmenter la résolution pour détecter de plus petites anomalies.
La cytogénétique conventionnelle étudie le caryotype standard et le caryotype à haute résolution et on est à 5
Mb au maximum. En cytogénétique moléculaire, on sera à des résolutions de l'ordre de la centaine de kb, et
c'est tout ce qu'on ne voit pas au niveau chromosomique dans un caryotype standard.
B.
Hybridation in situ en fluorescence FISH.
I. Principe
Elle est basée sur l'hybridation moléculaire.
L'hybridation moléculaire est le principe le plus extraordinaire jamais découvert en biologie, et on ne sait
toujours pas comment il fonctionne.
Elle possède 2 propriétés :
– Dénaturation = séparation des 2 brins d'une molécule d'ADN, c'est pour que la sonde simple brin
reconnaisse sa séquence cible.
– Renaturation : ré-association spécifique d'une molécule d'ADN simple brin avec sa séquence
complémentaire.
1/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
Cela se fait dans certaines conditions de température, de pH et de salinité.
Dans l'hybridation moléculaire, les molécules sont dénaturées, dé-associées, et à ce moment là, on obtient un
support où toutes les molécules sont simples brins, et notre fragment d'ADN va pouvoir ainsi s'hybrider. Si la
sonde que l'on veut voir s'hybrider est reconnue par une sonde fluorescente, on aura une hybridation in situ en
fluorescence car cette sonde marquée sera visible en microscopie à l'aide de filtres spéciaux.
II. Les Sondes
Ce sont des séquences d'acides nucléiques marquées par un ou plusieurs fluorochromes :
– Différents types :
– Séquences spécifiques d'ADN répétées (ex : centromère ou les télomères (TTAGGG) ou les
séquences des chromosomes acrocentriques correspondant aux séquences ribosomales)
– Séquences uniques : locus spécifique (analyse d'une petite partie du chromosome, un point) ou
peintures chromosomiques (permettant de marquer et d'analyser la totalité d'un chromosome).
Marquage : introduction des fluorochromes dans un fragment d'ADN.
– Random priming
– Nick translation
Les deux derniers noms n'ont pas été traités mais étaient sur la diapo.
Les sondes centromériques sont de type ADN satellite. Il existe aussi des sondes télomériques et acrocentriques.
–
III.Les Cibles
Les cibles peuvent être plusieurs choses :
– Les chromosomes métaphasiques (les mêmes que ceux des caryotypes)
– Les noyaux (donc chromosomes interphasiques)
– Les fibres d'ADN étirées (peignage moléculaire)
Selon la cible que l'on choisit d'analyser, on ne recherche pas les mêmes choses :
- Sur les chromosomes métaphasiques, on va rechercher des anomalies de structure et des anomalies locus
spécifiques.
- Sur les chromosomes interphasiques, on va pouvoir repérer des anomalies de nombre car l'on peut quantifier
la quantité de fluorescence mais aussi des anomalies de structure comme des translocations mais également les
translocations réciproques.
De plus, il faut avoir en tête qu'une sonde peut s'hybrider de façon non spécifique avec une cible non voulue :
pour remédier à ça, on fait des lavages afin d'éliminer tout ce qui n'est pas spécifique. (Je suppose qu'au moins
c'est spécifique, au moins l'accrochage est solide)
IV. Les étapes
4 étapes :
– Dénaturation → ADN simple brin
– Hybridation → appariement si séquences complémentaires
– Lavage et révélation avec des conditions et paramètres de stringence particuliers pour éviter justement
ces problèmes d'hybridation non spécifique.
– Analyse avec un microscope équipé de filtres à fluorescence.
On peut avoir par exemple des sondes rDNA qui vont marquer alors la totalité des chromosomes acrocentriques
2/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
ou alors une sonde télomérique.
V. Utilisation de la FISH
La FISH permet de faire des analyses ciblées :
Selon une orientation clinique, c'est à dire basée sur une anomalie clinique, un syndrome observé lors de la
consultation, et en fonction du diagnostic recherché, on va chercher telle ou telle anomalie. Cela peut être :
– Recherche d'une aneuploïdie en prénatal ou en postnatal (ex trisomie 21)
– Syndrome microdélétionnel/microduplication (il a dit tout plein de noms de maladie compliqués, mais
on s'en fou, car ils sont fous ces généticiens)
– Recherche de remaniement subtélomérique (avec des sondes spécifiques)
Selon une orientation cytogénétique : on fait suivre un caryotype standard/à haute résolution par une FISH pour
faire des analyses plus fines :
– Caractérisation d'une anomalie chromosomique
– Identification d'un chromosome surnuméraire
– Identification et évaluation d'une mosaïque cellulaire (si l'anomalie chromosomique clonale est
faiblement représentée)
– Contrôle des données issues de l'ACPA (Analyse Chromosomique sur Puce à ADN): mécanique
chromosomique à l'origine du CNV (Copy Number Variation) observé.
VI. Les limites
–
–
–
Expertise clinique, on ne connait pas la totalité des syndromes, et lorsqu'on est pas en mesure de porter
un diagnostic, dans ce cas là, on ne peut pas cibler l'analyse. Cette situation est très fréquente (presque
tous les jours) car il y a beaucoup de maladies rares.
Connaissance des régions minimales critiques des syndromes suspectés.
– Etudes des régions subtélomériques : délicat car la composition chimique des séquences
subtélomériques ne permet pas de faire une analyse aisée, en plus, c'est coûteux → technique
abandonnée au profit de l'ACPA
Microduplication (100 000 pb) : identification délicate, nécessite l'utilisation de techniques ayant une
résolution encore plus fine (on passe dans la génétique moléculaire … )
VII.
Multi-fish
(note du prof : je l'ai mis parce que c'est joli) Même si vous n'aurez pas les couleurs sur le ronéos … hihi
Hybridation simultanée et spécifique de 24 peintures chromosomiques.
Combinaison de 5 fluorochromes.
Numérisation successive des différents signaux émis par les sondes et superposition de l'ensemble des signaux.
On obtient une couleur spécifique pour chacun des chromosomes. Si on remarque que sur un même
chromosome il y a plusieurs couleurs, c'est qu'il y a une anomalie (type translocation).
3/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
Avantages :
– Analyse globale du génome avec une meilleure résolution que le caryotype standard
– Remaniements chromosomiques complexes
– Insertions chromosomiques
– Marqueurs chromosomiques
Limites :
– Niveau de résolution : 1,5-2 Mb au mieux
– Coût (les consommables sont chers : « En GM, on génère du déficit, et on le sait ! » )
On s'en fou de cette diapo.
Le caryotype haute résolution peut
trouver des anomalies de 4 à 5 Mb
donc des microdélétion sou des
microduplications.
FISH :
Résolution : 40 à 100 kb.
Inconvénient : analyse ciblée
– Orientation clinique
– Orientation cytogénétique
=> Nécessité de développer d'autres techniques d'identification d'anomalies chromosomiques de petite taille.
Sur cette image, on peut voir une trisomie 18 (3 chromosomes 18 sont marqués). Le marquage simultané des
chromosomes X a une valeur de CONTRÔLE (on marque un autre chromosome dont on sait qu'il a de très
faibles risques d'être anormal) : il fait office de témoin, de contrôle interne.
4/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
C.
Hybridation génomique comparative métaphasique (CGH)
Il ne nous en a pas trop parlé, car c'est plus trop utilisé.
Elle est basée sur de l'hybridation moléculaire. Le principe est qu'on mesure le rapport de fluorescence entre
l'ADN du patient et l'ADN témoin, et ceci en chaque point du chromosome. Le tout est sur un support solide,
c'est-à-dire une lame où sont étalés les chromosomes (avant on le faisait aussi sur des chromosomes
métaphasiques).
D'un coté, on a l'ADN d'un témoin qui va être utilisé comme sonde que l'on va marquer en rouge. On prend
l'ADN du malade que l'on marque d'une autre couleur. On va les combiner, et on va comparer le nombre de
copies des segments chromosomiques entre le patient et la référence.
On procède ainsi à la détection d'une perte ou d'un gain de matériel chromosomique.
- Lorsque le rapport de fluorescence est égal à 1, il y a la même quantité d'ADN, il n'y a ni perte ni gain, il y a
autant d'ADN chez le témoin que chez le patient.
- Lorsque le rapport P/T est égal à 0,5, il y a une perte de matériel génétique chez le patient, on a affaire à une
délétion.
- Lorsque le rapport P/T est égal à 1,5, il y a un gain de matériel génétique chez le patient, on a affaire à une
duplication.
Les délétions/duplications peuvent être visibles ou alors on peut s'aider de logiciels pour les repérer.
5/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
Avantages :
– Analyse globale du génome : visualisation + analyse
– ADN génomique, chromosomes du cas index inutile
Limites :
– Faible niveau de résolution : 5-10 Mb jusqu'à 3 Mb.
– Seuil de détection des mosaïques cellulaires (il doit y avoir au moins 50% de cellules anormales)
– Remaniements chromosomiques équilibrés (ni gain ni perte)
– Technique délicate
D.
CGH sur microréseau d'ADN : ACPA
I. Principe
Même technique de départ, c'est à dire le rapport de fluorescence.
Le support devient une lame de verre où est positionné le génome entier mais de façon fragmenté → analyse
complète.
Ces lames contiennent des dizaines de millions de spots correspondant chacun à une séquence du génome. Ces
séquences font de 16 pb à quelques dizaines de kb. Elles ont donc beaucoup plus courtes que pour le CGH
classique. Les sondes utilisées sont de l'ADN témoin plus l'ADN du malade. Les rapports de fluorescence sont
toujours de 1, 1,5 ou 0,5.
On est obligé d'utiliser un logiciel qui fait toutes les analyses car les délétions/duplications sont invisibles à
l'oeil nu : celui-ci va nous donner le rapport P/T de chaque région et va faire un pointage où il y a une anomalie.
6/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
7/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
Chaque carré rassemble plusieurs milliers de séquences, et sur toutes ces lames, on a la totalité du génome.
8/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
L'exemple ci-dessus, c'est une ACPA avec des cellules tumorales : c'est très couramment pratiqué. Il peut y
avoir des délétions et des duplications, y compris en même temps. Même lorsqu'on fait des analyses sur l'ADN
constitutionnel de l'individu, on va avoir des pertes et des gains de matériel génétique. C'est très important car
ceci montre que toutes les pertes et les gains de matériel chromosomique ne sont pas pathogènes.
II. Les sondes
On utilise des lames où sont fixés des séquences génomiques, les sondes
BACs/PACs (Chromosome Artificiel Bactérien, ce sont des chromosomes bactériens, des vecteurs dans
lesquels on met de l'ADN humain qui peut faire jusqu'à 200 kb)
• 80-200 kb
• Il y a des puces ciblées qui contiennent entre 3200 et 3500 clones (résolution 1 Mb), 26600 clones
(tiling path array)
• Oligonucléotides
• 60-80 pb
• Densités élevées : 44K → 2,1M, résolution jusqu'à 1 kb, donc repère mieux les petites anomalies.
• Puces ciblées ou pangénomiques
On peut aussi demander des puces qui nous intéresse, les faire préparer sur-mesure.
•
La résolution est fonction de :
• la sonde : type (taille), nombre, distance
• la spécificité et la sensibilité de la réaction d'hybridation sur chaque sonde (rapport signal/bruit)
9/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
III. Analyse
Utilisation d'un support bioinformatique :
– Calcul du ratio de fluorescence (différents algorithmes)
– On enlève tout ce qui n'est pas spécifique, comme par exemple les centromères.
Visualisation graphique des résultats
– 1 point = valeur du ratio de fluorescence au niveau d'une sonde
– Observation de variations du nombre de copies (CNV) entre P et T.
– CNV : segment d'ADN >1kb dont le nombre de copies varie par rapport à un ADN de référence, sans
préjuger du caractère pathogène ou pas. On se réfère à notre expérience et aux bases de données pour
déterminer ce caractère pathogène.
IV. Interprétation
Critères d'interprétation :
– Taille (pathogène si > 400kb)
– Caractère de novo ou hérité, c'est très important, lorsqu'on a un CNV, et que l'on fait l'analyse et
qu'aucun des 2 parents sains ne l'ont, c'est un critère supplémentaire de pathogénicité.
– Type
– Contenu génique
– Phénotype clinique associé : sain/pathologique
– Description dans la population générale (d'où l'utilisation de base de données)
– Description de patients présentant le même phénotype clinique
Puis validation et interprétation.
Vérification des résultats obtenus grâce à différentes techniques de biologie moléculaire ou de FISH.
Signification du CNV observé :
– Ne pas préjuger de sa pathogénicité mais il peut être pathogène avec une possibilité de pénétrance
incomplète et d'expressivité variable, il peut être bénin, ou alors de signification complètement
inconnue.
V. Intérêts (retenir que les indications sont multiples)
Pour les patients présentant un retard mental avec plus ou moins des malformation congénitales à caryotype
normal : identification d'un CNV pathogène dans environ 17-19% (versus 3-4% pour le caryotype)
– CNV répartis sur l'ensemble du génome, il y a plus de délétions que de duplications.
– Localisation interstitielle 2 à 3 fois plus élevée qu'au niveau subtélomérique
– Récurrence faible des CNV (sauf architecture « particulière » du génome)
– Taux de détection d'anomalie 5 fois plus élevé que les techniques cytogénétiques conventionnelles.
Les mosaïques cellulaires : taux de détection de 20%, mais il n'y a pas de biais lié à la culture cellulaire.
Description de nouveaux phénotypes cliniques.
Caractérisation d'anomalies chromosomiques fines (taille inférieure à 5 Mb)
Etude des remaniements chromosomiques apparemment équilibrés mais avec phénotype anormal : représente
20% des déséquilibres identifiés.
Identification de gènes.
Il n'a fait que passer rapidement ces diapos, sans trop les détailler mais il en aurait parlé pendant le cours...
10/11
GENETIQUE MEDICALE- Cytogénétique Moléculaire
VI. Limites de l'ACPA
–
–
–
Polyploïdie
Remaniements chromosomiques équilibrés car il n'y a ni gain, ni perte
Mécanisme à l'origine du déséquilibre observé, pour le conseil génétique (intérêt du contrôle par FISH
si possible)
Il faut toujours faire un contrôle, c'est capital. Ca se fait par la FISH ou par génétique moléculaire.
11/11