Chapitre 1 : Rappel. Structure et quelques propriétés. Les

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Chapitre 1 :
Rappel.
Structure et quelques propriétés.
Les mécanismes fondamentaux.
1 Structure de l'ADN
(Rappels rapides)
1.1 Enchaînement de désoxyribonucléotides
•
•
•
Les nucléotides sont liés entre eux pas des liaisons phosphodiesters.
Par convention une chaîne est écrite de 5' vers 3'
La structure de l'ADN est une double hélice (Watson & Crick, 1953)
1.2 Propriétés liées à la structure
1.2.1 Dénaturation, renaturation, hybridation.
La dénaturation est le fait de séparer deux brins d'ADN (= Fusion de l'ADN). Le paramètre
important de cette dénaturation est la Tm (m pour melting), c'est la température à laquelle 50% de
l'ADN est fusionné.Une portion d'ADN riche en A-T se dissociera avant une région riche en C-G.
•
•
•
•
La dénaturation de l'ADN est reversible :
Réassociation entre deux brins d'ADN de même origine : renaturation, formation d'un
homoduplex.
Réassociation de deux brins d'ADN de sources différentes : hybridation, formation d'un
hétéroduplex.
De l'ADN chaffé puis refroidi rapidement reste dénaturé.
De l'ADN chauffé puis refroidi lentement se renature.
Hybridation et Tm
•
Tm dépend :
De la composition en bases de l'ADN. D'autant plus élevé que le pourcentage de paire de
bases CG est élevé.
Ex: Calcul de la Tm pour des petits fragments de 15 à 20 paires de bases.
Tm (°C) = 2 x nb pb A/T + 4 x nb pb G/C
Pour des fragments longs (>200 pb)
Tm (°C) = 69,3 + 0,41 (%CG)
Validité des deux formules : conditions standard avec 50nM d'amorces et 50nM de Na+
•
De la présence de mésappariements isolés de bases, « mismatch »
 Un nom appariement isolé abaisse la stabilité d'un hybride
 Phénomène d'autant plus sensible que le fragment d'ADN est court
 Empiriquement, l'abaissement de Tm est de 1°C pour 1% de non appariement (valable
pour des fragments de taille <50pb). Cette sensibilité est mise à profit pour détecter les
mutations ponctuelles (diagnostic) et dans la technologie des puces à ADN.
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•
Du milieu
 Les sels : à haute concentration (>1nM) pas d'effet notable. La diminution de la
concentration entraîne une diminution de la Tm.
✗
Forte concentration en sels → faible stringence
✗
Faible concentration en sels → forte stringence
Effets utilisés pour diminuer le bruit de fond et démontrer la spécificité d'une
hybridation.
•

La formamide : abaisse fortement la température de fusion.
Pour des fragments supérieurs à 100pb : ∆Tm = -0,6 x (% formamide)

NaOH: Les liaisons phosphodiesters ne sont pas clivés dans l'ADN. Le NaOH est utilisé
pour se débarasser de l'ARN.
De la longueur des fragments
Tm augmente avec la longueur des fragments. La variation de Tm est d'autant plus
marquée que les fragments sont courts.
1.2.2 Sensibilité à l'action de nucléases
Les exonucléases clivent à partir des extrémités, les endonucléases clivent à l'intérieur des
chaînes polynucléotidiques.
Les mécanismes fondamentaux sont la réplication de l'ADN et le flux de l'information
génétique.
Réplication→Transcription→Traduction→Protéine.
2 La réplication
La synthèse de l'ADN se fait de 5' vers 3' à partir d'une origine de réplication
2.1 Les enzymes
Les ADN polymérases ont besoin d'une matrice, d'une amorce et de dNTP. Les activités
enzymatiques sont les suivantes :
•
Polymérase 5'-3'
•
Exonucléase 3'-5'
•
Exonucléase 5'-3'
2.2 Origine de réplication
2.2.1 E. coli
Origine de réplication unique et réplication bidirectionnelle.
2.2.2 Eucaryotes
Origines de réplication multiples.
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2.2.3 Réplication des ADN viraux
Un ADN viral est répliqué dans une cellule eucaryote :
•
à partir d'une origine de réplication virale
•
l'assemblage du complexe au niveau de l'origine nécessite généralement une ou
plusieurs protéines spécifiques du virus.
Ex : origine virale de SV40
L'initiation de la réplication nécessite l'antigène T (hélicase hexamérique réplicative
du virus formant un complexe au niveau de ori SV40.
3. Relation gène - fonction
3.1. Le flux de l’information génétique
Le contrôle de l’expression des gènes s’effectue à tous les niveaux :
ADN
Contrôle de
l’expression
des gènes
Transcription (ARN-polymérase)
ARN
Traduction (t-ARN + ribosomes)
Protéines
(Enzymes, hormones, récepteurs…)
3.2.Différences entre eucaryotes et procaryotes
Procaryotes : gène continu, ARN non maturé, transcription/traduction couplées, gènes
polycistroniques.
Eucaryotes : introns/exons, maturation de l’ARN, migration des ARN-m vers le cytoplasme,
gènes monocistroniques.
Traduction : procaryotes VS eucaryotes
Différences dans le ribosome
– Différences dans les signaux au niveau de l'ARNm, notion de cadre de lecture.
MAIS
– Le message codé sur l'ARNm a la même signification dans les deux types cellulaires
– Le code génétiques est quasi universel
– Il est redondant, mais seuls la Méthionine et le Tryptophane ne sont codés que par un seul
triplet.
–
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3.3.Initiation – terminaison
Région promotrice
+1
ADN
Ter
Région transcrite
ARN
5’ UTR
Protéines
3’ UTR
Région traduite
COOH
NH2
3.4.Les signaux de transcription procaryotes
L’expression des gênes peut être constitutive (continue) ou régulée (ex : opéron lactose, Trp).
- 10
- 35
TTGACA
+1
Terminateur
Structure en épingle
à cheveux
N
N
TATAAT
N
ARN
N
N
UUUUUU
- GCCGCCAGNNNNNCTGGCGGC
3.5.Signaux de transcription eucaryotes
Promoteur – Activateur, une structure modulaire.
5’
Séquences activatrices
- 30
+1
TATA
Inv
Promoteur minimum
Séquences amplificatrices "enhancers"
Boîtes (CAAT, CG, CRE, octamère)
3’
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3.6.Terminaison
Séquences riches en G/T
ADN 3’
AAT AAA
TTATTT
Séquences riches en G/U
ARN
AA U AAA
20 nt
clivage
AA U AAA
polyadénylation
AA U AAA
(A A A A) n
3.7.Traduction
3.7.1.Les signaux de la traduction procaryote
5’ UTR
GAAGGAG(N)8AUG
Séquence Shine Dalgarno = RBS
UAA
UAG
UGA
3.7.2.Les signaux de traduction eucaryotes
A partir du premier AUG sur l’ARN, jusqu’au codon stop.
3’
5’
GCC(A/G)CCAUG
Séquence de Kozack
UAA
UGA
UAG
3.7.3.Distribution des protéines dans la cellule
Dans la cellule animale, il y a une compartimentation. Environ 1010protéines par cellule sont
adressées vers le compartiment ad hoc.
–
–
–
Il existe trois voies importantes pour le tri des protéines :
Transport à travers le complexe des pores nucléaires,
Transport via des translocateurs : mitochondries
Transport par voie vésiculaire pour les protéines synthétisées dans le reticulum endoplasmique,
puis adressage aux lysosomes, endosomes, membrane plasmique, sécretion (exocytose)
Il existe une sélectivité pour les protéines transportées.
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Présence de signaux d’adressage aux différents compartiments cellulaires :
Compartiment ciblé séquence
Cytosol
aucune
Noyau (import)
PPKKKRKV
Noyau (export)
LALKLAGLDI
ER
peptide signal
4. PCR : Polymerase Chain Reaction
Cette technique permet l’amplification de chaînes d’ADN :
3’
5’
3’
5’
3’
5’
95°C
3’
5’
5’
5’
5’
5’
95°C
Tm – 5°C
3’
5’
5’
3’
5’
5’
+
+
3’
5’
ADN polymérase
5’
3’
dNTP
5’
5’
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