4. Techniques genes
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Techniques d’étude des Gènes et de leur Régulation A. Galmiche, 2013-2014 1. Introduction et techniques de base 2. Détection des acides nucléiques et mesure de l‘expression des gènes: Hybridations PCR Séquençage 3. Modulation de l‘expression des gènes: techniques de surexpression, Interférence ARN 1. Introduction et techniques de base 2. Détection des acides nucléiques et mesure de l‘expression des gènes: Hybridations PCR Séquençage 3. Modulation de l‘expression des gènes: techniques de surexpression, Interférence ARN Purification de l’ADN Extraction des acides nucléiques: lyse des cellules, élimination des protéines et des lipides, pour ADN: élimination des ARN par ribonucléase précipitation / chromatographies d‘affinité (silice) ADN dosé par spectrophotométrie: absorbance UV (λ 260 nm) Electrophorèse des Acides Nucléiques migration effectuée en champ électrique constant et à pH8 : acides nucléiques sont chargés négativement dans ces conditions ADNs linéaires migrent à travers gel agarose avec vitesse proportionnelle à leur taille (circularité et superenroulement interfèrent avec migration) Les ARN tendent à former des structures secondaires / tertiaires interférant avec la migration: inclusion formamide Electrophorèse des Acides Nucléiques Gel agarose Bromure d‘ethidium / lampe UV Les acides nucléiques sont rendus fluorescents grâce à un intercalant: bromure d‘éthidium, et gel analysé avec lampe à UV Enzymes de restriction Endonucléases d‘origine bactérienne : EcoRI (Escherichia coli) Spécifiques de séquences 4-8 bp Généralement palindromes EcoRI 5‘ G AAT T C C T T A A G 5‘ G 3‘ C T T A A 5‘ + 5‘ Clivage possible en décalage de brin / bouts francs AAT T C 3‘ G DNA Ligase ADN ligase réalise l‘accolement de fragments complémentaires La ligation nécessite la présence d‘ATP G 3‘ C T T A A 5‘ + 5‘ AAT T C 3‘ G DNA Ligase 5‘ G AAT T C C T T A A G 5‘ Reverse Transcriptase et synthèse d‘ADN complémentaire Reverse transcriptase, une enzyme rétrovirale permettant la synthèse d‘un brin d‘ADN complémentaire à ARNm, c‘est à dire l‘opération inverse de la transcription. ADN RNA polymerase Reverse Transcriptase ARNm Meilleure stabilité de l‘ADNs, utilisation possible pour applications requiérant ADN, le cDNA correspdt aux séquences de l‘ARN mature (ne contient pas d‘introns du gène) Synthèse de brins ADN complémentaires par la Reverse Transcriptase Clonage L‘ADN cloné peut être amplifié, l‘ADN purifié, etc. Les Plasmides Des ADN circulaires extra-chromosomiques de 1-200 kb, capables de réplication indépdt du reste du matériel génétique Fréquents dans bactéries: typiquement, au laboratoire de biologie moléculaire, les plasmides sont maintenus dans Escherichia coli Utilisations: pour clonage et manipulation de l‘information génétique, pour production de protéines recombinantes, ou encore pour moduler l‘expression des gènes dans les cellules eucaryotes Eléments constitutifs d’un Plasmide - Origine de réplication, conditionnant la maintenance dans la bactérie - Un site de clonage multiple, ou polylinker: concentrant plusieurs sites de restriction et permettant l‘insertion aisée de fragments d‘ADN à cloner - Cassette de résistance pour un ATB: sélectionner les bactéries ou les cellules eucaryotes possédant le plasmide (par ex. ampicilline pour les bactéries, généticine pour les cellules eucaryotes) - promoteur(s) pour permettre expression procaryotes et/ou eucaryote, ainsi que séquences pour terminer transcription - éventuellement, gène rapporteur: par ex, lorsque plasmide est destiné à expression eucaryote, GFP (Green Fluorescent Protein) pour identifier les cellules transfectées pET-41a, un vecteur d’expression chez procaryote Polylinker, ou site de clonage Origine de réplication Résistance atb Promoteur procaryote Exprimer un gène dans E. coli afin d‘en purifier le produit: production de protéines recombinantes 1. Culture bactérienne en présence Atb 2. Induction production protéine 3. Lyse bactérienne 4. Purification protéine: hormone peptidique, antigène vaccinal, etc… pEGFP-N1, vecteur d’expression eucaryote Promoteur eucaryote Origine de réplication Polylinker, ou site de clonage Rapporteur fluorescent Résistance atb Exprimer un gène dans la cellule eucaryote 1. Culture bactérienne en présence Atb 2. Lyse bactérienne et purification du plasmide 3. Transfection Vecteur destiné à exprimer un gène dans les cellules eucaryotes, donc destiné à transfection 1. Introduction et techniques de base 2. Détection des acides nucléiques et mesure de l‘expression des gènes: Hybridations PCR Séquencage 3. Régulation de l‘expression des gènes: techniques de surexpression, Interférence ARN Pourquoi détecter les acides nucléiques et mesurer l‘expression des gènes en Médecine ? Etude de l‘expression des gènes pour apprécier l‘état fonctionnel de la cellule, réalisation de génotypages Détection des microbes: bactéries et virus +++ Analyser l‘expression des gènes Historiquement, techniques d’hybridation utilisant sondes (Northern, Southern), séquençage… .... L’avènement de la Médecine moléculaire repose essentiellement sur la PCR (Polymerase Chain Reaction) Hybridations des Acides Nucléiques: concept de Sondes Les sondes sont utilisées pour détecter séquences spécifiques Une sonde est un ADN mono-brin, avec une séquence complémentaire à la séquence à détecter En s’hybridant avec sa séquence cible, elle permet de la détecter Sonde ADN à étudier Préparation des Sondes A l’origine, la sonde est soit un ADN génomique, soit un ADN complémentaire (ADNc, ou cDNA), soit un ADN obtenu par synthèse chimique Sa longueur varie, typiquement > 20nt Plusieurs possibilités de marquages: fluorescent, radioactif, enzymatique Les protocoles reposant sur les sondes Blotting: pour ARN (Northern blot) et ADN (Southern blot). Après migration sur gel d’agarose, les acides nucléiques à étudier sont immobilisés sur un support inerte (nitrocellulose / nylon) sur lequel on hybride la sonde Hybridation in situ: la distribution d’une séquence d’acide nucléique est analysée sur des cellules / des tissus fixés Puces ADN: cette fois, les sondes sont immobilisées sur support Northern Blot Hybridation in situ Les cellules ou le tissu à examiner sont fixés, et incubés en présence de la sonde Les techniques de fluorescence permettent d’examiner la présence de la séquence à rechercher en microscopie Hybridation in situ Human Papillomavirus DNA (pink) in epithelial cells identified by indirect immunofluorescence using antibody against cytokeratin (green), nuclei are in blue Les „Puces“ Fragments ADN simple brins sont déposés géométriquement sur un support solide Servent de sondes pour révéler séquences présentes dans l‘échantillon à tester (les acides nucléiques à détecter sont marqués en fluorescence) Principe du Microarray Interprétation des Résultats Les puces ADN permettent d‘appréhender les régulations transcriptionnelles de façon globale Interprétation requiert analyse bioinformatique Les résultats obtenus sont validés grâce à des techniques plus quantitatives (PCR quantitative) PCR (Polymerase Chain Reaction) La PCR, ou Polymerase Chain Reaction, est une réaction d‘amplification de l‘ADN in vitro La réaction comprend: ADN matrice à amplifier, 2 amorces spécifiques encadrant la séquence à amplifier, mélange deoxynucléotides (dNTPs), ADN polymerase dans conditions ioniques appropriées Les Cycles PCR La réaction est réalisée sur un thermocycler Une alternance de cycles comprenant chacun 3 étapes 1. dénaturation de la matrice: séparation des brins (95 °C) 2. hybridation amorces (env. 55-60 °C) 3. extension par ADN polymerase (70 °C) Typiquement, une amplification PCR comprend entre 20 et 30 cycles Principe de la PCR Taq Polymerase et PCR Initialement, ADN polymérase était rajoutée à chaque cycle de PCR (dénaturation 95°C détruisant la polymérase à chaque cycle) Découverte d’ADN polymerases thermorésistantes (Taq polymerase) Taq polymerase est à l’origine une polymérase produite par un extrémophile: Thermophilus aquaticus, vivant dans sources d’eau chaude Application Médicale de la PCR Extrême sensibilité de la détection PCR: quelques copies d‘ADN sont détectables La PCR est une technique particulièrement appropriée à la détection de pathogènes bactériens / viraux: par rapport aux techniques comme les sérologies ou la culture, sensibilité et rapidité La PCR: une révolution dans la détection des microorganismes pathogènes Jusqu‘à une époque récente, le diagnostic microbiologique était basé sur des analyses indirectes (la détection des réponses de l‘hôte: sérologie), ou bien sur la culture du pathogène La PCR permet la détection directe des microbes sans culture !!! PCR Quantitative - Principe Détection par fluorescence de la quantité d‘ADN amplifiée à chaque cycle de PCR. un agent fluorescent qui s‘incorpore à l‘ADN Fluorescence / nombre de Cycles En phase exponentielle, quantification est possible: chaque cycle de PCR multiplie par 2 la qté d‘ADN Paramètre essentiel: Ct, cycle threshold Principe de la RT-PCR Quantification des résultats RT-PCR La RT-PCR permet la quantification relative de l‘expression des gènes (cette quantification devient absolue si les résultats sont normalisés par rapport à un contrôle interne, dont la concentration est connue) conversion ∆Ct en ratio A / B = 2 - ∆Ct Par exemple, si ∆Ct est de 5 cycles (produit amplifié au dela du seuil 5 cycles avant conditions B dans conditions A), on obtient 2-5, c‘est à dire ratio A:B de 32 Les Sondes Rapporteur Fluorescentes La réaction PCR peut générer des produits non-spécifiques, en plus du produit désiré Pour une meilleure fiabilité de la quantification, il est possible d‘utiliser des systèmes permettant de ne mesurer en fluorescence que l‘amplification de séquences spécifiques: sondes à hydrolyse En plus couplage avec des fluorochromes différents, permettant alors de mener plusieurs amplifications dans un même tube: PCR multiplex Sondes à hydrolyse en PCR quantitative Activité exonucléasique de la Taq Fluochrome neutralisant, emetteur “quencher” Pas de fluorescence Fluorescence +++ Principe des sondes à hydrolyse La sonde est couplee en 5‘ avec un fluorochrome / et un quencher en 3‘: pas de fluorescence a l‘etat normal Mais hybridation puis hydrolyse de la sonde par activite exonucleasique de la DNA polymerase au fil de l‘amplification augmente fluorescence Applications Médicales En plus des avantages déja mentionnés de la PCR conventionnelle (détection rapide des pathogènes, bactéries ou virus...), possibilité de mesurer la quantité de pathogènes: il devient par exemple possible de mesurer la charge virale Détection d‘anomalies génétiques pouvant jouer un role dans pathologies génétiques ou cancer: génotypage Génotypage rapide en PCR Quantitative Multiplex exons 1 2 Sujet sain Délétion à tester hétérozygotie 3 4 6 7 8 9 10 11 Séquençage de l’ADN Méthode de Sanger: utilisation de di-déoxynucléotides ADN à séquencer: amplification in vitro réalisée à partir d’une amorce, en présence de didéoxynucléotides fluorescents Séquencage par la méthode des dideoxynucleotides P-O P-O O 5 Base 1 4 3 O Base 5 1 4 2 OH Di-déoxynucleotides bloquent élongation 3 2 Séquencage par la méthode des didéoxynucleotides Réaction de synthèse ADN in vitro à partir d’une amorce qui constitue le point de démarrage du séquençage en présence de didéoxynucléotides fluorescents (ddA, ddT, ddC, ddG) Séquençage par la méthode des didéoxynucléotides Amorce AT C GAT C G AA C G T C G G ddA T C G A T C G ddT C G A T C G ddC G A T C G ddG A T C G Séparation des produits récopiés suivant taille permet de déterminer séquence A T C G 1. Introduction et techniques de base 2. Détection des acides nucléiques et mesure de l‘expression des gènes: Hybridations PCR Séquençage 3. Modulation de l‘expression des gènes: techniques de surexpression, Interférence ARN Introduire les Gènes dans les cellules pour Surexprimer les protéines Pour l‘expression eucaryote, plasmides caractérises par présence de promoteurs adaptés - Promoteurs eucaryotes: eIF1, actine - Promoteurs viraux: CMV, SV40 Le couple cellule / promoteur conditionne le niveau d‘expression de la protéine à exprimer … Problème consiste surtout à introduire ces plasmides dans les cellules, c‘est à dire à transfecter Transfection Différentes techniques permettent d‘introduire un ADN dans les cellules i) Formation de précipités d‘ADN (calcium phosphate, polyéthylène-imine) qui sont mis au contact des cellules. Endocytose du précipité aboutit éventuellement à rupture de l‘endosome qui libère l‘ADN dans le cytosol ii) Electroporation: l‘application d‘un champ électrique bref permet la formation transitoire de pores dans la membrane plasmique, qui laissent passer l‘ADN iii) Liposomes, qui délivrent l‘ADN en fusionnant avec la membrane cellulaire iv) Microinjection v) Virus pEGFP-N1, un vecteur d’expression eucaryote codant pour la GFP Promoteur eucaryote Rapporteur fluorescent: GFP Transfection et identification des Cellules transfectées …. Ici, rendement de transfection est d’environ 25% Limites des possibilités de Transfection Il est souvent difficile de transfecter efficacement les cellules en cultures… certains types cellulaires sont particulièrement difficiles à transfecter, compromis toxicité / efficacité De plus, la plupart des plasmides ne sont pas répliqués de façon épisomale chez les eucaryotes: après transfection, l‘expression décline. On parle d‘expression transitoire Expressions Transitoire et Stable On peut chercher à établir une lignée dans laquelle le transgène sera exprimé de façon stable On sélectionne une cellule ayant intégré le plasmide dans son génome: le vecteur doit posséder un marqueur de sélection eucaryote, et on procède à une étape de clonage Expression Stable Sélection Clonage Transfection transitoire Transfection stable Transgenèse Rendue possible par manipulation génétique des cellules souches embryonnaires (ES), totipotentes L‘ADN à exprimer est introduit dans les cellules ES et on sélectionne un clone ayant l‘intégré de façon stable: ce clone est réinjecté dans un blastocyste, lui même implanté dans l‘utérus d‘une souris gestante A la naissance, le souriceau est une chimère: si le chimérisme concerne les gonades, des croisements successifs permettent d‘obtenir des souris possédant une ou deux copies du transgène: homo / hétérozygotes Transgenèse Souris transgénique pour GFP sous contrôle d‘un promoteur épidermique Supprimer l’Expression d’un Gène pour étudier la Fonction de son Produit 1. « Knock down »: ARN interférence 2. « Knock Out », « Knock in »: recombinaison homologue Interférence ARN RISC Dégradation ARN Régulation traduction Deux stratégies expérimentales permettant d‘utiliser l‘interférence ARN Introduction ARN dble brin: siRNA (small interfering RNA) courts (21-24 nt) … ou transfection d’un gène ADN transcrit en ARN formant épingle à nourrice et qui sera maturée en ARN interférent: shRNA (short hairpin RNA) Short Hairpin RNA (shRNA) et siRNA RNA pol shRNA siRNA Drosha nucleus Dicer RISC cytoplasm Remplacer ou invalider les gènes: la Recombinaison Homologue La recombinaison homologue est un échange de fragments d’ADN entre deux molécules d’ADN au niveau de séquences nucléotidiques homologues. Recombinaison homologue rend possible délétions, insertions, inversions de séquences d‘ADN de facon spécifique… à l‘origine des techniques d‘invalidation ou de remplacement des gènes (knock-out, knock-in) Sélection des cellules ayant realisé une Recombinaison Homologue Marqueurs sélection positive: cassette de résistance antibiotiques eucaryotes (néomycine par ex) Marqueurs sélection négative: thymidine kinase (TK) du virus HSV, qui confère sensibilité a des pro-drugs comme le gancyclovir, ou domaine portant l’activité de la toxine diphtérique, qui tue les cellules qui l’exprime Insertion judicieuse de ces marqueurs de sélection permet de sélectionner les cellules qui ont intégré le plasmide dans leur génome tout en éliminant celles dans lesquelles l’intégration s’est faite sans recombinaison homologue Recombinaison Homologue vecteur de mutagenèse + - neoR 1 X 1 TK 3 X 2 4 3 ADN génomique 1 neoR 3 4 Recombinaison homologue produit clone néo-Resistant, gan-Résistant Knock-out à l‘échelle de la souris Si la recombinaison homologue est utilisée pour invalider / remplacer un gène dans les cellules ES (cellules souches embryonnaires, totipotentes), on pourra produire une souris knock-out / knock-in. Applications du Knock-in: étudier les modalités de régulation d‘une protéine Remplacement d‘un gène par rapporteur (GFP par exemple) permet de suivre son expression Etudier le rôle des mutations survenant sur une protéine Tester le rôle des mutations pathologiques de gènes grâce au knock-in Dilated Cardiomyopathy Caused by Troponin Mutation Conclusion La biologie moléculaire: des outils puissants pour l’étude des maladies … Révolution des pratiques médicales (la PCR en microbiologie)
