Cours3 - Université Nice Sophia Antipolis

Polytech UEF1
BONCOMPAGNI Éric
MCU - Univ. Nice Sophia Antipolis
Site WEB : sites.unice.fr/EB
Outils moléculaires
pour l’analyse des génomes
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence
But : Disposer à volonté et en quantité d’une séquence d’ADN d’intérêt
En la multipliant dans un système bactérien (Escherichia coli)
Nécessite un vecteur de clonage qui comporte:
1- Une origine de réplication
2- Un gène de sélection
4- Un site multiple de clonage
Exemple de vecteur de clonage
MCS du pBluescript SK-
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence: Les étapes
1- Digérer l’ADN à cloner par une enzyme de
restriction adéquate
2- Digérer le vecteur par la même enzyme
4- Mettre en présence le vecteur et fragment
à cloner: appariement par
complémentarité des bases
5- Ajouter une DNA ligase (referme la
molécule d’ADN)
6- Transformer une souche d’E. coli
7- Sélectionner les bactéries transformées
et les isoler
Fragment
d’ADN
obtenu
facilement par extraction d’ADN
plasmidique à partir des bactéries
transformée
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Issue des connaissances acquises sur le processus d’intégration du phage
Lambda dans le chromosome d’E. coli
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Permet de s’affranchit :
1- des enzymes de restriction
2- des faibles efficacités de clonage
3- élimine les problèmes de site internes d’enzymes
4- contre sélection des clones vides : ccdB
5- multiples vecteurs de destination
Inconvénients :
1- Les sites Att de recombinaison s’intercalent entre les fragments
clones: acides aminés supplémentaires en cas de fusions
traductionnelles
2- Technologie brevetée: chère
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence: la technologie GOLDEN GATE
Basé sur l’utilisation d’enzymes de restriction dont le site de coupure est distant
du site de reconnaissance Ex BsaI (NB site non palindromique).
La coupure se fait indépendamment de la séquence bordant le site de restriction.
On génère des extrémités cohésives qui peuvent être liguées entre elles.
Cloner des séquences d’intérêt
Avantage:
1- Site non palindromique: clonage orienté
2- Pas de persistance de longue séquence (type bordures Att de
Gateway)
3- Réaction de digestion et de ligation dans un seul tube
4- En théorie cumulable à l’infini. On peut cloner plusieurs fragments en
une fois.
5- L’ensemble tant vers la construction finale puisque le site de
restrction est perdu.
6- Programme J5 aide au design de la stratégie :
https://j5.jbei.org/j5manual/pages/27.html#2
Inconvénients:
1- Retour à l’utilisation de ligase (enzyme sensible)
2- Les fragments à cloner ne doivent pas contenir de site BsaI
Cloner des séquences d’intérêt
Actuellement : CrispR/Cas9
https://fr.wikipedia.org/wiki/Cas9
05/10/2016
9
Cloner des séquences d’intérêt
05/10/2016
10
Isoler des gènes d’intérêt
Banques d’ADN génomique
• Intérêt: disposer de clones correspondant à la totalité du génome d’une espèce
•Méthodologie identique au clonage d’un seul fragment
mais digestion d’ADN génomique total
sélection de la taille des fragments
récupération d’un grand nombre de clone pour avoir toutes les régions du génome
Isoler des gènes d’intérêt
Banques d’ADN génomique
Taille des génomes en pb / génome haploïde
Bactéries
Champignons
Plantes
Insectes
Amphibiens
Oiseaux
Mammifères
105
106
107
108
109
1010
1011
Diapo A. Attard
Isoler des gènes d’intérêt
Banques d’ADN génomique
•Vecteurs de type BAC (Bacterial Artificial Chromosome)
Dérivé du facteur F d’E. coli (conjugaison)
1 copie par cellule (stabilité)
Maintient des fragments de taille jusqu’à 200kb
ici SacBII: contre-sélection des plasmides vides
Isoler des gènes d’intérêt
Banques d’ADN génomique
•Vecteurs de type YAC (Yeats Artificial Chromosome)
Contiennent télomères et centromères
Maintient des fragments de taille jusqu’à 500kb
Isoler des gènes d’intérêt
Banques d’ADNc
• Intérêt: disposer de clones correspondant à la totalité des gènes exprimés dans un tissus donné
1- Reverse transcription des ARNm,
2- Synthèse brin complémentaire
3- Clonage (idem banque génomique)
Isoler des gènes d’intérêt
Criblage de banques (génomique ou ADNc)
• Intérêt: recherche un clone génomique ou un ADNc correspondant à un gène étudié
1- ADN des clones (tous) déposé sur membrane de nylon
soit ADN directement soit bactéries
Les clones sont ordonnés et leur position est connue
2- Marquage d’une sonde correspondant au gène recherché
3- Hybridation de la sonde sur la membrane
4- Détection du signal d’hybridation (autoradiographie)
5- les clones détectés peuvent être cultivés et donnent accès à la
séquence recherchée.
Isoler des gènes d’intérêt
Criblage différentiel de banques ADNc
• Intérêt: identifier des gènes différentiellement exprimés dans un tissu donné
1- ADN des clones ADNc déposé sur membranes de nylon
Les clones sont ordonnés et leur position est connue
2- Marquage de sondes à partir d’ARNm issus des stades à
comparer
3- Hybridation de chaque sonde sur un jeu de membranes
4- Détection du signal d’hybridation (autoradiographie)
5- Comparaison des résultats d’hybridation
6- Les clones détectés dans une condition et pas l’autre sont
différentiellement exprimés.
Application
Production hétérologue de protéines d’intérêt
• Intérêt: obtenir en grande quantité une protéine présentant un intérêt fondamental/industriel
f1 origin
Utilise des vecteurs de clonage qui comporte:
1- Une origine de réplication
ORF-5G2-peptide signal
T7 tag
pET-28a(+)/5G2-peptide signal
6404 bp
4- Un site multiple de clonage
5- Un promoteur inductible (Lac)
His tag
kan sequence
2- Un gène de sélection
Mais aussi
T7 terminator
ColE1 pBR322 origin
thrombin
His tag
T7 promoter
lac operator
lac I
6- Des séquences codant pour des peptides
facilitant la purification (Tags)
NB: respecter le cadre de lecture lors du clonage!!!
ex: production d’une protéine à
activité cellulosique
Polytech UEF1
Structure et évolution
des génomes