Chapitre 2.1.12.

CHAPITRE 2.1.12.
PESTE PORCINE AFRICAINE
RÉSUMÉ
La peste porcine africaine (PPA) est une maladie infectieuse des suidés domestiques et sauvages
qui frappe les sujets de toute race et de tout âge ; elle est due à un virus responsable de divers
syndromes. La maladie aiguë est caractérisée par une forte fièvre, des hémorragies du système
réticulo-endothélial et un taux de mortalité élevé. Le virus infectieux peut persister plusieurs mois
dans les produits de charcuterie frais, salés et desséchés.
Le virus de la PPA est le seul membre de la famille des Asfarviridae.
Les méthodes de diagnostic de laboratoire se répartissent en 2 groupes : le premier rassemble les
épreuves d’isolement et de recherche des antigènes viraux ainsi que de l’ADN génomique, le
second, ceux de la mise en évidence des anticorps. Le choix des épreuves à employer dépend de
la situation épidémiologique de la région ou du pays.
Dans les pays indemnes de PPA mais suspectant sa présence, le diagnostic de laboratoire doit
viser l’isolement du virus en réalisant simultanément, l’inoculation de cultures de leucocytes ou de
moelle osseuse de porc, la détection de l’antigène sur des frottis ou des coupes de tissus au
cryostat à l’aide d’une épreuve des anticorps fluorescents (EAF) et, si possible, la détection de
l’ADN génomique par une réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). La recherche
des anticorps dans les fluides organiques doit aussi être réalisée en même temps.
Identification de l’agent pathogène : Les prélèvements tissulaires provenant de cas suspects du
terrain doivent être soumis à la recherche d’antigène spécifique par une EAF sur des frottis ou des
coupes au cryostat et à la mise en évidence du virus par inoculation de cultures primaires de
leucocytes de porc qui sont quotidiennement soumises à la recherche de l’hémadsorption et de
l’apparition d’un effet cytopathogène (ECP). Les cellules des cultures négatives font l’objet d’une
recherche de l’antigène par l’EAF et de passages aveugles en cultures fraîches de leucocytes.
La PCR peut être utilisée pour détecter le génome viral dans les tissus et elle est particulièrement
précieuse si ces derniers sont impropres à l’isolement viral et à la mise en évidence des anticorps.
Dans les cas douteux, Les prélèvements seront passés sur leucocytes et les techniques décrites
ci-dessus seront renouvelées.
Épreuves sérologiques : Là où la maladie est enzootique, là où un premier foyer est dû à une
souche de basse virulence, la recherche des nouveaux foyers doit inclure la mise en évidence par
une méthode immuno-enzymatique (ELISA), des anticorps spécifiques, dans le sérum ou les
extraits de tissus prélevés.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
A l’heure actuelle il n’existe pas de vaccin pour la PPA.
A. INTRODUCTION
Le virus de la PPA fut d’abord considéré comme un membre de la famille des Iridoviridae, mais la structure du
génome et le mode de réplication du virus ont révélé de nombreux points communs avec les membres de la
famille des Poxviridae (14). La proposition de classer le virus PPA dans une famille séparée de celle des
Iridoviridae fut acceptée au 6e Congrès du Comité International de Taxonomie virale (ICTV, International
Committee on the Taxonomy of Viruses) à Sendai (Japon), en 1984. Ce virus est à l’heure actuelle classé, en tant
que seul membre, dans la famille qualifiée d’Asfarviridae.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
Les virus PPA provoquent divers syndromes allant de la forme suraiguë à la forme chronique de la maladie avec
des porteurs en bonne santé apparente. Les souches les plus virulentes sont responsables d’une maladie
hémorragique d’évolution suraiguë ou aiguë, se traduisant par une fièvre élevée, une perte de l’appétit, des
hémorragies de la peau et des organes internes, la mort survenant en 2 à 10 jours. Le taux de mortalité peut
atteindre 100 %. Les souches moins virulentes entraînent des signes cliniques plus discrets – légère fièvre,
diminution de l’appétit et abattement – qui peuvent être volontiers confondus avec d’autres affections du porc et
qui peuvent ne pas conduire à une suspicion de PPA. Dans certains pays, des souches avirulentes, non
hémadsorbantes, provoquent une infection asymptomatique non hémorragique, mais une séroconversion ;
cependant certains sujets peuvent développer de petites lésions du poumon et de la peau dans les zones de
protrusions osseuses et dans celles soumises à des traumatismes.
La PPA ne peut être différenciée de la peste porcine classique (hog cholera) ni par l’observation clinique ni par
l’examen nécropsique, et les 2 maladies doivent être incluses dans le diagnostic différentiel des syndromes
fébriles hémorragiques du porc. Des septicémies bactériennes peuvent aussi être confondues avec la PPA et la
peste porcine classique. Les examens de laboratoire sont essentiels pour distinguer ces 2 maladies.
Dans les pays indemnes de PPA mais suspectant sa présence, le diagnostic de laboratoire doit viser l’isolement
du virus par mise en œuvre simultanée, de l’inoculation de cultures de leucocytes ou de moelle osseuse de porc,
et d’une recherche antigénique sur frottis ou coupes de tissus au cryostat par l’épreuve des anticorps fluorescents
(EAF). Cependant, la recherche des anticorps dans le sérum ou les liquides organiques par une méthode
immuno-enzymatique (ELISA), d’immuno-empreinte (immunoblotting) ou d’immunofluorescence indirecte (IFI),
doit être aussi menée parallèlement pour éviter tout retard dans la découverte d’une infection par un virus de
basse virulence. La sérologie peut être un outil précieux pour aider à confirmer un foyer, car les anticorps peuvent
souvent être mis en évidence chez les animaux qui meurent de forme aiguë.
Une autre technique est désormais disponible : l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) qui peut être
utilisée pour mettre en évidence le génome viral dans le sang ou les tissus. Elle est particulièrement utile lorsque
les prélèvements en voie de putréfaction sont impropres à l’isolement viral et à la détection antigénique.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1.
Identification de l’agent pathogène
Lorsque la PPA est suspectée, les prélèvements suivants doivent être envoyés au laboratoire : sang sur anticoagulant (héparine ou acide éthylène-diamine-tétra-acétique [EDTA]), rate, amygdale, rein, nœuds
lymphatiques. Ces prélèvements doivent être conservés au froid, sans congélation, durant le transport. Arrivés au
laboratoire, ils sont conservés à –70°C si leur traitement est différé. Lorsque le maintien de la chaîne du froid ne
peut être assuré, les prélèvements peuvent être placés en solution saline glycérinée ; cela peut altérer
légèrement la possibilité de l’identification virale, mais peut faciliter l’envoi de prélèvement au laboratoire et la
confirmation d’un foyer.
•
Préparation du prélèvement pour l’hémadsorption et l’inoculation au porc
i)
Préparer des suspensions de tissus en écrasant de petits fragments dans un mortier contenant du
sable stérile, puis ajouter de 5 à 10 ml d’une solution saline tamponnée ou de milieu de culture de
tissu, contenant des antibiotiques.
ii)
Clarifier la suspension par centrifugation à 1 000 g pendant 5 min.
Utiliser le surnageant pour l’hémadsorption (Section B.1.a. ci-dessous) et l’inoculation au porc (Section
B.1.d. ci-dessous), bien que l’inoculation au porc ne soit pas recommandée.
a)
Épreuve d’hémadsorption
L’épreuve d’hémadsorption (HAD) (6) est essentielle en matière de PPA et repose sur le fait que les
érythrocytes de porc adhèrent à la surface des monocytes et des macrophages de porc infectés par le virus
PPA et que la plupart des isolats produisent ce phénomène d’hémadsorption. Un petit nombre de virus non
hémadsorbants a été isolé, la plupart de ceux-ci étant non virulents, mais certains peuvent être à l’origine de
formes aiguës typiques de PPA. L’épreuve est réalisée en ajoutant du sang ou des suspensions de tissu,
issus de porc suspects, dans des cultures primaires de leucocytes (méthode 1 ci-dessous) ou bien en
préparant des cultures de leucocytes à partir de porcs inoculés au laboratoire ou à partir de sang de porcs
suspects récolté sur le terrain (méthode 2 ci-dessous). Il est possible de préparer jusqu’à 300 cultures à
partir de 100 ml de sang hépariné ou défibriné récolté. En cours de procédure, il est essentiel d’éviter la
contamination des cultures.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
•
Méthode 1 : Épreuve d’hémadsorption en culture primaire de leucocytes
i)
Récolter le volume requis de sang frais de porc sur héparine (100 unités internationales [UI]/ml de
sang).
ii)
Centrifuger à 700 g pendant 30 min, récupérer la couche de cellules blanches et les laver dans le
milieu.
iii)
7
Mettre en suspension les cellules à la concentration de 10 cellules/ml dans un milieu de culture
contenant 10 à 30 % de sérum de porc et des antibiotiques. Afin de prévenir une hémadsorption non
spécifique, le milieu doit contenir le sérum ou le plasma du porc donneur de leucocytes. Si une grande
quantité de prélèvements doit être éprouvée, les sérums homologues peuvent être remplacés par un
sérum qui a été reconnu préalablement capable de prévenir la formation de rosettes non spécifiques.
iv)
Répartir la suspension de cellules en aliquots de 1,5 ml dans des tubes de 160 x 16 mm et incuber en
position inclinée (5 à 10° de l’horizontale) à 37°C.
Note: pour un diagnostic de routine, des cultures de 2 à 4 jours sont suffisamment sensibles.
v)
Inoculer 3 tubes de cellules en ajoutant 0,2 ml de la préparation de prélèvement de tissu, par tube. Il
est conseillé d’inoculer des dilutions du dixième et du centième ; ce qui est particulièrement important
lorsque les prélèvements de terrain sont en mauvais état.
vi)
Inoculer des cultures témoins positives avec un virus hémadsorbant. Ne pas inoculer les témoins
négatifs est essentiel si l’on veut pouvoir révéler une hémadsorption non spécifique.
vii)
Après 3 jours, ajouter 0,2 ml d’une préparation fraîche à 1 % d’érythrocytes de porc en solution saline
tamponnée, dans chaque tubes.
viii) Examiner au microscope quotidiennement les cultures pendant 7 à 10 jours, à la recherche de l’effet
cytopathogène (ECP) et de l’hémadsorption.
ix)
Lecture des résultats: L’hémadsorption consiste en l’attachement d’une grande quantité d’érythrocytes
de porc sur la surface des cellules infectées. Un ECP consistant en la réduction du nombre de cellules
adhérentes en l’absence d’hémadsorption, peut être dû à la cytotoxicité de l’inoculum, à un virus de la
maladie d’Aujeszky ou à un virus PPA non hémadsorbant, qui peuvent être révélés par EAF sur le
culot cellulaire ou par PCR (voir ci-dessous). Si aucune modification n’est observée ou si
l’immunofluorescence ou la PCR sont négatives, passer le surnageant sur une culture fraîche de
leucocytes.
•
Méthode 2 : Épreuve « Autorosette » d’hémadsorption avec les leucocytes du sang périphérique de
porcs infectés
Cette méthode est plus rapide que celle de la préparation et de l’inoculation de cultures primaires de
leucocytes de porc (décrite dans la méthode 1 ci-dessus) et donnera des résultats plus rapides dans les cas
positifs. Elle peut être réalisée dans les laboratoires qui ne sont pas équipés pour des examens virologiques
de routine ; le minimum requis consiste en des lames et lamelles, un microscope, du milieu stérile, des
tubes ou flacons et des pipettes. Le sang des porcs suspects du terrain ou de ceux qui ont été inoculés au
laboratoire, est récolté sur héparine et les cultures de leucocytes sont préparées pour une recherche directe
de l’hémadsorption. Cependant, les résultats de l’épreuve sont difficiles à juger et elle est maintenant
remplacée par la PCR.
b)
i)
Récolter 20 ml de sang total dans une seringue contenant 2 000 UI d’héparine en solution saline,
mélanger et transférer dans un tube de verre ou un flacon étroit.
ii)
Placer le tube ou le flacon verticalement dans une étuve ou un bain-marie à 37°C et laisser les cellules
sédimenter. La sédimentation est améliorée par addition de 2 ml d’un expanseur de volume de plasma,
tel que le « Dextran 150 » qui est une solution de Dextran 150 dans 0,9 % d’une solution de NaCl pour
injection (Fisons, Royaume-Uni)
iii)
Incuber les cultures pendant 6 à 8 h à 37°C, puis, examiner les cultures à intervalle de 2 à 3 h par
transfert de petits aliquots de surnageant riche en cellules blanches avec quelques érythrocytes, sur
une lame et rechercher l’hémadsorption cellulaire sous un microscope.
Recherche antigénique par l’épreuve des anticorps fluorescents
L’EAF (2) peut être une méthode additionnelle de détection de l’antigène dans les tissus de porcs suspects
du terrain ou de porcs inoculés au laboratoire. Par elle-même, elle n’est pas suffisante pour le diagnostic de
la PPA. Elle peut être appliquée à la mise en évidence de l’antigène PPA dans les cultures de leucocytes où
l’HAD n’apparaît pas et peut ainsi identifier les souches virale non hémadsorbantes. Elle différencie aussi
l’ECP lié au virus PPA de celui provoqué par un autre virus tel que le virus d’Aujesky ou en rapport avec un
effet cytotoxique de l’inoculum.
264
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
c)
•
Protocole
i)
Préparer des coupes au cryostat ou des décalques des tissus à examiner, ou étaler le sédiment
cellulaire de cultures de leucocytes inoculés sur des lames ; faire sécher à l’air puis fixer à l’acétone
pendant 10 min à la température ambiante.
ii)
Colorer avec une immunoglobuline anti-PPA conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à la
dilution optimale recommandée par le fabricant ou obtenue après titrage préalable, pendant 1 h à 37°C
en chambre humide.
iii)
Fixer et colorer un témoin positif et un négatif de la même manière.
iv)
Laver à l’aide d’une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS), monter les lames de
tissus colorés en PBS/glycérol, et examiner au microscope à lumière ultra-violette avec des filtres
d’excitation et barrières appropriés.
v)
Lecture des résultats : Les tissus sont positifs si une fluorescence granuleuse cytoplasmique est
observée dans la zone paracorticale des organes lymphoïdes ou dans les macrophages fixés au sein
d’autres organes.
Mise en évidence du génome viral par la PCR
Des techniques PCR ont été développées, utilisant des amorces correspondant à une région hautement
conservée du génome, permettant de détecter et d’identifier une grande variété d’isolats appartenant à tous
les génotypes connus, y compris les virus non hémadsorbants et les souches de basse virulence. Les
techniques PCR sont particulièrement indiquées pour détecter et identifier l’ADN viral dans les tissus de
porc impropres à l’isolement viral ou à la recherche d’antigène en raison d’un début de putréfaction ou
lorsque l’on a tout lieu de penser que le virus a été inactivé avant l’arrivée des prélèvements au laboratoire.
Deux méthodes PCR sont décrites et comportent le traitement du prélèvement puis le protocole de
l’épreuve.
•
Méthode PCR
Ce protocole ainsi que le suivant (protocole 2) constituent un guide général et un point de départ pour la
réalisation de la PCR. Les conditions optimales de la réaction (temps et températures d’incubation, modèles
et fournisseurs d’équipement, concentrations des réactifs tels que les amorces et les dNTPs), peuvent
variées, aussi les conditions doivent-elles être d’abord évaluées. Les détails de validation de la PCR et les
procédures nécessaires à la validité de l’épreuve sont donnés au Chapitre I.1.4., « Validation et contrôle
qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) utilisées pour le diagnostic des
maladies infectieuses » de ce Manuel terrestre. Des modifications peuvent être facilement apportées aux
différents points du protocole afin d’obtenir de meilleures performances.
•
Préparation du prélèvement
i)
Préparer des suspensions tissulaires en écrasant de petits fragments de tissu dans un mortier
contenant du sable stérile et faire une dilution au 1/10 en ajoutant 5 à 10 ml de PBS contenant 1 % de
sérum bovin et des antibiotiques.
ii)
Centrifuger à 500 g pendant 5 min.
iii)
Extraction pour les témoins : homogénats tissulaires au 1/10 (même tissu que le prélèvement à
analyser) : (a) un témoin négatif : utiliser 500 µl d’un homogénat de tissu négatif en PPA ; (b) un
témoin positif : utiliser 500 µl d’un homogénat de tissu positif en PPA.
iv)
Transférer 500 µl dans un tube Eppendorf à bouchon à vis et porter à ébullition pendant 10 min.
v)
Centrifuger à 13 000 g dans une micro-centrifugeuse pendant 5 min.
Le surnageant tissulaire est utilisé dans l’épreuve.
Le procédé de préparation du prélèvement décrit ci-dessus est simple et bon marché, mais il peut entraîner
des résultats faussement négatifs en raison de la présence d’inhibiteurs PCR. Une autre possibilité
d’extraction faisant appel à la trousse de diagnostic NucleoSpin Virus (Macherey Nagel) est décrite
ci-dessous. Cette trousse de diagnostic comprend les réactifs RAV1, RAV3 et les filtres colonnes
NucleoSpin.
Protocole pour les prélèvements liquides : plasma, sérums, milieu de culture cellulaire.
(A noter que pour les prélèvements d’organes et de tissus, il faut préparer un homogénat au 1/10 dans du
PBS, puis clarifier par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min. Utiliser le surnageant).
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
Extraction pour les témoins : homogénats tissulaires au 1/10 (même tissu que le prélèvement à analyser) :
(a) un témoin négatif : utiliser 150 µl d’un homogénat de tissu négatif en PPA ; (b) un témoin positif : utiliser
150 µl d’un homogénat de tissu positif en PPA.
i)
Ajouter 600 µl de RAV1 (ARN porteur inclus) à 150 µl de prélèvement. Bien mélanger par aspirations
et refoulements à la pipette, puis au vortex. Incuber 5 à 10 min à la température ambiante.
ii)
Facultatif : Si la solution obtenue est trouble, centrifuger le mélange pendant 1 min pour clarifier.
Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
iii)
Ajouter 600 µl d’éthanol à la solution claire et mélanger au vortex.
iv)
Charger 700 µl du prélèvement sur une colonne NucleoSpin, la placer dans un tube à centrifuger de
2 ml.
v)
Centrifuger pendant 60 secondes à 6 000 g à température ambiante. Eliminer le liquide qui en est issu.
vi)
Charger le reste du prélèvement sur la même colonne (environ 600 µl) et centrifuger comme ci-dessus.
Eliminer le liquide qui l’a traversé.
vii)
Ajouter 500 µl de tampon RAV3 à la colonne NucleoSpin.
viii) Centrifuger pendant 30 secondes à 6 000 ou 8 000 g. Eliminer le liquide et répéter cette étape de
lavage.
ix)
Eliminer le liquide de lavage ayant traversé la colonne, puis placer celle-ci dans un nouveau tube à
centrifuger de 2 ml et centrifuger 5 min à vitesse maximale pour éliminer complètement le tampon
RAV3.
x)
Elution des acides nucléiques : Placer la colonne NucleoSpin dans un tube à centrifuger stérile de
1,5 ml, ajouter 50 µl de tampon d’élution (5 mM Tris/HCl pH 8,5, préchauffé à 70°C), et incuber 2 min.
xi)
Centrifuger 60 secondes à 8 000 g.
xii)
Conserver les 50 µl d’ADN élués à –20°C jusqu’à leur utilisation.
•
Solutions stock
i)
La Taq polymérase d’ADN et le tampon d’amplification (10x) sont disponibles dans le commerce.
ii)
Stock de dNTPs 1,25 mM : Préparer des solutions stock de 50 mM de chacun des nucléotides
suivants : dATP, dCTP, dGTP et dTTP. Ajouter 10 µl de chacune de ces solutions à 360 µl d’eau
distillée stérile.
iii)
Amorces à la concentration de 20 pmol/µl : Séquence de l’amorce 1 : 5’-ATGGA-TACCG-AGGGAATAGC-3’ (brin positif) ; séquence de l’amorce 2 : 5’-CTTAC-CGATG-AAAAT-GATAC-3’ (brin négatif).
iv)
Tampon de charge : 0,25 % d’Orange G en solution aqueuse glycérinée à 30 %.
v)
Tampon TAE (50x) pour gel d’agarose : Base Tris (242 g) ; acide acétique glacial (57,1 ml) ; EDTA
0,5 M, pH 8,0 (100 ml) ; eau distillée (q. s. pour 1 litre).
vi)
Marqueurs d’ADN : Des échelles de 100 paires de bases sont disponibles dans le commerce.
•
Protocole 1
i)
Ajouter les réactifs suivants au nombre nécessaire de tubes Eppendorf polypropylène de 0,75 ml :
Eau distillée stérile (24,5 µl) ; (10x conc.) tampon d’amplification (5 µl) ; chlorure de magnésium 25 mM
(4 µl) ; solution stock à 1,25 mM de dNTP(8 µl) ; amorce 1 à 20 µM (1 µl) ; amorce 2 (1 µl) ; surnageant
tissulaire (10 µl) ; Taq polymérase d’ADN à 5 U/µl (0,25 µl).
ii)
Les tubes témoins ne contiennent pas de surnageant tissulaire.
Témoins négatif (pas d’ADN) : Ajouter 10 µl d’eau distillée.
Témoins positif : Ajouter 2 µl d’ADN PPA et 8 µl d’eau distillée.
iii)
Recouvrir le mélange de 60 µl d’huile minérale.
iv)
Placer tous les tubes dans un thermo-cycleur ADN et conduire le programme suivant :
1 cycle à 94°C pendant 5 min.
35 cycles à 94°C durant 1 min, 50°C durant 1 min et 72°C pendant 1 min.
1 cycle à 72°C durant 10 min.
Maintenir à 4°C.
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Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
v)
A la fin du programme, prélever délicatement 20 µl de chaque mélange réaction au dessous de l’huile
minérale, les transférer dans un tube propre et ajouter 2 µl de tampon de chargement.
vi)
Charger tous les échantillons dans un gel à 2 % d’agarose en tampon TAE contenant du bromure
d’éthidium, à une concentration finale de 0,5 µg/ml.
Ajouter le marqueur ADN sur une piste de chaque coté du gel.
vii)
Soumettre le gel à une tension constante de 150 volts pendant 2 h.
viii) Lecture des résultats : Observer le gel sous une source UV. Lors d’échantillon positif, une légère
bande sera présente qui devra migrer au même niveau que le produit PCR du témoin positif. Calculer
la taille des produits PCR dans les échantillons éprouvés et le témoin positif par référence aux
marqueurs standards. Le produit PCR du témoin positif a une taille de 278 paires de bases. Aucune
bande ne doit être vue dans le témoin négatif.
•
Protocole 2 : TaqMan® PCR (5)
•
Préparation du prélèvement
La méthode décrite ci-dessous est celle publiée sous la référence 5. Un certain nombre de kits d’extraction
de l’ADN sont commercialisés pour la préparation d’échantillons utilisables en PCR selon le prélèvement
soumis à l’analyse et peuvent être utilisés dans les laboratoires de référence.
Le Protocole Mini Kit ARN viral QIAamp® (QIAGEN) (spin protocole, janvier 1999) est décrit ci-dessous.
Cette trousse de diagnostic peut être utilisée pour traiter le sang de sujets suspects de peste porcine. Dans
ce cas, la détection du virus de la PPA peut être réalisée en parallèle avec celle du virus de la peste porcine
classique (voir Chapitre 2.1.13., « Peste porcine classique (hog cholera) », dans les méthodes de détection
moléculaire).
i)
Placer 560 µl du tampon AVL fourni, dans un tube de micro-centrifugation de 1,5 ml.
ii)
Ajouter 140 µl d’échantillon à tester ou d’échantillon témoin et mélanger au vortex par impulsions
successives, pendant environ 15 s. Des échantillons d’homogénats de rate, de moelle osseuse et de
cellules mononuclées de sang périphérique, prélevés sur des porcs non infectés, devront être traités
en même temps que les échantillons soumis à l’épreuve. Une extraction supplémentaire de témoins
négatifs peut aussi être préparée pour chaque échantillon soumis et le témoin négatif non infecté en
réalisant, en même temps, des extractions de l’eau exempte de nucléase pour servir de blanc (tous les
témoins devront ensuite être soumis à la PCR en parallèle avec les échantillons éprouvés).
iii)
Incuber à température ambiante au moins 10 min.
iv)
Centrifuger brièvement le tube pour récupérer les gouttes de l’intérieur du couvercle.
v)
Ajouter 560 µl d’éthanol à l’échantillon, passer au vortex en pulsations pendant environ 15 secondes et
centrifuger brièvement le tube pour récupérer les gouttes de l’intérieur du couvercle.
vi)
Ajouter 630 µl de la solution v) à une colonne QIAamp spin (dans un tube de récupération de 2 ml)
sans mouiller le bord. Boucher le tube et centrifuger pendant 1 minute à 6 000 g. Placer la colonne
spin dans un nouveau tube de récupération propre et éliminer le tube contenant le filtrat.
vii)
Ouvrir délicatement la colonne QIAamp spin et répéter l’étape vi).
viii) Ouvrir délicatement la colonne QIAamp spin et ajouter 500 µl de tampon AW1. Boucher et centrifuger
pendant 1 min à 6 000 g. Placer la colonne spin dans un nouveau tube de récupération propre de 2 ml
et éliminer le tube contenant le filtrat
ix)
Ouvrir délicatement la colonne QIAamp spin et ajouter 500 µl de tampon AW2. Boucher et centrifuger
pendant 3 min à 20 000 g.
x)
Placer la colonne QIAamp spin dans un nouveau tube de micro-centrifugation de 1,5 ml. Eliminer
l’ancien tube de récupération contenant le filtrat. Ouvrir délicatement la colonne QIAamp spin et ajouter
60 µl de tampon AVE. Boucher et incuber à la température ambiante pendant 1 min. Centrifuger
1 minute à 6 000 g.
xi)
Eliminer la colonne QIAamp spin. Conserver l’extrait d’ADN (60 µl) à –20°C jusqu’à son utilisation en
PCR.
•
Solutions stock
i)
Eau stérile exempte de nucléases ou toute autre eau stérile appropriée et TaqMan® PCR reaction
master mix (2×).
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
ii)
Amorces à la concentration de 50 pmol/µl : Amorce 1, séquence : 5’-CTGCT-CATGG-TATCA-ATCTTATCGA-3’ (brin positif) ; Amorce 2, séquence : 5’-GATAC-CACAA-GATC(AG)-GCCGT-3’ (brin
négatif).
iii)
Sonde TaqMan® à la concentration de 5 pmol/µl : (5’-[6-carboxy-fluorescein (FAM)]-CCACG-GGAGGAATAC-CAACC-CAGTG-3’-[6-carboxy-tetraméthyl-rhodamine (TAMRA)]).
•
Amplification PCR par l’épreuve TaqMan® (5)
i)
Dans un tube à micro-centrifugation stérile de 1,5 ml, préparer, pour chaque échantillon, le mélange
réaction PCR décrit ci-dessous. Préparer le mélange réaction en quantité suffisante pour le nombre
d’échantillons à tester mais en ménageant la possibilité de traiter un échantillon supplémentaire.
Eau exempte de nucléase ou eau stérile (7,5 µl) ; (2x conc.) TaqMan® PCR reaction master mix
(12,5 µl) ; amorce 1, 50 pmol (0,5 µl) ; amorce 2, 50 pmol (0,5 µl) ; sonde TaqMan®, 5 pmol (1 µl).
ii)
Ajouter 22 µl du mélange réaction PCR à un puits d’une plaque à lecture optique MicroAmp® pour
chaque échantillon à tester.
iii)
Ajouter 3 µl d’extrait d’échantillon ou de témoins préalablement préparés (voir ci-dessus) et fermer
avec soin chaque puits.
iv)
Faire tourner la plaque pendant 1 min dans une centrifugeuse adaptée afin de mélanger le contenu de
chaque puits.
v)
Placer la plaque dans un TaqMan® Sequence Detection System par amplification PCR et appliquer le
programme suivant :
1 cycle à 50°C de 2 min
1 cycle à 95°C de 10 min
40 cycles à 95°C de 15 s, à 58°C de 1 min.
Note : Si un TaqMan® thermo-cycleur n’est pas disponible, un thermo-cycleur ordinaire peut être utilisé
et les produits PCR sont alors analysés par des lecteurs de point final de fluorescence ou bien par
électrophorèse sur un gel à 1,5 % d’agarose.
vi)
d)
Lecture des résultats : affecter une valeur cycle-seuil (CT) à chaque réaction PCR à l’aide d’un
balayage de tous les foyers d’amplification (un foyer de signal fluorescent sur le nombre de cycles).
Les échantillons à tester négatifs, les témoins non infectés et les blancs doivent avoir une valeur
de CT > 40,0. Les échantillons à tester positifs et les témoins positifs doivent avoir une valeur de
CT < 40,0 (les échantillons fortement positifs ont une valeur CT < 30,0).
Inoculation de porcs
Autrefois, l’inoculation au porc a été utilisée pour différencier la peste porcine classique de l’africaine en
raison d’une similitude des signes cliniques. Les prélèvements étaient inoculés à 2 groupes de porcs, l’un
ayant été vacciné contre la peste porcine classique (hog cholera), l’autre pas. Cette épreuve n’est plus
nécessaire aujourd’hui dans la mesure où il existe des épreuves de laboratoire qui donnent des résultats
fiables à la fois pour la peste porcine classique et pour la PPA. L’inoculation au porc est lente à répondre,
chère, difficile à réaliser et entraîne une souffrance importante des animaux qui n’est plus acceptable. Aussi
cette méthode n’est désormais plus recommandée.
2.
Épreuves sérologiques
Chez les porcs guéris, les anticorps persistent longtemps après l’infection, parfois toute la vie, et un certain nombre
d’épreuves sont disponibles pour mettre en évidence ces anticorps ; cependant peu d’entre eux ont été retenus pour
le diagnostic de routine au laboratoire (1, 3, 8, 9, 12). La méthode la plus utilisée est l’ELISA (13, 15), qui permet
d’examiner soit le sérum soit les liquides organiques. Une analyse de confirmation d’échantillons positifs en ELISA
doit être faite dans les cas critiques à l’aide d’une autre épreuve, telle que l’immunofluorescence indirecte (IFI), la
coloration à l’immuno-peroxidase ou l’immuno-empreinte (3, 10). L’anticorps n’est pas habituellement produit chez le
porc infecté avec un virus PPA virulent. En revanche, des titres élevés sont obtenus chez les porcs infectés par des
souches virales de virulence basse ou modérée, mais ce ne sont pas des anticorps neutralisants.
Dans les régions où la PPA est enzootique, la confirmation des cas suspects de maladie utilisant le test ELISA
standard est pleinement valable, en combinaison avec une épreuve sérologique complémentaire (IFI) ou de
détection antigénique (EAF). Dans certains pays, plus de 95 % des cas positifs ont été identifiés en utilisant la
268
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
combinaison IFI et EAF (12). Il faut noter que lorsque les porcs ont été infectés avec des souches avirulentes ou
de basse virulence, les épreuves sérologiques peuvent être les seuls moyens de détecter les animaux infectés.
La contre-immunoélectrophorèse et l’ELISA peuvent être appliqués à des analyses sériques à grande échelle,
bien que l’ELISA soit plus sensible pour détecter les sérums positifs individuels et qu’il ait été largement utilisé
dans le cadre de programmes d’éradication.
La méthode retenue dépend du personnel et des moyens matériels disponibles.
a)
Méthode immuno-enzymatique (épreuve prescrite pour les échanges internationaux)
L’ELISA (1, 9) est une épreuve directe capable de détecter les anticorps PPA chez les porcs infectés par
des virus de basse ou moyenne virulence.
•
Préparation de l’antigène
L’antigène ELISA est préparé à partir de cellules infectées cultivées en présence de sérum de porc (4).
i)
Infecter des cellules MS à une multiplicité d’infection de 10 avec une souche adaptée, et incuber en
milieu contenant 2 % de sérum de porc.
ii)
Récolter les cellules après 36 à 48 h post-infection, lorsque l’ECP est bien marqué. Laver en PBS,
centrifuger à 650 g pendant 5 min, laver le culot cellulaire dans du sucrose 0,34 M en Tris/HCl 5 mM,
pH 8,0, et culotter les cellules par centrifugation.
Effectuer les étapes (iii) à (v) sur glace :
iii)
Reprendre le culot cellulaire dans du sucrose 67 mM en Tris/HCl 5 mM, pH 8,0 (1,8 ml par flacon de
175 cm2), et laisser reposer pendant 10 min avec une agitation après 5 min.
iv)
Ajouter du détergent non ionique Nonidet P-40 à une concentration finale de 1 % (poids/volume), et
laisser reposer 10 min (agitation après 5 minutes) pour lyser les cellules.
v)
Ajouter du sucrose à une concentration finale de 64 % (poids/poids) en Tris/HCl 0,4 M, pH 8,0, et
centrifuger à 1 000 g pendant 10 min pour culotter les noyaux.
vi)
Récupérer le surnageant et ajouter de l’EDTA (à une concentration finale de 2mM), du
béta-mercaptoéthanol (concentration finale de 50 mM) et du NaCl (concentration finale de 0,5 M) en
Tris/HCl 0,25 mM, pH 8,0, puis incuber pendant 15 min à 25°C.
vii)
Centrifuger à 100 000 g pendant 1 h à 4°C sur une couche de 20 % de sucrose (poids/poids) en
Tris/HCl 50 mM, pH 8,0.
Prélever la bande située immédiatement au-dessus de la couche de sucrose et l’utiliser comme antigène
ELISA. La conserver à –20°C.
•
Protocole (13)
i)
Fixer l’antigène sur les plaques de micro-titrage en ajoutant 100 µl de la dilution recommandée ou prétitrée de l’antigène dans du tampon carbonate/bicarbonate 0,05 M, pH 9,6, dans chaque puits.
ii)
Incuber à 4°C pendant 16 h (durant une nuit), puis laver 5 fois avec du Tween 20 à 0,05 % en PBS,
pH 7,2.
iii)
Diluer le sérum à tester et les sérums témoins positif et négatif au 1/30 dans du Tween 20 à 0,05 % en
PBS, pH 7,2, et ajouter 100 µl de chaque dilution sérique dans 2 puits contigus d’une plaque revêtue
de l’antigène.
Si 4 paires de chaque sérum témoins positif et négatif sont réparties en différentes localisations de la
plaque, 40 sérums peuvent être testés en double sur une même plaque comme le montre le schéma
de plaque ci-dessous.
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
A
+
–
B
+
–
C
+
–
D
+
–
E
–
+
F
–
+
G
–
+
H
–
+
iv)
Incuber les plaques à 37°C pendant 1 h (éventuellement sur un plateau d’agitation), puis laver 5 fois
avec du Tween 20 à 0,05 % en PBS.
v)
A chaque puits, ajouter 100 µl de conjugué protéine-A/peroxidase de raifort à la dilution recommandée
ou pré-déterminée en Tween 20 à 0,05 % en PBS.
vi)
Incuber les plaques à 37°C pendant 1 h, puis laver 5 fois en Tween 20 à 0,05 % en PBS.
vii)
Ajouter du peroxyde d’hydrogène à la solution de substrat (0,04 % d’orthophénylènediamine en
tampon phosphate/citrate, pH 5,0) à raison de 10 µl/25 ml, et répartir 100 µl de substrat dans chaque
puits.
viii) Incuber à température ambiante durant environ 10 min ; le temps nécessaire au développement de la
couleur dépend à la fois, de la température du substrat au moment de la répartition dans les puits et de
la température de la pièce.
b)
ix)
Stopper la réaction en ajoutant 100 µl d’acide sulfurique 1,25 M à chaque puits.
x)
Lecture des résultats : les sérums positifs présentent une couleur jaune clair et peuvent être lus à l’œil
nu, mais pour s’assurer que tous les positifs aient été identifiés, il est nécessaire d’apprécier la densité
optique (DO) dans chaque puits au spectrophotomètre, à 492 nm, sur un lecteur ELISA. Un sérum
sera considéré positif s’il présente une valeur de DO supérieure à deux fois la moyenne des DO
obtenues sur les témoins négatifs de la plaque.
Épreuve d’immunofluorescence indirecte
Cette épreuve (11) doit être utilisée en confirmation, pour les sérums provenant de zones indemnes de PPA
et positifs en ELISA, ainsi que pour les sérums provenant de zones d’enzootie pour lesquels il est difficile de
conclure en ELISA.
270
•
Protocole
i)
Préparer une suspension de cellules de rein de porc ou de singe infectées par le virus PPA à une
5
concentration de 5 x 10 cellules/ml, étaler de petites gouttes de celle-ci sur une lame, sécher à l’air
puis fixer à l’acétone à la température ambiante pendant 10 min. Noter que les lames peuvent alors
être stockées à –20°C jusqu’à utilisation.
ii)
Inactiver à la chaleur les sérums à tester, à 56°C pendant 30 min.
iii)
Ajouter les dilutions appropriées des sérums à tester et des sérums témoins négatif et positif, réalisées
en solution saline tamponnée, sur les lames comportant à la fois des cellules infectées et des cellules
témoins non infectées ; incuber pendant 1 h à 37°C en chambre humide.
iv)
Laver les lames en PBS puis à l’eau distillée.
v)
Ajouter la dilution pré-déterminée ou recommandée de conjugué immunoglobuline anti-porc/FITC ou
de protéine-A/FITC sur toutes les lames ; incuber à 37°C pendant 1 h en chambre humide.
vi)
Laver les lames en PBS puis à l’eau distillée, monter en PBS/glycérol puis examiner au microscope à
ultraviolet avec des filtres de barrière et d’excitation convenables.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
vii)
c)
Lecture des résultats : Le sérum témoin positif sur les cellules infectées doit être positif et tous les
autres témoins doivent être négatifs avant que les sérums à tester ne soient lus. Les sérums sont
jugés positifs si les cellules infectées montrent une fluorescence spécifique.
Épreuve d’immuno-empreinte
Cette épreuve doit être effectuée en alternative à l’IFI pour confirmer des résultats douteux sur des sérums
individuels. L’épreuve d’immuno-empreinte est très spécifique mais sa sensibilité peut être inférieure à celle
de l’IFI.
•
Préparation des bandes d’antigène
i)
Préparer des protéines cytoplasmiques solubles virales comme décrit pour la préparation de l’antigène
ELISA à la Section B.2.a.
ii)
Les séparer par électrophorèse dans un gel à 17 % d’acryl-amide/N,N’-diallyltartardiamide (DATD), à
l’aide d’une échelle standard de poids moléculaire appropriée.
iii)
Transférer les protéines sur des membranes de nitrocellulose 14 x 14 cm2, par électrophorèse à
courant constant de 5 mA/cm, en tampon de transfert (20 % de méthanol dans glycine 196 mM,
Tris/HCl, pH 8,3).
iv)
Sécher la membrane et marquer le coté où les protéines ont été transférées.
v)
Découper une bande à partir du bord du filtre et effectuer le protocole de l’immuno-empreinte décrit
ci-dessous. Identifier la région contenant les protéines de 23 à 35 kDa à l’aide du marqueur de poids
moléculaire développé en parallèle et découper cette région en étroites bandes de 0,5 cm. Marquer
chaque bandes sur le coté où le transfert des protéines a eu lieu.
Ces bandes (d’environ 4 cm de long) constituent les bandes antigène utilisées en immuno-empreinte et
contiennent les protéines avec lesquelles les anticorps porcins sériques, apparus à la fois dans les formes
aiguës et chez les convalescents, vont réagir.
•
Préparation de la solution substrat de chloronaphtol
Cette solution doit être préparée au moment de l’emploi.
i)
Dissoudre 6 mg de 4-chloro-1-naphtol dans 2 ml de méthanol et ajouter lentement cette solution à
10 ml de PBS tout en remuant.
ii)
Eliminer le précipité blanc qui se forme par filtration à travers un papier filtre Whatman
No.1 (optionnel).
iii)
Ajouter 4 µl de peroxyde d’hydrogène.
•
Protocole
Les bandes antigène doivent être maintenues la face marquée vers le haut, durant toute la réalisation de
l’immuno-réaction.
i)
Placer les bandes antigène dans le tampon de saturation (2 % de lait en poudre écrémé en PBS) à
37°C pendant 30 min, sous agitation continue.
ii)
Préparer des dilutions au 1/40 des sérums à tester et des sérums témoins positif et négatif dans le
tampon de saturation.
iii)
Incuber les bandes antigène dans le sérum correspondant, à 37°C, pendant 45 min, sous agitation
continue. Incuber une bande antigène dans le sérum témoin positif et une autre dans le sérum témoin
négatif. Ces 2 bandes servent de témoins. Laver 4 fois dans le tampon de saturation, le lavage final
doit durer 5 min en agitation continue.
iv)
Ajouter le conjugué protéine-A/peroxydase de raifort à la dilution en tampon de saturation,
recommandée ou obtenue d’un pré-titrage, à toutes les bandes antigène. Incuber à 37°C, pendant
45 min, en agitation continue. Laver 4 fois en tampon de saturation ; le lavage final doit durer 5 min en
agitation continue.
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
d)
v)
Préparer la solution de substrat, l’ajouter aux bandes antigène et incuber à la température ambiante
pendant 5 à 15 min en agitation continue.
vi)
Stopper la réaction avec de l’eau distillée, lorsque les bandes de protéines sont suffisamment
sombres.
vii)
Lecture des résultats : Les sérums positifs réagissent avec plus d’une protéine sur la bande antigène ;
ils doivent donner un même motif protéinique et la même intensité de couleur que les bandes antigène
colorées par le sérum positif de contrôle.
Épreuve de contre-immunoélectrophorèse (immunoelectro-osmophorèse)
Cette épreuve (7) peut être conduite rapidement et les anticorps spécifiques peuvent être détectés dans
certains sérums, 30 min après sa mise en œuvre. Elle nécessite un équipement d’électrophorèse (chambre
d’électrophorèse, lames support, cutter de gel) et un générateur de courant constant de 500 volts. En raison
de sa faible sensibilité, cette épreuve est recommandée pour l’étude de groupes de porcs, mais pas pour
des analyses individuelles.
•
Protocole
i)
Placer le nombre requis de lames de verre de 2,5 x 10 cm sur le support, sur une table à niveau
horizontal, et recouvrir les lames avec le volume nécessaire d’agarose à 0,6 % en tampon
véronal/acétate, pH 8,6 (force ionique de 0,025) contenant 0,1 % d’azide de sodium, et laisser reposer.
ii)
Découper 4 paires de puits de 3 mm de diamètre, séparées de 10 mm, dans le gel de chaque plaque
comme montré ci-dessous.
S
Ag
S
Ag
{
{
{
{
+
–
{
{
{
{
(S = sérum ; Ag = antigène ; + = électrode positive ; – = électrode négative)
iii)
Remplir les puits avec les réactifs appropriés, y compris ceux correspondant aux témoins positif et
négatif des sérums et des antigènes, à l’aide de tubes capillaires (hématocrite).
iv)
Placer les supports de lames dans la chambre à électrophorèse et faire migrer pendant 30 min sous un
courant constant de 19 volts/cm.
v)
Après migration, examiner les lames sous une source indirecte de lumière pour rechercher les lignes
spécifiques de précipitation.
vi)
Laver les lames dans une solution de NaCl à 2 % pendant une nuit, puis pendant 2 h dans de l’eau
distillée changée plusieurs fois, avant séchage.
vii)
Colorer les lames séchées à l’amido black à 0,075 % dans des volumes égaux de méthanol, d’acide
acétique à 12 %, d’acétate de sodium à 1,6 %, renfermant 0,007 % de glycérol, pendant 5 à 10 min,
puis décolorer par 3 lavages de 10 min dans une solution de 45 % d’éthanol et 10 % d’acide acétique
glacial.
viii) Lecture des résultats : Sur les lames colorées, les lignes de précipitation observées entre les puits de
l’antigène et un sérum testé positif doivent être identiques à celles formées entre l’antigène et le sérum
témoin positif.
C. SPÉCIFICATIONS APPLICABLES AUX VACCINS ET AUX PRODUITS
BIOLOGIQUES À USAGE DIAGNOSTIQUE
A l’heure actuelle, il n’existe pas de vaccin contre la PPA.
272
Manuel terrestre de l’OIE 2005
Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
REFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES
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inmunofluorescencia. (The diagnosis of African swine fever by immunofluorescence). Bull. OIE, 72, 819–
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3.
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ELISA-peste porcina africana, mediante la técnica de ‘Immunoblotting’. Utilización de las proteínas
inducidas por el virus cone pesosmoleculares comprendidos entre 23 y 35 kilodaltons, en el desarrollo de
un ‘kit’ de diagnóstico. (Confirmation of sera positive by ASF ELISA with the immunoblotting technique. Use
of virus-induced proteins of 23−25 kDa in the development of a diagnostic kit.) Med. Vet., 7, 135–141.
4.
ESCRIBANO J.M., PASTOR M.J. & SANCHEZ VIZCAINO J.M. (1989). Antibodies to bovine serum albumin in swine
sera: implications for false positive reactions in the serodiagnosis of African swine fever. Am. J. Vet. Res.,
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5.
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African swine fever virus. J. Virol. Methods, 107, 53–61.
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8.
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immunosorbent assay for the detection of African swine fever antigen and antibody. J. Hyg., 83, 363–369.
*
* *
NB : Il existe plusieurs Laboratoires de référence de l’OIE pour la peste porcine africaine (se reporter à la liste de
la partie 3 de ce Manuel terrestre ou consulter le site internet de l’OIE pour une liste actualisée : www.oie.int).
Manuel terrestre de l’OIE 2005
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