Chapitre 2.1.12.

CHAPITRE 2.1.12.
PESTE PORCINE AFRICAINE
RÉSUMÉ
La peste porcine africaine (PPA) est une maladie infectieuse des suidés domestiques et sauvages
qui frappe les sujets de toute race et de tout âge ; elle est due à un virus responsable de divers
syndromes. La maladie aiguë est caractérisée par une forte fièvre, des hémorragies du système
réticulo-endothélial et un taux de mortalité élevé. Le virus infectieux peut persister plusieurs mois
dans les produits de charcuterie frais, salés et desséchés.
Le virus de la PPA est le seul membre de la famille des Asfarviridae.
Les méthodes de diagnostic de laboratoire se répartissent en 2 groupes : le premier rassemble les
épreuves d’isolement et de recherche des antigènes viraux ainsi que de l’ADN génomique, le
second, ceux de la mise en évidence des anticorps. Le choix des épreuves à employer dépend de
la situation épidémiologique de la région ou du pays.
Dans les pays indemnes de PPA mais suspectant sa présence, le diagnostic de laboratoire doit
viser l’isolement du virus en réalisant simultanément, l’inoculation de cultures de leucocytes ou de
moelle osseuse de porc, la détection de l’antigène sur des frottis ou des coupes de tissus au
cryostat à l’aide d’une épreuve des anticorps fluorescents (EAF) et, si possible, la détection de
l’ADN génomique par une réaction d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). La recherche
des anticorps dans les fluides organiques doit aussi être réalisée en même temps.
Identification de l’agent pathogène : Les prélèvements tissulaires provenant de cas suspects du
terrain doivent être soumis à la recherche d’antigène spécifique par une EAF sur des frottis ou des
coupes au cryostat et à la mise en évidence du virus par inoculation de cultures primaires de
leucocytes de porc qui sont quotidiennement soumises à la recherche de l’hémadsorption et de
l’apparition d’un effet cytopathogène (ECP). Les cellules des cultures négatives font l’objet d’une
recherche de l’antigène par l’EAF et de passages aveugles en cultures fraîches de leucocytes.
La PCR peut être utilisée pour détecter le génome viral dans les tissus et elle est particulièrement
précieuse si ces derniers sont impropres à l’isolement viral et à la mise en évidence des anticorps.
Dans les cas douteux, Les prélèvements seront passés sur leucocytes et les techniques décrites
ci-dessus seront renouvelées.
Épreuves sérologiques : Là où la maladie est enzootique, là où un premier foyer est dû à une
souche de basse virulence, la recherche des nouveaux foyers doit inclure la mise en évidence par
une méthode immuno-enzymatique (ELISA), des anticorps spécifiques, dans le sérum ou les
extraits de tissus prélevés.
Spécifications applicables aux vaccins et aux produits biologiques à usage diagnostique :
A l’heure actuelle il n’existe pas de vaccin pour la PPA.
A. INTRODUCTION
Le virus de la PPA fut d’abord considéré comme un membre de la famille des Iridoviridae, mais la structure du
génome et le mode de réplication du virus ont révélé de nombreux points communs avec les membres de la
famille des Poxviridae (14). La proposition de classer le virus PPA dans une famille séparée de celle des
Iridoviridae fut acceptée au 6e Congrès du Comité International de Taxonomie virale (ICTV, International
Committee on the Taxonomy of Viruses) à Sendai (Japon), en 1984. Ce virus est à l’heure actuelle classé, en tant
que seul membre, dans la famille qualifiée d’Asfarviridae.
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
Les virus PPA provoquent divers syndromes allant de la forme suraiguë à la forme chronique de la maladie avec
des porteurs en bonne santé apparente. Les souches les plus virulentes sont responsables d’une maladie
hémorragique d’évolution suraiguë ou aiguë, se traduisant par une fièvre élevée, une perte de l’appétit, des
hémorragies de la peau et des organes internes, la mort survenant en 2 à 10 jours. Le taux de mortalité peut
atteindre 100 %. Les souches moins virulentes entraînent des signes cliniques plus discrets – légère fièvre,
diminution de l’appétit et abattement – qui peuvent être volontiers confondus avec d’autres affections du porc et
qui peuvent ne pas conduire à une suspicion de PPA. Dans certains pays, des souches avirulentes, non
hémadsorbantes, provoquent une infection asymptomatique non hémorragique, mais une séroconversion ;
cependant certains sujets peuvent développer de petites lésions du poumon et de la peau dans les zones de
protrusions osseuses et dans celles soumises à des traumatismes.
La PPA ne peut être différenciée de la peste porcine classique (hog cholera) ni par l’observation clinique ni par
l’examen nécropsique, et les 2 maladies doivent être incluses dans le diagnostic différentiel des syndromes
fébriles hémorragiques du porc. Des septicémies bactériennes peuvent aussi être confondues avec la PPA et la
peste porcine classique. Les examens de laboratoire sont essentiels pour distinguer ces 2 maladies.
Dans les pays indemnes de PPA mais suspectant sa présence, le diagnostic de laboratoire doit viser l’isolement
du virus par mise en œuvre simultanée, de l’inoculation de cultures de leucocytes ou de moelle osseuse de porc,
et d’une recherche antigénique sur frottis ou coupes de tissus au cryostat par l’épreuve des anticorps fluorescents
(EAF). Cependant, la recherche des anticorps dans le sérum ou les liquides organiques par une méthode
immuno-enzymatique (ELISA), d’immuno-empreinte (immunoblotting) ou d’immunofluorescence indirecte (IFI),
doit être aussi menée parallèlement pour éviter tout retard dans la découverte d’une infection par un virus de
basse virulence. La sérologie peut être un outil précieux pour aider à confirmer un foyer, car les anticorps peuvent
souvent être mis en évidence chez les animaux qui meurent de forme aiguë.
Une autre technique est désormais disponible : l’amplification en chaîne par polymérase (PCR) qui peut être
utilisée pour mettre en évidence le génome viral dans le sang ou les tissus. Elle est particulièrement utile lorsque
les prélèvements en voie de putréfaction sont impropres à l’isolement viral et à la détection antigénique.
B. TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC
1. Identification de l’agent pathogène
Lorsque la PPA est suspectée, les prélèvements suivants doivent être envoyés au laboratoire : sang sur anti-
coagulant (héparine ou acide éthylène-diamine-tétra-acétique [EDTA]), rate, amygdale, rein, nœuds
lymphatiques. Ces prélèvements doivent être conservés au froid, sans congélation, durant le transport. Arrivés au
laboratoire, ils sont conservés à –70°C si leur traitement est différé. Lorsque le maintien de la chaîne du froid ne
peut être assuré, les prélèvements peuvent être placés en solution saline glycérinée ; cela peut altérer
légèrement la possibilité de l’identification virale, mais peut faciliter l’envoi de prélèvement au laboratoire et la
confirmation d’un foyer.
• Préparation du prélèvement pour l’hémadsorption et l’inoculation au porc
i) Préparer des suspensions de tissus en écrasant de petits fragments dans un mortier contenant du
sable stérile, puis ajouter de 5 à 10 ml d’une solution saline tamponnée ou de milieu de culture de
tissu, contenant des antibiotiques.
ii) Clarifier la suspension par centrifugation à 1 000 g pendant 5 min.
Utiliser le surnageant pour l’hémadsorption (Section B.1.a. ci-dessous) et l’inoculation au porc (Section
B.1.d. ci-dessous), bien que l’inoculation au porc ne soit pas recommandée.
a) Épreuve d’hémadsorption
L’épreuve d’hémadsorption (HAD) (6) est essentielle en matière de PPA et repose sur le fait que les
érythrocytes de porc adhèrent à la surface des monocytes et des macrophages de porc infectés par le virus
PPA et que la plupart des isolats produisent ce phénomène d’hémadsorption. Un petit nombre de virus non
hémadsorbants a été isolé, la plupart de ceux-ci étant non virulents, mais certains peuvent être à l’origine de
formes aiguës typiques de PPA. L’épreuve est réalisée en ajoutant du sang ou des suspensions de tissu,
issus de porc suspects, dans des cultures primaires de leucocytes (méthode 1 ci-dessous) ou bien en
préparant des cultures de leucocytes à partir de porcs inoculés au laboratoire ou à partir de sang de porcs
suspects récolté sur le terrain (méthode 2 ci-dessous). Il est possible de préparer jusqu’à 300 cultures à
partir de 100 ml de sang hépariné ou défibriné récolté. En cours de procédure, il est essentiel d’éviter la
contamination des cultures.
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• Méthode 1 : Épreuve d’hémadsorption en culture primaire de leucocytes
i) Récolter le volume requis de sang frais de porc sur héparine (100 unités internationales [UI]/ml de
sang).
ii) Centrifuger à 700 g pendant 30 min, récupérer la couche de cellules blanches et les laver dans le
milieu.
iii) Mettre en suspension les cellules à la concentration de 107 cellules/ml dans un milieu de culture
contenant 10 à 30 % de sérum de porc et des antibiotiques. Afin de prévenir une hémadsorption non
spécifique, le milieu doit contenir le sérum ou le plasma du porc donneur de leucocytes. Si une grande
quantité de prélèvements doit être éprouvée, les sérums homologues peuvent être remplacés par un
sérum qui a été reconnu préalablement capable de prévenir la formation de rosettes non spécifiques.
iv) Répartir la suspension de cellules en aliquots de 1,5 ml dans des tubes de 160 x 16 mm et incuber en
position inclinée (5 à 10° de l’horizontale) à 37°C.
Note: pour un diagnostic de routine, des cultures de 2 à 4 jours sont suffisamment sensibles.
v) Inoculer 3 tubes de cellules en ajoutant 0,2 ml de la préparation de prélèvement de tissu, par tube. Il
est conseillé d’inoculer des dilutions du dixième et du centième ; ce qui est particulièrement important
lorsque les prélèvements de terrain sont en mauvais état.
vi) Inoculer des cultures témoins positives avec un virus hémadsorbant. Ne pas inoculer les témoins
négatifs est essentiel si l’on veut pouvoir révéler une hémadsorption non spécifique.
vii) Après 3 jours, ajouter 0,2 ml d’une préparation fraîche à 1 % d’érythrocytes de porc en solution saline
tamponnée, dans chaque tubes.
viii) Examiner au microscope quotidiennement les cultures pendant 7 à 10 jours, à la recherche de l’effet
cytopathogène (ECP) et de l’hémadsorption.
ix) Lecture des résultats: L’hémadsorption consiste en l’attachement d’une grande quantité d’érythrocytes
de porc sur la surface des cellules infectées. Un ECP consistant en la réduction du nombre de cellules
adhérentes en l’absence d’hémadsorption, peut être dû à la cytotoxicité de l’inoculum, à un virus de la
maladie d’Aujeszky ou à un virus PPA non hémadsorbant, qui peuvent être révélés par EAF sur le
culot cellulaire ou par PCR (voir ci-dessous). Si aucune modification n’est observée ou si
l’immunofluorescence ou la PCR sont négatives, passer le surnageant sur une culture fraîche de
leucocytes.
• Méthode 2 : Épreuve « Autorosette » d’hémadsorption avec les leucocytes du sang périphérique de
porcs infectés
Cette méthode est plus rapide que celle de la préparation et de l’inoculation de cultures primaires de
leucocytes de porc (décrite dans la méthode 1 ci-dessus) et donnera des résultats plus rapides dans les cas
positifs. Elle peut être réalisée dans les laboratoires qui ne sont pas équipés pour des examens virologiques
de routine ; le minimum requis consiste en des lames et lamelles, un microscope, du milieu stérile, des
tubes ou flacons et des pipettes. Le sang des porcs suspects du terrain ou de ceux qui ont été inoculés au
laboratoire, est récolté sur héparine et les cultures de leucocytes sont préparées pour une recherche directe
de l’hémadsorption. Cependant, les résultats de l’épreuve sont difficiles à juger et elle est maintenant
remplacée par la PCR.
i) Récolter 20 ml de sang total dans une seringue contenant 2 000 UI d’héparine en solution saline,
mélanger et transférer dans un tube de verre ou un flacon étroit.
ii) Placer le tube ou le flacon verticalement dans une étuve ou un bain-marie à 37°C et laisser les cellules
sédimenter. La sédimentation est améliorée par addition de 2 ml d’un expanseur de volume de plasma,
tel que le « Dextran 150 » qui est une solution de Dextran 150 dans 0,9 % d’une solution de NaCl pour
injection (Fisons, Royaume-Uni)
iii) Incuber les cultures pendant 6 à 8 h à 37°C, puis, examiner les cultures à intervalle de 2 à 3 h par
transfert de petits aliquots de surnageant riche en cellules blanches avec quelques érythrocytes, sur
une lame et rechercher l’hémadsorption cellulaire sous un microscope.
b) Recherche antigénique par l’épreuve des anticorps fluorescents
L’EAF (2) peut être une méthode additionnelle de détection de l’antigène dans les tissus de porcs suspects
du terrain ou de porcs inoculés au laboratoire. Par elle-même, elle n’est pas suffisante pour le diagnostic de
la PPA. Elle peut être appliquée à la mise en évidence de l’antigène PPA dans les cultures de leucocytes où
l’HAD n’apparaît pas et peut ainsi identifier les souches virale non hémadsorbantes. Elle différencie aussi
l’ECP lié au virus PPA de celui provoqué par un autre virus tel que le virus d’Aujesky ou en rapport avec un
effet cytotoxique de l’inoculum.
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• Protocole
i) Préparer des coupes au cryostat ou des décalques des tissus à examiner, ou étaler le sédiment
cellulaire de cultures de leucocytes inoculés sur des lames ; faire sécher à l’air puis fixer à l’acétone
pendant 10 min à la température ambiante.
ii) Colorer avec une immunoglobuline anti-PPA conjuguée à l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à la
dilution optimale recommandée par le fabricant ou obtenue après titrage préalable, pendant 1 h à 37°C
en chambre humide.
iii) Fixer et colorer un témoin positif et un négatif de la même manière.
iv) Laver à l’aide d’une solution physiologique tamponnée au phosphate (PBS), monter les lames de
tissus colorés en PBS/glycérol, et examiner au microscope à lumière ultra-violette avec des filtres
d’excitation et barrières appropriés.
v) Lecture des résultats : Les tissus sont positifs si une fluorescence granuleuse cytoplasmique est
observée dans la zone paracorticale des organes lymphoïdes ou dans les macrophages fixés au sein
d’autres organes.
c) Mise en évidence du génome viral par la PCR
Des techniques PCR ont été développées, utilisant des amorces correspondant à une région hautement
conservée du génome, permettant de détecter et d’identifier une grande variété d’isolats appartenant à tous
les génotypes connus, y compris les virus non hémadsorbants et les souches de basse virulence. Les
techniques PCR sont particulièrement indiquées pour détecter et identifier l’ADN viral dans les tissus de
porc impropres à l’isolement viral ou à la recherche d’antigène en raison d’un début de putréfaction ou
lorsque l’on a tout lieu de penser que le virus a été inactivé avant l’arrivée des prélèvements au laboratoire.
Deux méthodes PCR sont décrites et comportent le traitement du prélèvement puis le protocole de
l’épreuve.
• Méthode PCR
Ce protocole ainsi que le suivant (protocole 2) constituent un guide général et un point de départ pour la
réalisation de la PCR. Les conditions optimales de la réaction (temps et températures d’incubation, modèles
et fournisseurs d’équipement, concentrations des réactifs tels que les amorces et les dNTPs), peuvent
variées, aussi les conditions doivent-elles être d’abord évaluées. Les détails de validation de la PCR et les
procédures nécessaires à la validité de l’épreuve sont donnés au Chapitre I.1.4., « Validation et contrôle
qualité des méthodes d'amplification en chaîne par polymérase (PCR) utilisées pour le diagnostic des
maladies infectieuses » de ce Manuel terrestre. Des modifications peuvent être facilement apportées aux
différents points du protocole afin d’obtenir de meilleures performances.
• Préparation du prélèvement
i) Préparer des suspensions tissulaires en écrasant de petits fragments de tissu dans un mortier
contenant du sable stérile et faire une dilution au 1/10 en ajoutant 5 à 10 ml de PBS contenant 1 % de
sérum bovin et des antibiotiques.
ii) Centrifuger à 500 g pendant 5 min.
iii) Extraction pour les témoins : homogénats tissulaires au 1/10 (même tissu que le prélèvement à
analyser) : (a) un témoin négatif : utiliser 500 µl d’un homogénat de tissu négatif en PPA ; (b) un
témoin positif : utiliser 500 µl d’un homogénat de tissu positif en PPA.
iv) Transférer 500 µl dans un tube Eppendorf à bouchon à vis et porter à ébullition pendant 10 min.
v) Centrifuger à 13 000 g dans une micro-centrifugeuse pendant 5 min.
Le surnageant tissulaire est utilisé dans l’épreuve.
Le procédé de préparation du prélèvement décrit ci-dessus est simple et bon marché, mais il peut entraîner
des résultats faussement négatifs en raison de la présence d’inhibiteurs PCR. Une autre possibilité
d’extraction faisant appel à la trousse de diagnostic NucleoSpin Virus (Macherey Nagel) est décrite
ci-dessous. Cette trousse de diagnostic comprend les réactifs RAV1, RAV3 et les filtres colonnes
NucleoSpin.
Protocole pour les prélèvements liquides : plasma, sérums, milieu de culture cellulaire.
(A noter que pour les prélèvements d’organes et de tissus, il faut préparer un homogénat au 1/10 dans du
PBS, puis clarifier par centrifugation à 12 000 g pendant 5 min. Utiliser le surnageant).
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Chapitre 2.1.12. — Peste porcine africaine
Extraction pour les témoins : homogénats tissulaires au 1/10 (même tissu que le prélèvement à analyser) :
(a) un témoin négatif : utiliser 150 µl d’un homogénat de tissu négatif en PPA ; (b) un témoin positif : utiliser
150 µl d’un homogénat de tissu positif en PPA.
i) Ajouter 600 µl de RAV1 (ARN porteur inclus) à 150 µl de prélèvement. Bien mélanger par aspirations
et refoulements à la pipette, puis au vortex. Incuber 5 à 10 min à la température ambiante.
ii) Facultatif : Si la solution obtenue est trouble, centrifuger le mélange pendant 1 min pour clarifier.
Transférer le surnageant dans un nouveau tube.
iii) Ajouter 600 µl d’éthanol à la solution claire et mélanger au vortex.
iv) Charger 700 µl du prélèvement sur une colonne NucleoSpin, la placer dans un tube à centrifuger de
2 ml.
v) Centrifuger pendant 60 secondes à 6 000 g à température ambiante. Eliminer le liquide qui en est issu.
vi) Charger le reste du prélèvement sur la même colonne (environ 600 µl) et centrifuger comme ci-dessus.
Eliminer le liquide qui l’a traversé.
vii) Ajouter 500 µl de tampon RAV3 à la colonne NucleoSpin.
viii) Centrifuger pendant 30 secondes à 6 000 ou 8 000 g. Eliminer le liquide et répéter cette étape de
lavage.
ix) Eliminer le liquide de lavage ayant traversé la colonne, puis placer celle-ci dans un nouveau tube à
centrifuger de 2 ml et centrifuger 5 min à vitesse maximale pour éliminer complètement le tampon
RAV3.
x) Elution des acides nucléiques : Placer la colonne NucleoSpin dans un tube à centrifuger stérile de
1,5 ml, ajouter 50 µl de tampon d’élution (5 mM Tris/HCl pH 8,5, préchauffé à 70°C), et incuber 2 min.
xi) Centrifuger 60 secondes à 8 000 g.
xii) Conserver les 50 µl d’ADN élués à –20°C jusqu’à leur utilisation.
• Solutions stock
i) La Taq polymérase d’ADN et le tampon d’amplification (10x) sont disponibles dans le commerce.
ii) Stock de dNTPs 1,25 mM : Préparer des solutions stock de 50 mM de chacun des nucléotides
suivants : dATP, dCTP, dGTP et dTTP. Ajouter 10 µl de chacune de ces solutions à 360 µl d’eau
distillée stérile.
iii) Amorces à la concentration de 20 pmol/µl : Séquence de l’amorce 1 : 5’-ATGGA-TACCG-AGGGA-
ATAGC-3’ (brin positif) ; séquence de l’amorce 2 : 5’-CTTAC-CGATG-AAAAT-GATAC-3’ (brin négatif).
iv) Tampon de charge : 0,25 % d’Orange G en solution aqueuse glycérinée à 30 %.
v) Tampon TAE (50x) pour gel d’agarose : Base Tris (242 g) ; acide acétique glacial (57,1 ml) ; EDTA
0,5 M, pH 8,0 (100 ml) ; eau distillée (q. s. pour 1 litre).
vi) Marqueurs d’ADN : Des échelles de 100 paires de bases sont disponibles dans le commerce.
• Protocole 1
i) Ajouter les réactifs suivants au nombre nécessaire de tubes Eppendorf polypropylène de 0,75 ml :
Eau distillée stérile (24,5 µl) ; (10x conc.) tampon d’amplification (5 µl) ; chlorure de magnésium 25 mM
(4 µl) ; solution stock à 1,25 mM de dNTP(8 µl) ; amorce 1 à 20 µM (1 µl) ; amorce 2 (1 µl) ; surnageant
tissulaire (10 µl) ; Taq polymérase d’ADN à 5 U/µl (0,25 µl).
ii) Les tubes témoins ne contiennent pas de surnageant tissulaire.
Témoins négatif (pas d’ADN) : Ajouter 10 µl d’eau distillée.
Témoins positif : Ajouter 2 µl d’ADN PPA et 8 µl d’eau distillée.
iii) Recouvrir le mélange de 60 µl d’huile minérale.
iv) Placer tous les tubes dans un thermo-cycleur ADN et conduire le programme suivant :
1 cycle à 94°C pendant 5 min.
35 cycles à 94°C durant 1 min, 50°C durant 1 min et 72°C pendant 1 min.
1 cycle à 72°C durant 10 min.
Maintenir à 4°C.
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