manuel de référence à l`usage des personnels de laboratoire

u4(n)=u4(n-1)+
0.02×u3(n-1)-0.0
0004×u3(n-1)×u
4(n-1)
MANUEL DE RÉFÉRENCE À L'USAGE DES PERSONNELS
DE LABORATOIRE
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ
Bureau régional de l'Afrique
Brazzaville
LE VIRUS
DE L'IMMUNODÉFICIENCE HUMAINE
ET SON DIAGNOSTIC
MANUEL DE RÉFÉRENCE À L'USAGE DES PERSONNELS
DE LABORATOIRE
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ
Bureau régional de l'Afrique
Brazzaville • 2004
DIVISION DES MALADIES TRANSMISSIBLES
PROGRAMME RÉGIONAL SIDA
©
Bureau régional de l'OMS pour l'Afrique
(2004)
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signifie pas qu'ils sont approuvés ou recommandés par l'Organisation mondiale de la Santé de
préférence à d'autres produits de nature analogue qui ne sont pas mentionnés. A l'exception
des erreurs et des omissions, les noms des produits sont signalés par des majuscules au début
du mot.
Imprimé en République d' Afrique du Sud
ii
SOMMAIRE
Page
Préface . . ……………………………………………………………………………………………. ....................................vii
INTRODUCTION ..................................................................................................................................1
I
RAPPEL SUR LE VIRUS ET LA RÉPONSE IMMUNITAIRE ..........................................................................3
1.
Le virus .....................................................................................................................................3
2.
Les défenses immunitaires .........................................................................................................4
A.
Les moyens de défense non spécifiques ............................................................................4
B.
Les moyens de défenses spécifiques ..................................................................................4
a)
Éléments intervenant dans la réaction immunitaire .................................................4
b)
Réaction immunitaire ............................................................................................7
c)
Modulation de la réponse immunitaire ..................................................................8
II. L'AGENT VIH .......................................................................................................................................11
1.
Structure du virus ....................................................................................................................11
A.
2.
Le génome ....................................................................................................................13
a)
Les gènes classiques ……………………………………………………….........................13
b)
Les gènes supplémentaires ..................................................................................13
B.
La capside virale …………………………………………………………………. ...........................14
C.
La matrice ……………………………………………………………………….. ............................14
D.
L'enveloppe ..................................................................................................................14
Multiplication du VIH .............................................................................................................15
A.
Fixation sur la cellule cible .............................................................................................15
B.
Pénétration ...................................................................................................................16
C.
Décapsidation ..............................................................................................................17
D.
Rétrotranscription et intégration .....................................................................................17
E.
Expression de l'ADN intégré ..........................................................................................18
F.
Assemblage-libération-maturation ................................................................................19
3.
Variabilité génétique du VIH ...................................................................................................19
4.
Les cellules cibles du VIH ........................................................................................................20
5.
Caractéristiques physico-chimiques du virus ............................................................................21
iii
III. ÉPIDÉMIOLOGIE DE L'INFECTION .....................................................................................................22
1. Les chiffres de l'infection ..................................................................................................................22
2. Modes de transmission du virus ........................................................................................................23
3. Répartition géographique des types et sous-types ..............................................................................23
IV. HISTOIRE NATURELLE DE LA MALADIE ..............................................................................................25
1.
La contamination ...........................................................................................................................25
2.
La primo-infection .........................................................................................................................25
3.
La séro conversion .........................................................................................................................26
4.
Le Syndrome de l'immunodéficience acquise ou SIDA ....................................................................26
V. LE DIAGNOSTIC DU VIH .....................................................................................................................27
1. Le diagnostic sérologique de l'infection à VIH ...................................................................................27
A.
ELISA ou test immuno-enzymatique .........................................................................................27
a)
Test ELISA indirect .........................................................................................................28
b)
Test ELISA de compétition .............................................................................................28
c)
Test ELISA sandwish ......................................................................................................29
d)
Test d'immunocapture des anticorps ..............................................................................30
e)
Les tests combinés de détection antigène/anticorps ........................................................31
2. Évolution des tests ELISA de diagnostic du VIH ..................................................................................31
3. Composition antigénique des tests de détection des anticorps ............................................................31
4. Tests de recherche de l'antigène p.24 ...............................................................................................32
B.
Les tests rapides .......................................................................................................................32
5. Les tests de confirmation ..................................................................................................................36
A.
Le western blot ou test d'immunoempreinte .............................................................................36
B.
L'immunofluorescence indirecte .............................................................................................37
C.
L'immunoanalyse en ligne .......................................................................................................38
D.
La radio-immunoprécipitation (RIPA) .......................................................................................38
6. La mesure de la réplication virale ......................................................................................................38
7. La culture du virus ...........................................................................................................................39
8. Cas particulier de la transmission mère-enfant ...................................................................................39
VI. LES MESURES DE SÉCURITÉ AU LABORATOIRE ...................................................................................41
VII. STRATÉGIES OMS/ONUSIDA DE DIAGNOSTIC DU VIH .....................................................................42
iv
VIII STRATÉGIES DE TESTS SELON L'OMS ET L'ONUSIDA ..........................................................................44
1. Stratégies I de tests VIH : sécurité transfusionnelle, des greffes
et des dons d'organes .......................................................................................................................44
2. Stratégies II de tests VIH : surveillance, diagnostic de l'infection .........................................................44
3. Stratégies III de tests VIH : diagnostic de l'infection VIH .....................................................................44
IX. ASSURANCE DE LA QUALITÉ ...............................................................................................................46
X. NOTIONS DE TRAITEMENT ANTIRÉTROVIRAL ..................................................................................47
CONCLUSION .....................................................................................................................................49
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .....................................................................................................50
GLOSSAIRE ..........................................................................................................................................54
ANNEXE TECHNIQUE .........................................................................................................................56
v
vi
PRÉFACE
La progression rapide de l'incidence de l'infection à VIH en Afrique a créé une situation de grande urgence sanitaire qui
exige la mobilisation accrue de ressources humaines en nombre suffisant et des moyens matériels importants. Pour faire face à
cette situation d'urgence, les stratégies de lutte regroupent les interventions en matière de prévention et le dépistage précoce de
l'infection. Afin de les mettre en œuvre de manière efficace différents types de personnels qualifiés sont indispensables, parmi
lesquels les personnels de laboratoire. Ceux-ci sont incontournables dans le dispositif, car ils sont chargés de détecter l'infection
des personnes infectées. Cependant, les personnes qui sont sélectionnées pour remplir cette tâche n'ayant pas toujours les
connaissances suffisantes qui leur permettraient d'appliquer les principes régissant le travail quotidien qu'elles ont à accomplir,
il s'avère indispensable de renforcer leurs capacités. Pour cela, le présent manuel de référence se propose de leur apporter les
notions théoriques essentielles à la pratique courante en atteignant les cinq objectifs suivants : i) faire un rappel sur les virus en
général et sur les éléments intervenant dans la réponse immunitaire; ii) présenter la structure de l'agent VIH et son cycle de
multiplication; iii) faire connaître les principes des tests de diagnostic, de suivi de l'infection VIH, les tests de biologie
moléculaire et les mesures de sécurité au laboratoire; iv) donner des notions sur l'épidémiologie du VIH, sur l'histoire naturelle
de la maladie et sur le traitement; v) présenter les stratégies OMS/ONUSIDA de diagnostic du VIH et introduire des notions
d'assurance de la qualité.
Ce manuel de référence comprend dix chapitres dont chacun répond aux domaines principaux de la biologie du VIH
selon la structure suivante : introduction, ce qu'il faut savoir, informations techniques, points importants à retenir.
Le manuel insiste tout particulièrement sur les moyens de défense spécifiques et non spécifiques de l'organisme contre
l'infection, la structure du VIH, son organisation génomique, sa variabilité génétique. La connaissance de ces éléments
permettra de comprendre les bases du diagnostic sérologique et les mécanismes d'échappement des virus.
La connaissance du cycle de multiplication du VIH, quant à elle, permettra de comprendre aussi bien les mécanismes de
l'infection que les cibles de la thérapeutique antirétrovirale.
S'adressant aux personnels de laboratoire, le présent document accorde également une part importante au diagnostic en
traitant des techniques qui sont utilisées, à savoir : les tests sérologiques y compris les tests rapides, les tests de confirmation, les
méthodes moléculaires et la culture du virus. La maîtrise de ces techniques est indispensable lorsqu'il s'agit d'effectuer les tests
dans la pratique et de rendre des résultats. Outre l'application dans le travail des principes et techniques préconisés, les
connaissances acquises grâce au manuel permettront aux personnels de laboratoire de bien choisir leurs tests.
vii
viii
INTRODUCTION
Apparu il y a vingt ans, le SIDA s'est propagé dans le monde entier (10). C'est l'épidémie la plus dévastatrice connue par
l'humanité à ce jour. En effet, à la fin de l'année 2003 (16), selon le rapport de l'ONUSIDA, on enregistrait entre 34 et 46
millions de personnes vivant avec le VIH (Figure 1) et 2,5 à 3,5 millions de décès pour l'année (Figure 3). L'Afrique
subsaharienne est la région du monde la plus touchée avec 28,2 millions de personnes infectées (Figure 1) et 2,4 millions de
décès (Figure 3). Pour la seule année 2003, selon l'ONUSIDA, on a enregistré 5 millions d'infections nouvelles dans cette
région. La gravité de cette infection a exigé rapidement une bonne connaissance de l'agent responsable pour pouvoir mieux le
combattre. Grâce à la recherche intense dont le virus du VIH a fait l'objet depuis sa découverte, connaît bien sa structure et son
mode de réplication ainsi que le mécanisme de l'infection et de l'installation de la maladie. Des médicaments sont disponibles,
d'autres sont en train d'être mis au point, ce qui laisse un espoir certain pour les malades.
Cependant, des progrès restent encore à faire en particulier, pour mieux connaître la variabilité génétique du virus, ce
qui permettrait d'envisager l'obtention d'un vaccin efficace.
Dans les domaines du dépistage et du diagnostic de l'infection, les progrès considérables accomplis ont donné lieu à
une variété de tests de grande précision et de haute fiabilité dont on dispose actuellement. De plus, les principales techniques
ont connu des améliorations significatives, ce qui les met à la portée de la plupart des laboratoires.
Parmi les éléments importants de la stratégie de lutte contre l'infection, on peut citer la formation continue des
personnes chargées de combattre l'infection, ce qui garantirait l'efficacité de cette stratégie. En effet, mieux formées, ces
personnes seront capables de faire face à l'infection à VIH. Ce manuel de référence destiné aux personnels chargés du dépistage
de l'infection apporte les principales connaissances nécessaires au travail dans un laboratoire de dépistage et de diagnostic de
l'infection à VIH.
1
Figure 1
Adultes et enfants vivant avec le VIH/SIDA
Estimations à fin 2003
Amérique du Nord
790 000 – 1,2 million
Europe
occidentale
Europe orientale
& Asie centrale
1,2 – 1,8 million
520 000 – 680 000
Asie de l’Est & Pacifique
700 000 – 1,3 million
Afrique du Nord
& Moyen–Orient
Caraïbes
Asie du Sud & du Sud–
350 000 – 590 000 470 000 – 730 000
Est 4,6 – 8,2 millions
Afrique
subsaharienne
Amérique latine
1,3 – 1,9 million
25,0 – 28,2 millions
Australie &
Nouvelle–Zélande
12 000 – 18 000
Total : 34 – 46 millions
Organisation
mondiale
de la Santé
00002–Fr–4 – Décembre 2003
Figure 2
Nombre estimatif d’adultes et d’enfants
infectés par le VIH en 2003
Amérique du Nord
36 000 – 54 000
Caraïbes
45 000 – 80 000
Amérique latine
Europe orientale
Europe
& Asie centrale
occidentale 180 000 – 280 000
Asie de l’Est & Pacifique
Afrique du Nord
150 000 – 270 000
& Moyen–Orient
Asie du Sud & du Sud–Est
43 000 – 67 000
30 000 – 40 000
120 000 – 180 000
Afrique
subsaharienne
610 000 – 1,1 million
3,0 – 3,4 millions
Australie &
Nouvelle–Zélande
700 – 1 000
Total : 4,2 – 5,8 millions
Organisation
mondiale
de la Santé
00002–Fr–5 – Décembre 2003
Figure 3
Nombre estimatif de décès par SIDA
chez l’adulte et l’enfant en 2003
Amérique du Nord
12 000 – 18 000
Caraïbes
30 000 – 50 000
Amérique latine
49 000 – 70 000
Europe
occidentale
Europe orientale
& Asie centrale
2 600 – 3 400
23 000 – 37 000
Afrique du Nord
& Moyen–Orient
35 000 – 50 000
Afrique
subsaharienne
2,2 – 2,4 millions
Asie de l’Est & Pacifique
32 000 – 58 000
Asie
du Sud & du Sud–Est
330 000 – 590 000
Australie
& Nouvelle–Zélande
< 100
Total : 2,5 – 3,5 millions
00002–Fr–6 – Décembre 2003
2
Organisation
mondiale
de la Santé
I.
RAPPEL SUR LES VIRUS ET LA RÉPONSE IMMUNITAIRE
Introduction
Ce chapitre donne un aperçu des caractéristiques du virus, des mécanismes de défenses immunitaires que déclenche
l'organisme humain au moment de l'infection par le virus. Il est divisé en deux sous-chapitres, à savoir :
•
les virus, et
•
les défenses immunitaires.
Ce qu'il faut savoir
À la fin du chapitre vous devez être capable de :
•
présenter les caractéristiques du virus;
•
décrire les moyens de défenses non spécifiques;
•
décrire les moyens de défenses spécifiques;
•
expliquer les mécanismes de la réponse immunitaire.
Informations techniques
1.
Le virus
Le virus est une particule infectieuse différente en tous points des bactéries et des parasites. Il est caractérisé par
l'existence d'un seul type d'acide nucléique ARN (acide ribonucléique) ou ADN (acide désoxyribonucléique) enfermé dans
une enveloppe protéique appelée capside, avec parfois une enveloppe externe. Les parasites et les bactéries possèdent
obligatoirement les deux types d'acides nucléiques et ont une structure se rapprochant de celle de la cellule. Le virus est de très
petite taille, il peut passer à travers un filtre dont les pores ont 22 nm de diamètre. Ne possédant aucun système de métabolisme,
il est obligé de vivre à l'intérieur d'une cellule vivante dont il va détourner la machinerie pour produire les éléments dont il a
besoin. On dit que c'est un parasite strict (ou obligatoire) de la cellule hôte.
Sa multiplication est différente de celles des autres modèles (mitose cellulaire, division binaire des bactéries, etc.); elle
a lieu à l'intérieur de la cellule hôte d'où il va puiser tous les éléments qui lui sont nécessaires. La réplication se fait à partir de son
génome et aboutit à la production de plusieurs milliers de copies du virus. Le virus acquiert son enveloppe au détriment de la
membrane cellulaire.
Il est antigénique et immunogène, ce qui va entraîner la production d'anticorps par l'organisme infecté dirigés contre les
structures protéiques virales. Les troubles qui se développent chez la personne infectée sont la conséquence de la multiplication
du virus dans les cellules. Lorsque le virus quitte la cellule, il a tous ses constituants. Dès qu'il pénètre dans une nouvelle cellule
il se débarrasse de ses enveloppes, l'acide nucléique se retrouve libre dans le cytoplasme et va s'exprimer. On peut imager en
décrivant le virus comme étant une information génétique emballée qui va être décodée et copiée en de multiples exemplaires.
3
2.
Les défenses immunitaires
L'immunité est une fonction physiologique essentielle du corps humain. Elle lui permet de résister et de se prémunir
contre les agressions permanentes auxquelles il est confronté. Les moyens de défense de l'organisme sont de deux types : les
moyens non spécifiques et les moyens spécifiques.
A.
Les moyens de défense non spécifiques
•
Les défenses mécaniques : la peau et les muqueuses constituent une barrière pour les agents infectieux.
•
Les défenses biochimiques : des substances chimiques libérées au niveau de la peau (ex. : acide lactique et
acides gras de la sueur, etc.) et des muqueuses (ex. : lysozyme et acidité gastrique et acidité urinaire, etc.)
peuvent neutraliser l'agent infectieux.
•
Les défenses cellulaires : lorsque l'agent infectieux a réussi à pénétrer dans l'organisme, il est attaqué par les
cellules phagocytaires que sont les polynucléaires, les granulocytes, les monocytes du sang, les macrophages
des tissus. L'agent est phagocyté par la cellule puis digéré.
•
Les défenses humorales : elles font intervenir des substances humorales, dont la plus connue est l'interféron.
Lorsqu'il est présent, le virus peut pénétrer la cellule mais ne peut pas se répliquer, ce qui entraîne sa mort.
Dans l'infection virale en général, ce sont ces moyens de défenses non spécifiques qui interviennent pour
empêcher la maladie de se développer. Lorsqu'ils sont dépassés, l'infection peut s'installer dans la durée.
B.
Les moyens de défense spécifiques
Ils sont constitués par la réaction immunitaire qui est un mécanisme spécifique dirigé contre l'agent infectieux qui l'a
déclenché.
a) Éléments intervenant dans la réaction immunitaire
•
Les organes de l'immunité
Ils sont constitués par la moelle osseuse, le thymus, les ganglions lymphatiques, la rate et le tissu lymphoïde.
•
Les lymphocytes
Ce sont les cellules effectrices de la réponse immunitaire, c'est-à-dire qu'elles sont chargées de la mise en œuvre de la
réaction immunitaire proprement dite. Les lymphocytes sont produits par la moelle osseuse, ils se répartissent en
cellules T et B.
•
Les cellules T sont celles qui ont subi la maturation dans le thymus. Elles sont constituées de deux souspopulations : les lymphocytes T-helper et les lymphocytes T-suppresseurs/cytotoxiques. Les lymphocytes vont
4
se localiser dans les organes lymphoïdes périphériques, en particulier les ganglions lymphatiques. Il y en a un
faible nombre qui circulent dans le sang.
•
Les cellules B sont produites et maturées dans la moelle osseuse, leur vie est courte; elles peuplent les organes
lymphoïdes périphériques et circulent peu dans le sang. Sous stimulation antigénique, elles se transforment en
plasmocytes sécréteurs d'anticorps spécifiques de l'antigène stimulant.
•
Les cellules présentatrices d'antigènes
Elles capturent l'agent agresseur et présentent sa structure antigénique aux lymphocytes. On trouve dans ce
groupe les monocytes/macrophages, les cellules dendritiques, etc.
•
Les molécules du système HLA (complexe majeur d'histocompatibilité)
Elles permettent à l'organisme de reconnaître ses constituants et de ne pas les détruire. Elles s'expriment à la
surface des cellules et interviennent dans la présentation de l'antigène aux lymphocytes.
•
Les cytokines
Ce sont des molécules, comme les interleukines (Il) et les interférons (IFN), qui sont sécrétées par les cellules
immunitaires activées. Elles vont agir sur les cellules non encore activées et assurer ainsi la coordination des
différentes phases de la réponse immunitaire. Elles jouent également un rôle dans la régulation de certaines fonctions
cellulaires (prolifération, différenciation, migration cellulaire).
•
Les marqueurs CD (cluster of différentiation)
Ce sont des molécules que l'on retrouve à la surface de différentes cellules dont les lymphocytes et qui permettent de
les identifier. Le lymphocyte T-helper porte le marqueur CD4 et le lymphocyte T-cytotoxique porte le marqueur
CD8.
•
Les récepteurs pour l'antigène
Ils sont fixés sur la membrane du lymphocyte et lui permettent de reconnaître l'antigène. Le lymphocyte CD3+
possède un récepteur appelé TCR (T cell receptor) qui va capter l'antigène. Pour le lymphocyte B, le récepteur est une
immunoglobuline portée à sa surface.
•
Les antigènes
Dans les infections virales, ce sont essentiellement les protéines structurales du virus qui sont antigéniques. Leur
présence déclenche la réaction immunitaire et la production d'anticorps spécifiques.
•
Les anticorps
Ce sont des immunoglobulines sécrétées par les plasmocytes (forme sécrétoire des lymphocytes B).
Ils sont
spécifiques de l'antigène qui a déclenché leur production.
5
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage VIH et contrôle de qualité, Guide
du personnel de laboratoire». AIDSTECH, 1991
6
b)
Réaction immunitaire
La pénétration d'un agent infectieux dans l'organisme va déclencher une réponse immunitaire. Lors du premier
contact on a une réponse primaire avec production d'immunoglobulines IgM, suivie de la production d'IgG; les
anticorps ne deviennent détectables qu'après un délai d'environ une semaine. Lors d'une rencontre ultérieure on a
une réponse secondaire plus rapide, constituée essentiellement d'IgG. La réaction immunitaire met en jeu une
réaction à médiation cellulaire basée sur les lymphocytes T, une réaction à médiation humorale basée sur les l
ymphocytes B et une coopération cellulaire entre lymphocytes T et B.
Réaction à médiation cellulaire
La stimulation par l'antigène déclenche une multiplication des lymphocytes T qui vont se différencier en cellules Tmémoires et en cellules T- effectrices.
•
Les lymphocytes T-mémoire appelés encore lymphocytes T-helper ou CD4+ ont une durée de vie longue. Ils
sont spécifiques de l'antigène dont ils vont garder la structure en mémoire. À chaque nouvelle rencontre avec
l'antigène ils prolifèrent, ce qui contribue à augmenter le pool de cellules ayant en mémoire la structure de
l'antigène. Ils produisent des interleukines qui assurent la transmission de signaux aux autres cellules du
systèm immunitaire. Ces cellules sont en position centrale dans l'immunité, c'est pour cela que leur
destruction par le VIH entraîne des troubles sévères de l'immunité.
•
Les lymphocytes T-cytotoxiques ou cellules effectrices ou CD8+ agissent directement en détruisant les
cellules porteuses de l'antigène. Il y a également dans ce groupe de cellules effectrices les lymphocytes Tsuppresseurs qui possèdent le marqueur CD8+. Elles contrôlent le niveau de la réponse et assurent le retour à
l'équilibre du système immunitaire.
Réaction à médiation humorale
Elle met en jeu les lymphocytes B. La stimulation par un antigène va entraîner la transformation du lymphocyte,
porteur du récepteur pour cet antigène, en lymphoblaste qui va donner le plasmocyte sécréteur des anticorps
spécifiques. La cellule produit d'abord des IgM puis après un "switch" intra-cellulaire; elle produit des IgG puis des
IgA et ensuite les autres classes d'immunoglobulines. Il y a une prolifération de plasmocytes producteurs, c'est ce qui
explique que la quantité des anticorps va en augmentant au fur et à mesure du déroulement de la réaction
immunitaire.
7
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage VIH et contrôle de qualité, Guide du personnel
de laboratoire». AIDSTECH, 1991
La coopération cellulaire
•
Coopération T-B : le lymphocyte T-helper (ou CD4+ ou mémoire) va par l'intermédiaire des interleukines qu'il
produit, entraîner l'amplification de la croissance et de la différenciation des lymphocytes B en cellules productrices
d'anticorps. Cela permet de raccourcir le temps de mise en œuvre de la réponse secondaire puisqu'il a déjà en
mémoire la structure de l'antigène.
•
Coopération T-T : suite à la présentation de l'antigène par la cellule présentatrice d'antigène (généralement un
macrophage), le lymphocyte CD4+ va induire la transformation d'autres lymphocytes-T en lymphocytes-T
cytotoxiques CD8+.
c)
Modulation de la réponse immunitaire
La réponse immunitaire est adaptée aux besoins de défense de l'organisme. Elle se déclenche suite à une stimulation par un
antigène étranger et retourne à son état de base une fois l'organisme débarrassé de l'agresseur. Le retour à l'équilibre est assuré
par les lymphocytes T-suppresseurs avec la contribution de médiateurs non spécifiques libérés lors de la réaction inflammatoire.
8
Source : Adaptée de D. Male, in «Immunologie, aide mémoire illustré». 3° éd.
1999. De Boeck Université.
9
LES POINTS IMPORTANTS À RETENIR
Virus
o
Il possède un seul type d'acide nucléique, ARN ou ADN.
o
C'est un parasite strict de la cellule.
o
Il se multiplie à partir de son génome, à l'intérieur de la cellule.
o
Il est antigénique et immunogène.
o
Les troubles observés chez la personne infectée sont la conséquence de la multiplication virale.
Défenses immunitaires
o
C'est une fonction physiologique importante du corps humain.
o
Il existe des moyens de défense spécifiques et non spécifiques.
o
Les moyens de défense non spécifiques sont mécaniques, biochimiques, cellulaires et humoraux.
o
Les lymphocytes sont les cellules effectrices de la réponse immunitaire spécifique. Les monocytes
(macrophages) et les cellules dendritiques ont également un rôle à jouer.
o
La présence de l'antigène déclenche la réaction immunitaire et la production d'anticorps.
o
La réaction immunitaire fait intervenir une réponse à médiation cellulaire, une réaction à médiation
humorale et une coopération cellulaire.
10
II. L'AGENT VIH
Introduction
La haute diversité du virus de l'immunodéficience humaine va être étudiée dans ses différents aspects
(1,11,12,18,19,37), c'est-à-dire aussi bien sa structure pure, sa morphogénèse et sa variabilité. Ce chapitre est divisé en cinq
sous-chapitres portant sur :
•
la structure du virus;
•
la multiplication du virus;
•
la variabilité génétique du virus;
•
les cellules cibles du VIH;
•
les caractéristiques physico-chimiques du virus.
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre, vous devez être capable de :
•
décrire la structure du virus;
•
connaître la morphogenèse du virus;
•
discuter de la variabilité génétique du virus;
•
connaître les cellules cibles du VIH;
•
connaître les caractéristiques physico-chimiques du virus.
Informations techniques
Le virus responsable du SIDA est appelé virus de l'immunodéficience humaine ou VIH en abrégé; en anglais on le
nomme «Human Immunodeficiency Virus» ou «HIV». Il appartient à la famille des rétrovirus; ce sont des virus à ARN qui ont la
particularité de passer par une phase ADN au cours de leur multiplication. La rétrotranscription en ADN est possible grâce à une
enzyme apportée par le virus que l'on nomme la transcriptase inverse (reverse transcriptase).
1.
La structure du virus
Il se présente sous la forme d'une particule sphérique de 80 à 100 nm de diamètre. Il est constitué de quatre éléments : le
génome, la capside, la matrice et l'enveloppe.
11
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage VIH et contrôle de qualité. Guide du personnel
de laboratoire». AIDSTECH, 1991
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage VIH et contrôle de qualité. Guide du personnel
de laboratoire» AIDSTECH, 1991.
12
A.
Le génome
Il est constitué de deux molécules d'ARN identiques, chacune d'elle comporte environ 10 000 nucléotides porteurs de
l'information génétique nécessaire à la synthèse des protéines virales. On a les gènes dits classiques et les gènes dits
supplémentaires.
a)
Les gènes classiques
Ils représentent la majeure partie de la molécule d'ARN et sont constitués de trois gènes :
•
Le gène gag (group antigen) : il code pour des protéines de la structure interne du virus
-
b)
p17 MA (matrice)
-
p24 CA (capside)
-
p7 NC (nucléocapside)
•
Le gène pol (polymérase) : il code pour les enzymes virales transcriptase inverse, intégrase et protéase.
•
Le gène env (enveloppe): il code pour des protéines de la structure externe du virus.
-
gp160 (c'est une protéine précurseur)
-
gp120 SU (c'est une protéine de la surface de l'enveloppe virale)
-
Gp 41 TM (protéine transmembranaire).
Les gènes supplémentaires
On a identifié six gènes appelés tat, rev, nef, vif, vpr et vpu (VIH-1) ou vpx (VIH-2). Ces gènes codent pour des protéines
de régulation qui interviennent lors de la réplication virale, mais qui ne participeront pas à la structure du virus.
Les six petits gènes de régulation et leur rôle
tat
“transactivator of transcription”
Le gène Tat est un activateur puissant de la transcription en ARN-m et en ARN viral. En sa présence, les cellules
infectées produisent 1000 fois plus d'ARN viraux.
rev
“regulation of expression of viral proteins”
Le gène Rev permet l'exportation des ARN-m codant les protéines
de structure et les enzymes virales.
nef
“negative regulatory factor”
Le gène Nef favorise la réplication virale.
vif
“virion infectivity factor”
Le gène Vif augmente l'infectivité des nouveaux virions formés par la cellule.
vpr
“viral protéin r”
Le gène vpr et l'activateur de la transcription.
Vpu (VIH-1)
« viral protéin u »
Pour un rôle incertain dans l'assemblage des virions
vpx (VIH-2)
viral protéin x
13
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage VIH et contrôle de qualité. Guide du personnel
de laboratoire». AIDSTECH, 1991
B.
La capside virale
Située au cœur de la particule virale, elle est constituée de protéines p24. Elle renferme les deux molécules de l'ARN, la
protéine p7 et les enzymes virales (transcriptase inverse et intégrase).
C.
La matrice
Constituée de protéines p17, elle tapisse l'intérieur de la particule virale. La protéase virale se retrouve au niveau de
cette matrice.
D.
L'enveloppe
C'est un fragment de la membrane cytoplasmique de la cellule hôte qui est utilisé par le virus comme enveloppe externe.
Elle est recouverte à sa surface par la glycoprotéine d'enveloppe externe gp120 et par la glycoprotéine gp41 transmembranaire.
Ces glycoprotéines de surface proviennent du clivage de la gp160 qui est un précurseur. La gp120 est une protéine dont la
structure se modifie continuellement du fait d'une variabilité génétique propre au VIH. C'est le domaine V3 (variable) de sa
structure qui lui servira à se fixer au récepteur CD4 cellulaire.
14
2.
La multiplication du VIH
Elle se déroule en plusieurs étapes :
A.
Fixation sur la cellule cible
La protéine gp120 reconnaît le récepteur CD4 de la cellule et s'y fixe par son domaine V3. Cela va se traduire par un
changement conformationnel de sa structure qui va permettre sa reconnaissance et sa fixation par d'autres protéines, des corécepteurs cellulaires appelés CCR5 (sur le macrophage) et CXCR4 (sur le lymphocyte). Ces co-récepteurs du VIH sont
normalement des récepteurs cellulaires pour des cytokines qui attirent les leucocytes au cours des réactions inflammatoires.
Les cellules dendritiques présentatrices d'antigène, localisées sur l'épithélium muqueux fixent le virus à l'aide d'un troisième
type de récepteur appelé DC-SIGN. Cette fixation rend le virus résistant. La cellule migre avec le virus porté par le DC-SIGN
jusqu'au ganglion où le virus trouvera les lymphocytes et les récepteurs nécessaires à sa pénétration. Il semble que le virus ne se
réplique que dans le lymphocyte, les autres cellules qui peuvent le fixer le transportent vers les zones riches en lymphocytes.
Source : Adaptée de W. Rozenbaum, in «Guide Infection à VIH 2001 : Impact Médecin Hebdo».
15
Source : Adaptée de «Les Rétroviridae in : http://neb5000.multimania.com/
VirologieI/Retroviridae/Retroviridae%201.htm».
B.
Pénétration
L'interaction de la gp120 avec le co-récepteur va permettre de démasquer la gp41 qui va s'insérer dans la
membrane cellulaire et fusionner avec elle. Cette fusion crée un passage permettant à la nucléocapside virale de se
retrouver à l'intérieur du cytoplasme cellulaire.
16
Source : Adaptée de «Les Rétroviridae in : http://neb5000.multimania.com/
VirologieI/Retroviridae/Retroviridae%201.htm»
C.
Décapsidation
Les enzymes protéolytiques du cytoplasme cellulaire vont digérer la capside virale permettant la libération de
l'ARN viral et de ses enzymes. L'expression virale peut alors commencer.
D.
Rétrotranscription et intégration
La transcriptase inverse virale va permettre la synthèse, à partir de l'ARN viral parental, d'un ADN bicaténaire. Cet
ADN pro-viral (le génome viral étant de type ARN) se circularise et migre vers le noyau en même temps que l'intégrase
virale. Cette enzyme va couper les deux brins de l'ADN cellulaire et y introduire l'ADN proviral. Celui-ci pourra rester
intègre pendant longtemps, réalisant une infection chronique de la cellule, comme il pourra s'exprimer et donner le
génome et les autres constituants des nouveaux virus, ce qui est plus fréquent. L'ARN viral parental est hydrolysé dans le
cytoplasme cellulaire.
17
E.
Expression de l'ADN intégré
L'ARN polymérase cellulaire transcrit l'ADN proviral en ARN-messager et en ARN-génomique viral. Ce premier
transcrit-ARN va jouer à la fois le rôle de messager lu par les ribosomes de la cellule, et celui d'ARN génomique exprimant
l'information virale. Les six petits gènes viraux dits supplémentaires s'expriment en premier; ils codent pour des protéines
régulatrices de l'expression des gènes en coopération avec des facteurs cellulaires. Cela va orienter l'activité de l'ARNpolymerase cellulaire vers la transcription des gènes codant les protéines de structure et les enzymes viraux (gag, pol, env.)
Une polyprotéine gag et une polyprotéine pol sont synthétisées; elles migrent vers la membrane cellulaire. Sous l'action de
la protéase virale, elles seront découpées en protéines capsidales et en enzymes virales lors de la phase de maturation. Une
polyprotéine env est produite, elle sera glycosylée au niveau de l'appareil de golgi cellulaire pour donner la gp160, une
glycoprotéine précurseur. Sous l'action d'une protéase cellulaire, ce précurseur est clivé en glycoprotéines gp120 et gp41
que l'on retrouvera sur la surface membranaire.
Source : Adaptée de De Vitta et al. in «AIDS, etiology, diagnosis, treatment
and prevention». 4° éd. 1997. J Curran et al Associate editors. Lippincott-Raven .
18
F.
Assemblage-libération-maturation
L' assemblage se fait sous la membrane cellulaire à un endroit remanié par la fixation à son extérieur des gp120 et
gp41. Les protéines de structure s'assemblent autour de deux molécules d'ARN, ensuite la membrane cellulaire va
bourgeonner autour de ces éléments jusqu'à les recouvrir et donner les nouveaux virions encore immatures. La protéase
virale achève la maturation des précurseurs qui donnent alors les protéines définitives de la structure virale. Les nouveaux
virus sont alors aptes à infecter d'autres cellules. Le cycle de multiplication du VIH est relativement rapide; une particule
virale peut donner plus de 10 000 exemplaires par jour.
3.
Variabilité génétique du VIH
Le VIH est caractérisé par une grande variabilité génétique. Ceci va constituer un élément aggravant de l'infection,
car les organismes auront sans cesse à lutter contre des souches différentes.
Le génome du virus contient toutes les informations génétiques nécessaires à la perpétuation du message.
Cependant, pour survivre, il doit constamment s'adapter aux menaces de l'environnement. Les variations qu'il va subir au
niveau de son génome vont se traduire par des modifications de la structure externe. Le système immunitaire se retrouvant
confronté à une structure nouvelle ne la reconnaît pas, laissant ainsi le virus lui échapper. Néanmoins, tous les virus
modifiés ne survivent pas car ils ne vont pas résister à la pression de la sélection qu'ils subissent. La diversité est produite
au hasard, seules les bonnes variations (celles qui ne perturbent pas la multiplication) seront viables. Les mauvais variants
disparaissent car les modifications subies empêchent la multiplication virale de se dérouler normalement, ce qui est létal
pour le virus.
L'apparition de nouveaux variants est favorisée par la multiplication très rapide du virus, de l'ordre de
10 000
virus par jour en moyenne. À ce rythme, pour une particule virale au départ on en aura mille milliards au 4ème jour. Le
nombre de virus éliminés par la sélection est dérisoire par rapport à cette production.
La variation fait suite aux erreurs qui surviennent lors de la réplication du génome viral et sont le fait surtout de la
transcriptase inverse. Elle fait en moyenne une erreur sur 10 000 nucléotides, ce qui correspond à la taille du génome. Mais
du fait de la sélection, ne seront gardés que les variants pouvant se répliquer. En général, lorsque la variation touche les
protéines env, la souche obtenue est viable car elle va présenter une structure non reconnue par le système immunitaire de
l'hôte. Si la variation entraîne une modification d'une enzyme du virus, ce variant disparaît car il ne peut plus se multiplier.
La variabilité du gène codant pour la glycoprotéine gp 120 est importante à considérer car c'est celle-ci qui permet la
fixation du virus au récepteur CD4. On a pu constater que la gp120 possède une région constante (C) et une région
variable (V). Les régions constantes sont essentielles à la survie du virus; lorsque le gène qui code leurs protéines subit une
mutation, celle-ci est létale. Les modifications qui portent sur la région V mettent la gp120 à l'abri de la réponse
immunitaire de l'hôte, et permettent au virus d'infecter facilement d'autres cellules. Les modifications du gène gag,, dues
aux erreurs commises par la transcriptase inverse, vont se traduire par des modifications antigéniques de la région V de la
gp 120. C'est cela qui a permis d'identifier les groupes et les sous types du VIH-1.
En 1986, on a découvert en Afrique de l'Ouest un virus différent de celui connu jusque-là. On l'a appellé VIH-2,
le virus précédemment connu est alors nommé VIH-1. Les études génétiques montrent qu'il y a seulement 42 %
d'homologie entre les deux types; chaque type de virus comporte lui-même des différences. Le VIH-1 est divisé en trois
groupes M (majoritaire), O (outlier) et N (non-M non-O). Le groupe M est lui-même subdivisé en sous-types env VIH-1
dénommés par des lettres allant de A à J.
19
La connaissance de la variabilité génétique du virus est importante pour la mise au point de tests de diagnostics et
de vaccins. En effet, un test peut être bon dans un pays et pas dans un autre s'il ne détecte pas tous les sous-types circulant
dans cet autre pays. Cette variabilité doit être prise en compte lors du choix des tests diagnostics.
Pour les vaccins, il est bien connu que celui-ci doit donner aux cellules mémoires de l'organisme la structure de
l'antigène pour leur permettre de déclencher la réponse immunitaire lors d'un contact ultérieur avec le virus. Or les
modifications continues qui affectent la région V de la gp120 rendent difficile la mise au point d'un vaccin qui pourrait
faire produire des anticorps neutralisants. Le vaccin produit à partir d'une souche ne serait efficace que contre la souche
utilisée. Cependant, même dans ce cas il peut devenir inopérant. En effet, la grande vitesse de la réplication virale
débouchera rapidement sur l'apparition de nouveaux variants chez la personne, non reconnus par les anticorps vaccinaux.
Cette répartition est cependant très évolutive, avec la variabilité importante du virus, l'apparition de nouveaux
sous-types n'est pas à exclure.
Virus de l'immunodéficience humaine
Éléments des gènes
VIH-1
VIH-2
Gènes
GP 160
Nature
Précurseur des GP120 et GP41 du VIH-1
ENV
GP140
GP120
GP105
ENV
Glycoprotéine d'enveloppe
P68
POL
Transcriptase inverse
P55
GAG
Précurseur des protéines internes
P52
POL
Transcriptase inverse
ENV
Glycoprotéine transmembranaire
GAG
Précurseur des protéines internes
POL
Endonucléase
GP41
GP36
P40
P34
4.
Précurseur des GP105 et GP36 du VIH-2
P24
P26
GAG
Protéine interne
P17
P16
GAG
Protéine interne
Les cellules cibles du VIH
Le virus peut se fixer sur toute cellule présentant à sa surface le récepteur CD4, cependant les cibles
préférentielles sont les lymphocytes CD4+ (mémoires) et les cellules présentatrices d'antigènes (macrophages, monocytes,
cellules dendritiques).
20
Dans le lymphocyte CD4+ le virus se réplique de façon importante, il quitte la cellule qui va mourir et infecte
d'autres cellules.
La cellule présentatrice d'antigène adsorbe le virus à sa surface et favorise sa dissémination dans l'organisme.
5.
Caractéristiques physico-chimiques du virus
À l'extérieur de l'organisme, le virus est très fragile et pour le détruire il suffit d'utiliser l'une des méthodes
suivantes :
•
chauffage à 56°C pendant 30 minutes
•
solution d'eau de javel à 0,1%
•
l'éthanol à 50%
•
le glutaraldéhyde à 1%
•
Le formol à 0,5%.
LES POINTS IMPORTANTS À RETENIR
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
Le VIH appartient à la famille des rétroviridae
Il est constitué de 4 éléments, un génome à ARN, une capside, une matrice et une enveloppe.
Il se fixe aux cellules portant le récepteur CD4 et le co-récepteur CXCR4 ou CCR5. Sur la cellule
dendritique, il se fixe au récepteur DC-SIGN.
Le virus à trois gènes principaux GAG, POL, ENV
Lors de la multiplication, le génome viral passe par une phase ADN suite à l'action de la transcriptase
inverse. L'action de cette enzyme est fondamentale pour sa réplication.
Les enzymes importantes pour la multiplication sont la transcriptase inverse, la ligase et la protéase.
Le cycle de multiplication du virus permet de comprendre les cibles de la chimiothérapie antivirale.
Le VIH est caractérisé par une grande variabilité génétique, ce qui constitue un élément aggravant de
l'infection.
Les cellules cibles préférentielles du VIH sont les lymphocytes CD4+ (mémoires).
Le virus est fragile à l'extérieur de l'organisme.
Le virus est sensible aux détergents, aux agents tensio-actifs, à la chaleur, aux ultraviolets.
21
III. ÉPIDÉMIOLOGIE DE L'INFECTION
Introduction
Un aperçu global de la situation du VIH/SIDA est donné ici, avec un accent particulier sur la situation en Afrique.
L'ampleur de l'épidémie, les modes de transmission, et les sous-types de VIH en circulation sont couverts par les trois souschapitres suivants :
•
les chiffres de l'infection;
•
les modes de transmission du virus;
•
la répartition géographique des types et sous-types
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
présenter la situation du VIH en Afrique;
•
décrire les modes de transmission du virus;
•
décrire les sous-types de VIH en circulation dans la région
Informations techniques
1.
Les chiffres de l'infection
Le rapport publié conjointement par l'OMS et l'ONUSIDA à la fin de l'année 2003, estime entre 34 et 46 millions
le nombre de personnes vivant avec le VIH dans le monde. Les nouvelles infections sont de l'ordre de 5 millions et les
décès de 3 millions pour la même période. Le nombre de personnes décédées depuis le début de l'épidémie est de 21,8
millions.
L'épidémie est plus sévère dans les pays en voie de développement. Sur les 14 000 nouvelles infections
survenant par jour à l'échelle mondiale, plus de 95 % surviennent dans ces pays. En fonction de l'âge, on note environ
2000 enfants et 13 000 adultes âgés de 15 à 49 ans dont 50 % sont des femmes; l'épidémie touche surtout l'adulte jeune.
L'Afrique sub-saharienne est la région la plus touchée du monde; la prévalence de l'infection chez l'adulte se situe entre
7,5 et 8,5 % alors que la moyenne mondiale est de 1,1 %. À elle seule, elle compte 70 % du total mondial de personnes
vivant avec le VIH. Dans le total des nouvelles infections, tous âges confondus, 71,69 % sont recensées en Afrique subsaharienne et 86,66 % chez les enfants âgés de moins de quinze ans. Concernant les décès, cette région a compté 80 %
des 3 millions enregistrés dans le monde au cours de l'année 2003. Chez les enfants, la proportion est de 88 % du total
mondial de décès par VIH. Les orphelins du VIH/SIDA en Afrique sub-saharienne représentaient à la fin de 1999 un total
de 12,1 millions, soit 91,66 % du total mondial.
Dans cette région, l'espérance de vie à la naissance qui avait nettement augmenté depuis les indépendances,
risque de chuter dans certains pays à 45 ans et ce à l'horizon 2005-2010. En décimant la population jeune active, le SIDA
est en train d'effacer des années d'efforts de développement et d'aggraver les problèmes économiques des pays concernés.
22
2.
Modes de transmission du virus
Il y a quatre modes principaux de transmission du virus :
•
Par voie sexuelle : c'est une infection sexuellement transmissible; ce mode de contamination est le plus
répandu dans le monde.
•
Par le sang : la contamination se fait par transfusions sanguines ou par injection de dérivés sanguins, non
contrôlés.
•
Par des objets souillés de sang (seringues, instruments, etc.) : ces objets deviennent contaminants lorsqu'ils
ont été en contact avec le sang par blessure ou autres.
•
Par transmission mère-enfant : elle survient essentiellement lors de l'accouchement ou par l'allaitement au
sein.
La transmission hétérosexuelle constitue le mode de contamination le plus fréquent, les femmes étaient plus touchées
que les hommes. Environ 10 % des personnes sont infectées par une transfusion sanguine ou par l'usage de matériel non stérile.
3.
Répartition géographique des types et sous-types
Le VIH-1 est présent dans le monde entier. Il se subdivise en groupes O, M et N. Le groupe M se rencontre dans le
monde entier et les groupes O et N sont identifiés au Cameroun. Le groupe M est subdivisé en sous-types dont la répartition
mondiale est très variée (1,6,33,34,36,40). Dans les pays où l'infection VIH est d'introduction récente, un sous-type domine
alors que dans les pays où elle est ancienne ont trouve plusieurs sous-types à la fois. Cependant, cette constatation est relativisée
par l'expansion de l'épidémie qui se traduit par l'introduction de nouveaux sous-types dans des régions où on rencontrait un
autre sous-type. En fonction de la prédominance actuelle, on peut donner la répartition géographique suivante des sous- types :
•
A, C, D, E, F, G, H, et J en Afrique centrale.
•
A, C en Afrique de l'Ouest.
•
B en Amérique du Nord et du Sud, en Europe, en Australie et au Japon.
•
C, A, D en Afrique australe.
•
C en Inde.
•
E en Thaïlande.
•
F au Brésil.
•
I à Chypre.
Dans la pratique du laboratoire, il est important de connaître la circulation des souches dans sa région et cela pour
pouvoir faire un choix judicieux des tests. Par exemple, il faut noter également la présence de recombinants dans diverses
parties du monde, ainsi que la localisation du VIH-2 essentiellement en Afrique de l'Ouest bien que des cas aient été notifiés en
Europe.
Les fabricants produisent des tests détectant un maximum de souches, cependant il faut toujours valider le test proposé
avec des sérums VIH positifs provenant de toute la région où l'on exerce avant de le retenir.
23
LES POINTS IMPORTANTS À RETENIR
o
o
o
o
o
o
24
La voie sexuelle est la voie de transmission prédominante dans la Région africaine, suivie de la
transmission mère - enfant et la voie sanguine.
Il existe deux types de virus dans la Région : le VIH1 et le VIH2.
Le VIH1 à dix sous-types connus.
Le VIH2 à cinq sous-types connus.
La Région africaine compte 70% du nombre total de personnes infectées dans le monde.
Le virus est sensible aux détergents, aux agents tensio-actifs, à la chaleur, aux ultraviolets.
IV. HISTOIRE NATURELLE DE LA MALADIE
Introduction
Entre le jour de l'infection et l'apparition des anticorps, il s'écoule un laps de temps qu'on appelle fenêtre sérologique.
Durant cette période, les tests de dépistage n'arrivent pas à détecter la présence du virus. Ce chapitre va décrire l'histoire
naturelle de la maladie, ce qui permettra de comprendre le mécanisme de développement des anticorps à travers les quatre
sous-chapitres suivants :
•
la contamination;
•
la primo infection;
•
la séroconversion;
•
le syndrome d'immunodéficience acquise.
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
décrire l'évolution cinétique des différents marqueurs du VIH.
Informations techniques
L'infection à VIH va évoluer en trois phases : la contamination, l'infection asymptomatique, la maladie.
1.
La contamination
Le virus pénètre dans l'organisme et gagne les ganglions lymphatiques où il va se multiplier essentiellement dans les
lymphocytes CD4+. Au cours de cette phase qui peut durer jusqu'à 48 heures, il n'y a aucun signe clinique ou biologique
permettant de faire le diagnostic.
2.
La primo-infection
Le virus se multiplie en grandes quantités dans les ganglions lymphatiques qui deviennent palpables cliniquement et
des quantités importantes de virus sont libérées dans le sang. Cette virémie peut être objectivée par la mesure de la charge virale
plasmatique et par la recherche de l'antigénémie p24; elle augmente rapidement. Dans 50 % des cas, cette primo infection est
accompagnée de signes cliniques non spécifiques : fièvre, arthralgies, céphalées et polyadénopathies. Lorsque les signes
cliniques sont importants au cours de la primo infection, il faut craindre une évolution rapide vers le stade de SIDA.
La charge virale plasmatique, c'est-à-dire la quantité de virus présente dans l'organisme, se positive dès le 7ème jour. L'antigène
p24 peut être détecté à partir du 15ème jour.
25
3.
La séro conversion
Elle commence avec l'apparition des anticorps anti-VIH dans la circulation, au plus tôt la 3ème semaine et au plus tard
le 7
3ème
mois après la contamination; le délai moyen d'apparition est de 6 à 8 semaines.
Ces anticorps augmentent rapidement dans le sang alors que la virémie va chuter de façon très importante. Le virus ne
se multiplie plus que dans les organes lymphoïdes et la virémie reste basse; cette phase va durer en moyenne 8 ans. Cette
multiplication virale est inhibée par l'action des lymphocytes CD8+ (T-cytotoxique) qui détruisent les cellules infectées et par
les anticorps qui vont limiter la fixation sur les cellules cibles. Cette phase est cliniquement muette, cependant l'altération
continue des lymphocytes CD4+ (T-helper ou mémoires) va aboutir progressivement à une rupture de l'équilibre qui s'est
établi entre réplication intra-ganglionnaire du virus et la réponse immunitaire. On passe alors à la phase de SIDA maladie.
4.
Le Syndrome de l'immunodéficience acquise ou SIDA :
(7,8,15,1720,21,22,24,2526,29,30,31,32,38,42,43,44,47)
Lorsque le nombre de lymphocytes CD4+, cellules à rôle central dans l'immunité, chute à moins de 200 cellules par
3
mm de sang (la normale est de 1000/mm3), les défenses de l'organisme ne peuvent plus être assurées et la maladie commence.
La virémie augmente de façon importante et devient facilement détectable; des infections opportunistes caractéristiques de
l'immunodépression s'installent. On est alors au stade de SIDA qui peut se traduire également par des manifestations nerveuses
dues à l'atteinte du système nerveux central ou par un sarcome de Kaposi caractérisé par des lésions cutanées de couleur brunviolet, infiltrées dans le derme.
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage VIH et contrôle de qualité. Guide du personnel
de laboratoire». AIDSTECH, 1991
LE POINT IMPORTANT À RETENIR
o
26
Les premiers anticorps apparaissent trois semaines à deux mois après l'infection
V.
LE DIAGNOSTIC DU VIH
Le diagnostic biologique du VIH repose sur la détection des anticorps. Différents tests permettant de le réaliser sont
disponibles. Les moyens de dépistage sont analysés à travers les cinq sous-chapitres suivants :
•
le diagnostic sérologique;
•
les tests de confirmation;
•
la mesure de la réplication virale;
•
la culture de virus;
•
le cas particulier de la transmission mère-enfant.
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
connaître les critères pour sélectionner les tests;
•
expliquer la différence entre un test ELISA et un test rapide/simple;
•
connaître les tests de confirmation du VIH;
•
discuter du diagnostic de la transmission mère-enfant.
Les tests de dépistage de l'infection à VIH par recherche d'anticorps sont apparus assez tôt après le début de
l'épidémie. Actuellement, il existe des tests de mise en évidence des anticorps anti-VIH, des tests de confirmation, des tests de
mise en évidence de l'antigène p24, des tests de mise en évidence et de quantification du génome viral. La culture du virus est
possible, mais vu le risque pour les manipulateurs, elle reste limitée à des laboratoires équipés de confinement élevé de type
PIII.
1.
Le diagnostic sérologique de l'infection à VIH
Deux méthodes très souvent utilisées sont de haute fiabilité : l'ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay ou test
immuno-enzymatique) et les tests rapides de détection des anticorps anti-VIH.
A.
ELISA ou Test immuno-enzymatique
Il y a cinq méthodes ELISA :
•
le test ELISA indirect;
•
le test ELISA de compétition;
•
le test ELISA sandwich;
•
le test ELISA d' immunocapture des anticorps;
•
le test ELISA combiné antigènes/anticorps.
27
a)
Test ELISA indirect
Sur une phase solide, constituée généralement par une cupule de polystyrène, on fixe de l'antigène viral; cette étape
s'appelle "sensibilisation de la plaque ou coating". À l'aide de protéines non humaines, on sature les espaces restés libres pour
éviter d'avoir par la suite des fixations non spécifiques; on appelle cela "saturation ou overcoating". Ces deux manipulations
sont généralement exécutées par le fabricant.
Au laboratoire, on incube le sérum du patient avec les cupules sensibilisées à une température et pendant une durée
qui dépendent du test utilisé. Les anticorps anti-VIH se lient aux antigènes du virus, après lavage pour éliminer les produits non
fixés; on ajoute un conjugué constitué d'une anti-IgG humaine marquée à l'aide d'une enzyme et on incube à nouveau. Après
un deuxième lavage, on met dans les cupules le substrat de l'enzyme. Il se développe une coloration qui sera d'autant plus forte
que la quantité d'anticorps anti-VIH est importante dans le sérum testé. Pour le diagnostic du VIH, ce type de test a été
abandonné car la révélation à l'aide d'une anti-IgG marquée ne permet pas de détecter les anti-VIH des autres classes
d'immunoglobulines. Cela donnait au test une sensibilité insuffisante.
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage HIV et contrôle de
qualité, guide du personnel de laboratoire». AIDSTECH, 1991
b)
Test ELISA de compétition
La sensibilisation et la saturation sont réalisées comme précédemment décrit. Les anti-VIH sériques vont entrer en
compétition avec le conjugué pour la fixation à l'antigène sensibilisant la cupule de polystyrène. Le conjugué est un anticorps
marqué dirigé contre le même antigène que celui qui sensibilise les cupules. Le conjugué est toujours introduit en quantités
fixes dans le mélange réactionnel. L'échantillon contenant l'anticorps et le conjugué sont ajoutés en même temps. Lorsque la
28
concentration d'anti-VIH est élevée dans le sérum du patient, il restera peu de place pour la fixation du conjugué qui sera alors
éliminé au lavage. La coloration sera faible, voir absente. À l'opposé moins il y aura d'anti-VIH dans le sérum et plus il y aura de
sites libres pour la fixation du conjugué. La coloration sera forte. Dans l'ELISA compétition, l'intensité de la coloration est
inversement proportionnelle à la quantité d'anticorps présents dans le sérum. Cette réaction se fait en deux temps et donne ainsi
un résultat plus rapide que la méthode précédente. Cependant, l'ELISA par compétition n'est plus utilisé pour le diagnostic VIH
car l'interférence au niveau de la réaction des autres immunoglobulines sériques, altèrerait la qualité du résultat.
c)
Test ELISA sandwich
Cette méthode est utilisée aussi bien pour la mise en évidence des anticorps que des antigènes. Si on recherche un
antigène sérique, p24 par exemple, il sera pris en sandwich entre l'anticorps anti-p24 sensibilisant la phase solide et l'anticorps
anti-p24 conjugué à l'enzyme. Pour la recherche de l'anti-VIH, on sensibilise la phase solide avec l'antigène du virus qui va
capter l'anti-VIH sérique. La révélation se fait avec de l'antigène VIH conjugué à l'enzyme. Cette réaction se déroule en trois
temps :
i)
incubation du sérum et lavage;
ii)
incubation avec le conjugué et lavage;
iii)
Addition du substrat de l'enzyme.
Après la réaction enzyme-substrat, il se développe une réaction colorée dont
l'intensité est proportionnelle à la
quantité d'anticorps (ou d'antigènes selon le cas). La coloration est mesurée à l'aide d'un photomètre; la lecture à l'œil est
déconseillée, de nombreux positifs pouvant être considérés comme négatifs. Ce sera le cas en particulier pour les échantillons
faiblement positifs.
Les tests de recherche d'anticorps par cette méthode ont été considérablement améliorés. Ils atteignent une sensibilité
voisine de 100 % et une spécificité qui dépasse 95 %.
Source : Adaptée de N.T. Constantine et al. in «Dépistage HIV et contrôle de
qualité, guide du personnel de laboratoire». AIDSTECH, 1991
29
d)
Test d' immunocapture des anticorps
On sensibilise la phase solide, habituellement une cupule de polystyrène, avec un mélange d'anticorps monoclonaux
produits sur animaux capables de fixer les IgM et les IgG humaines. Lorsque les sérums sont incubés dans les cupules, des IgG
et des IgM sériques sont capturées par la phase solide sensibilisée. Après lavage pour éliminer le matériel non lié, on incube à
nouveau avec un conjugué constitué d'antigène du VIH marqué à l'aide d'un enzyme. Celui-ci se fixera de façon spécifique aux
IgM et IgG anti-VIH, les anticorps non spécifiques capturés par la phase solide ne fixent pas le conjugué. On élimine le
conjugué non lié par lavage et l'on met le substrat de l'enzyme. En cas de positivité, il se constitue un complexe phase solide IgM/IgG antiVIH - antigène marqué, qui sera objectivé par une coloration due à la réaction de l'enzyme avec son substrat. En cas
de négativité, ce complexe ne se forme pas, il n'y a pas de coloration. Ce test d'immunocapture qui est à la fois sensible et
spécifique ne convient cependant pas lorsqu'on analyse des échantillons dilués avec du sérum humain normal. L'apport d'IgM
et d'IgG normalement présentes dans tout sérum va avoir un effet de compétition vis-à-vis des IgM et IgG spécifiques du VIH, ce
qui réduit la sensibilité du test. Ceci n'est pas observé lorsque la dilution se fait dans une solution dépourvue
d'immunoglobulines humaines.
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage HIV et contrôle de qualité, guide du personnel
de laboratoire». AIDSTECH, 1991
30
e)
Les tests combinés de détection antigène/anticorps
Les cupules de polystyrène sont sensibilisées à l'aide d'antigènes des virus 1 et 2 ainsi que d'un pool d'anticorps
réagissant avec p24 et p26. Le conjugué est composé des mêmes antigènes et anticorps marqués. Ce test réalise ainsi un
sandwich qui va détecter à la fois l'antigène et l'anticorps.
2.
Évolution des tests ELISA de diagnostic du VIH
Depuis1985, quatre générations de tests ont été développées (2,5,14,17,21,35,39,41,46)
•
Tests de 1ère génération
Ils utilisaient comme antigène pour la réaction un lysat de cellules infectées constitué d'un mélange de
protéines virales et cellulaires. Ces tests donnaient de nombreux faux positifs et une détection tardive de la
séroconversion anti-VIH.
•
Tests de 2ème génération
Ces tests ont considérablement amélioré la sensibilité et la spécificité des réactions par l'utilisation comme
antigènes de protéines obtenues par recombinaison génétique ou de peptides synthétiques. Le délai de
séroconversion a été raccourci de plus de 10 jours par rapport aux tests précédents. Cependant, comme ce
test utilise des IgG marquées pour la révélation des réactions, il ne pouvait pas détecter les anticorps anti-VIH
de classe IgM qui sont les premiers anticorps produits.
Cela allonge le délai de détection de la
séroconversion et donne une sensibilité insuffisante.
•
Tests de 3ème génération
Dans ces tests, l'utilisation d'un conjugué antigène du VIH marqué, permet de détecter toutes les classes
d'immunoglobulines anti-VIH. Cela raccourcit de 5 jours, le délai de détection de la séroconversion (par
rapport aux tests de 2ème génération). Ces tests de 3ème génération sont les plus utilisés actuellement.
•
Tests de 4ème génération
Ils combinent la détection de l'anticorps anti-VIH et de l'antigène p24 viral. Un résultat positif peut signifier
la présence de l'antigène p24 seul ou associé à l'anticorps. Pour trancher, il faut dans un deuxième temps
utiliser des tests séparés pour déterminer la cause de la réactivité. Ces tests ont le grand avantage de détecter
l'infection 5 jours avant l'apparition des premiers anticorps de classe IgM. Ils sont particulièrement utiles lors
de la primo- infection sans signes cliniques, car on ne pense pas alors à rechercher l'antigène p24.
3.
Composition antigénique des tests de détection des anticorps
Du fait de la grande variabilité des souches virales, il faut être très attentif à la composition antigénique des tests
utilisés. Actuellement, on exige d'un test qu'il soit en mesure de détecter les anticorps anti-VIH-1 du groupe M, O et l'anti-VIH2. Normalement, les tests actuellement disponibles répondent à cette exigence.
31
4.
Tests de recherche de l'antigène p24
Ce constituant essentiel de la capside peut être recherché par méthode immuno-enzymatique. Il s'agit d'un ELISA de
type «sandwich». Actuellement, l'intérêt principal de rechercher l'antigène p24 circulant réside dans la détection de la primoinfection. Devant des signes évocateurs, syndrome grippal, syndrome mononucléosique, polyadénopathies, fièvre isolée, etc.,
une recherche d'antigène p24 permet le diagnostic, 5 jours avant l'apparition des anticorps anti-VIH, détectables par un test de
3ème génération. Le pic d'antigène p24 va durer de 3 à 25 jours, il est pratiquement parallèle au pic de l'ARN viral circulant. Audelà de cette durée, l'antigène p24 devient difficilement détectable car pris dans des immunocomplexes antigène p24 anticorps anti-p24; sa mise en évidence à ce stade nécessite une dissociation des immunocomplexes pas toujours aisée à
réaliser. Par contre, l'antigène sera de nouveau détecté à la phase SIDA car sa production en grande quantité à ce moment-là ne
permet pas aux anticorps de complexer tous les antigènes produits.
Il est important de noter qu'à la période de primo-infection, le fait d'avoir antigène p24 négatif et anticorps anti-VIH
négatif, n'exclut pas l'infection par le virus. Il faut toujours faire une recherche d'anticorps anti-VIH quelques semaines après.
Avant l'apparition des méthodes de détection de l'ARN viral, la recherche de l'antigène p24 était utilisée comme
marqueur de la réplication virale. On continue à l'utiliser comme élément de révélation de la culture in vivo.
B.
Les tests rapides
On les définit comme des tests permettant de détecter les anticorps anti-VIH en moins de 30 minutes. D'utilisation
facile, ils sont réalisés avec les mêmes antigènes que ceux utilisés pour produire les tests ELISA.
Il y a plusieurs types de tests rapides :
•
Les systèmes de filtration : ils ont l'inconvénient de nécessiter plusieurs étapes.
•
Les tests d'agglutination: sont d'utilisation facile mais ils nécessitent la lecture par une personne
expérimentée pour l'obtention d'une spécificité et d'une sensibilité élevées.
•
Tests à flux capillaire: ce sont des bandelettes d'utilisation facile dont la lecture est rapide. Elle se fait par
rapport à une bande témoin qui, elle aussi, doit se colorer pour que le résultat soit acceptable.
Les tests rapides de 2ème génération, actuellement disponibles, nécessitent peu ou pas d'équipement. On peut les
réaliser à partir du plasma, du sérum et même à partir du sang total prélevé par piqûre au doigt. La spécificité et la sensibilité sont
similaires à celles de l'ELISA, ils détectent les mêmes types d'anticorps (anti VIH-1 M et O, anti- VIH-2) avec des résultats
pouvant être obtenus en 2 à 5 minutes. L'interprétation des résultats est la même que celle de l'ELISA classique. Par ailleurs, ces
tests permettent la mise en œuvre de la stratégie OMS de dépistage du VIH.
32
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage HIV et contrôle de qualité, guide
du personnel de laboratoire». AIDSTECH, 1991.
33
34
Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage HIV et contrôle de qualité, guide
du personnel de laboratoire». AIDSTECH, 1991
35
5.
Tests de confirmation
L'existence de résultats de recherche d'anticorps anti-VIH faussement positifs et les conséquences qui en découlaient
ont rendu nécessaire le développement de tests complémentaires plus spécifiques. Plusieurs tests peuvent être utilisés :
•
A.
le Western Blot;
•
l'immunofluorescence indirecte;
•
l'immunoanalyse en ligne;
•
la radio-immunoprécipitation.
Le western blot ou test d'immunoempreinte
C'est le plus répandu et le plus utilisé des tests de confirmation. On peut l'assimiler à un ELISA réalisé sur une
bandelette contenant toutes les protéines constitutives du VIH, et un contrôle interne qui permet de s'assurer de la bonne
exécution de la réaction. Il y a le western blot pour anti-VIH-1, pour anti-VIH-2 et celui qui peut détecter les deux types
d'anticorps sur la même bande.
Son principe consiste à faire réagir les anticorps anti-VIH sériques avec toutes les protéines du virus. Celles-ci sont
séparées, en fonction de leur poids moléculaire, par migration sur un gel de polyacrylamide. Elles sont ensuite transférées par
électrotransfert sur des bandelettes de nitrocellulose que l'on sature comme pour l'ELISA, et ce pour éviter les fixations non
spécifiques. Ces étapes sont réalisées par le fabricant.
Au laboratoire, les bandes sont d'abord réhydratées. On en utilise une par échantillon et une par sérum de contrôle.
Chacune d'elle est incubée avec le sérum correspondant. Les anticorps présents vont se lier aux protéines virales retenues par la
phase solide. Après lavage, pour éliminer l'excès de matériel, on incube à nouveau mais cette fois avec un conjugué constitué
d'anti-IgG humaines marquées à l'aide d'un enzyme. Àprès, on lave une nouvelle fois, on met le substrat de l'enzyme qui va
révéler des bandes colorées à chaque fois que le complexe anticorps-antigène s'est formé. Pour que la réaction soit validée, il est
nécessaire que les lignes témoins soient visibles sur la bandelette, on peut alors effectuer la lecture par comparaison des lignes
obtenues avec celles que donne le sérum témoin qui réagit avec toutes les protéines. On considère le test positif lorsqu'on a une
réactivité vis-à- vis de deux protéines env, plus une protéine gag ou une protéine pol.
Actuellement, avec l'amélioration de la qualité des tests de détection des anticorps anti-VIH, il n'est plus nécessaire de
faire le test de confirmation systématiquement. Il reste toutefois indiqué dans le diagnostic, en cas de résultats indéterminés.
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Source : Adaptée de N. T. Constantine et al. in «Dépistage HIV et contrôle de qualité, guide
du personnel de laboratoire». AIDSTECH, 1991
B.
L'immunofluorescence indirecte
Cette technique est facile à réaliser, cependant elle nécessite un microscope à fluorescence et un personnel entraîné à
la lecture de la fluorescence. Son principe est le suivant :
Sur les puits de lames de microscope en verre téflonné, on dépose des lymphocytes-T humains infectés inactivés et
des cellules non infectées qui serviront à la détection d'éventuels anticorps non spécifiques pouvant interférer avec la réaction.
Quatre puits sont utilisés pour les cellules infectées et quatre autres pour les cellules non infectées. Après un séchage à
l'air, les cellules sont fixées à l'acétone. Les lames ainsi préparées peuvent être conservées sous emballage scellé, plusieurs
semaines à -20°C et jusqu'à un an à-70°C. Avant de lancer la réaction, on sort les lames du congélateur et on les laisse revenir à
température ambiante dans leur emballage, pour éviter le dépôt d'humidité de condensation sur les cellules pouvant les lyser.
La réaction peut commencer, on dépose dans chaque puits les sérums dilués que l'on incube pendant 30 minutes à la
température de 37°C. Cette étape permet aux anticorps de se fixer sur les antigènes viraux exprimés par les cellules. Ensuite, on
lave les lames en tampon PBS pendant 15 minutes pour éliminer tout ce qui n'est pas fixé; il faut changer le liquide de lavage
une à deux fois. On sèche les lames à l'air et on les incube de nouveau pendant 30 minutes à 37°C avec une immunoglobuline
anti-IgG humaine conjuguée à l'isothiocyanate de fluorescéine. Celui-ci a la propriété d'émettre une lumière fluorescente sous
37
excitation par une lumière ultra-violet émise par la lampe du microscope à fluorescence. Un nouveau lavage est effectué dans
les mêmes conditions que précédemment pour éliminer tout le conjugué non fixé. Après le séchage, on dépose du glycérol sur
les lames et on les couvre d'une lamelle couvre-objet. Les lames sont de préférence examinées immédiatement à l'aide du
microscope à fluorescence; en cas d'impossibilité on peut les garder une nuit au noir à la température de +4°C.
Si de l'anticorps anti-VIH est présent dans le sérum, il se fixe sur les antigènes des cellules, ce qui sera objectivé grâce à
la fixation du conjugué. On obtient le complexe : cellules avec antigènes - anticorps anti-VIH - conjugué anti-IgG. À la lecture
on aura une fluorescence cytoplasmique car les particules virales sont dans le cytoplasme de la cellule infectée. Comme les
lymphocytes ont un gros noyau occupant la majeure partie du volume cellulaire, on observera une région fluorescente en forme
de croissant dans le cytoplasme. Il est important de commencer d'abord par lire les cellules témoins et de s'assurer de l'absence
d'une fluorescence à leur niveau. À la différence du Western Blot, cette technique permet seulement de dire qu'il y a des
anticorps anti-VIH. Par ailleurs, il faut être très entraîné à la reconnaissance de la fluorescence anti-VIH, car des maladies autoimmunes peuvent entraîner la fixation d'anticorps présents dans le sérum dirigés contre des constituants de la cellule (éléments
du noyau, mitochondries, etc.). Ils seront révélés par la réaction et on les prendra à tort pour des anti-VIH.
C.
L'immunoanalyse en ligne
Des protéines recombinantes et des peptides synthétiques spécifiques de VIH-1 ou VIH-2 selon le cas, sont déposées
sous forme de lignes sur des membranes fixées à des supports plastiques. Manipulée comme un Western Blot, cette méthode
constitue une alternative moins onéreuse, permettant de valider et éventuellement de différencier les deux virus.
D.
La radio-immunoprécipitation (RIPA)
Cette méthode d'utilisation peu courante est limitée à quelques laboratoires. Elle utilise un principe de marquage
radioactif. Les cellules infectées sont mises en culture en présence d'acides aminés radios marqués que le virus incorpore. Les
particules virales ainsi marquées sont recueillies par lyse cellulaire. Les protéines sont solubilisées et mises en contact avec le
sérum; les complexes immuns qui se forment vont être absorbés sur des billes de sépharose-protéine-A puis dilués. Le précipité
ainsi obtenu est mis à migrer sur un gel de polyacrylamide, pour séparer les protéines virales et la révélation est faite par
autoradiographie. Après migration, le gel est exposé contre un film radiographique qui va être impressionné par la radio-activité
retenue par les différentes protéines. Il est développé comme une radiographie ordinaire. Le plus souvent, on détecte les
protéines gp160 et gp120, ce qui permet d'affirmer que le sérum est positif. Cette technique est très sensible et spécifique, mais
elle ne peut être utilisée en routine.
6.
La mesure de la réplication virale
L'acide nucléique du virus peut être mis en évidence dans ses deux formes : ARN ou ADN rétrotranscrit par la technique de
détection de séquences nucléotidiques après amplification appelée PCR (Polymerase Chain Reaction ou Amplification en
Chaîne par la Polymérase). Par ailleurs, cette technique est la seule à permettre la détection du virus pendant les périodes de
latence. En permettant la quantification de l'ARN viral, elle fournit un bon moyen de suivre l'évolution du traitement
antirétroviral. La PCR est très sensible; une seule copie d'acide nucléique viral est amplifiée en des milliers voire en millions
d'exemplaires. Elle permet de faire le diagnostic avant que l'antigène p24 ou les anti-VIH ne deviennent détectables. Elle permet
de déceler le virus dans le plasma, dans les lymphocytes ou dans les cellules cultivées.
La PCR ne permet d'amplifier que des séquences d'ADN et lorsque l'acide nucléique viral est sous forme ARN, on doit
38
d'abord faire une rétrotranscription in vitro à l'aide d'une transcriptase inverse; on obtient un ADN complémentaire ou ADNc
que l'on va amplifier. La méthode PCR se déroule en quatre étapes :
•
Dénaturation de l'ADN viral : cela permet d'obtenir un ADN monocaténaire.
•
Association de l'ADN viral avec des amorces (primers) : ces amorces correspondent à des séquences de
bases des régions non variables du génome. Deux amorces nucléotidiques, complémentaires des brins sens
positif et négatif de l'ADN cible sont utilisées.
•
Extension de l'amorce : cette étape permet l'élongation du brin complémentaire obtenu.
•
Cycles d'amplification : la polymérase va copier les brins obtenus en plusieurs exemplaires. La révélation du
produit se fait à l'aide de sondes marquées par des enzymes ou des signaux de chimiluminescences. Les
sondes à marquage radio actif ont tendance à ne plus être utilisées.
En répétant le cycle plusieurs fois, on obtient une croissance exponentielle du nombre de copies de la séquence que
l'on a ciblé. La sensibilité de cette technique est telle qu'une seule particule virale dans 10000 lymphocytes, soit 20 microlitres
de sang, pourra être détectée. Elle est également très spécifique, cependant, elle est d'exécution délicate. La PCR nécessite de la
technicité, des locaux adéquats et une grande discipline dans le travail. Le non-respect de ces conditions se traduit par des faux
résultats, la plus infime particule contaminante sera suramplifiée de façon telle qu'on risque d'être obligé de changer de local
pour continuer à pratiquer ces techniques. La PCR est réservée à des laboratoires bien équipés et disposant d'un personnel
qualifié pour le diagnostic moléculaire.
La recherche de l'acide nucléique viral est utile pour le diagnostic précoce de l'infection, quand tous les autres
paramètres sont silencieux, et pour le diagnostic de l'infection chez le nouveau-né de mère infectée par le VIH. Facile à
quantifier, la PCR permet le suivi de la thérapeutique anti-virale, c'est ce que l'on appelle la mesure de la charge virale.
7.
La culture du virus
C est une méthode longue, difficile et coûteuse. Elle ne peut être appliquée que si l'on dispose d'un laboratoire de
haute sécurité, classé PIII. La mise en culture est réalisée selon le principe de la co-culture. À partir d'un sang prélevé stérilement
dans un tube hépariné stérile, on réalise sans dépasser un délai de 6 heures une séparation de lymphocytes. Dans un milieu de
culture adéquat, on met les lymphocytes du patient en contact avec des lymphocytes provenant de donneurs sains. Les
lymphocytes provenant du patient infectent les lymphocytes sains qui vont alors multiplier le virus. On mesure la quantité de
particules virales produites, exprimées en nombre d'unités infectieuses par millions de lymphocytes. Pour cela, on quantifie
dans les surnageants de culture, soit l'activité transcriptase inverse, soit l'antigène p24.
8.
Cas particulier de la transmission mère-enfant
Chez l'enfant né de mère atteinte par l'infection, le diagnostic par ELISA ou par tests rapides de détection des anticorps
est rendu très difficile par la présence des anticorps maternels que l'on peut détecter jusqu'à l'âge de 18 mois. Actuellement, le
diagnostic de la contamination de l'enfant par sa mère se fait par PCR ou par culture. Lorsqu'on n'a pas accès à ces techniques,
on peut utiliser la recherche de l'antigène p24 comme technique alternative
39
LES POINTS IMPORTANTS À RETENIR
o
o
o
o
o
40
Les principes des différents tests ELISA.
L'évolution des tests de diagnostic sérologique.
Les tests rapides/simples.
Les principes des différents tests de confirmation.
Diagnostic de la transmission mère-enfant.
VI.
LES MESURES DE SECURITÉ AU LABORATOIRE
Des mesures de sécurité doivent être observées au laboratoire afin d'assurer la protection des manipulateurs. Ce
chapitre décrit les mesures à prendre dans ce sens.
Ce qu'il faut savoir
A la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
Connaître et appliquer les mesures de sécurité
Informations techniques
Tout prélèvement arrivant au laboratoire est potentiellement infectieux. Cependant des mesures simples permettent
d'assurer la sécurité du manipulateur et de ses collègues. C'est ainsi qu'il faudra :
•
toujours porter des gants pour manipuler les prélèvements;
•
ne jamais pipeter à la bouche;
•
ne pas fumer, manger ou se maquiller dans les zones de travail;
•
s'il y a risque de projection de sang, porter un masque et des lunettes de protection;
•
décontaminer les paillasses à l'eau de javel, systématiquement à la fin du travail et à chaque fois que du sang
•
se laver les mains au savon et à l'alcool à 70°, après chaque manipulation;
ou du liquide biologique est renversé;
•
recevoir les prélèvements dans des containers fermés hermétiquement. Il faut les manipuler délicatement,
ne pas s'éclabousser quand on ouvre le container ou les tubes de sang;
•
en cas de contact avec du sang ou du liquide biologique, se laver immédiatement avec de l'eau et du savon
puis avec de l'alcool à 70°; ou avec de l'eau de javel à 0,1 %. Si le contact se fait avec une muqueuse, il faut
laver abondamment à l'eau ou au sérum physiologique;
•
que tous les effluents du laboratoire selon le cas, soient autoclavés, ou soumis à une désinfection chimique,
ou incinérés.
Les mesures de protection sont faciles à respecter et ne sont pas très contraignantes. Une bonne discipline dans leur
application permettra de travailler en toute sécurité.
LE POINT IMPORTANT À RETENIR
o
Toutes les mesures de sécurité sont à connaître et à appliquer scrupuleusement.
41
VII.
STRATÉGIES OMS/ONUSIDA DE DIAGNOSTIC DU VIH
Les recommandations concernant le choix et l'utilisation des tests de mise en évidence des anticorps anti-VIH ont été
publiées pour la première fois par l'OMS en 1992. Depuis, de nouveaux types de méthode ont été mis au point, y compris pour
la recherche des anticorps dans la salive et l'urine. Toutefois, les stratégies de dépistage décrites ici ne seront appliquées qu'aux
tests sur le sérum ou plasma. Ces stratégies ont été élaborées pour réduire le coût du dépistage tout en maximisant la sensibilité
et la spécificité.
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
identifier les objectifs du dépistage du VIH;
•
connaître les stratégies recommandées et la marche à suivre;
•
décrire les avantages et les désavantages des différentes stratégies.
Les tests de recherche des anticorps anti-VIH sont réalisés dans les cas suivants :
•
pour assurer la sécurité transfusionnelle, des greffes d'organes, de tissus, de sperme et d'ovules;
•
dans la surveillance de la prévalence et de la tendance de l'infection au sein d'une population;
•
pour le diagnostic de l'infection chez des personnes asymptomatiques ou porteuses de signes suggestifs de
l'infection VIH/SIDA.
L'OMS et l'ONUSIDA recommandent trois stratégies de tests en fonction des trois cas cités ci-dessus et du taux de la
prévalence de l'infection.
42
Prévalence de
l'infection à VIH
Objectifs du test
1. Sécurité de la transfusion
sanguine et du don d'organe
2. Surveillance
épidémiologique
Toutes les
prévalences
I
? 10 %
I
≤
II
10%
< 30%
3. Diagnostic
de l'infection
à VIH
Types de stratégies
I
Signes cliniques et
symptômes
≤ 30%
> 10%
II
II
Asymptomatique
≤ 10%
III
43
VIII. STRATÉGIES DE TESTS SELON L'OMS ET L'ONUSIDA
1.
Stratégies I de tests VIH : Sécurité transfusionnelle, des greffes et des dons d'organes
Quelle que soit la prévalence de l'infection, on teste un prélèvement de sang. S'il est négatif on valide le don, s'il est
positif ou indéterminé le don est refusé. Cependant, le résultat de ce test n'est pas suffisant pour le diagnostic et ne doit pas être
utilisé pour annoncer la séropositivité du donneur.
2.
Stratégies II de tests VIH : Surveillance, diagnostic de l'infection
Le sérum est testé avec un ELISA ou un test rapide. S'il est négatif on valide le résultat. S'il est positif, on le manipule à
nouveau avec un test basé sur un principe différent ou ayant une composition antigénique différente. Si ce 2ème résultat est
positif, on valide le résultat comme positif. Par contre, si le 2ème résultat est négatif, on doit refaire les deux tests.
Trois éventualités sont possibles :
•
•
le 1er et le 2ème tests sont retrouvés positifs, on considère le résultat positif;
les résultats restent discordants, on considère le résultat comme indéterminé, on refait alors un prélèvement
après deux semaines et à intervalle de 3, 6 et 12 mois si nécessaire, mais si un an plus tard les résultats restent
indéterminés, la personne est considérée comme négative pour les anticorps anti-VIH;
•
3.
le premier et le 2ème tests sont négatifs, on valide le résultat comme négatif.
Stratégies III de tests VIH : diagnostic de l' infection VIH
Comme dans les stratégies précédentes, si le 1er test est négatif on valide le résultat comme négatif. S'il est
positif, on refait le test, on a alors trois éventualités :
•
le 2ème test est négatif, on refait les deux tests; si les deux sont négatifs, on valide le résultat comme négatif;
•
les deux résultats sont trouvés positifs, on refait un 3ème test;
•
la discordance persiste, on fait un 3ème test.
Après le 3ème test, on a encore trois éventualités :
a)
si les trois tests sont positifs, on valide le résultat comme positif;
b)
s'il y a une discordance positif/positif/négatif ou positif/négatif/positif, le résultat est considéré indéterminé;
comme précédemment, on refait un prélèvement après 2 semaines, puis 3 mois, 6 mois et 12 mois; après un
an de suivi, la personne est considérée négative en anticorps anti-VIH;
c)
si la discordance est du type positif/négatif/négatif, on tient compte du milieu de la personne; si elle est dans
un milieu à risque, le résultat est déclaré indéterminé et on fait le suivi sérologique sur un an, si elle est dans
un milieu à faible risque, le résultat est considéré négatif;
44
(d)
Les trois tests devront être soient basés sur des principes différents, soit de composition antigénique
différente.
LE POINT IMPORTANT À RETENIR
o
Il existe trois stratégies pour le dépistage du VIH en fonction des objectifs et de la prévalence.
45
IX.
ASSURANCE DE LA QUALITÉ
Afin de garantir les résultats corrects au laboratoire, des mesures tendant à améliorer et à assurer la reproductibilité
doivent être mise en place. Le développement d'un programme d'assurance de la qualité va énormément contribuer à renforcer
la qualité intrinsèque des résultats fournis par le laboratoire.
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
Identifier le rôle de l'assurance de la qualité pour le diagnostic du VIH.
•
Connaître les différentes étapes d'un programme d'assurance de la qualité.
Tous les laboratoires assurant le dépistage du VIH doivent respecter des critères de qualité. La norme ISO 8402 définit
ainsi l'assurance la qualité : «Ensemble des activités préétablies et systématiques mises en œuvre dans le cadre d'un système
qualité, et démontrées en tant que de besoin, pour donner la confiance appropriée en ce qu'une entité satisfera aux exigences
de la qualité.»
Au laboratoire, l'application de cette définition va consister à mettre en place un ensemble de processus qui garantisse
que les résultats finaux rendus par le laboratoire sont aussi exacts que possible. Cela se fera par la mise en place d'un système de
contrôle pour repérer aussi bien les erreurs techniques que de secrétariat, et ce depuis le recueil du prélèvement jusqu'à la
remise du résultat final. La démarche qualité devra comporter un contrôle de qualité et une évaluation externe de la qualité.
Le contrôle de qualité consiste à mettre en place des mesures lors de la réalisation de chaque analyse afin de vérifier
qu'elle se déroule correctement. On peut savoir ainsi, si l'analyse en cours est valable et donne des résultats acceptables.
Cependant, le contrôle de qualité garantit la manipulation du sérum, mais n'indique pas si les résultats finaux sont exacts, ni s'ils
ont été correctement enregistrés. Par exemple, si on a fait une erreur d'étiquetage du tube de prélèvement, le résultat de la
manipulation est bon mais il ne correspond pas au patient, ce dernier recevra un faux résultat.
L'évaluation externe de la qualité est assurée par un laboratoire national de référence. Celui-ci envoie à chaque
laboratoire participant les mêmes échantillons de sérum codés. Ils devront les manipuler dans les conditions habituelles de
travail et renvoyer les résultats au laboratoire national. Celui-ci en fait l'étude et transmet ses conclusions et commentaires aux
différents laboratoires participants. Ainsi chacun pourra évaluer la qualité de ses résultats et de ses performances. Cela lui
permettra également de déterminer l'efficacité de son programme d'assurance qualité. Le laboratoire national de référence doit
lui-même être inscrit à un système international d'évaluation externe de la qualité.
LE POINT IMPORTANT À RETENIR
o
46
Importance du contrôle de qualité, l'évaluation de la qualité, de l'assurance de la qualité.
X.
NOTIONS DE TRAITEMENT ANTIRÉTROVIRAL
Ce chapitre donne un aperçu des possibilités disponibles pour améliorer les conditions de vie des malades grâces à
une thérapeutique qui va réduire la production virale et accroître le bien-être des patients.
Ce qu'il faut savoir
À la fin de ce chapitre vous devez être capable de :
•
Décrire les mécanismes d'action des antirétroviraux
Le but du traitement antirétroviral est la réduction de la charge virale plasmatique, c'est-à-dire la quantité de virus
circulants, au niveau le plus bas possible et le plus longtemps possible. La décision de traiter est prise en tenant compte du taux
des CD4/CD8 et du taux de charge virale.
Les antirétroviraux sont classés en fonction de leur mode d'action sur le virus, qui consiste à bloquer une étape
essentielle à la multiplication virale. C'est ainsi que l'on a les inhibiteurs de la transcriptase inverse et les inhibiteurs de la
protéase virale.
Les inhibiteurs de la transcriptase inverse sont de deux types :
•
les inhibiteurs non nucléosidiques ou IN (Zidovuine, Didanosine, Stavudine, etc.);
•
les inhibiteurs non nucléosidiques ou INN (Elfavirenz, Delavirdine Nevirapine, etc.).
Ils sont virostatiques, c'est-à-dire qu'ils empêchent la multiplication du virus sans le tuer.
Les inhibiteurs de la protéase virale ou IP (Nelfinavir, Saquinavir, Indinavir, etc.) empêchent la maturation du virus en
bloquant l'action de la protéase virale. Les virus seront libérés sous forme immature et deviennent non infectants.
Tous les schémas thérapeutiques sont basés sur une association de ces produits. C'est ainsi que l'on recommande
d'administrer 2 IN + 1 IP ou 2 IN + 1 INN ou 3 INN. Cependant malgré les progrès remarquables marqués en particulier par la
disparition des infections opportunistes chez le patient et une amélioration de sa qualité de vie, ces traitements restent
insuffisants à éliminer le virus et à permettre le rétablissement total de l'immunité chez le patient. Chez les patients en phase
chronique d'infection VIH, on observe malgré le traitement, un rétablissement lent de l'immunité et chez la majorité d'entre eux
une absence presque totale de retour d'immunité anti-VIH. Pour contrecarrer cela, on a été incité à donner aux patients traités
une immunothérapie pour pallier les insuffisances immunitaires du patient. C'est ainsi que l'on adjoint au traitement
antirétroviral une cytokine, l'interleukine-2 (Il-2). D'autres cytokines sont en cours d'essai, ainsi que l'interféron pour ses
propriétés antivirales en particulier chez les sujets co-infectés par le VHC.
Les perspectives d'avenir s'orientent vers la thérapie génique avec la mise au point de vecteurs qui ont permis, in vitro,
de rendre des cellules cibles de l'infection résistantes au virus. L'option la plus importante reste celle du développement d'un
vaccin efficace. Cependant, on se heurte encore à de nombreux problèmes, le plus important étant celui de la grande variabilité
du VIH.
47
L'efficacité du traitement est mesurée par le taux de CD4/CD8 et le niveau de charge virale. Les autres éléments du
suivi sont constitués par la formule de numération sanguine, le taux de plaquettes, la sérologie des virus des hépatites B et C ainsi
que le cytomégalovirus. Pour juger des effets indésirables du traitement, divers tests biochimiques sont utilisés dans la
surveillance de ceux-ci (créatinine, transaminases, phosphatases alcalines, gamma GT, glycémie, triglycérides, cholestérol,
HDL-cholesterol).
On devra également faire des dosages plasmatiques des antirétroviraux. L'apparition des éventuelles résistances aux
antirétroviraux est montrée par des génotypages de résistances que l'on réalise à l'aide de séquenceurs.
LES POINTS IMPORTANTS À RETENIR
o
o
48
Inhibiteurs de la transcriptase
Inhibiteurs de la protéase
CONCLUSION
Après deux décennies d'évolution, l'infection à VIH/SIDA continue de s'étendre dans le monde. Le délai important
qui s'écoule entre l'infection et l'apparition des premiers signes de la maladie laisse présager l'apparition d'un nombre
important de cas de SIDA dans le proche avenir. Cela sera particulièrement le cas pour l'Afrique qui est le continent où l'on
compte le plus grand nombre de personnes vivant avec le VIH. Dans ce contexte, le dépistage de l'infection VIH constitue une
dimension stratégique de l'effort de lutte contre la propagation de la maladie. En détectant un maximum de personnes infectées,
on peut faciliter la mise en place de mesures préventives permettant ainsi de limiter la propagation du virus vers des personnes
non encore infectées.
Actuellement, le diagnostic de mise en évidence de l'infection est à la portée de tous les laboratoires. La disponibilité
de tests à la fois fiables et sensibles, a grandement facilité la tâche, certains comme les tests rapides ne nécessitent pas de grandes
installations. Cependant, le respect des bonnes règles de travail et la mise en place d'une démarche qualité sont indispensables
pour l'obtention de bonnes performances au laboratoire. Il ne faut pas perdre de vue qu'un résultat inexact a des répercussions
graves : faussement positif, il entraîne une situation difficile chez la personne en particulier sur le plan psychologique;
faussement négatif, il laisse un porteur méconnu qui continuera à disséminer le virus.
Avec le développement des thérapeutiques anti-rétrovirales, les laboratoires sont de plus en plus sollicités pour
assurer le suivi du traitement. L'évolution des techniques de mesure de la charge virale dans le sens de la simplification et de la
praticabilité mettra à terme cette technique à la portée de laboratoires qui ne peuvent pas la pratiquer actuellement.
L'infection virale se propage rapidement, mais l'évolution des connaissances la concernant se fait également à rythme
soutenu. Dans l'histoire de la virologie, jamais un virus n'a bénéficié d'une recherche aussi importante, avec autant de moyens
et de résultats aussi appréciables que le VIH. À ce jour, la prévention reste le meilleur moyen d'éviter l'infection; elle fait encore
appel à des moyens non spécifiques. En tenant compte de tous les progrès, un vaccin sera sûrement disponible dans un avenir
qui ne devrait pas être trop lointain, l'infection pourra alors être contrôlée de façon efficace.
49
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53
GLOSSAIRE
Anticorps : protéines produites par l'organisme en réponse à la présence d'une substance étrangère, d'un antigène.
Antigène : substances étrangères qui incitent généralement le système immunitaire à produire des anticorps. Ces anticorps
peuvent réagir spécifiquement avec l'antigène spécifique.
Assurance de la qualité : programme d'ensemble qui assure que les résultats finaux communiqués par un centre de dépistage
sont aussi précis que possible.
CD4 : molécule réceptrice qui fixe le VIH. Située sur des lymphocytes T dits auxiliaires ainsi que sur certaines autres cellules,
elle sert de marqueur pour identifier ces cellules.
Cellules B : catégorie de lymphocytes humains qui se développent dans la moelle osseuse et jouent un rôle important dans
l'immunité humorale.
Cellules cytotoxiques : lymphocytes T qui reconnaissent des antigènes spécifiques sur des cellules infectées ou malignes et qui
tuent ces cellules.
Cellules inductrices : lymphocyte T qui incitent d'autres cellules immunitaires à réagir.
Cellules inhibitrices : lymphocytes T qui inhibent ou répriment la réaction immunitaire des autres cellules du système
immunitaire.
Cellule T : cellules produites dans la moelle osseuse et qui migrent dans le thymus où elles se multiplient et mûrissent pour
devenir des lymphocytes capables d'une réaction immunitaire.
Cellule TN : cellules tueuses naturelles. Lymphocytes qui sont des tueurs non spécifiques de certaines cellules tumorales ou
infectées par un virus.
Contrôle de qualité : les mesures de contrôle à exécuter à chaque test de dépistage pour vérifier qu'il se déroule correctement.
Env : le gène qui dirige la production des glycoprotéines d'enveloppe du VIH, notamment la gp160, la gp120 et la gp41.
Enveloppe : la paroi externe du virus, composée de glycoprotéines et de lipides.
Évaluation de la qualité : le moyen de déterminer la qualité des résultats. Généralement un dispositif externe de contrôle des
compétences des structures de dépistage.
Fenêtre sérologique : la période suivant l'infection mais qui précède le moment où un anticorps peut être détecté.
Gag : le gène des antigènes associés en groupe qui encode les protéines de noyau p55, p24, p17 et p15 du VIH.
Génome : la somme de tous les gènes d'un organisme
54
Glycoprotéines : protéines liées à des hydrates de carbone
Immunogénique : qui déclenche une réaction immunitaire.
Infection : stade où le virus s'est attaché à la cellule hôte, l'a pénétrée et s'y est incorporé.
Infections opportunistes : infections qui se produisent chez un sujet immunodéprimé et qui ne se produiraient pas chez un sujet
ayant un appareil immunitaire sain. Infections dues à des germes normalement bien tolérés par l'organisme mais deviennent
agressifs lorsque le système immunitaire est déficient.
Lymphocytes : globules blancs du sang et possédant un seul noyau.
Lymphocytes T auxiliaires : type de cellules T qui stimulent les réponses immunitaires. Les lymphocytes T auxiliaires coopèrent
avec les cellules B et d'autres cellules T pour déclencher des réactions d'anticorps. On les appelle aussi des T-4 parce qu'ils
portent le marqueur CD4.
Macrophages : cellules géantes du système phagocytaire mononucléaire qui dévorent les microbes, présentent les antigènes et
secrètent d'importantes substances activantes de l'appareil immunitaire.
Négatif : le résultat d'un test que l'on communique indiquant que l'analyse n'a révélé aucune présence d'infection par le VIH.
Noyau : région interne du virus, recouverte d'une enveloppe protéique, contenant le génome ARN ou ADN et des enzymes
virales.
Plasmocytes : lymphocytes B activés qui produisent des anticorps dirigés contre un antigène particulier.
PMN : leucocytes polymorphonucléaires. Globules blancs qui sont granulocytes et phagocytes.
Pol : le gène de polymérase ou les protéines de polymérase p66, p51, et p31.
Positif : le résultat d'un test que l'on communique indiquant que l'analyse a révélé la présence d'une infection par le VIH.
Prévalence : le pourcentage de personnes dans une population donnée atteintes d'une maladie ou d'une affection à un moment
déterminé.
Rétrovirus : virus qui utilise une enzyme de réplication pour prendre un génome d'ARN et fabriquer de l'ADN.
Sensibilité d'un test : mesure de la probabilité d'un test de détecter correctement les sujets infectés ou non infectés.
Test de dépistage rapide : épreuve de diagnostic biologique de l'infection à VIH dont le résultat peut être obtenu en moins de 30
minutes
Transcriptase inverse : l'enzyme de réplication utilisée par les rétrovirus.
55
ANNEXE TECHNIQUE
LE DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE DE L'INFECTION À VIH
La recherche des anticorps anti-VIH nécessite :
-
un prélèvement sanguin;
-
des réactifs pour l'exécution du test;
-
un personnel qualifié.
A.
Le prélèvement sanguin
1.
Préparation :
2.
-
Alcool et coton ;
-
Seringue stérile ou trocart (épicrânienne pour les prélèvements difficiles) ;
-
Garrot et pansements ;
-
Tubes stériles et étiquettes (étiqueter le tube avant de faire le prélèvement) ;
-
Fiche de renseignements à remplir.
Ponction sanguine :
-
3.
Pose du garrot (ne pas laisser le garrot plus de 3 minutes) ;
-
Désinfecter avec de l'alcool la zone de ponction;
-
Prélever 5 ml de sang veineux chez l'enfant de moins de 10 ans;
-
Prélever 10 ml de sang veineux chez l'adulte de plus de 10 ans ;
-
Récupérer le sang dans les tubes stériles préalablement étiquetés.
Décantation et centrifugation du prélèvement :
a)
-
Sérum : (le prélèvement se fait sans anticoagulant)
Laisser le sang se décanter jusqu'à rétraction du caillot (au moins 1 heure à température ambiante 15-25°C).
Si l'opération se fait avant 30 minutes, on risque d'avoir de la fibrine dans le sérum et une hémolyse qui
risquent de gêner la réaction et donner de faux résultats.
-
Récupérer le surnageant à l'aide d'une pipette Pasteur stérile (à défaut une micropipette à embout stérile)
dans un tube préalablement étiqueté.
Important: ne jamais aspirer avec la bouche, utiliser toujours un dispositif pour receuillir le sérum (poire, autopipette etc.)
-
Centrifuger le prélèvement à 2000 tours par minute pendant au moins 15 minutes à la température
ambiante, en veillant à bien équilibrer la centrifugeuse.
b)
-
Plasma
C'est un prélèvement avec anticoagulant, le sang ne doit pas être centrifugé à plus de 1500 tours par
minute, car les hématies risquent d'éclater et donner une hémolyse qui pourra interférer lors de la réaction.
-
56
Récupérer délicatement le surnageant dans un tube étiqueté en évitant de prendre les hématies.
Important : le sang total (avec ou sans anticoagulant) peut être conservé à +4°C mais ne doit en aucun cas être congelé.
B.
Conservation des échantillons
-
C.
Le sérum ou le plasma peuvent être conservés :
•
Au réfrigérateur à +4°C pendant 72 h au maximum
•
Au congélateur à 20°C pendant 1 à 2 mois
•
A 70°C pendant plusieurs années
Transport
-
Les prélèvements seront transportés sous triple emballage (tube-sachet-boîte).
-
Étiqueter correctement les tubes.
-
Remplir lisiblement et complètement la fiche de renseignements.
-
Les mettre dans une glacière avec accumulateur de froid pendant le transport.
Important : partager le sérum ou plasma en deux, aliquoter et conserver une partie au congélateur pour d'autres contrôles.
D.
Mesures d'hygiène et de sécurité
-
On ne doit en aucun cas recapuchonner les aiguilles après le prélèvement.
-
Jeter le matériel tranchant (aiguille, verre, lame) utilisé lors des manipulations dans un container rigide
(flacon en plastique) contenant de l'eau de javel.
Les tests Elisa sont très sensibles et spécifiques. Cependant, ils nécessitent un appareillage onéreux, dont un lecteur pour
plaques et un laveur. Le personnel doit être qualifié.
LE SUIVI SÉRO IMMUNOLOGIQUE DU VIH
La multiplication du virus VIH induit un déficit en cellules CD4/CD8 c'est un indicateur important pour la mise sous
traitement antiretroviral et pour le suivi des malades atteint du sida.
Le test de dosage des CD4/CD8 est :
a)
soit un test elisa basé sur le principe d'immunocapture :
*phase solide : particules paramagnétique sensibilisées avec des anti cd2
(Capteurs des CD4et des CD8 par la molécule CD2 )
*conjugué : anti CD4 marqué à la peroxydase
anti CD8 marqué à la peroxydase
*système révélateur : chromogène
*support microplaque aimanté
b)
Soit une méthode de chimiluminescence nécessitant un appareillage et des réactifs coûteux.
Cependant cette méthode est excellente et mérite d'être généralisée.
57
REMARQUES
* la mise en évidence des anti- VIH est essentielle pour la sécurité transfusionnelle,
les transplantations d'organes et le diagnostic de l'infection à VIH.
* Les tests utilisés doivent être sensibles et spécifiques. Elles sont fixées par les normes
OMS à un minimum de 99 % pour la sensibilité et à un minimum de 95 % pour la spécificité.
* Les tests rapides et simples de deuxième génération sont recommandés.
* Il est important d'inclure dans tous les protocoles de travail des instructions pour la détection
des erreurs techniques.
* Les tests doivent être pratiqués par un personnel qualifié.
* Respecter les mesures d'hygiène et de sécurité au cours des prélèvements et des manipulations.
58
59
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