Embryologie - Oursin
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EMBRYOLOGIE! PARTIE 2: BIOLOGIE DU DÉVELOPPEMENT DE L’OURSIN (C. GHIGLIONE)! ! I - PRÉSENTATION DE L’OURSIN! • L’Oursin est utilisé depuis très longtemps en recherche, notamment dans le but de comprendre la reproduction. • Pour comprendre ce qui se passe chez l’être humain, il faut se référer à des organismes plus simples. L’Oursin a ainsi permis d’éclaircir comment nous nous reproduisons et nous développons. ! • Les Oursins sont des animaux à forme globulaire, recouverts par des piquants de formes et de tailles variables. Généralement, l'Oursin est un animal de quelques centimètres. • La plupart des études nous intéressant ont été réalisées sur l'espèce méditerranéenne Paracentrotus lividus (c’est une espèce comestible). 1 • Les Oursins appartiennent au phylum des Échinodermes, comprenant 7000 espèces, toutes marines. Le phylum des Échinodermes regroupe 5 classes: ➤ Deutérostomes • Les Échinodermes sont des deutérostomes, c’est à dire qu’au cours de leur développement, l'anus se forme en premier à partir du blastopore, contrairement au protostomes. 2 • Donc d'un point de vue évolutif, les Échinodermes sont plus proches de nous que le reste des Invertébrés. • Caractéristiques des Deutérostomes: - Développement de la région anale avant la région buccale - Segmentation holoblastique (= segmentation totale) - Segmentation radiaire: les plans de clivage sont soit parallèles, soit perpendiculaires à l’axe primordial qui est l'axe animal-végétatif (A-V). - Capacité de régulation des blastomères. ! ➤ Oursin adulte • Les Oursins adultes se retrouvent de manière générale sur des rochers. • On oriente l’Oursin par rapport à la position de sa bouche: - La face orale est toujours face au support car l'Oursin est un animal brouteur. - À l'opposé, la face aborale (= région ano-génitale) permet l’expulsion des gamètes et des déchets. • Entre les piquants, les Oursins possèdent des pieds ambulacraires, de longues structures se terminant par des ventouses. • Le squelette calcaire de l'Oursin est nommé test. On peut y observer une alternance de bandes de différentes couleurs. C'est grâce à ce test calcaire que l'Oursin a une forme globulaire. • Les pieds ambulacraires ou podias permettent à l'Oursin de se déplacer lentement et de monter sur la vitre des aquariums. 3 • On ne peut pas distinguer les mâles et les femelles à l'état adulte. Le seul moyen de déterminer le sexe de l'Oursin est de voir les gamètes qu'il produit ou les gonades. • Les pieds ambulacraires et les piquants s'organisent en rangées. Il y a alternance entre: - 5 régions ambulacraires portant les pieds ambulacraire qui passent au niveau de petits trous - 5 régions interambulacraires, au niveau desquelles les piquants sont mis en place. • Ces 2x5 régions de l’Oursin adulte témoignent de la symétrie pentaradiaire propre aux Échinodermes. Il est beaucoup plus facile de repérer cette symétrie pentaradiaire au niveau des Étoiles de mer. • Au niveau de la bouche, on observe un très gros trou dans lequel travaille la lanterne d’Aristote. • Au niveau de la face aborale, quand on enlève tous les piquants, on voit la région anogénitale avec des petits trous servant à expulser les gamètes mâles ou femelles. • Une dissection de la région orale permet de montrer la disposition de la lanterne d'Aristote, appareil masticateur de l'Oursin adulte. • On y reconnaît les 5 dents calcaires alternées avec une pièce squelettique articulée faisant office de pince: le compas. 4 • Divers muscles assurent les mouvements des dents. • On remarquera la rigoureuse conservation de la symétrie pentaradiée. ! ➤ Avantages que présente l’Oursin pour l’étude du développement animal • L’Oursin est un organisme modèle pour comprendre le processus de développement animal, plus particulièrement celui des Vertébrés. Les organismes modèles privilégiés pour l’étude du développement des Invertébrés sont la drosophile et le nématode C. elegans. • L'embryon d'Oursin a permis de faire de grandes avancées dans la compréhension de la fécondation et du développement précoce d'organismes plus évolués, notamment les Mammifères et l’Homme. • De nombreux avantages font de l’Oursin un organisme modèle pour l’étude du développement animal: - Grand nombre de gamètes: ‣ Une femelle Oursin mise sur un bécher contenant de l'eau de mer et dont la ponte est stimulée par injection de chlorure de potassium dans sa cavité peut produire à elle seule jusqu'à 107 gamètes. ‣ Les Oursins mâles peuvent en produire jusqu'à 1012. - Fécondation et développement externes: La fécondation se fait dans l’eau de mer. On peut alors récupérer les gamètes et observer la fécondation et le développement in vitro. - Développement rapide et synchrone: ‣ L’œuf d’Oursin est oligolécithe, donc possède très peu de réserves vitellines. Le développement ne peut donc pas durer dans le temps. ‣ Un développement synchrone signifie que des œufs fécondés au même moment passent les différents stades de développement au même moment. - Génome de S. purpuratus séquencé: 5 ‣ Le séquençage permet de repérer les gènes contenus dans le génome. ‣ Le séquençage du génome de l’Oursin a permis de classer les gènes par ordre - - ! d'importance (au cours de l’évolution, certains gènes très importants sont conservés donc ont une fonction très importante) et ainsi de mettre en place des réseaux génétiques pour comprendre tel ou tel processus. Embryon et larve transparents: On peut observer très facilement le développement interne. Structure simple (peu de cellules) de l'embryon et la larve Pluteus d’Oursin Étude de la régulation/fonction d’un gène par injection d’ADN, ARNm, ou morpholinos: L'œuf d'Oursin fait environ 100 µm de diamètre, donc on peut le voir facilement au microscope et injecter différentes substances par des microcapillaires, par exemple des substances qui empêchent l'expression d'un gène (perte de fonction) ou qui provoquent la surexpression du gène (gain de fonction). Manipulation aisée (transplantation/dissociation cellulaire): Malgré la taille relativement petite, les manipulations sont relativement aisées. En utilisant des microcapillaires de verre très fins, on peut couper ces embryons et greffer les cellules coupées autre part. • Malheureusement, l'Oursin présente comme tout modèle des inconvénients pour l'étude du développement animal: - Production saisonnière des gamètes (de janvier à juin pour Paracentrotus lividus): La production des gamètes est massive pendant la saison de janvier à juin. Le réchauffement de l’eau et l’augmentation de l’intensité lumineuse provoque pour les Oursins qui vivent en colonie l’expulsion des gamètes. - Analyse génétique classique impraticable car temps de génération trop long: Il faut plusieurs années pour qu'un Oursin deviennent adulte. On a donc recours a d'autres techniques (ex: microinjections). ! ➤ Le développement indirect de l’Oursin 6 • Le développement de l'Oursin est indirect, c'est à dire qu'il fait intervenir une métamorphose. • Chronologie du développement: - La fécondation donne lieu à un œuf fécondé. - L’œuf fécondé se divise activement au cours de la phase de segmentation. - Environ 6h30 après la fécondation, l’œuf est dit dans la phase jeune blastula. - La jeune blastula se transforme en une larve prisme environ 30h après la fécondation. - La larve prisme se transforme elle-même en larve pluteus environ 36h après la fécondation. - On aboutit après évolution à la phase de métamorphose, au cours de laquelle seule une partie de la larve forme un Oursin juvénile. - Il faut 2 ans à partir de l’œuf fécondé pour obtenir un Oursin adulte. • On différencie 2 types de phases au développement indirect de l’Oursin: - la phase pélagique, correspondant à l’embryon et à la larve qui sont capables de nager dans la colonne d’eau - la phase benthique, correspondant à l'Oursin juvénile qui n'est plus capable de nager et se fixe au sol. ! II - DE LA FÉCONDATION À L’OURSIN ADULTE! A) Les gamètes 7 • L’Oursin est un groupe d’organismes gonochoriques, comportant des Oursins femelles et des Oursins mâles qu’on ne peut pas distinguer lorsqu’on est face à un individu entier. • Le seul moyen qu'on a de les différencier est de regarder leurs gonades ou leurs gamètes: - L’injection de KCl stimule la ponte. - En réalisant une dissection au niveau de l’équateur de l’organisme et en se séparant de la partie orale, on observe soit 5 ovaires soit 5 testicules. La couleur de ces gonades est différente: ‣ Les ovaires sont de couleur orange foncé tirant vers le rouge (les œufs sont de couleur orangée). ‣ Les testicules sont de couleur jaunâtre, laiteuse (spermatozoïdes). • Les gamètes sont matures quand ils sont expulsés, la maturation se faisant dans le corps du parent. • Ces œufs ou spermatozoïdes sont expulsés par 5 petits trous appelés orifices génitaux. Une fois expulsés, ils se rencontrent par les courants dans l'eau de mer. • Sans sacrifier les Oursins adultes, on peut repérer les mâles et les femelles par le phénomène de ponte « naturelle ». Si on les laisse sécher, ils expulsent leurs gamètes: - Les oeufs de couleur orange qu'on appelle aussi les ovotides sédimentent au fond du bécher. - Les spermatozoïdes blancs, mobiles, sont capables de nager dans l'eau de mer. ! ! ! ! ! 8 1. Gamète mâle • Les spermatozoïdes sont composés de 3 parties: - La tête comprend différentes structures: ‣ le pronucleus mâle ‣ une réserve d'actine globulaire ‣ l’acrosome, une vésicule qui contient différentes protéines parmi lesquelles des hydrolases, protéines relarguées par l'acrosome et capables de digérer la gangue gélatineuse de l’œuf, mais aussi la bindine, très importante pour que l’œuf reconnaisse un spermatozoïde de la même espèce. - La pièce intermédiaire, contenant: ‣ des mitochondries ‣ des centrosomes (COMT) à partir desquels des microtubules se prolongent dans le flagelle. - Le flagelle, dont le battement permet au spermatozoïde de se déplacer. • Le battement du flagelle est possible grâce aux microtubules organisés en axonèmes: - 9 doublets de microtubules en périphérie s'organisent autour d'un doublet central. - D'autres protéines sont nécessaires pour le fonctionnement du flagelle, et notamment la dynéine (interne et externe) jouant le rôle de protéine moteur capable de se déplacer le long des filaments. - Cette dynéine a besoin d’énergie sous forme d’ATP, qui est fournie par les mitochondries. • Au niveau du spermatozoïde, une seule membrane entoure la tête, la pièce intermédiaire et le flagelle. ! 2. Gamète femelle 9 • L’axe primordial, c’est à dire l’axe animal-végétatif, est mis en place avant la fécondation. - On reconnaît le pôle animal par la présence d’un canal par lequel sont émis les globules polaires. - Le gamète est attaché à l’ovaire au niveau du pôle végétatif. • Contrairement au gamète mâle qui n’en possède qu’une, l'œuf d’Oursin possède 3 membranes: - la membrane plasmique, avec de nombreuses microvillosités. - l’enveloppe vitelline: Avant la fécondation, l’enveloppe vitelline est vraiment collée à l'extérieur de la membrane plasmique. Il faut de la microscopie électronique pour pouvoir la détecter. - la gangue gélatineuse: la plus externe, qu’on ne voit pas au microscope optique car elle se gorge d'eau de mer. On lui attribue 2 fonction: ‣ un rôle de flotteur pour empêcher l'oeuf de sédimenter rapidement au fond de la mer ‣ un rôle de synthèse d’une substance permettant d'attirer le spermatozoïde. • L’œuf non fécondé contient: - le pronucleus femelle - des granules corticaux, appelés ainsi car se trouvent au niveau du cortex, qui désigne la partie du cytoplasme directement sous la membrane plasmique (environ 15 000 par œuf d’oursin). Ce sont de grosses vésicules d'environ 1 µm de diamètre. • Perpendiculaire à l'axe animal-végétatif, l’espèce Paracentrotus lividus (uniquement) présente une bande pigmentée. Elle contient des pigments orangés qui se concentrent sous l'équateur de l'oeuf. C'est grâce à cette bande pigmentée qu'on a pu identifier l'orientation des plans de division. ! ! B) Fécondation 10 • Pour la fécondation, il faut que les spermatozoïdes soient capables de se diriger vers l’œuf. • Ce mécanisme fait intervenir de petites molécules au sein de la gangue gélatineuse. • Expérience: - Dans une solution d’eau de mer contenant uniquement des spermatozoïdes, ceux-ci sont activés par l'eau de mer et font des tours. - Lorsqu'il y a des œufs, ces derniers synthétisent des substances qui attirent les spermatozoïdes: c'est le chimiotactisme. - Cette substance est de la resact, un peptide de 14 acide aminé synthétisé par la gangue gélatineuse. Si au niveau de la suspension de spermatozoïde on ajoute de la resact, les spermatozoïdes se dirigent vers la pipette. • La resact prévient la fécondation inter-espèce en étant propre à chaque espèce. La resact assure donc une reproduction au sein d'une seule et même espèce. • Une fois qu’a eu lieu la reconnaissance, les spermatozoïdes s'agglutinent sur l'oeuf. • Une expérience de saturation permet de déterminer qu’il peut y avoir jusqu'à 1500 spermatozoïde sur la surface d’1 œuf d'Oursin. Cependant, pour que le développement se fasse de façon normale, il ne peut y avoir plus d'un seul spermatozoïde fécondant l’œuf. 11 • Chez l'oeuf d'Oursin, le spermatozoïde peut pénétrer à n'importe quel endroit de l'oeuf, il n'y a pas de zone particulière comme chez la drosophile. • Lorsque les deux gamètes sont en contact, chacun des deux gamètes est activé. La double activation est nécessaire pour que la fécondation se fasse correctement. ! 1. Réaction acrosomale du spermatozoïde • L’enveloppe vitelline de l'oeuf d'Oursin porte le récepteur de la bindine. 1. Le spermatozoïde n'est pas encore activé. Grâce à la resact, le spermatozoïde est attiré vers l’œuf. 2. Exocytose de l’acrosome: - Le contact du spermatozoïde avec l’œuf provoque son activation donc le début de la réaction acrosomale. - La vésicule acrosomale fusionne avec la membrane plasmique du spermatozoïde au niveau de sa tête. - C’est une exocytose: tout le contenu de la vésicule est expulsé en dehors de la tête. - Parmi les substances expulsées des protéines du nom d’hydrolases sont capables de dégrader la gangue gélatineuse et permettent au spermatozoïde de se frayer un chemin au travers de la gangue gélatineuse. - La bindine, qui est à l’origine à l'intérieur de la membrane de l’acrosome, se retrouve affichée à l'extérieur. 3. Polymérisation de l'actine G et formation d'un complexe bindine-récepteur: - La polymérisation de l’actine globulaire de la réserve d’actine aboutit à la formation du filament acrosomal. - Lorsque ce filament est formé, la bindine se trouve à la surface du filament acrosomal. - La bindine est reconnue spécifiquement par le récepteur de la bindine se trouvant à la surface de l’enveloppe vitelline de l’œuf. Il y a donc une seconde reconnaissance entre le spermatozoïde et l'œuf d'Oursin. En fonction des espèces d’Oursins, des bindines et des récepteurs différents sont synthétisés. 12 4. Dégradation de l'enveloppe vitelline et contact entre la membrane plasmique du spermatozoïde et la membrane plasmique de l’œuf. 5. Fusion entre les membranes plasmiques: elle aboutit à ce que tout le spermatozoïde pénètre au niveau de l'œuf. ! ➤ Blocage précoce et transitoire de la polyspermie • La monospermie, c’est à dire l’entrée d’un unique spermatozoïde dans l’œuf, est essentielle pour que la fécondation et le développement se fassent correctement. • Avant fécondation, l’œuf d'Oursin est métaboliquement inerte. Peu de temps après la fécondation, tout le métabolisme est mis en route, à savoir les mécanismes de traduction, transcription et réplication. 13 • Dès que le spermatozoïde est pénétré dans l’œuf, il entraîne une modification du potentiel de membrane: - Avant fécondation, l’œuf a un potentiel de membrane négatif d'environ -70 mV. - L’entrée du spermatozoïde provoque des échanges d'ions entre l’intérieur de l'œuf et l'eau de mer. - Ces échanges d’ions aboutissent à une inversion rapide du potentiel de membrane, qui passe à environ +10 mV. - Cette inversion est transitoire car le potentiel de membrane diminue petit à petit jusqu’à atteindre à nouveau sa valeur de repos de -70 mV au bout de 10 minutes après la fécondation. • Cette inversion du potentiel électrique de la membrane de l'œuf d’Oursin empêche un autre spermatozoïde de pénétrer. • Mais cette inversion du potentiel électrique est transitoire: au bout de 10 minutes, le potentiel est à nouveau de -70 mV et d’autres spermatozoïdes peuvent féconder l'oeuf d’Oursin. • Il faut donc un autre mécanisme pour bloquer la polyspermie, qui lui dure beaucoup plus longtemps. ! 2. Réaction corticale de l’œuf ➤ Augmentation transitoire du calcium intracellulaire au cours de la fécondation • Au moment de la fécondation, on peut observer facilement par fluorescence calciumdépendante une augmentation transitoire et rapide de la concentration de calcium intracellulaire dans l'œuf d’Oursin. • Ce calcium provient du réticulum endoplasmique, d’où il est relargué au moment de la fécondation. • Une couleur rouge témoigne d’une concentration très forte en calcium. On voit que l’augmentation de la concentration se propage à travers l’œuf. Cette concentration diminue au cours du temps. • Cette augmentation transitoire du calcium intracellulaire entraîne une seconde phase d'activation de l'œuf, qu'on appelle la réaction corticale. 14 • Les granules corticaux, situés sous la membrane plasmique de l’œuf d’Oursin, contiennent des protéines dont des hydrolases et des sucres. 1. Augmentation transitoire du calcium intracellulaire: Le contact entre les membranes plasmiques du spermatozoïde et de l’œuf d’Oursin entraîne une réponse électrique rapide et l’augmentation rapide de la concentration en calcium intracellulaire. 2. Exocytose des granules corticaux: - Cette augmentation du calcium intracellulaire provoque l'exocytose des granules corticaux. - Les granules corticaux déversent leur contenu entre la membrane plasmique et l'enveloppe vitelline. - Les sucres des granules corticaux, une fois déversés, entraînent une entrée massive d'eau de mer. - On observe donc un décollement de l'enveloppe vitelline de la membrane plasmique, ce qui crée un espace périvitellin. Ce décollement se fait aussi grâce à des enzymes coupant des ponts entre la membrane plasmique et l’enveloppe vitelline. 3. Mise en place de l’enveloppe de fécondation: Une fois que l'enveloppe vitelline s'est décollée, elle subit des modifications chimiques qui la rendent très résistante. ce qui fait qu'on la nomme enveloppe de fécondation. 15 • Une autre protéine contenue dans ces granules corticaux est la hyaline: - Suite à l’exocytose des granules corticaux, cette protéine se retrouve dans l'espace périvitellin. - Toute la membrane plasmique de l'oeuf est alors recouverte par une couche protéique très riche en hyaline, qu’on appelle la couche hyaline. - Elle est nécessaire pour faire la cohésion entre les blastomères au moment de la division de l’œuf fécondé. ! ➤ Blocage tardif et définitif de la polyspermie • La réaction corticale de l’œuf et la mise en place de l'enveloppe de fécondation est un blocage tardif nécessitant quelques minutes. Mais contrairement à l’augmentation transitoire du potentiel électrique de membrane de l’œuf, ce mécanisme de lutte contre la polyspermie est un blocage définitif. • Note: Le schéma avec les 3 étapes vu précédemment n'est pas très juste car la mise en place de l'enveloppe de fécondation se fait à partir du point de contact du spermatozoïde avec l’œuf. Cette enveloppe se fait de façon concentrique et à la fin la totalité de l’œuf est recouverte. • Cette enveloppe de fécondation est très utile pour savoir si l’œuf est fécondé ou pas. • C'est à l'intérieur de cette enveloppe de fécondation que se passe tout le développement, elle est détruite seulement au moment de l'éclosion. En plus d'empêcher la polyspermie, elle offre une protection mécanique. ! 3. Œuf fécondé • On différencie un œuf fécondé et un œuf non fécondé par: - l'enveloppe de fécondation, présente après fécondation - les granules corticaux, absents après fécondation. ! ! ! ! ! ! ! 16 ! ! 4. Amphimixie • Une fois l’œuf fécondé, le pronucleus femelle et le pronucleus mâle se dirigent l'un vers l'autre pour fusionner et former le noyau zygotique. Ce phénomène est l’amphimixie. ! C) Segmentation 17 • Une fois que la fécondation a eu lieu, l’œuf fécondé entre dans une période de division intense qu'on appelle la période de segmentation de l'embryon. • Caractéristiques de la segmentation de l’embryon d’Oursin: - holoblastique (ou totale) - radiaire - réductive: L'œuf a une taille qui n'augmente pas mais un nombre de cellules qui augmente, donc c’est la taille des cellules qui diminue. - fin de la segmentation marquée par l’éclosion: La segmentation s'achève au stade de blastula, c’est à ce stade que l'embryon se débarrasse de son enveloppe de fécondation et est capable de nager librement dans l'eau de mer. • La bande pigmentée perpendiculaire à l'axe animal végétatif est conservée pendant la phase de segmentation, ce qui permet de déterminer les plans de clivage qui s’opèrent: - Le 1er plan de clivage se fait de façon méridienne. Il passe par le pôle animal et végétatif et donne deux blastomères de taille identique. Il aboutit au stade 2 cellules. - Le 2e plan de clivage se fait aussi de façon méridienne mais est perpendiculaire au premier plan de clivage. Il aboutit au stade 4 cellules. - Le 3e plan de clivage se fait de façon équatoriale. Il aboutit à un embryon au stade 8 cellules appelé aussi morula (= petite mûre), constitué de 4 cellules au niveau de l'hémisphère animal et 4 cellules au niveau de l’hémisphère végétatif, toutes de taille identique. - Le 4e plan de clivage est un peu particulier: ‣ Les 4 cellules de l'hémisphère animal se divisent de façon méridienne pour former 8 mésomères de taille identique. ‣ Les 4 cellules de l'hémisphère végétatif se divisent de façon asymétrique, avec un plan de clivage est proche du pôle végétatif. Cette division aboutit à 4 micromères au niveau du pôle végétatif et 4 macromères. 18 - La 5e division aboutit au stade 32 cellules: ‣ Les 8 mésomères se divisent de façon équatoriale pour former les couches - cellulaires an1 et an2. ‣ Les 4 macromères se divisent de façon méridienne pour former 8 macromères. ‣ Les 4 micromères se divisent une nouvelle fois de façon asymétrique pour donner naissance à 4 grands micromères et 4 petits micromères. La 6e division aboutit au stade 64 cellules: l’embryon d’Oursin à ce stade est composé de différentes assises cellulaires orientées de façon perpendiculaire à l'axe animal-végétatif. 19 ➤ Établissement d’une carte des territoires présomptifs à l’aide de traceurs fluorescents • Pour déterminer quel sera le destin de ces différentes cellules, on établit des cartes de territoires présomptifs en utilisant des marqueurs fluorescents: on injecte un marqueur fluorescent rouge non toxique dans une cellule et on laisse le développement se poursuivre. On répète l’opération pour chaque cellule. • Un territoire présomptif est ce que doit donner normalement un blastomère à la fin du développement. • Les Oursins sont des organismes triploblastiques qui présentent donc au cours du développement embryonnaire 3 feuillets. • Les trois feuillets embryonnaires, bien que mis en place de façon précoce, peuvent être distingués beaucoup plus facilement au moment de la gastrulation. ! ! 20 • Chaque cellule donne soit de l’ectoderme, soit de l’endoderme, soit du mésoderme: - Les cellules an1 et une partie des cellules an2 donnent naissance à l’ectoderme. - Une partie des cellules veg1 et une partie des cellules veg2 donnent naissance à l’endoderme. - Une partie des cellules veg2, les grands micromères et les petits micromères donnent naissance au mésoderme. ! ➤ Fin de la segmentation: éclosion • Toute la phase de segmentation se déroule à l’intérieur de l'enveloppe de fécondation. • Au fur et à mesure que l’œuf se divise, il y a formation d'une cavité qu'on appelle le blastocoele. Au cours de la segmentation, le blastocoele devient de plus en plus volumineux. • Au stade blastula, une centaine de cellules forment une monocouche autour du blastocoele (environ 6-8h après la fécondation). 21 • Remarque: Au stade blastula, l’embryon est toujours à l'intérieur de l’enveloppe. Puis se produit l’éclosion lorsque l’embryon atteint une taille d’environ 500 cellules et la blastula est capable de nager en pleine eau de mer. • L’éclosion a lieu environ 10h après la fécondation. • Le stade d'éclosion coïncide avec la fin de la segmentation, à ce moment-là il y a beaucoup moins de cellules qui se divisent. • L’éclosion se fait grâce à la synthèse et à la sécrétion de l'enzyme d'éclosion. • Des techniques d’immunomarquage de l'enzyme d’éclosion permettent de mettre en évidence une coloration brune au niveau de l'hémisphère animal: ce sont les cellules qui deviendront l’ectoderme qui produisent l’enzyme d’éclosion. ! 22 • Après l’éclosion, l’embryon se transforme: - Chaque cellule de la blastula met en place un cil capable de battre: l’embryon devient motile. - Au niveau du pôle animal, les cils sont beaucoup plus allongés: les cellules se trouvant au pôle animal forment une touffe ciliaire apicale. Les cils de la touffe ciliaire apicale battent beaucoup plus lentement, ils forment une sorte de gouvernail permettant à l’embryon de s’orienter. - L’embryon au départ sphérique montre un applatissement et un épaississement au niveau du pôle végétatif pour former une plaque végétative. C’est à partir de cette plaque que commence la gastrulation. ! D) La gastrulation 23 • La gastrulation aboutit à la formation du tube digestif primitif qu’on appelle l'archentéron. Cet archentéron va s'allonger progressivement et donner un tube digestif qui permettra à la larve de se nourrir de diatomées planctoniques. • La première étape de la gastrulation est une migration cellulaire, la première de l’embryogenèse: des cellules commencent à migrer à l'intérieur du blastocoele. Grâce à cette migration, les cellules formant le mésoderme et l'endoderme rentrent à l'intérieur de l’embryon. • Cette première migration cellulaire fait intervenir uniquement les descendants des grands micromères. Une population d'une trentaine de grands micromères migrent. • Au stade blastula, toutes les cellules sont organisés en un épithélium d’une couche cellulaire unique. Comme tous les épithéliums, les cellules de la blastula sont polarisées: - La membrane apicale se distingue par: ‣ la formation d'un cil ‣ la couche hyaline, formée principalement de la protéine hyaline qui a été déversée au moment de l'exocytose des granules corticaux de l'œuf fécondé. Cette couche hyaline sert à maintenir la cohésion des blastomères les uns avec les autres. En plus de cette couche, des jonctions serrées permettent aux blastomères de rester associés les uns avec les autres. - La membrane basale se distingue par son contact avec la matrice extracellulaire (en vert), matrice formée de nombreuses protéines différentes. ! ! ! ! ! ! ! 24 1. Ingression des cellules du mésenchyme primaire Schémas d'une partie de la monocouche cellulaire au niveau du pôle végétatif • Au début de la gastrulation, certains descendants des grands micromères reçoivent un signal induisant un changement de forme. • En rouge, un descendant des grands micromères perd son cil apical et commence à s'arrondir. • La cellule s’extrait de l'épithélium pour rejoindre l'intérieur du blastocoele, et ceci par 3 mécanismes: - Elle perd l'affinité pour la couche hyaline au niveau de sa membrane apicale. - Elle augmente de près d'un facteur 100 l'affinité avec la MEC. - Elle perd contact avec ses cellules voisines. • C’est un phénomène de transition épithélium-mésenchyme. En effet, par définition, une cellule épithéliale n'est pas capable de migrer. En exprimant de nouvelles protéines, cette cellule épithéliale s'est transformée en une cellule mésenchymateuse capable de migrer. On appelle aussi ce phénomène ingression des cellules du mésenchyme primaire. ! ! ➤ Positionnement du mésenchyme primaire et formation de spicules ! ! 25 • Positionnement du mésenchyme primaire: - Une fois qu’elles ont migré, les cellules du mésenchyme primaire ou PMC (Primary Mesenchyme Cells) émettent des longs prolongements cytoplasmiques du nom de filopodes dans le but de toucher des zones cibles. - Elles forment alors 2 groupes de cellules qu'on appelle les amas cellulaires au niveau oral de l'embryon. - Ces deux amas cellulaires oraux sont reliés par 2 chaînes: la chaîne orale et la chaîne aborale. - C'est ainsi que se met en place un deuxième axe embryonnaire: l’axe oral-aboral. • Formation de spicules: - Les cellules du mésenchyme primaire fusionnent alors les unes aux autres pour former un syncitium: les noyaux se retrouvent dans un même cytoplasme. - Au sein de ces deux amas cellulaires, un dépôt de CaCO3 conduit à la formation de deux structures triradiées qu’on appelle des spicules. - Les 2 spicules triradiées s'allongent pour former 2 baguettes triradiées qu'on retrouvera plus tard au cours du développement, au niveau du stade larvaire prisme et du stade larvaire pluteus. • En effet, la larve pluteus ressemble à une petite tour Eiffel, et cette forme est permise par l'allongement des spicules triradiées. Le rôle des cellules du mésenchyme primaire est donc de donner le squelette embryonnaire et larvaire de l’Oursin. ! 2. Naissance de l’archentéron • Après l'ingression du mésenchyme primaire, un autre phénomène se déroule au niveau de la plaque végétative: 26 - Après migration des descendants des grands micromères, les cellules voisines - - reforment une monocouche cellulaire au niveau de la plaque végétative. Ces cellules sont notamment les petits micromères et les cellules veg2. Un peu plus tard, ces cellules au niveau de la plaque végétative changent de forme pour être en forme de bouteille: le changement de forme débute par une constriction apicale des cellules végétatives pour pouvoir s'invaginer. Au contraire, la face basale s’agrandit. Ce changement de forme est rendu possible par le remodelage du cytosquelette d’actine. Ce processus donne naissance à l'archentéron. 27 • La flèche verte montre que le territoire veg2 et les petits micromères s'infléchissent vers le blastocoele. • Ce mécanisme d’inflexion des cellules est rendue possible: - par la constriction apicale des cellules qui s’invaginent - mais aussi par une force mécanique de poussée vers le pôle végétatif de la part des cellules veg1. • Une fois l'invagination formée, il y a un trou au niveau du pôle végétatif: c'est le blastopore, qui donne naissance à la fin de la gastrulation à l'anus. C'est par ce blastopore que seront évacués les déchets. ! 3. Élongation de l’archentéron • Une fois que l'archentéron a commencé à se mettre en place, il s'allonge progressivement. En fin d'allongement, il atteint le toit du blastocoele au niveau du pôle animal. • La première phase d'invagination forme un archentéron court (environ 1/3 de la taille de l’embryon) à grand diamètre. On appelle ce stade gastrula précoce. • 1ère phase d’élongation: - Cet archentéron s’allonge ensuite durant une première phase d’élongation pour aboutir à une gastrula tardive. - Cet allongement ne fait pas intervenir de divisions cellulaires, donc le diamètre de la gastrula tardive est beaucoup plus petit. 28 - Cette première phase d'allongement se fait grâce à un réarrangement des cellules qui composent l’archentéron: Les cellules s’intercalent les unes avec les autres pour allonger l'archentéron le long de l'axe animal-végétatif. - Cette intercalation n'est pas suffisante pour allonger entièrement l’archentéron. • 2e phase d’élongation: - D'autres cellules mésenchymateuses se forment à partir des cellules veg2 et des petits micromères. Elles sont nommées les cellules mésenchymateuses secondaires ou SMC (Secondary Mesenchyme Cells). - Ces cellules du mésenchyme secondaire se retrouvent au sommet de l'archentéron. Elles aussi émettent de longs filopodes pour chercher une zone cible à l'intérieur du blastocoele. Cette zone cible sera la zone qui donnera plus tard le stomodeum qui donnera la bouche. - Une fois la zone atteinte, elles rétractent leurs filopodes et tirent de cette façon l'archentéron vers le stomodeum. • De part et d'autre de l'archentéron, les cellules du mésenchyme primaire ont commencé à former les 2 spicules. • À la fin de la gastrulation, les feuillets endodermique et mésodermique ont pénétré à l'intérieur de l’embryon: - Les cellules endodermiques forment le tube digestif. - Les cellules mésodermiques forment les cellules mésenchymateuses. - Toutes les autres cellules forment l'épiderme. ! ! 29 • Ces deux amas cellulaires oraux sont reliés par une chaîne aborale et orale. En fin de gastrulation, ces 2 chaînes entourent l’archentéron. ! 4. Formation de la bouche Vues de profil de l’embryon en fin de gastrulation • L’archentéron s'allonge grâce aux cellules du mésenchyme secondaire. Ces cellules reconnaissent une zone qui deviendra la future face orale. Elles amènent le tube digestif au niveau de cette future face orale. • À un endroit précis, l’ectoderme s’invagine légèrement et se rapproche du toit de l’archentéron. • Les deux entrent éventuellement en contact et fusionnent, formant la membrane stomodéale, qui se perfore pour former le stomodeum, future bouche de l’animal. ! 30 • L'axe oral-aboral se met en place au moment de la gastrulation et est perpendiculaire à l’axe animal-végétatif. • Les 2 ectodermes formés, l’ectoderme de la face orale et l’ectoderme de la face aborale, ne se comportent pas de la même manière: alors que l'épiderme oral s’aplatit, l'épiderme aboral s'allonge, ce qui fait que l'embryon change de forme et aboutit à la larve prisme. ! E) Stade larvaire 1. Larve prisme • À partir de l'oeuf fécondé et jusqu'au stade gastrula, l’embryon présente une symétrie radiaire. • En fin de stade gastrula, l’embryon n'est plus sphérique, il présente une symétrie bilatérale. À partir de ce stade prisme, l'embryon à une organisation en symétrie bilatérale avec un côté gauche et un côté droit. • Tube digestif à 3 constrictions: - À la fin du stade gastrula et au début de la larve prisme, le tube digestif s'organise et forme 3 constrictions: l’œsophage débouche sur l'estomac qui débouche sur l’intestin. Le tube digestif se termine par l'anus. - C’est un tube digestif primitif mais fonctionnel qui permet à la larve de se nourrir. • Bandelette ciliée: - Une bandelette ciliée se met en place au stade larve prisme, à la jonction entre l'épiderme oral et l’épiderme aboral. - Il est composé de cellules ayant des cils plus importants. - Ces cils ont deux rôles: 31 ‣ En battant, ils permettent à la larve de nager avec la face orale en avant donc avec la bouche en avant. ‣ Ils permettent également de ramener les particules nutritives vers la bouche (la larve prisme et la larve pluteus sont des larves planctoniques qui se nourrissent de diatomées qu'on retrouve au sein du plancton). • Spicules: - Les 2 spicules permettent la mise en place de la forme de la larve. - Le spicule droit et le spicule gauche se rejoignent au niveau de l'apex de la larve. ! 2. Larve pluteus • Une fois que la larve prisme est mise en place, elle se transforme en larve pluteus. • Alors qu’il n’y avait eu aucun d’accroissement de taille jusqu’à la gastrula (90 µm), la taille de la larve prisme augmente. Cet accroissement de taille est dû d’une part à la division cellulaire et d’autre part à sa capacité à se nourrir. Ces deux phénomènes font que la larve grandit. 32 • Cette croissance se traduit également par la mise en place de 4 bras à partir de l’allongement des 2 spicules triradiés: 2 bras oraux au niveau de la bouche et 2 bras anaux au niveau de l’anus. ! F) Métamorphose 1. Formation de l’hydrocoele • Le développement de l'Oursin est un développement indirect puisqu'il fait intervenir une métamorphose. La métamorphose aboutit à l'Oursin juvénile. • On revient au stade gastrula tardive. Les cellules du mésenchyme secondaire, qui ont permis l’allongement de l’archentéron, peuvent avoir plusieurs destins: - Certaines cellules se défont de l'archentéron et deviennent des cellules pigmentaires. - Certaines cellules se défont de l'archentéron et forment des cellules musculaires. - Certaines forment des cellules blastocoelaires. Les cellules blastocoelaires se détachent avant qu'il y ait formation de la bouche de l'embryon. ! • Une partie des cellules du mésenchyme secondaire se sépare du sommet de l'archentéron et forme 2 vésicules coelomiques. • Ces 2 vésicules coelomiques sont présentes au cours du stade pluteus: un coelome à gauche et un coelome à droite du tube digestif. 33 • La formation d’un Oursin juvénile se fait à partir du coelome gauche. • 3 structures différentes bourgeonnent à partir des 2 poches coelomiques gauche et droite: - l'axocoele - l'hydrocoele en position intermédiaire - le somatocoele • L’Oursin est formé uniquement à partir de l'hydrocoele gauche (ce qui montre bien qu'il y a une asymétrie gauche droite). • L’hydrocoele mène à la formation d’un rudiment à partir duquel est formé le juvénile: - L’hydrocoele gauche s’entoure d’ectoderme qu’on appelle le vestibule. - Une fois l’hydrocoele formé, l’ectoderme s’invagine et entoure la poche pour faire le rudiment. - L’hydrocoele droit va dégénérer. ! 2. Formation du rudiment (disque imaginal) 34 • Le disque imaginal est un groupe de cellules particulières qui après métamorphose donneront des structures particulières. • L’hydrocoele bourgeonne en 5 vésicules qui restent associées les unes aux autres. • Le nombre de 5 vésicules indique le début de la pentamérisation. L’Oursin juvénile aura déjà une symétrie pentaradiaire. ! 3. Oursin juvénile • Au bout de 3 semaines après fécondation, on peut observer 5 structures associées au sein de la larve pluteus. • À partir de 4 semaines, on peut observer un début de formation du test calcaire à partir du rudiment. • La formation du test calcaire alourdit la larve pluteus qui tombe au fond de la mer. • Un peu plus tard au cours du développement, l’Oursin en cours de formation se débarrasse de ce qui reste de la larve pluteus qui est inutile à sa formation en l’ingérant. • On aboutit au bout de 5 semaines à la formation d'un juvénile qui va former des piquants et des pieds ambulacraires. ! ! ! ! 35 • L’Oursin en cours de formation se débarrasse de toute l'enveloppe larvaire pour se fixer sur un rocher. ! ! III - MISE EN PLACE DES DIFFÉRENTS AXES EMBRYONNAIRES DE L'OURSIN ➤ Les axes embryonnaires • Pour la plupart des animaux, l’axe embryonnaire animal-végétatif est mis en place avant la fécondation, dans l’œuf non fécondé. 36 • C'est à partir de cet axe primordial que se mettent en place chez l’Oursin les autres axes embryonnaires, et notamment l'axe oral-aboral appelé aussi axe ventro-dorsal. Il apparaît à la fin du stade gastrula. • Un autre axe de symétrie est mis en place, c'est l'axe droite-gauche. • L’axe animal-végétatif est très important car c'est à partir de cet axe que toutes les divisions cellulaires sont orientées. ! ➤ Démonstration de l'existence de la polarité animale-végétative avant la fécondation 37 • Depuis très longtemps, on a essayé de comprendre comment se met en place cet axe animal-végétatif. • Des capillaires de verre très fin permettent de couper précisément les œufs non fécondés. La bande pigmentée permet d’orienter le plan de coupe: - En coupant l’œuf non fécondé de manière méridienne, chacune des deux moitiés d’œuf est capable de se reformer, d'être fécondée par un spermatozoïde et de se développer en larve pluteus quasi-normale (plus petite que la larve pluteus normale). - En coupant l’œuf non fécondé de manière équatoriale, la moitié animale est séparée de la moitié végétative: ‣ La moitié animale donne après fécondation un embryon animalisé, c'est à dire que l’embryon est uniquement composé de cellules animales. Ainsi, l’embryon est hypercilié et possède une touffe ciliaire beaucoup plus grande. Il ne présente pas de formation ni de cellules de l'endoderme ni de cellules du mésoderme, il s’arrête au stade blastula. ‣ La moitié végétative donne après fécondation une larve pluteus quasi-normale. • Ces expériences montrent qu’il semble que la partie végétative de l’œuf puis de l'embryon est très importante pour permettre le développement normal. ! ➤ Développement de blastomères isolés à partir d’un embryon au stade 4 cellules • Ensuite, les auteurs ont laissé se développer les embryons jusqu’au stade 4 cellules. Pour isoler les 4 blastomères: - soit on utilise des capillaires très fins - soit on les met dans de l'eau de mer artificielle dépourvue de calcium, ce qui empêche les blastomères de rester associés les uns aux autres. • Si on laisse le développement se poursuivre, on observe que chacun des 4 blastomères donne une larve pluteus normale. • Cette expérience montre que les blastomères au stade 4 cellules sont totipotentes. ! ➤ Développement de moitiés d’embryon obtenues par coupure au stade 8 cellules • Les auteurs ont ensuite divisé les embryons au stade 8 cellules, suivant l'axe animal végétatif ou suivant l’équateur. 38 - En coupant le long de l'axe animal-végétatif, les 2 moitiés sont capables de donner une larve pluteus quasi-normale. - En coupant suivant l’équateur: ‣ Les 4 cellules de l'hémisphère animal se développent en un embryon animalisé. ‣ Les 4 cellules de l'hémisphère végétatif se développent en une larve pluteus quasinormal. • Cette expérience montre également qu'il semble y avoir une substance (inconnue) présente uniquement dans l’hémisphère végétatif nécessaire pour permettre un développement normal. ! ➤ Expériences suggérant l’existence d’un gradient végétatif 39 • Ces expériences utilisent des embryons chimériques: ils proviennent d’une transplantation de cellules, c’est à dire que des cellules d'une partie d’un embryon donneur sont isolées et mises en contact contact avec d’autres cellule d’un embryon receveur, qui est alors dit chimérique: il est composé des ses propres cellules et des cellules d’un autre embryon. - Expérience A: Témoin. - Expérience B: Le développement d’une moitié animale isolée aboutit à une animalisation complète. - Expérience C: En rajoutant à cette moitié de cellules animales isolées l’assise cellulaire veg1, on commence à voir un peu d'endoderme qui se forme. L'animalisation est beaucoup moins sévère que dans le cas de la moitié animale isolée. - Expérience D: En rajoutant à cette moitié de cellules animales l'assise cellulaire veg2, on obient une larve pluteus reconnaissable. - Expérience E: En rajoutant à cette moitié de cellules animales les micromères, on obtient une larve pluteus normale. • Ces expériences montrent: - qu’en fusionnant les cellules de la moitié végétative à celles de la moitié animale, le développement se déroule de manière plus normale. - que les micromères semblent avoir une influence plus importante que l’assise cellulaire veg2 qui auraient elles-mêmes une influence plus importante que l’assise cellulaire veg1, ce qui semble suggérer l'existence d'un gradient végétatif. • On peut alors faire l’hypothèse d’une substance concentrée au pôle végétatif essentielle au développement normal de l’Oursin. ! ➤ Perturbations du développement après traitement au zinc et au lithium • Il est très difficile de perturber l’axe animal-végétatif. Cette opération est cependant rendue possible en ajoutant des substances chimiques telles que le zinc ou le lithium, qui ont des effets opposés l’un à l’autre sur la mise en place de l'axe animal-végétatif. 40 • Au stade blastula, l'embryon d'Oursin synthétise et sécrète l'enzyme d'éclosion. Grâce à un anticorps reconnaissant spécifiquement l'enzyme d'éclosion, on peut vérifier que c'est la partie animale qui produit cette enzyme. Les cellules exprimant l’enzyme d’éclosion forment plus tard de l’ectoderme. • La larve pluteus se forme 48h après la fécondation. • Conséquences de l’ajout et maintien de lithium dans le milieu de développement de l’œuf fécondé: - Expression de l’enzyme d’éclosion: Un immunomarquage permet de révéler que le domaine d'expression de l'enzyme d'éclosion est beaucoup plus réduit. - Territoires présomptifs: Le nombre de cellules à l’origine de l’ectoderme est donc réduit. Au contraire, le nombre de cellules donnant de l'endoderme et du mésoderme augmente. Ceci fait que la limite entre l'ectoderme et l’endo-mésoderme est deplacée vers le pôle animal. - Phénotype: L’action du lithium entraîne le phénotype embryon végétalisé, qui forme davantage de structures endodermiques et mésodermiques au détriment des structures ectodermiques. Cette végétalisation entraîne un tube digestif beaucoup plus gros, tellement gros qu'il ne peut pas rester à l'intérieur du blastocoele. Il se retrouve alors à l'extérieur du blastocoele, c'est ce qu'on appelle une exogastrulation. • Conséquences de l’ajout et maintien de zinc dans le milieu de développement de l’œuf fécondé: - Expression de l’enzyme d’éclosion: Toutes les cellules de la blastula expriment l’enzyme d’éclosion. Le domaine d’expression de l’enzyme d’éclosion est augmenté. - Territoires présomptifs: Toutes les cellules de l’embryon deviennent donc de l’ectoderme. - Phénotype: L’action du zinc aboutit à des embryons animalisés qui ne gastruleront jamais car ils ne possèdent pas de cellules endodermiques et mésodermiques. • Donc bien que l'axe animal-végétatif se met en place très tôt, cette mise en place peut être perturbée par l'ajout de substances. ! ➤ Capacité des micromères à induire un deuxième archentéron chez l'embryon d'Oursin 41 • Au stade 16 cellules, une division asymétrique des micromères forme des grands micromères et des petits micromères. • Le destin des grands micromères est la formation des cellules du mésenchyme primaire qui donnent les spicules. Si on isole ces micromères et qu'on les cultive dans de l'eau de mer, on observe qu’ils sont capables de donner à eux-seuls des spicules quasiment normales. • On veut connaître l’importance des micromères pour le développement: - Au stade 16 cellules, on sépare les 4 micromères du reste de l’embryon et on les met dans une solution qui les rend fluorescents qui leur donne une coloration rouge pour les repérer. - On greffe ensuite ces micromères à différents endroits sur différents embryons receveurs au stade 16 cellules. On les greffe par exemple au niveau du pôle animal, puis on laisse l’embryon se développer. - Au moment de la gastrulation, au niveau du pôle animal, on observe une invagination des cellules et la formation d'un archentéron en plus de celui au pôle végétatif. Ces 2 archentérons se rejoignent et fusionnent. • Donc les micromères ont un réel pouvoir inducteur: lorsqu'elles sont transplantées au niveau de l'hémisphère animal, les cellules au niveau du pôle animal ne donnent plus de l'ectoderme mais donnent de l'endoderme et du mésoderme. Les micromères sont donc capables de reprogrammer les cellules à proximité. ! ➤ Effets de l’ablation des micromères sur la gastrulation • Si on élimine les micromères au stade 16 cellules, 32 cellules ou 64 cellules, la gastrulation n’a pas lieu. 42
