Module 2 - EU-RL GMFF

Analyse d’échantillons alimentaires pour la
présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 2
Présentation du manuel, méthodes de travail et
introduction au cours
M. Querci
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L’EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours
2
Table des matières
Module 2
Présentation du manuel, méthodes de travail et
introduction au cours
COMMENT DETECTER LES OGM
3
AVANTAGES INHERENTS ET LIMITATIONS DES APPROCHES BASEES SUR L’ADN ET SUR LES
PROTEINES
4
REMARQUES GENERALES ET PRESENTATION DU MANUEL
7
REFERENCES
Analyse d’échantillons alimentaires pour la présence d’organismes génétiquement modifiés
11
Module 2
Présentation du manuel, méthodes de travail et introduction au cours
3
Comment détecter les OGM
Comme indiqué précédemment, les végétaux transgéniques se caractérisent par
l’insertion d’un nouveau gène (ou d’un nouvel groupe de gènes) dans leur génome.
Les nouveaux gènes sont ensuite transcrits et la nouvelle protéine est exprimée.
Ceci donne au végétal une nouvelle caractéristique telle que la résistance à certains
insectes ou la tolérance aux herbicides. La base de tout type de technologie de
détection d’OGM consiste à exploiter la différence entre la variété non modifiée et la
plante transgénique. Ceci peut se faire en détectant le nouvel ADN transgénique qui
a été introduit ou la nouvelle protéine exprimée ou, si la protéine joue le rôle
d’enzyme, en procédant à une analyse chimique pour détecter le produit de la
réaction enzymatique.
Deux approches scientifiques sont généralement utilisées aujourd’hui pour détecter
la modification génétique dans des cultures telles que le soja, le blé, le coton et
d’autres. L’une d’elles, ELISA (essai d’immunoabsorption enzymatique), implique la
recherche de la présence de protéines spécifiques en exploitant la spécificité de
liaison entre l’antigène exprimé et l’anticorps cible ; l’autre, la PCR (réaction de
polymérisation en chaîne), repose sur la détection de nouvelles séquences d’ADN
insérées dans le génome de plantes cultivées. Ces méthodes révèlent l’absence ou
la présence d’OGM dans l’échantillon, mais peuvent aussi fournir une indication sur
la quantité (pourcentage) présente dans un échantillon testé.
La première méthode validée au niveau de l’UE était une technique de contrôle
basée sur la PCR qui permettait de détecter la plupart des OGM actuellement
approuvés pour la commercialisation (Lipp et al., 1999). Mise au point par Pietsch et
al. (1997), cette méthode repose sur la détection des séquences de contrôle qui
accompagnent le gène nouvellement introduit, en l’occurrence le promoteur 35S et le
terminateur nos. La validation a été coordonnée par l’Unité Produits Alimentaires et
Biens de Consommation de l’IPSC du Centre Commun de Recherche, et exécutée
en collaboration avec l’Institut des Matériaux et des Mesures de Référence (IRMM)
du CCR, qui était responsable de la production de matériaux de référence certifiés.
Comme indiqué ci-dessus, des efforts de recherche ont été également dirigés vers le
développement de méthodes reposant sur les protéines. Une méthode très
spécifique à l’examen du soja Roundup Ready® basée sur le test ELISA a été
validée (Lipp et al., 2000), tandis que d’autres ont été mises au point
(http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm).
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4
Avantages inhérents et limitations des approches basées sur l’ADN
et sur les protéines
L’approche basée sur l’ADN
L’utilisation des méthodes analytiques basées sur la technologie PCR pour détecter
des séquences d’ADN associées aux OGM est de plus en plus courante.
La PCR permet d’amplifier sélectivement des fragments spécifiques d’ADN qui se
trouve en faible quantité dans un mélange complexe d’autres séquences d’ADN.
Dans la PCR, les petits éléments d’ADN complémentaires sont appelés des amorces
et s’utilisent en paires. Ces amorces sont conçues pour s’hybrider sur des sites de
reconnaissance de séquence complémentaires situés sur le brin opposé du gène
d’intérêt. Par le biais d’une série de cycles thermiques différentiels répétitifs, un
enzyme de polymérase d’ADN aide à répliquer et à amplifier la séquence de manière
exponentielle entre la paire d’amorces. Ces gènes amplifiés sont enfin soumis à une
électrophorèse sur gel standard de manière à pouvoir en détecter la présence en se
basant sur la détermination de leur taille.
Diverses méthodes basées sur la PCR ont été élaborées dans le but de détecter et
de quantifier les OGM dans des espèces cultivées pour l’alimentation humaine et
animale. La détermination de l’identité génétique permet, en outre, la ségrégation et
la traçabilité (préservation de l’identité) sur toute la chaîne d’approvisionnement des
cultures GM.
Afin de pouvoir détecter les OGM, il est essentiel de connaître le type de modification
génétique, notamment la constitution moléculaire du gène introduit et les éléments
régulateurs connexes (promoteurs et terminateurs). Une quantité minimale du
matériau d’échantillon contenant un ADN intact comportant le gène cible s’impose
pour pouvoir procéder à l’analyse.
La PCR est une technique de laboratoire qui nécessite un personnel formé et un
équipement spécialisé.
Les caractéristiques principales du diagnostic PCR sont, entre autres, les suivantes :
- Il peut être extrêmement sensible, capable de détecter une ou plusieurs répliques
d’un gène ou d’une séquence cible d’intérêt dans le matériel génétique complet d’un
organisme (ou génome). Cette sensibilité élevée a pour résultat que des taux de
contamination accidentelle très faibles peuvent produire de faux positifs. En
conséquence, il est très important de veiller à prévenir toute contamination croisée.
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- Par rapport aux essais immunologiques (synthèse de l’amorce par rapport à la
production d’anticorps), il requiert un temps de développement par réactif
relativement limité.
- La plupart des réactifs nécessaires sont disponibles dans le commerce et peuvent
être aisément obtenus auprès d’un grand nombre de fournisseurs. Une licence est
toutefois parfois réclamée afin de pouvoir utiliser certains de ces réactifs dans des
applications diagnostiques commerciales.
- L’analyse de l’échantillon prend environ un jour.
- La PCR peut établir une distinction entre divers types de modification génétique
(également appelés « événements de transformation ») si elle est correctement
développée. Les méthodes diagnostiques permettant d’identifier des événements de
transformation spécifiques requièrent un temps de développement et des efforts de
validation supplémentaires.
L’approche basée sur les protéines
La méthode de test basée sur les protéines utilise des anticorps spécifiques à la
protéine d’intérêt. Le test ELISA détecte ou mesure la quantité de protéine d’intérêt
présente dans un échantillon, lequel peut en contenir diverses autres. Le test ELISA
utilise un anticorps unique pour établir la liaison avec la protéine spécifique, un
second anticorps pour amplifier la détection (facultatif) et un anticorps conjugué à un
enzyme dont le produit génère une réaction colorée facile à visualiser et à quantifier
en la comparant à une courbe standard de la protéine d’intérêt.
Pour être correct, l’essai doit être exécuté par un personnel dûment formé sur un
équipement spécialisé.
Les caractéristiques principales du test ELISA sont les suivantes :
- Une moins grande sensibilité que la PCR et donc un moins grand risque de « faux
positifs » induits par de faibles niveaux de contamination.
- Des coûts en amont élevés pour le développement des essais et la génération des
anticorps et des protéines de référence.
- Un coût peu élevé par échantillon à partir du moment où les réactifs sont
développés.
- Il ne peut établir de différence entre des modèles et des modes d’expression
différents entre divers événements transgéniques exprimant des caractéristiques
protéiniques similaires.
- Les méthodes basées sur les protéines ont un temps de production important pour
le développement des réactifs et la mise au point de la méthode.
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- Les essais basés sur les protéines constituent une méthode de test efficace et
pratique lorsqu’une protéine détectable est produite. Certains produits issus de
modification génétique ne s’expriment cependant qu’au cours de certains stades de
développement ou dans certaines parties du végétal et il est, dès lors, improbable
qu’un test ELISA permette une détection aisée de ces OGM. La transformation
industrielle dénature, par ailleurs, facilement les protéines, ce qui peut poser
problème lors de l’utilisation de la méthode ELISA pour analyser des fractions
d’aliments transformés.
Compte tenu de tous ces éléments, il est clair que le test ELISA et la PCR devraient
être considérés comme complémentaires plutôt que comme des méthodes
s’excluant l’une l’autre.
Tableau 1 : synthèse comparative des méthodes ELISA et PCR
Méthode
Durée
Facilité d’utilisation
ELISA
Élément
testé
Protéine
2 à 8 heures
PCR
ADN
1 à 3 jours
Moyenne ; nécessite une
familiarité avec les pratiques
de laboratoire ; les tests sont
spécifiques et varient en
fonction de la culture et de la
variété.
Difficile ; nécessite un
équipement et une formation
spécialisés.
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Résultats
Confirment la modification
génétique spécifique et
permettent de quantifier.
Très sensibles avec un risque
de faux positifs ; confirment la
présence d’ADN GM et
permettent de quantifier.
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Remarques générales et présentation du manuel
La méthode de validation est capitale tant pour les laboratoires que pour les
autorités de contrôle. Dans l’idéal, le contrôle de la performance de chaque méthode
devrait être confirmée par un nombre limité de laboratoires spécialisés afin d’obtenir
des résultats reproductibles, sensibles et spécifiques. Le Centre Commun de
Recherche de la Commission Européenne a été le premier à valider l’utilisation des
méthodes ELISA et PCR pour tester les matières premières composées de soja
Roundup Ready® et d’une méthode PCR pour le maïs Maximizer (Bt-176) et à
valider une méthode PCR pour le soja Roundup Ready® et le maïs Maximizer (Bt176) dans des fractions d’aliments transformés (Lipp et al., 1999, 2000 et 2001).
Depuis lors, plusieurs autres méthodes d’analyse qualitative et quantitative ont été
développées et validées. Afin d'obtenir des informations actualisées sur les
méthodes validées en vue de la détection et la quantification d’OGM, veuillez
consulter le site : http://mbg.jrc.ec.europa.eu/home/ict/methodsdatabase.htm. La
préparation d’un échantillon est essentielle pour la détection et la quantification tant
avec la méthode basée sur l’ADN qu’avec celle reposant sur la protéine. Il est
important de connaître les limitations de chaque procédure en fonction de la réponse
souhaitée (ex. : qualitative ou quantitative). Tant la taille de l’échantillon que les
procédures d’échantillonnage influencent considérablement les conclusions à tirer de
chacune de ces méthodes de test.
Une exigence fondamentale pour chacune des méthodes de détection est la
disponibilité de matériaux de référence certifiés. Produits par l’IRMM du CCR
(Trapmann et al., 2002 et 2001), les échantillons utilisés durant la formation sont des
matériaux
de
référence
certifiés. Les
caractéristiques
et
les
certificats
correspondants sont présentés dans le module 3. Un autre élément critique, sur
lequel nous ne nous attarderons pas durant ce cours, mais qu’il est important de
mentionner, est l’homogénéisation de l’échantillon.
La Figure 1 résume les différentes étapes suivies durant le cours. L’extraction
d’ADN optimisée est fondamentale pour garantir la présence et la qualité de l’ADN
extrait et amplifiable par le biais de la PCR. Cet aspect est particulièrement
important, car la majorité des denrées alimentaires présentes sur le marché et
fabriquées à partir de soja ou de maïs ont subi une importante transformation. Il est
notoire que l’ADN peut se dégrader considérablement durant la transformation
alimentaire, en particulier sous l’influence d’un traitement thermique effectué en
présence d’eau. Plus l’aliment est transformé, plus la quantité de fragments d’ADN
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suffisamment longs et renfermant, à l’état intact, la cible dont on a besoin pour
détecter des OGM dans l’aliment transformé, risque d’être limitée. Une méthode
d’extraction d’ADN adéquate et correcte devrait, en outre, veiller à supprimer les
substances inhibitrices présentes dans l’échantillon. Ce point sera abordé dans le
module 4. Plusieurs méthodes d’extraction de l’ADN ont été élaborées et diverses
entreprises commerciales ont mis au point des kits spécialisés, prêts à l’emploi. La
performance et la validité des différents protocoles disponibles seront présentés
durant le cours. Afin d’éviter toutes implications directes avec une quelconque firme
commerciale, il a toutefois été décidé de procéder à l’extraction d’ADN en utilisant la
méthode au CTAB, un protocole validé et souple qui a fait ses preuves avec une
grande variété de matrices.
Après l’extraction d’ADN, les échantillons (ainsi que les produits de la PCR) seront
analysés par l’électrophorèse sur gel d’agarose (module 5).
Les principes, les avantages et les inconvénients de la réaction de polymérisation
en chaîne seront présentés dans le module 6.
Comme mentionné ci-dessus, l’utilisation efficace de techniques modernes pour la
détection d’OGM dépend de la disponibilité d’informations précises. La détection
d’OGM nécessite au minimum une connaissance partielle de la séquence génétique
cible et du type de modification génétique. Les caractéristiques spécifiques des
lignées transgéniques du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup
Ready® seront présentées dans le module 7.
Différentes approches de la PCR ont été élaborées pour la détection d’OGM
autorisés. La spécificité de la PCR dépend du choix précis des amorces. Les
amorces de PCR peuvent être dirigées vers différents éléments utilisés dans le
processus de transformation. Une « vaste gamme » de systèmes de détection PCR,
généralement appelés « méthodes de criblage », peut être obtenue en désignant des
amorces spécifiques aux séquences les plus fréquemment utilisées dans la
transformation. Il s’agit généralement de séquences régulatrices (promoteurs et
terminateurs). Des végétaux génétiquement modifiés peuvent aussi être subdivisés
en « catégories » en fonction du gène structurel qui y est inséré. Un moyen
supplémentaire pour diriger la spécificité de la réaction consiste à choisir des
amorces spécifiques aux séquences d’ADN situées dans divers éléments génétiques
(par exemple, promoteur-gène structurel ou gène structurel-terminateur). Enfin, pour
autant que l’on dispose d’informations spécifiques et complètes sur la séquence afin
d’obtenir des méthodes réellement spécifiques à une plante génétiquement modifiée,
il est possible de mettre au point des systèmes « spécifiques de la lignée » (ou de
l’événement de transformation) en sélectionnant une combinaison de séquences
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« uniques » présentes exclusivement dans cette lignée transformée. Pour y parvenir,
on conçoit des amorces s’hybridant dans la région de l’ADN qui établit la jonction
avec le site d’insertion. La jonction entre l’ADN inséré (ADN-T) et l’ADN hôte offre
une séquence de nucléotides unique qui constitue une cible idéale pour la réalisation
d’un test PCR très spécifique. Les méthodes utilisées durant le cours sont résumées
dans la Figure 1 et seront décrites en détail dans le module 8. La partie
expérimentale des méthodes et des protocoles est reprise dans le module 9.
Comme indiqué ci-dessus, la nécessité de quantifier la quantité d’OGM présents
dans un échantillon a conduit au développement de nombreux protocoles basés sur
la PCR, qui fournissent non seulement une réponse qualitative (présence/absence),
mais aussi une indication plus ou moins précise (en fonction de la méthode choisie)
de la quantité relative d’OGM présents dans un échantillon donné. Les deux
approches basées sur l’ADN les plus courantes sont la PCR compétitive et la PCR
en temps réel (module 10). Cette dernière s’effectue à l’aide d’instruments
spécifiques et sophistiqués qui ne sont disponibles actuellement qu’auprès de
quelques entreprises commerciales. Les protocoles qui seront appliqués durant la
formation sont décrits dans le module 11.
Enfin, le module 12 présente, dans les grandes lignes, l’approche sérologique de la
détection d’organismes génétiquement modifiés. La technique ELISA y sera en
particulier exposée, tandis que le protocole permettant d’exécuter un test ELISA
spécifique au Roundup Ready® sera détaillé.
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10
Homogénéisation de
l’échantillonnage
Non exécutée durant le
cours
Extraction d’ADN
Matériaux bruts et
matériaux transformés
Contrôle de l’ADN du végétal
par PCR
+
-
ADN végétal présent
Pas d’ADN végétal détectable
Détection d’éléments régulateurs
(promoteur 35S et terminateur nos)
PCR de
dépistage
+
Végétal GM
PCR des gènes de la
lectine pour le soja et
de la zéine pour le maïs
Végétal non GM
Détection
spécifique d’OGM
par la PCR nichée
Détection d’OGM
avec la méthode
ELISA
Quantification de
l’ADN par
spectrophotométrie
Quantification de
l’OGM par la PCR
en temps réel
Figure 1 : schéma des méthodes appliquées durant le cours
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11
Références
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Trapmann, S., Le Guern, L., Prokisch, J., Robouch, P., Kramer, G. N., Schimmel, H.,
Pauwels, J., Querci, M., Van den Eede, G. and Anklam, E. (2001). The
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fractions
of
MON810
maize.
Certified
Reference
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IMMR-413.
(https://irmm.jrc.ec.europa.eu/html/reference_materials_catalogue/catalogue/atta
chements/ERM-BF413_report.pdf). (Dernière connection Janvier 2010)
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