Travaux Pratiques de Biochimie 2024/2025: Protocoles et Consignes

Travaux Pratiques de Biochimie – 2024/2025
Recommandations importantes à lire avant les séances de TD et de TP.
Dans ce module, les séances de Travaux Pratiques de 2h alterneront avec des séances de de
Travaux Dirigées de 2h pour préparer et/ou analyser les manipulations effectuées. Il est donc
obligatoire de venir aux TD, car vous n’aurez pas toutes les informations nécessaires pour
réaliser le TP pendant le temps alloué, et c’est lors de ces TD que vous devrez rendre vos
comptes rendus.
Le module sera organisé de la façon suivante :
TD n°1 : Préparation des séances de TP
Partie 1 : Doser la concentration de protéines contenue dans une culture cellulaire
TP n°1 : Manipulations
TD n°2 : Exploitation des résultats et analyse. Remise du compte rendu n°1
Partie 2 : Extraire et purifier l’ADN génomique à partir d’une culture cellulaire.
TP n°2 : Manipulations
TD n°3 : Exploitation des résultats et analyse. Remise du compte rendu n°2
Consignes pour le TD n°1 :
Vous devrez lire les protocoles de TP et les questions liées au TD sur chacune des 2 parties
avant de venir en séance.
Consignes pour les TD n°2 et 3 :
Se munir :

de papier millimétré (pas de prêt de papier millimétré en TP)

d’une règle translucide

d’une calculatrice (type collège)
Consignes pour les TP :
Les séances dureront 2h. Cette durée est suffisante pour réaliser l’intégralité des tâches
demandées avec succès, sous réserve que vous ayez préparé ce TP en amont et compris la
séance de TD.
Se munir :

d’une blouse (en coton) (pas de prêt de blouse en cas d’oubli !)

d’une calculatrice (type collège)
Votre TP sera évalué par un compte rendu (à imprimer ou recopier en fin de ce document),
ainsi qu’une courbe à tracer et analyser sur papier millimétré. La notation tiendra également
compte des manipulations, ainsi que du rangement de la salle en fin de séance.
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TD n°1 : Preparation des Travaux Pratiques
Partie 1 : Dosage des protéines de la culture bactérienne.
1- Quel est le principe du dosage par spectrophotométrie ?
2- En utilisant vos connaissances sur les acides aminés acquises au premier semestre, quelle pourrait
être la longueur d’onde à utiliser pour réaliser ce dosage ?
3- Pourquoi un tel dosage peut être difficile à réaliser sur un échantillon biologique ?
Le réactif de Bradford permet de réaliser un dosage qui permet de contourner cette problématique,
avec une longueur d’onde d’absorption à 595 nm qui apparaît lorsque le réactif est au contact d’une
protéine.
4- Quelle couleur voit-on apparaître avec une absorption à
595 nm (voir schéma à droite) ?
5- Si l’on souhaite utiliser cette absorption à 595nm pour
doser les protéines, quelle loi peut-on utiliser, et quel
paramètre ne connaît-on pas pour une protéine donnée ?
En déduire l’utilité de la gamme étalon avec la protéine de
référence SAB.
La gamme étalon de SAB consiste en différentes solutions (nommées tubes 0 à 7 dans le protocole)
contenant des concentrations connues de cette protéine « standard ».
Exemple de calculs demandés lors du TP :
6- On réalise une gamme de dilution de Sérum Albumine Bovine (SAB) dans 6 tubes, de volume final
200 µl à partir d’une solution mère de concentration 2 mg/ml. Remplir le tableau suivant :
Tube
[SAB] finale (mg/ml)
Vol SAB (µl)
Vol H2O (µl)
0
1
0
5
2
0,1
3
4
20
40
5
6
0,8
7
1
150
7- Quelle est la particularité du tube 0 ? A quoi pourra-t-il vous servir lors de la mesure
d’absorbance de chacune des dilutions ?
8- Dans le protocole, on vous demande de réaliser un triplicata (3 fois chaque mesure
d’absorbance), pourquoi ?
9- Quel est le type de courbe attendu avec cette courbe de calibration ? Pourquoi ? Comment
allez-vous utiliser cette courbe pour déterminer la concentration en protéines de l’échantillon
(lysat cellulaire) ?
Partie 2 : Extraction et quantification de l’ADN de la culture
bactérienne.
10- Quels sont les différents composés qui vont être libérés dans le milieu lors de la lyse
bactérienne ?
11- Rechercher sur internet (ou dans votre cours du semestre 1) la structure chimique du SDS
(Sodium Dodecyl sulfate). A quelle catégorie de biomolécules est-il apparenté, et quelles sont
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ses 2 propriétés physicochimiques ? Quelle influence pourrait-il avoir sur une famille de
biomolécules présentes dans le milieu cellulaire bactérien ?
12- Exemple de calculs demandés lors du TP
 On part d’une solution de SDS à 20 %, on en ajoute 100 µl dans un volume de 300 µl, quelle est la
concentration finale du SDS en % ?
 On ajoute ensuite à ce volume du perchlorate concentré à 4M, pour atteindre une concentration
de 1M. Quelle volume de perchlorate doit-on ajouter ?
13- Rechercher sur internet si le dichlorométhane est miscible à l’eau. Pourquoi l’utilise-t-on lors
de cette purification de l’ADN (autrement dit : quelles biomolécules seront séparées de l’ADN
après l’ajout de dichlorométhane) ?
14- Que mesure-t-on une fois l’ADN purifié à 280 et 260 nm (voir vos cours du premier semestre) ?
15- Exemple de calculs demandés lors du TP : Après purification, on trouve les absorbances
suivantes : A260 = 0,146 UA et A280 = 0,076 UA. Quelle quantité totale d’ADN (en mg) a-t-on
purifié à partir de la culture bactérienne ; cet ADN a-t-il été bien purifié ?
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TP n°1 : Dosage proteique de l’extrait cellulaire
Matériel :
Réactifs :
- Microtubes de 1,5 ml
- Micropipettes de 20 et 200 µl et cônes
plastiques
- Plaque 96 puits.
- Solution de SAB (protéine standard étalon)
à 1 mg/ml
- Le lysat cellulaire à doser (Volume total :
100µl).
But du TP :
Dans cette séance, vous allez utiliser le réactif de Bradford qui permet de doser les protéines
par spectrophotométrie. Ce dosage se fait toujours en 2 étapes :
1/ Réalisation d’une courbe de calibration, en utilisant plusieurs solutions d’une protéine modèle
(SAB) de concentrations connues.
2/ Utiliser cette courbe pour déterminer la concentration d’une autre solution X.
Protocole :
Le bleu de Coomassie contenu dans le réactif de Bradford a la propriété de s’adsorber sur la
plupart des protéines (interaction avec les acides aminés basiques et aromatiques). Cette fixation
provoque une modification de son spectre d’absorption : augmentation de son absorbance à 595 nm.
Ceci est à la base de la méthode de dosage des protéines en solution due à Bradford (1976).
1- Manipulations préliminaires
Avant de commencer, vous devez prélever un échantillon de chaque solution à utiliser. Pour chaque
solution, prélever dans un microtube (différent) de 1,5 ml à partir de la solution stock donnée par votre
enseignant :
- 500 µl de solution SAB à 1mg/ml
- 50 µl de lysat cellulaire.
2- Préparation des solutions étalons :
En vous référant au tableau ci-dessous, préparez 8 microtubes contenant les solutions 0 à 7 en
utilisant la solution de SAB à 1 mg/ml. Calculez les concentrations de SAB en mg/ml obtenues dans
chacun de ces tubes.
Numéro de tube
0
1
2
3
4
5
6
7
H2O (µL)
200
190
180
160
140
120
100
80
VSAB à 1 mg/mL (µL)
0
10
20
40
60
80
100
120
3- Réalisation du dosage:
Cette étape pratique est la plus importante du TP. Vous serez notamment évalué sur votre capacité
à pipetter proprement. Soyez minutieux !
Le réactif de Bradford est toxique, vous devez mettre des gants lors de l’ajout de ce dernier.
En vous basant sur le schéma ci-contre, déposez
dans une plaque 96 puits 10 µl de chaque réactif
(0 à 7 et lysat), en réalisant des triplicats.
N’utilisez que la moitié de la plaque comme
indiqué (l’autre servira pour le collègue suivant).
Astuce : déposer les 10µl au fond du puits, et
non sur le bord.
Une fois les 10µl déposés dans tous les puits
d’intérêt, déposez ensuite 200 µl du réactif de
Bradford dans chacun des puits à analyser.
Après mélange, les absorbances brutes (à 595nm) de chaque puits de la microplaque sont lues
sur le lecteur à microplaque. Annotez la feuille imprimée avec nom/Prénom/groupe, et la rendre à
votre enseignant.
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4- Traçage de la courbe étalon (à faire lors du TD n°2) :
1- Quel est le tube que l’on considère comme référence ? Pour ce tube, faire la moyenne des 3
absorbances – que l’on appelle le blanc.
2- Pour chaque puits d’intérêt, calculer l’absorbance corrigée (= absorbance brute moins le
blanc).
3- Sur une feuille de papier millimétré, tracer la courbe de l’absorbance corrigée en fonction de
la concentration de SAB (en mg/ml). Attention :
 Ne représenter que les absorbances des tubes 0 à 7.
 Ne pas faire de moyenne de chaque tube, mais placer à chaque fois les 3
points du triplicata.
4- Choisir ensuite une droite moyenne qui passe au mieux dans le nuage de points ainsi tracé
(attention, elle doit passer par l’origine !).
5- Détermination de la concentration protéique (à faire lors du TD n°2):
En utilisant ensuite la courbe, déterminez la concentration de votre extrait cellulaire (faites une
moyenne de toutes les concentrations obtenues graphiquement pour chaque solution). Indiquez
également sur votre feuille de papier millimétré la masse totale de protéines dans l’extrait
prélevé.
TP n°2 : Extraction/purification d’ADN Genomique
Matériel :
-
Pipettes et cônes
Microtubes de 1,5 ml
Vortex
Centrifugeuse de paillasse
Produits :
-
SDS (Dodécyl Sulfate de Sodium) à
10% (m/v) – à conserver à la fin du TP
Perchlorate de sodium (NaClO4) 5 M –
à conserver à la fin du TP
Dichlorométhane
Ethanol à 100 % à –20°C
Culot d’une culture à resuspendre
Protocole :
1- Manipulations préliminaires
Avant de commencer, vous devez prélever un échantillon la culture cellulaire. Dans un microtube,
prélevez 240 µl de cette dernière.
2- Extraction de l’ADN génomique
1- Ajouter dans le microtube 60 µl de solution aqueuse de SDS à 10%. Bien homogénéiser en
utilisant le Vortex. Déterminer la concentration finale de SDS et l’ajouter dans votre compte
rendu.
2- Ajoutez ensuite le perchlorate de sodium 5 M pour obtenir une concentration finale de 1 M.
Homogénéisez en utilisant le Vortex. Déterminer le volume de perchlorate à utiliser et l’ajouter
dans votre compte rendu.
3- Ajoutez un volume de dichlorométhane identique au volume total contenu dans le microtube.
Agitez plusieurs fois en retournant le tube.
4- Centrifugez 5 min. à 13 000 g (attention à équilibrer la centrifugeuse avec un tube d’un.e
collègue). Récupérez par aspiration délicate la phase aqueuse supérieure dans un nouveau
microtube en prenant soin de ne pas prélever la phase intermédiaire (débris cellulaires et
protéines dénaturées).
Astuce : prélever en plusieurs volumes de 50µl, en comptant le nombre de prélèvement effectués et
en vous arrêtant lorsque vous prélever le dépôt blanc. Cela vous permettra de prélever proprement
votre volume et d’estimer au mieux celui-ci.
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5- Estimez le volume récupéré et ajoutez 2 volumes d’éthanol 100 % à –20°C. Mélangez
doucement par retournement du tube : l’ADN précipite (flocons blancs).
6- Centrifugez 10 min. à 13 000 g. Eliminez totalement l’éthanol et laissez sécher le culot d’ADN
5 min. sur la paillasse.
7- Dissolvez ensuite l’ADN dans 500 µL d’eau.
8- Prélevez 100 µL de la solution d’ADN et y ajouter 900µl d’eau dans un nouveau microtube.
C’est cette solution diluée que vous utiliserez pour les mesures d’absorbances suivantes.
3- Analyse spectrophotométrique de l’ADN extrait
1- Dans une microplaque adaptée (laissant passer les UV), déposer 200µl de votre solution diluée
d’ADN.
2- Une fois la plaque lue pour l’ensemble de la salle, la feuille imprimée sera récupérée par
l’enseignant.
4- Analyse des résultats (à faire lors du TD n°3)
1- Calculez la concentration de la solution d’ADN obtenue selon la formule suivante (utiliser les
données indiquées dans le compte rendu) :
pour de l’ADN double brin en solution dans l'eau, dans une cuve de 1cm, 1 unité de A260 = 50 ng.µL-1.
En déduire la masse d’ADN présente dans la culture prélevée.
2- Calculez le rapport A260/A280
Le rapport A260/A280 permet d’estimer la qualité de l’ADN purifié :
- un rapport A260/A280<1,70 indique une contamination par des protéines
- un rapport 1,70<A260/A280<2,0 correspond à la valeur théorique d’un ADN bien purifié
- un rapport A260/A280>2,0 indique une contamination par de l’ARN.
5- Détermination de la température de fusion et identification de l’ADN
génomique extrait (à faire lors du TD n°3)
La proportion de GC (%GC) dans l’ADN génomique d’un organisme est une donnée qui est
spécifique de l’organisme considéré, et peut être notamment utilisé en systématique (classement des
espèces). Le tableau ci-dessous vous indique quelques valeurs de %GC pour différents génomes :
Espèce
Apis Mellifera
Arabidopsis Thaliana
Homo sapiens
Rattus Norvegicus
Nom
usuel
Abeille
Homme
Rat
%GC
Espèce
Nom usuel
%GC
32,7
36,0
40,9
41,9
Yersinia pestis
Escherichia coli
Leishmania major
Mycobacterium
tuberculosis
Peste (pathogène)
47,7
50,0
59,7
65,6
Leishmaniose (pathogène)
Tuberculose (pathogène)
Une méthode simple pour estimer le %GC d’un ADN génomique est de déterminer sa
température de fusion Tm. Cette valeur varie linéairement avec le %GC selon la formule suivante
(d’après Mandel et Marmur, Methods Enzymol, 1968) :
La détermination de la température Tm est réalisée en mesurant l’absorbance de l’ADN à 260
nm à différentes températures. Vous observerez un saut d’absorbance dû à l’effet hyperchrome. La
valeur de Tm est déterminée graphiquement comme la température à laquelle l’absorbance a
augmenté de 50%.
Analyse des données :
En utilisant les données présentées par votre enseignant, tracez la courbe A260 = f(T), déterminez la
valeur de Tm, et identifiez l’organisme à partir duquel vous avez extrait cet ADN.
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