BIOLOGIE Les enzymes : des biocatalyseurs

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Concours B ENSA
B-0108B
BIOLOGIE
Durée : 4 heures
L’usage de la calculatrice, d’abaques et de tables est interdit pour cette épreuve.
Si, au cours de l’épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d’énoncé, il le signale
sur sa copie et poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu’il a été amené à
prendre.
L’épreuve comprend deux parties indépendantes comptant chacune pour la moitié de la note.
Première partie : question de synthèse
Les enzymes : des biocatalyseurs
N.B. Il est rappelé aux candidats que la notation prendra en compte non seulement la
clarté, la précision et la concision de l’exposé, mais également la qualité de l’expression, de
l’illustration et de la présentation.

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Deuxième partie : étude de documents
L’acétylcholine estérase (AChE) met fin à la transmission synaptique au niveau des synapses
cholinergiques dans le système nerveux par hydrolyse rapide du neurotransmetteur acétylcholine. La
réaction catalysée par l’enzyme est la suivante :
acétylcholine + eau → acide acétique + choline
En raison de son rôle physiologique, l’AChE constitue une cible privilégiée pour de nombreux
insecticides, dont les carbamates, une classe de pesticides utilisés en agriculture et en santé publique.
Or une résistance à ces composés a été décrite pour de nombreuses espèces, en particulier pour Culex
pipiens, vecteur de la fièvre du Nil.
L’étude qui suit consiste à caractériser l’activité AChE du moustique Culex pipiens, ainsi que le
mécanisme à l’origine de la résistance décrite, dans le but de mettre au point un test diagnostic de cette
résistance.
1 - Un extrait cellulaire, préparé à partir de la souche de référence S-LAB de Culex pipiens, est
ultracentrifugé en gradient de saccharose dans un tampon en présence (ronds noirs) ou en absence
(ronds blancs) d’un détergent, le Triton X-100. L’activité AChE des différentes fractions est présentée
Figure 1.
Figure 1
0 10 20 30 40
Fractions
0
0,5
1,0
Activité AChE (unités arbitraires)
GAL PAL
0 10 20 30 40
Fractions
0
0,5
1,0
Activité AChE (unités arbitraires)
0 10 20 30 40
Fractions
0
0,5
1,0
Activité AChE (unités arbitraires)
GAL PAL
Les flèches verticales indiquent les positions de la phosphatase alcaline bovine (PAL) et de la
-galactosidase d’Escherichia coli (GAL), qui sont utilisées comme étalons internes et ont pour
coefficients de sédimentation respectivement 6,1S et 16S.
Expliquer, en une dizaine de lignes au maximum, le principe de l’ultracentrifugation en gradient
de saccharose.
Quel est le rôle du détergent ?
Que vous suggère la comparaison des profils d’activité AChE obtenus en présence et en
absence de détergent ?

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2 - Afin de caractériser l’activité AChE de la souche S-LAB, les fractions 24 & 25 du pic obtenu en
présence de détergent (cf. Figure 1) sont collectées, puis sont traitées (+) ou non (-) par la
phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PIPLC) avant d’être analysées par électrophorèse
en conditions non dénaturantes. La PIPLC est une enzyme qui libère spécifiquement les protéines
liées à un phospholipide membranaire, le glycosyl-phosphatidylinositol (GPI).
Après migration, l’activité AChE est déterminée par la méthode de Ellman : le gel est découpé en deux
parties, l’une est colorée en utilisant l’acétylthiocholine (AcSCH), à une concentration égale à 10
-3
M,
comme analogue de substrat et l’autre en utilisant AcSCH en présence de propoxur (un carbamate) à
une concentration égale à 5x10
-4
M (Figure 2). L’apparition de la coloration révèle la présence d’une
activité AChE.
Figure 2
1
2
3
4
- PIPLC + PIPLC - PIPLC + PIPLC
AcSCH 10
-3
M
Propoxur 5.10
-4
M
AcSCH 10
-3
M
1
2
3
4
- PIPLC + PIPLC- PIPLC + PIPLC - PIPLC + PIPLC- PIPLC + PIPLC
AcSCH 10
-3
M
Propoxur 5.10
-4
M
AcSCH 10
-3
M
Les têtes de flèche indiquent l’origine de migration, la flèche verticale indique le sens de migration
La quantité de protéines déposées dans chaque piste est identique
Expliquer, en une dizaine de lignes au maximum, le principe de la séparation de protéines par
électrophorèse non dénaturante en gel de polyacrylamide.
Que permet de mettre en évidence l’utilisation de PIPLC ?
Quel est l’effet du propoxur ?
Conclure quant à la nature des bandes 1, 2, 3 & 4 ?
3 - L’activité AChE des mêmes fractions est ensuite étudiée avec des doses croissantes de propoxur
(Figure 3).
Figure 3
Activité AChE résiduelle (%)
Propoxur (M)
60
40
20
0
80
100
10
-10
10
-8
10
-6
10
-4
10
-2
Activité AChE résiduelle (%)
Propoxur (M)
60
40
20
0
80
100
10
-10
10
-8
10
-6
10
-4
10
-2
Que permet de confirmer ce résultat ? Justifiez votre réponse.

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4 - Les effets de différentes concentrations en propoxur sur la mortalité des moustiques sont étudiés
pour la souche de référence S-LAB, étudiée jusque là, et pour une autre souche nommée MSE
(Figure 4A). L’activité AChE de ces deux souches est ensuite étudiée in vitro en gel non dénaturant
selon le protocole présenté à la question 2 (Figure 4B).
Figure 4A
98
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
2
5.10
-8
5.10
-6
5.10
-7
5.10
-3
5.10
-4
5.10
-5
Propoxur (M)
Mortalité (%)
S-LAB MSE
98
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
2
98
95
90
80
70
60
50
40
30
20
10
5
2
5.10
-8
5.10
-6
5.10
-7
5.10
-3
5.10
-4
5.10
-5
Propoxur (M)
Mortalité (%)
S-LAB MSE
Figure 4B
S-LAB S-LABMSE MSE
Propoxur
5.10
-4
M
Sans
Propoxur
S-LAB S-LABMSE MSE
Propoxur
5.10
-4
M
Sans
Propoxur
Les têtes de flèche indiquent l’origine de migration, la flèche verticale indique le sens de migration
La quantité de protéines déposées dans chaque piste est identique
Etablir une corrélation entre la viabilité des souches et les différentes activités AChE présentes
dans chaque souche.
Emettre une hypothèse permettant d’expliquer les différences de viabilité observées.
5 – Le séquençage des génomes de nombreuses espèces animales a permis de rechercher les gènes ace
codant pour des AChE. Deux tels gènes, ace-1 & ace-2, ont ainsi été mis en évidence chez Culex
pipiens. Le Tableau 5A présente le polymorphisme nucléotidique de l’exon 3 du gène ace-1 de
différents moustiques Culex pipiens. Dans cette figure les échantillons sont classés selon la sous-
espèce (C. p. pipiens ou C. p. quinquefasciatus), la présence d’AChE résistante (Ri) ou non (Si) au
propoxur et le pays d’origine. Seuls les sites de polymorphisme sont indiqués et un tiret indique la
similitude avec la première séquence du tableau, c’est-à-dire avec la séquence « Burkina Faso ».
La séquence nucléotidique complète de l’exon 3 de l’échantillon S1, ainsi que la séquence protéique
correspondante, sont données dans le Tableau 5B.
En vous appuyant sur les données des tableaux 5A & 5B, ainsi que sur les annexes, émettre
une hypothèse permettant d’expliquer l’origine de la résistance au propoxur du produit du
gène ace-1 dans les souches de moustiques R ? Justifiez votre réponse.

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Tableau 5A
4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8
5 5 7 9 1 2 6 7 9 0 5 6 8 8 9 9 1 3 3 4 4 5 6 7 7 8 9 1 4
0 3 1 8 3 8 4 3 7 3 1 0 1 4 1 6 4 2 9 1 7 6 3 4 7 0 0 3 6
C. pipiens quinquefasciatus
Pays Nom
Burkina Faso
R1 T C A T C G G G G C G G G C C C C C A C C T C C C C G A T
Zimbabwe
R2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Côte d’Ivoire
R3 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Mali
R4 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Martinique
R5 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Brésil
R6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
USA
S1 - T - C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
USA
S2 - T - C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
USA
S3 - T - - - - - A - - - - - - - - - - G - - - - - - - A - -
USA
S4 - T - - - - - A - - - - - - - - - - G - - - - - - - A - -
Chine
S5 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - T - - - - -
Chine
S6 - T – C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - -
Thaïlande
S7 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
Inde
S8 - T - C - - A - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
Afrique du sud
S9 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
Afrique du sud
S10 - T - - - - - A - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - -
Côte d’Ivoire
S11 - T – C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - -
Congo
S12 - T C C - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
Brésil
S13 - T – C - - - - - - - - - - - - - - G - T - - - - - - - G
Polynésie française
S14 - T - - - - - - - - - - - - - - - - G - - - - - - - - - G
C. pipiens pipiens
Tunisie
R7 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G -
Portugal
R8 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G -
Italie
R9 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G -
France
R10 A T - C - - - A - - C - - - A G T T - - - - T - T T - G -
Belgique
S15 A T - C - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - G -
Belgique
S16 A T - C - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - G -
Australie
S17 A T - C - - - A - A C - - - A G T T G - - - T - T T - G -
France
S18 A T - C - - - A - - C - - - A G T T G - - - T - T T - G -
Légende : 4 indique la position du 450
ème
nucléotide du gène ace-1
5
0
Tableau 5B
Légende : agt indique que le codon agt code pour un résidu Ser
S
451 agtggaaaga aggtggacgc atggatgggc attccgtacg cgcagccccc gctgggtccg
23
S G K K V D A W M G I P Y A Q P P L G P
511 ctccggtttc gacatccgcg accggccgaa agatggaccg gtgtgctgaa cgcgaccaaa
43
L R F R H P R P A E R W T G V L N A T K
571 ccgcccaact cctgcgtcca gatcgtggac accgtgttcg gtgacttccc gggggccacc
63
P P N S C V Q I V D T V F G D F P G A T
631 atgtggaacc cgaacacacc gctctcggag gactgtctgt acatcaacgt ggtcgtgcca
83
M W N P N T P L S E D C L Y I N V V V P
691 cggcccaggc ccaagaatgc cgccgtcatg ctgtggatct tcgggggtgg cttctactcc
103 R P R P K N A A V M L W I
F G G G F Y S
751 gggactgcca cgctggacgt gtacgaccac cggacgctgg cctcggagga gaacgtgatc
123
G T A T L D V Y D H R T L A S E E N V I
811 gtagtttcgc tgcagtaccg tgtcgcaagt cttggg
143 V V S L Q Y R V A S L G