BIOLOGIE Les enzymes : des biocatalyseurs

Concours B ENSA
B-0108B
BIOLOGIE
Durée : 4 heures
L’usage de la calculatrice, d’abaques et de tables est interdit pour cette épreuve.
Si, au cours de l’épreuve, un candidat repère ce qui lui semble être une erreur d’énoncé, il le signale
sur sa copie et poursuit sa composition en expliquant les raisons des initiatives qu’il a été amené à
prendre.
L’épreuve comprend deux parties indépendantes comptant chacune pour la moitié de la note.
Première partie : question de synthèse
Les enzymes : des biocatalyseurs
N.B. Il est rappelé aux candidats que la notation prendra en compte non seulement la
clarté, la précision et la concision de l’exposé, mais également la qualité de l’expression, de
l’illustration et de la présentation.
1/8
Deuxième partie : étude de documents
L’acétylcholine estérase (AChE) met fin à la transmission synaptique au niveau des synapses
cholinergiques dans le système nerveux par hydrolyse rapide du neurotransmetteur acétylcholine. La
réaction catalysée par l’enzyme est la suivante :
acétylcholine + eau → acide acétique + choline
En raison de son rôle physiologique, l’AChE constitue une cible privilégiée pour de nombreux
insecticides, dont les carbamates, une classe de pesticides utilisés en agriculture et en santé publique.
Or une résistance à ces composés a été décrite pour de nombreuses espèces, en particulier pour Culex
pipiens, vecteur de la fièvre du Nil.
L’étude qui suit consiste à caractériser l’activité AChE du moustique Culex pipiens, ainsi que le
mécanisme à l’origine de la résistance décrite, dans le but de mettre au point un test diagnostic de cette
résistance.
1 - Un extrait cellulaire, préparé à partir de la souche de référence S-LAB de Culex pipiens, est
ultracentrifugé en gradient de saccharose dans un tampon en présence (ronds noirs) ou en absence
(ronds blancs) d’un détergent, le Triton X-100. L’activité AChE des différentes fractions est présentée
Figure 1.
Figure 1
Activité AChE (unités arbitraires)
GAL
PAL
1,0
0,5
0
0
10
20
30
40
Fractions
Les flèches verticales indiquent les positions de la phosphatase alcaline bovine (PAL) et de la
-galactosidase d’Escherichia coli (GAL), qui sont utilisées comme étalons internes et ont pour
coefficients de sédimentation respectivement 6,1S et 16S.
Expliquer, en une dizaine de lignes au maximum, le principe de l’ultracentrifugation en gradient
de saccharose.
Quel est le rôle du détergent ?
Que vous suggère la comparaison des profils d’activité AChE obtenus en présence et en
absence de détergent ?
2/8
2 - Afin de caractériser l’activité AChE de la souche S-LAB, les fractions 24 & 25 du pic obtenu en
présence de détergent (cf. Figure 1) sont collectées, puis sont traitées (+) ou non (-) par la
phospholipase C spécifique du phosphatidylinositol (PIPLC) avant d’être analysées par électrophorèse
en conditions non dénaturantes. La PIPLC est une enzyme qui libère spécifiquement les protéines
liées à un phospholipide membranaire, le glycosyl-phosphatidylinositol (GPI).
Après migration, l’activité AChE est déterminée par la méthode de Ellman : le gel est découpé en deux
parties, l’une est colorée en utilisant l’acétylthiocholine (AcSCH), à une concentration égale à 10-3 M,
comme analogue de substrat et l’autre en utilisant AcSCH en présence de propoxur (un carbamate) à
une concentration égale à 5x10-4 M (Figure 2). L’apparition de la coloration révèle la présence d’une
activité AChE.
Figure 2
AcSCH 10-3 M
Propoxur 5.10-4 M
AcSCH 10-3 M
- PIPLC
+ PIPLC
- PIPLC
+ PIPLC
1
2
3
4
Les têtes de flèche indiquent l’origine de migration, la flèche verticale indique le sens de migration
La quantité de protéines déposées dans chaque piste est identique
Expliquer, en une dizaine de lignes au maximum, le principe de la séparation de protéines par
électrophorèse non dénaturante en gel de polyacrylamide.
Que permet de mettre en évidence l’utilisation de PIPLC ?
Quel est l’effet du propoxur ?
Conclure quant à la nature des bandes 1, 2, 3 & 4 ?
3 - L’activité AChE des mêmes fractions est ensuite étudiée avec des doses croissantes de propoxur
(Figure 3).
Activité AChE résiduelle (%)
Figure 3
100
80
60
40
20
0
10-10
10-8
10-6
Propoxur (M)
Que permet de confirmer ce résultat ? Justifiez votre réponse.
3/8
10-4
10-2
4 - Les effets de différentes concentrations en propoxur sur la mortalité des moustiques sont étudiés
pour la souche de référence S-LAB, étudiée jusque là, et pour une autre souche nommée MSE
(Figure 4A). L’activité AChE de ces deux souches est ensuite étudiée in vitro en gel non dénaturant
selon le protocole présenté à la question 2 (Figure 4B).
Figure 4A
98
95
90
Mortalité (%)
80
70
60
S-LAB
50
40
MSE
30
20
10
5
2
5.10-8
5.10-7
5.10-6
5.10-5
5.10-4
5.10-3
Propoxur (M)
Figure 4B
S-LAB
MSE
Sans
Propoxur
S-LAB
MSE
Propoxur
5.10-4 M
Les têtes de flèche indiquent l’origine de migration, la flèche verticale indique le sens de migration
La quantité de protéines déposées dans chaque piste est identique
Etablir une corrélation entre la viabilité des souches et les différentes activités AChE présentes
dans chaque souche.
Emettre une hypothèse permettant d’expliquer les différences de viabilité observées.
5 – Le séquençage des génomes de nombreuses espèces animales a permis de rechercher les gènes ace
codant pour des AChE. Deux tels gènes, ace-1 & ace-2, ont ainsi été mis en évidence chez Culex
pipiens. Le Tableau 5A présente le polymorphisme nucléotidique de l’exon 3 du gène ace-1 de
différents moustiques Culex pipiens. Dans cette figure les échantillons sont classés selon la sousespèce (C. p. pipiens ou C. p. quinquefasciatus), la présence d’AChE résistante (Ri) ou non (Si) au
propoxur et le pays d’origine. Seuls les sites de polymorphisme sont indiqués et un tiret indique la
similitude avec la première séquence du tableau, c’est-à-dire avec la séquence « Burkina Faso ».
La séquence nucléotidique complète de l’exon 3 de l’échantillon S1, ainsi que la séquence protéique
correspondante, sont données dans le Tableau 5B.
En vous appuyant sur les données des tableaux 5A & 5B, ainsi que sur les annexes, émettre
une hypothèse permettant d’expliquer l’origine de la résistance au propoxur du produit du
gène ace-1 dans les souches de moustiques R ? Justifiez votre réponse.
4/8
Tableau 5A
4 4 4 4 5 5 5 5 5 6 6 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 8 8
5 5 7 9 1 2 6 7 9 0 5 6 8 8 9 9 1 3 3 4 4 5 6 7 7 8 9 1 4
0 3 1 8 3 8 4 3 7 3 1 0 1 4 1 6 4 2 9 1 7 6 3 4 7 0 0 3 6
C. pipiens quinquefasciatus
Pays
Burkina Faso
Zimbabwe
Côte d’Ivoire
Mali
Martinique
Brésil
USA
USA
USA
USA
Chine
Chine
Thaïlande
Inde
Afrique du sud
Afrique du sud
Côte d’Ivoire
Congo
Brésil
Polynésie française
Nom
R1
R2
R3
R4
R5
R6
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S11
S12
S13
S14
T
-
C
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
A
C
–
C
C
–
C
–
-
T
C
C
C
C
C
C
C
C
C
C
-
C
-
G
-
G
A
-
G
A
A
A
-
G
-
C
-
G
-
G
-
G
-
C
-
C
-
C
-
C
-
C
-
A
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
G
C
-
C
T
-
T
-
C
-
C
T
-
C
-
C
-
G
A
A
-
A
-
T
G
G
G
G
G
G
G
G
R7
R8
R9
R10
S15
S16
S17
S18
A
A
A
A
A
A
A
A
T
T
T
T
T
T
T
T
-
C
C
C
C
C
C
C
C
-
-
-
A
A
A
A
A
A
A
A
-
A
-
C
C
C
C
C
C
C
C
-
-
-
A
A
A
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
G
G
G
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
G
G
G
G
-
-
-
T
T
T
T
T
T
T
T
-
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
T
-
G
G
G
G
G
G
G
G
-
C. pipiens pipiens
Tunisie
Portugal
Italie
France
Belgique
Belgique
Australie
France
4 indique la position du 450ème nucléotide du gène ace-1
5
0
Légende :
Tableau 5B
451
23
511
43
571
63
631
83
agtggaaaga aggtggacgc atggatgggc attccgtacg cgcagccccc gctgggtccg
S
G
K
K
V
D
A
W
M
G
I
P
Y
A
Q
P
P
L
G
P
ctccggtttc gacatccgcg accggccgaa agatggaccg gtgtgctgaa cgcgaccaaa
L
R
F
R
H
P
R
P
A
E
R
W
T
G
V
L
N
A
T
K
ccgcccaact cctgcgtcca gatcgtggac accgtgttcg gtgacttccc gggggccacc
P
P
N
S
C
V
Q
I
V
D
T
V
F
G
D
F
P
G
A
T
atgtggaacc cgaacacacc gctctcggag gactgtctgt acatcaacgt ggtcgtgcca
M
W
N
P
N
T
P
L
S
E
D
C
L
Y
I
N
V
V
V
P
691
cggcccaggc ccaagaatgc cgccgtcatg ctgtggatct tcgggggtgg cttctactcc
103
751
R P R P
K N A
A V M
L W I F
G G G
F Y S
gggactgcca cgctggacgt gtacgaccac cggacgctgg cctcggagga gaacgtgatc
123
G
811
gtagtttcgc tgcagtaccg tgtcgcaagt cttggg
143
V
Légende :
T
V
A
S
T
L
L
Q
agt
D
Y
V
R
Y
V
D
A
H
S
R
L
T
L
A
S
E
E
N
V
G
indique que le codon agt code pour un résidu Ser
S
5/8
I
Figure 6
Activité acétylcholine estérase (%)
6 - L’ADNc du gène ace-1 de la souche S1 a été cloné dans un vecteur d’expression eucaryote pour
donner la construction pAce1-S. La mutation précédemment identifiée dans les souches R a ensuite été
introduite par mutagenèse dirigée dans l’ADNc pour donner le vecteur pAce1-R. Des cellules S2 de
mouche du vinaigre, Drosophila melanogaster, n’exprimant pas d’AChE de manière constitutive
sont utilisées pour produire les différentes protéines recombinantes. La Figure 6 illustre la
quantification de l’activité AChE-1 en présence de concentrations croissantes de propoxur de lysats de
cellules S2 transfectées avec le vecteur vide (rond noir), de cellules S2 transfectées avec pAce-1-R
(carré noir) et de cellules S2 transfectées avec pAce-1-S (losange blanc). Parallèlement, l’activité
AChE-1 de lysats de cellules de moustiques Culex pipiens résistants (losange noir) et sensibles (carré
blanc) au propoxur est testée dans les mêmes conditions.
140
120
100
80
60
40
20
0
0
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
Propoxur (M)
Rappeler ce qu’est un vecteur d’expression.
Que démontre cette expérience ?
7 - Un test permettant la mise en évidence de la mutation du gène ace-1 responsable de la résistance au
propoxur a été développé. Ce test de polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP)
repose sur la comparaison des profils de coupure, par des enzymes de restriction, de l’exon 3 du gène
ace-1 préalablement amplifié par PCR.
Grâce aux résultats obtenus au cours de l’ensemble de l’étude précédente, expliquer les
grandes étapes de la réalisation pratique de ce test en justifiant comment un tel test permet
concrètement de distinguer les moustiques sensibles et résistants.
Quel intérêt pratique présente un tel test ?
8 - La résolution de la structure cristallographique de l’AChE de raie électrique, Torpedo californica, a
permis d’identifier au sein du site actif les trois acides aminés essentiels à la catalyse : Ser 200,
Glu 327 et His 440 (Figure 8A).
Figure 8A
6/8
Sur la base de cette structure et des homologies entre les séquences protéiques de l’AChE de Torpedo
californica et de l’AChE-1 de Culex pipiens il a été possible de construire un modèle tridimensionnel
de cette dernière (Figure 8B). Des agrandissements des sites catalytiques d’une forme enzymatique
sensible au propoxur et d’une forme résistante sont présentés respectivement Figures 8C et 8D.
L’acide aminé muté, identifié précédemment, ainsi que les acides aminés Ser 200, His 440 et Glu 327,
responsables de l’activité catalytique, y sont représentés sous forme de sphères de van der Waals.
Figures 8B,C,D
B
C
D
Quelle famille d’enzymes présente la même triade catalytique au niveau de son site actif ?
Par analogie avec cette famille, présenter le mécanisme catalytique de l’AChE.
Proposer une explication à la résistance au propoxur de l’enzyme mutée sur la base de ces
données structurales et de vos connaissances du mécanisme catalytique de l’AChE.
7/8
Annexes
Annexe 1 - Tableau du code génétique
Première lettre
(extrémité 5’)
U
C
A
G
Deuxième lettre
U
C
A
G
Troisième lettre
(extrémité 3’)
Phe
Ser
Tyr
Cys
U
Phe
Ser
Tyr
Cys
C
Leu
Ser
Stop
Stop
A
Leu
Ser
Stop
Trp
G
Leu
Pro
His
Arg
U
Leu
Pro
His
Arg
C
Leu
Pro
Gln
Arg
A
Leu
Pro
Gln
Arg
G
Ile
Thr
Asn
Ser
U
Ile
Thr
Asn
Ser
C
Ile
Thr
Lys
Arg
A
Met
Thr
Lys
Arg
G
Val
Ala
Asp
Gly
U
Val
Ala
Asp
Gly
C
Val
Ala
Glu
Gly
A
Val
Ala
Glu
Gly
G
Annexe 2 - Code à une lettre des acides aminés
A : alanine
C : cystéine
D : acide aspartique
E : acide glutamique
F : phénylalanine
G : glycine
H : histidine
I : isoleucine
K : lysine
L : leucine
M : méthionine
N : asparagine
P : proline
Q : glutamine
R : arginine
8/8
S : sérine
T : thréonine
V : valine
W : tryptophane
Y : tyrosine