Culture Cellulaire : Cours et TP sur les Techniques de Culture

La culture cellulaire est un processus par lequel des cellules sont cultivées in vitro, donc en
milieu artificiel, à l’extérieur de leur environnement naturel, et dans des conditions
extrêmement contrôlées.
Le but d’une culture c’est quoi ? Et bien c’est tout simplement de disposer de suffisamment
de cellules pour pouvoir produire des molécules organiques ou pour l’expérimentation, à
travers diverses expériences qui seront d’ailleurs détaillées au cours de la TP.
Les cellules en culture peuvent être de type :
 Epithéliale : cellules adhérentes apparaissent plates et de forme polygonale
 Lymphoblaste : cellules en suspension de forme sphérique
 Fibroblaste : cellules adhérentes de forme allongée et bipolaire
1. Les types de culture cellulaire
 La culture primaire : C’est une culture initiée à partir de cellules, de tissus ou d'organes
prélevés directement sur un organisme. La multiplication des cellules s'arrête quand
un élément du milieu nutritif est épuisé. Quand elles sont cultivées sur support, leur
croissance s'arrête par inhibition de contact. (C.à.d. quand elles forment un tapis
confluent de monocouche cellulaire.)
 La culture secondaire : quand les cellules de la culture primaire arrivent à l’état de
confluence elles doivent être réensemencées à une densité plus faible dans un
nouveau flacon avec un milieu de culture frais, cette opération est appelée : repiquage
ou passage. Les nouvelles cultures obtenues sont donc des cultures secondaires dont
les cellules conservent les caractéristiques du tissu d'origine mais leur nombre de
divisions est limité comme dans l’organisme.
 Les lignées cellulaires : les cellules qui ont subi des modifications génétiques qui
permettent leur croissance indéfinie. Elles proviennent de tumeurs spontanées ou de
cellules transformés par immortalisation.
2. Origine et obtention des cellules
 Les cellules circulantes ou libre : tel que les cellules sanguines récupéré par une simple
centrifugation.
 Les cellules des tissus solides : Récupéré d’une migration cellulaire à partir d’explant
ou bien dissociation de tissu et libération des cellules
3. Conditions de culture

La culture cellulaire exige la reconstitution des conditions originales du milieu des
cellules pour se faire, on doit contrôler la température, le taux d’humidité, le pH et
les besoins nutritif.
• O2
• CO2 :5%
• Humidité : 84-85%
• Température : 37°C
• pH≈7.4
4. Milieu de culture
Les milieux de culture cellulaire :
Les milieux de culture cellulaire sont des solutions nutritives essentielles pour la croissance et
la maintenance des cellules in vitro. Un milieu de culture doit contenir les exigences cellulaires
minimales : Eau, ions minéraux (osmolarité), sources de carbone et d’énergie : glucose, source
d’acides aminés, solution tampon (la régulation du pH pH 7,4), rouge de phénol : indicateur
de PH, vitamines : Cofacteurs d’enzyme et des bases azotées : ribose et désoxyriboses. D’une
autre part un milieu de culture contient des compléments variables selon les milieux :
Glutamine à 1 %, sérum de veau fœtale (SVF), EGF : facteur de croissance épidermique, facteur
d’adhésion, inhibiteur à antitrypsine et mélange d’antibiotiques à 1%
(Pénicilline/Streptomycine). Ils peuvent être classés en plusieurs types, chacun ayant des
caractéristiques spécifiques adaptées à différents types de cellules et besoins expérimentaux.
Types de milieux de culture cellulaire :
a. Milieux de culture classiques
Ces milieux sont conçus pour soutenir la croissance générale des cellules. Ils contiennent des
nutriments essentiels, des sels, des acides aminés, des vitamines et parfois du sérum. Parmi
les milieux classiques les plus courants, on trouve :
• DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) : Utilisé pour une variété de
lignées cellulaires de mammifères.
• RPMI 1640 : Conçu pour les cellules lymphoïdes, comme les cellules B et T.
• MEM (Minimum Essential Medium) : Contient les nutriments essentiels pour la
plupart des cellules de mammifères.
• F-12 de Ham : Riche en nutriments, souvent utilisé pour les hybridomes12.
b. Milieux de culture sélectifs

Ces milieux contiennent des composants qui favorisent la croissance d'un type cellulaire
spécifique tout en inhibant d'autres. Ils sont souvent enrichis d'antibiotiques ou d'agents
antimicrobiens pour éliminer les contaminants. Par exemple :
• Milieu sélectif pour cellules tumorales : Contient des facteurs qui favorisent la
prolifération de cellules cancéreuses tout en inhibant les cellules normales.
c. Milieux de culture différentiels
Ces milieux permettent de distinguer différents types cellulaires basés sur leurs
caractéristiques morphologiques ou métaboliques. Ils contiennent souvent des indicateurs qui
changent de couleur en fonction du type cellulaire cultivé, facilitant ainsi l'identification. Par
exemple :
• Milieu MacConkey : Utilisé en microbiologie pour distinguer les bactéries
lactose-fermentantes24.
• Milieux spécialisés : Certains milieux sont conçus pour des applications
spécifiques, comme la culture de cellules souches ou la production de protéines
recombinantes. Ces milieux peuvent être enrichis en hormones ou facteurs de
croissance nécessaires à la différenciation cellulaire
5. Les bonnes pratiques de culture cellulaire
La contamination en culture cellulaire par des microorganismes et la cross-contamination sont
des problèmes majeurs en culture cellulaire.
Les contaminants (bactéries, levures, champignons, mycoplasmes…) sont introduits par :
 L’opérateur
 L’atmosphère
 La surface de travail
 Les solutions utilisées
Il faut donc établir des règles de conduite strictes dans les salles de culture surtout si plusieurs
personnes sont susceptibles d’utiliser le même espace de travail.
Protection individuelle et technique aseptique
La culture cellulaire est une compétence délicate qui nécessite des techniques et des pratiques
essentielles avant manipulation :
• Porter une blouse propre et réservée au laboratoire de culture cellulaire
• Porter des gants pour manipuler des cellules
• Changer les gants régulièrement et immédiatement en cas de projection de
matériel biologique
• Désinfecter la zone de travail avant et après toute manipulation

• Travailler sous un poste de sécurité microbiologique bien entretenu et contrôlé
régulièrement
• Ne pas porter les mains au visage (pour se moucher, replacer une mèche de
cheveux…)
6. Matériels et entretien
a. Hotte ou poste de sécurité microbiologique (PSM)
 PSM de type I : Protège l’environnement et le manipulateur des agents biologiques
manipulés, mais ne protège pas la manipulation des polluants extérieurs. L’espace de
travail n’est pas stérile.
 PSM de type II : Protège le manipulateur et l’environnement des agents biologiques
manipulés. Il protège également la manipulation des polluants extérieurs
 PSM de type III : Assure un confinement total des produits biologiques manipulés.
L’enceinte est non seulement ventilée, mais également en dépression. L’espace de
travail est stérile. De plus, l’environnement de travail est clos, et l’accès à la
manipulation se fait par des manchons sans aucun contact direct
b. . L’espace de travail est stérile.
• Nettoyer le plan de travail avec de l’éthanol à 70% (ne jamais utiliser l’eau de javel).
• Décontaminer tout le matériel avant de l’introduire sous le PSM II
• Ne pas bloquer les grilles se trouvant à l’entrée de la hotte, ni boucher les grilles se
trouvant à l’arrière de manière à ne pas perturber le flux d’air.

• Ne pas stocker de matériel inutile ou de déchet sous la hotte
• Travailler au centre du plan de travail, en retrait de la veine de garde
• Attention à la décontamination par UV ! – Les lampes UV ont une durée de vie limitée
(~3000 heures) : elles ne génèrent plus qu’une lumière bleue et pas de rayonnement UV
• Le PSM doit être nettoyer au moins une fois par mois, plus fréquemment en fonction du
nombre d’utilisateur et de l’activité du laboratoire – Retirer les grils du plan de travail –
Nettoyer la base du PSM
c. Incubateur
La mise en culture des cellules se fait dans des incubateurs à jaquette d’eau (humidité relative
84%) qui fonctionnent à 37° C et à 5% de dioxyde de carbone pour maintenir le pH du milieu
à un pH correct. Ils ont tous des compteurs pour enregistrer la température et le niveau de
gaz.
• Limiter la fréquence et la durée d’ouverture
• Nettoyer et désinfecter régulièrement les incubateurs (retirer les étagères et les
nettoyer)
• Nettoyer et désinfecter le bac d’eau, utiliser de l’eau stérile en ajoutant un fongicide ou
bactéricide
• Désinfecter en cas de projection de liquide
d. Microscope
Un simple microscope inversé avec un grossissement x 100 est essentiel pour que les
cultures puissent être examinées dans les flacons et les plaques. Il est nécessaire pour faire
la numération cellulaire et pour pouvoir reconnaître les changements morphologiques dans
les cultures. (N’oublier pas de désinfecter la platine du microscope régulièrement)