3.01A Bruno Charpentier Biologie moléculaire Qui assure le déroulement des fonctions biologiques essentielles ? Des machines moléculaires, ayant des complexités différentes dans les trois domaines du vivant : (Bacteria, Archaea et Eucarya). Formées par l’assemblage de nombreux constituants (les pièces) de nature protéique mais aussi parfois d’acides ribonucléiques (ARN). Les machines fondamentales ont été identifiées au cours des années 50-60. Elles permettent la réplication, la transcription et la traduction, qui sont les fonctions fondamentales du dogme central de la Biologie Moléculaire. SCHEMA Les machines essentielles mais aussi celles assurant des fonctions plus spécifiques : D’autres machines, spécifiques d’un domaine du vivant, ont depuis été identifiées. Ces dernières interviennent pour des mécanismes comme : - L’épissage des pré-ARNm, La modification chimique de l’ADN, de l’ARN, La maturation de l’ARN, des protéines, L’interférence ARN(RNAi), etc. Pour chacune, l’activité se déroule suivant le même principe dans tous les organismes, mais évolution vers plus de complexité : machines bactériennes sont pratiquement toujours les moins complexes. Questions auxquelles tente de répondre le biologiste moléculaire : - - I) Quelle est la composition exacte de ces machines moléculaires ? Comment sont-elles assemblées dans les cellules ? Quel est le rôle précis de chaque constituant : o Purement structural ? o Directement impliqué dans leur activité ? Par quel mécanisme moléculaire fonctionnent-elles ? Peut-on identifier des étapes réactionnelles intermédiaires ? Comment s’effectue la régulation de leur fonctionnement ? Beaucoup de pathologies sont associées à des problèmes de dysfonctionnement de la régulation de ces machines Après le réplisome, fonction d’une deuxième machine fondamentale de biosynthèse des acides nucléiques : celle assurant lors de la transcription, la synthèse d’ARN A) Unités transcriptionnelles Transcription : c’est une biosynthèse d’acides nucléique (ici ARN) qui repose : 1 3.01A - Bruno Charpentier Sur la complémentarité des bases selon la loi des appariements Watson-Crick Sur une polymérisation s’effectuant de5’ vers 3’ Sur la création de liaisons 3’->5’ phosphodiester entre les ribonucléotides tri-phosphate (rNTP) L’énergie nécessaire à la formation des liaisons est fournie par les liaisons triphosphate des nucléotide Pour ADN seulement 3 règle changent : liaison phosphodiester entre désoxyribonucléotide SCHEMAS La brique élémentaire des polymères d’acides nucléiques : le nucléotide ! B) ARN codants et non codants On distingue deux grandes familles de polymérases : - - Les ADN polymérases : o ADN dépendantes : Réplication o ARN dépendantes : Rétro-transcription ; télomérase Les ARN polymérases : o ADN dépendantes : transcription o ARN dépendantes : transcription ; réplication (virus à ARN) Dans les types d’ARN produits dans les cellules par l’activité ARN polymérase, ondistingue 2 grandes familles : - Les ARN codant des protéines : ARN messagers (ARNm) Les ARN non codants (ARNnc) ou non messagers (ARNnm) 2 3.01A Bruno Charpentier La part des génomes dédiée à l’epression des ARNnc VS ARNm : C) ARN polymérase et régions promotrices Les régions transcrites des génomes = unités transcriptionnelles (UT) Une UT en pleine activité : ici, polymérisations en cours de transcrits précurseurs des ARNr, donnant l’apparence d’un arbre de Noël 3 3.01A Bruno Charpentier UT : régions des génomes permettant le déroulement d’évènements de transcription - Initiation à un promoteur Elongation : biosynthèse ARN Terminaison à un terminateur Il y a plrs types d’UT pouvant être rencontrés : - - Les UT permettant la production d’ARNm, portent des phases codantes traduites en protéines : les ORF (Open Reading Frame) o Cas des procaryotes, o Cas des eucaryotes Les UT permettant la production des ARNnc SCHEMA Structure des ARN polymérases bactériennes, archées et eucaryotes Des assemblages à plusieurs sous-unités de protéines, de plus en plus complexes au cours de l’évolution Structure des ARN polymérases bactériennes : Chez les bactéries, une seule ARN polymérase pour toutes les UT. Une forme apoenzyme (E) de 4 Sous Unités (α2 β et β’) portant l’activité ARN polymérase ADN dépendante. Un facteur protéique σ interagit avec l’apoenzyme et conduit à la formation d’une forme holoenzyme E σ, seule capable d’initier la transcription au promoteur. Plusieurs types de facteurs σ sont produits, conduisant à la formation de plusieurs types d’holoenzymes. La spécificité de reconnaissance d’une famille de promoteurs est assurée par le facteur σ Structure des ARN polymérases des eucaryotes : Chez les eucaryotes, 3ARN polymérases distinctes, chacune étant spécifique de la transcription d’un type d’UT : 4 3.01A - Bruno Charpentier ARN polymérase I ARN polymérase II ARN polymérase III Formées par 4 sous-unités principales, rappelant les 4 SU bactériennes, plus 12 à 15 autres protéines. In vivo, les trois formes d’ARN polymérases interagissent en plus avec de nombreux autres facteur sa fin de pouvoir initier la transcription à un type de promoteur Structure des ARN polymérases des archées : Chez les archées, une seule ARN polymérase pour toutes les UT. Structure similaire à ARN polymérase II des eucaryotes Spécificité des ARN polymérases des eucaryotes : ARN polymérase I : transcription dans le nucléole des ARNr 18S, 5.8S et 28S ARN polymérase II : transcription dans le nucléoplasme de : tous les ARNm, 4 snRNA (U1, U2, U4 et U5), snoRNA et scaRNA, miRNA ARN polymérase III : transcription dans le nucléoplasme de : ARNt, ARNr 5S, snRNA U6, ARN 7S Structure des promoteurs : Alignement des séquences nucléotidiques connues pour être suffisantes à l’initiation de la transcription : identification de la séquence consensus. Principe de l’identification d’une séquence consensus : cas des promoteurs bactériens reconnus par Eσ 70 => effectuer des alignements de séquences SCHEMA D) Etapes d’initiation, d’élongation et de terminaison - Les grandes étapes du mécanisme d’initiation de la transcription Fixation spécifique de l’ARN polymérase sur un promoteur, Ouverture locale de l’ADN db: brin matrice disponible, Incorporation dans le site actif de l’ARN polymérase des premiers rNTP, Formation de la première liaison 3’->5’ phosphodiester, Départ de l’ARN polymérase du promoteur : passage de l’initiation à l’élongation de la transcription SCHEMA 5 3.01A Bruno Charpentier Terminaison de la transcription : - - A lieu lorsque le complexe d’élongation de la transcription rencontre la séquence du terminateur. Deux types de mécanismes pour les terminateurs bactériens : o Ceux indépendants de facteurs, o Ceux dépendants du facteur Rho Pour la terminaison des transcrits eucaryotes, les extrémités 3’-OH des transcrits sont produites par une coupure endonucléolytique. SCHEMA E) Le devenir des ARN produits Formation de RNP(RiboNucleoprotein Particle) - ARNr -> ribosomes snRNA -> snRNP snoRNA -> snoRNP miRNA -> miRNPetc. mRNA -> hnRNP(heterogeneous nuclear RNP) -> mRNP Nécessité d’un trafic intracellulaire - Pour les cellules eucaryotes, transport d’espèces ARN du noyau vers le cytoplasme Certaines espèces restent dans le noyau et sont adressées dans des régions précises (nucléole, corpuscule de Cajal, speckles, etc.), Pour les espèces transportées, certaines sont adressées vers des régions précises du cytoplasme ou vers les organelles F) La maturation et modification 5’ et 3’ des transcrits Modification covalentes subies par les pré-ARNm eucaryotes : - - Avant leur transport vers le cytoplasme, les transcrits de l’ARN polymérase II sont : o Modifiés à leur extrémité 5’= mise en place d’une coiffe. o Modifiés à leur extrémité3’= mise en place d’une queue poly(A)(réaction de polyadénylation). Sauf les ARNm des histones et les ARNnc. Pour les pré-ARNm : élimination des introns par épissage Mise en place de la coiffe : - Addition d’une guanosine tri-phophate (GTP). Liaison à l’extrémité 5’ de l’ARN par une liaison 5’-5’ inhabituelle (GpppNpNpN----). Réaction catalysée par une enzyme nucléaire : guanylyl transférase. La guanine additionnelle est ensuite méthylée : coiffe m7G. Pour certaines espèces, méthylations supplémentaires : coiffe hyperméthylée m2,2,7G. SCHEMA 6 3.01A Bruno Charpentier Mise en place de la queue poly(A) : - - Après terminaison de la transcription, o Coupure endonucléolytique au site de polyadénylation, o Ajout de nucléotides adényliques à l’extrémité 3’-OH. Activité d’une poly(A) polymérase qui polymérise la formation de liaisons3’-5’phosphodiester entre molécules d’ATP mais sans brin matrice Fixation d’un grand nombre de copies d’une protéine, la PABP (polyA Binding Protein) SCHEMA G) Epissage Mise en évidence de l’existence de gènes morcelés par des introns La réaction d’épissage se déroule au sein du spliceosome (=machinerie) - - L’épissage a lieu dans le noyau au sein d’une macrostructure, le spliceosome, composée de : o 5 snRNP : U1, U2, U4, U5 et U6 o De nombreux facteurs annexes. Le spliceosome s’assemble sur le pré-ARNm, au niveau des introns avant que la réaction d’épissage se déroule -> rôle de séquences conservées pour la reconnaissance des introns. La réaction d’épissage se déroule en deux étapes de transestérification permettant la jonction de deux exons et la libération de l’intron sous forme de lasso SCHEMA 7 3.01A Bruno Charpentier H) Couplages - Plusieurs machines moléculaires peuvent être en action conjointe. Leurs activités sont alors couplées. Requiert que les composants des deux machines soient présents dans un même compartiment cellulaire Pour ce qui concerne la machine de transcription, couplages du type : o Transcription/Traduction (Procaryotes), o Transcription/Maturation, o Transcription/Epissage o Transcription/Modification, Couplage transcription/traduction pour les UT bactériennes I) Dégradation - - Dégradation par un jeu d’activités endonucléolytiques et exonucleolytiques. o 1/2-vie très courte des ARNm bactériens (~2 min) o ARNm eucaryotes : qq minutes à qq jours. Bactéries : débute par une activité endonucléolytique (ex : RNaseE, RNase III), puis action d’un complexe multiprotéique de dégradation le dégradosome, progressant de 3’ -> 5’. Eucaryotes : o Déadénylation puis activité exonucléase 3’->5’ par un complexe multiprotéique (= Exosome). o Élimination de la coiffe par le complexe Dcp1/Dcp2 puis activité de l’exonucléase 5’>3’ Xrn1. 8 3.01A II) Bruno Charpentier La machine fondamentale de biosynthèse des protéines permettant la traduction A) ARNm, ORF et code génétique La traduction : - Mécanisme post-transcriptionnel de lecture de l’information portée par l’ARNm : biosynthèse des protéines. Couplé à la transcription chez les bactéries Eucaryotes : se déroule au niveau du réticulum endoplasmique rugueux (RER) dans le cytoplasme Cette biosynthèse repose sur : o Le décodage de l’information portée par ARNm o Une lecture par groupe de 3 nucléotides = codons o L’intervention d’ARN adaptateurs, les ARN de transfert (ARNt), qui portent une séquence complémentaire à chaque codon et sont liés covalemment à des acides aminés o La formation de liaisons peptidiques au sein des ribosomes qui parcourent les ARNm de 5’ vers 3’. o Une synthèse des polypeptides depuis leur extrémité NH2terminale vers leur extrémité COOH terminale Les acteurs du mécanisme de traduction Information portée par les phases ouvertes de lecture (ORF) au sein des ARNm : 1 codon = 3 nucléotides adjacents => 43= 64 combinaisons Une « phase ouverte de lecture » ou «Open Reading Frame» débute par un codon d’initiation de la traduction (AUG) et se termine par un codon STOP La méthionine est codée par un seul codon (AUG) 9 3.01A Bruno Charpentier 3 codons ne permettent pas l’incorporation d’AA : ce sont les codons de terminaison de la traduction (UAG, UGA, UAA). Bilan : 64 codons - 3 codons = 61 codons pour 20 AA Les codons ne se chevauchent pas Définition du cadre de lecture : 1ARNm = 3 cadres de lecture possibles Pour ADN s’il n’y a pas d’indication => 6 ORF potentielles d’où la nécessité d’une définition précise des UT et des ORF portées par les ARNm Certains AA codés par 4 codons : variation sur le nucléoside en 3ième position Mais, 6 codons pour certains AA : Ser, Leu, Arg 10 3.01A Bruno Charpentier Code génétique et usage des codons : la fréquence des codons utilisés varie selon les espèces Tous les codons dont la 2ièmelettre est un U correspondent à des acides aminés hydrophobes, donc ayant des propriétés physico-chimiques proches. Val, Leu, Ile, Phe, Met Les acides aminés à chaîne latérale acide sont codés par des codons débutant par GA => Asp, Glu Trp : AA codé par un seul codon UGG => Il s’agit d’un codon rare dans les ORF Effet des mutations dans les ORF : - Mutation faux sens : substitution d’AA Mutation non-sens : création d’un codon stop Mutation frame shift : décalage du cadre de lecture Cas particulier de la sélénocystéine : Sélénocystéine : décrite comme le 21ièmeaa. Analogue sélénié de la cystéine, dérivé métabolique de la sérine. Présente dans les sélénoprotéines qui remplissent des fonctions cellulaires très importantes Codée par le codon STOP UGA : incorporée dans les Sélénoprotéines lors d’un mécanisme de traduction particulier B) Les ARNt et leur aminoacylation Production et maturation des ARNt - Taille de 70 à 100 nucléotides. Présents sur des UT polycistroniques portant des ARNnc chez les bactéries. Chez les eucaryotes, transcrits par l’ARN polymérase III. Maturation à partir d’un précurseur pré-ARNt : o Action de la RNaseP pour la maturation de l’extrémité 5’, 11 3.01A Bruno Charpentier o o Action de Ribonucléases en 3’, Addition d’une séquence CCA en 3’ par une enzyme ARNt nucléotidyl-transférase (=CCase). Propriétés structurales des ARNt - Structure secondaire typique en feuille de trèfle Présence de résidus modifiés : dihydrouridines, ribothymine, pseudouridine, inosine, méthylations, thiolation. Ces modifications sont importantes pour la structure des ARNt. Sont introduites post transcriptionnellement par des enzymes spécifiques Bras accepteur VC boucle anticodon Les ARNt sont aminoacylés : portent un AA estérifié à leur extrémité CCA-3’OH La séq de 3 résidus dans la boule de l’anticodon s’apparie au codon sur l’ARNm, assurant ainsi la correspondance entre codon et AA conformément au code génétique Séq de l’anticodon GAA => par quel AA sera aminoacylé par cet ARNt ? => Phe bc séq codon 5’-UUC-3’ donc séq anticodon = 5’-GAA-3’ Codon/ anticodon/ décodage ou comment la traduction peut être bancale L’appariement entre le 1er nucléotide de l’anticodon et le 3ème d’un codon peut être non canonique (=distinct des interactions Watson-Crick classiques) exemple : G-U ; U-G ; A-I ; C-I ; U-I sont des paires dites Wobble (Inosine a propriétés pour s’apparier avec les autres bases= géométrie spé pouvant se mettre en place) 12 3.01A Bruno Charpentier Paire Wobble ou comment faire des économies d’ARNt 2 ARNt aminoacylés par l’alanine reconnaissent 4 codons ARNt isoaccepteurs : - - 30 à 40 ARNt différents chez bactéries & 50 à 100 dans cell euc ARNt isoaccepteurs sont aminoacylés par le même AA mais : o Ont des séq anticodon différentes mais le reste de leur séq primaire identique o Ont une séq anticodon identique mais le reste de leur séq primaire est différente Ne sont pas exprimés au même taux dans les cellules ARNt suppresseurs : - Des ARNt sont dits suppresseurs quand lis reconnaissent et s’hybrident à un codon stop pour incorporer un AA dans la prot en cours de trad La prot ainsi synth sera alors différente dans sa région COOH-terminale de la prot codée par l’ORF de type sauvage ARNt et Aminoacyl-ARNt synthétase (ARS) : reconnaissance cruciale pour la fidélité du code génétique : Une vingtaine d’enzymes distinctes appartenant à cette famille sont produites dans cellules 2 f° importantes : - Reconnaissance spé des ARNt isoaccepteurs d’un même AA Estérification de l’AA à l’extrémité 3’-OH de ces ARNt = aminoacylation Spé de reconnaissance Structure 3D du complexe formé entre ARS de la Gln et l’ARNtGln Contacts : boucle anticodon et bras accepteur ; ATP = moléc jaune Les ARS ont une double spécificité, très étroite pour les 2 substrats : AA et anticodon ARNt complémentaire au codon de cet AA Réaction aminoacylation en 2 étapes - Activation de l’AA par adénylation : formation de l’aminoacyl-AMP AA + ATP AA~AMP + PPi La formation du lien ester, riche en énergie, entre le groupement carboxyle de l’AA et l’hydroxyle 2’ ou 3’ du ribose de l’adénosine terminale (CCA) de l’ARNt AA~AMP + ARNt ARNt~AA + AMP 13 3.01A Bruno Charpentier C) Les ribosomes Structure du ribosome : - - Macro-complexe de type RNP permettant le décodage des ARNm dans une polarité 5’-3’ et la synth des polypeptides Leur structure est conservée dans les 3 domaines du vivant : 2 SU, 2/3 ARN + 1/3 prot Diamètre de 25 nm La structure 3D des 2 SU a été publiée en 2000 Les ARNr snt responsables de principales activités du ribosome : o Ils forment un complexe central compact et architecturent le ribosome o La petite SU contrôle la sélection des ARNt~AA en f° de l’identité des codons présents sur ARNm o L’activité catalytique : le centre peptidyl transférase (PTC) est localisée dans la grande SU au cœur des ARN 23S et 28S Les prot ribosomiques contribuent au maintien de la structure du cœur du ribosome et aux changements de conformation lors de la traduction Les composants du ribosome chez les procaryotes : - Grande SU (LSU) de conste de sédimentation 50S et de PM = 1.6 mégaDa : ARNr 23S + 5S => 34 prot (L1 à L34) Petite SU (SSU) de conste de sédimentation 30S et de PM = 0.9 mégaDa = ARNr 16S => 21 prot (S1 à S21) Les composants du ribosome chez les euc : - Grande SU 60S : ARNr 28S + 5.8S +5S => 49 prot Petite SU 40S : ARNr 18S => 33 prot Un ribosome en cours de traduction Efficacité : euc = 2AA/sec ; procaryotes 10-20AA/sec 14 3.01A Bruno Charpentier Les 4 sites fonctionnels du ribosome : 3 sites de fixation pour les ARNt : - Site A : aminoacyl Site P : peptidyl Site E : Exit Localisés sur les 2 SU Le 4ème site dans la petite SU est formé de la fente dans laquelle coulisse l’ARNm La chaine peptidique naissante sort du tunnel présent dans la grande SU et dont la structure est maintenue par ARNr 23S. La chaine peptidique est liée à ARNt du site P. D) Etapes d’initiation, d’élongation et de terminaison Lors de la traduction, le ribosome va assurer des fonctions cruciales pour la fidélité du décodage - - Initiation : fixation du cadre de lecture, reconnaissance du codon d’initiation (AUG) Elongation : o Spécificité dans la sélection des ARNt aminoacylés (ARNt~AA) en fonction de l’enchainement des codons o Catalyse des liaisons peptidiques entre les AA o Translocation le long de l’ARNm dans une polarité 5’-3’ Terminaison : reconnaissance des codons STOP SCHEMA Il est aidé dans ces activités par des prot à activité GTP-ase : - Prot associées au GTP dans leur forme active Portent une activité GTP-ase (GTP => GDP +Pi) Recyclage par échange GDP => GTP Celles correspondant à des facteurs de traduction interviennent : o Lors de l’initiation, IF2, eIF2, eIF5 o Lors de l’élongation, EF-Tu, EF-G o Lors de la terminaison, RF3 (release factor) Initiation : fixer le cadre de lecture - La 1ère étape du mécanisme de traduction est l’association de la petite SU du ribosome avec ARNm Des mécanismes différents chez les procaryotes et les euc Procaryotes : o Rôle d’une séq située qq nucléotides en amont du codon AUG permet le recrutement de la SU 30S = séq Chine et Dalgarno (SD) incluse dans le RBS (ribosome Binding Site) o La séq SD est complémentaire (sur 3 à 10 nucléotides selon les gènes) à une séq présente dans l’ARNr 16S o Séq consensus pour SD 5’PPP ----AGGAGGUAA—(N)5 à 9—AUG-// STOP---3’OH 15 3.01A Bruno Charpentier SCHEMA cas bactéries et archées Un ARNt spécialisé pour l’initiation de la traduction chez les bactéries - Un ARNt spé (ARNtfMet = ARNt initiateur) aminoacylé par une N-formyl Methionine (N-fMet) reconnait spécifiquement le codon initiateur AUG Un autre Art (ARNtMet = ARNt élongateur) reconnait les codons AUG internes aux ORF lors de l’élongation de la traduction Ces 2 ARNt sont reconnus par la même ARS mais l’ARNtfMet~Met est le seul reconnu par la méthionyl-ARNt formyl transférase permettant de générer l’ARNtfMet~N-fMet SCHEMA Toutes les prot bactériennes portent donc une N-formyl Méthionine à leur extrémité NH2-terminale ? - - - En cours de synth prot, après enchainement des 15 premiers AA, le groupement formyl est enlevé de la plupart des prot par une déformylase La présence d’une fMet à l’extrémité d’une prot sert de discriminant pour le système immunitaire eucaryote (granulocytes => phagocytose) Dans 50% des cas la méthionine peut elle aussi être enlevée par une aminopeptidase Les étapes de l’initiation de la traduction chez les bactéries : mise en place du complexe d’initiation - - 3 facteurs (IF1, IF2, IF3) participent transitoirement au positionnement de la SU 30S et de l’ARNtfMet~fMet au niveau du codon d’initiation AUG. Différents complexes sont préformés : o 30S-IF1-IF3 o (IF2 : GTP) - ARNtfMet~fMet Association de ces complexes avec ARNm => ARNm-(303S-IF1-IF3)-( IF2:GTP)- ARNtfMet~fMet Reconstitution du ribosome : o Association de la SU50S o Libération IF1, IF3 o Hydrolyse GTP et libération IF2 : GDP SCHEMA complexe initiation de la trad Intérêt de tous ces complexes : - Maintien d’un état dissocié des SU 30S et 50S : rôle IF3 L’ARNtfMet~fMet associé à IF2 : GTP est le seul à pouvoir occuper les site P du ribosome => le site A est libre pour accueillir l’ARNt …………. 2 mécanismes possibles chez les eucaryotes : 16 3.01A - Bruno Charpentier Coiffe dépendante (CAP-dependant) = Recrutement de la SU 40S par la coiffe m7Gppp puis glissement de la SU jusqu’à rencontrer un codon AUG IRES dépendant = Mise en place du complexe d’initiation à des sites internes (IRES, Internal Ribosome Entry Site) L’initiation de la traduction dépendante de la coiffe chez les euc : - - Pas de formyl méthionine Pas de séq SD typique comme celle des procaryotes mais présence d’une séq dite kosak Intervention d’un plus grand nombre de facteurs protéique de traduction et forte dépense énergétique Pré complexe d’initiation : [40S-eIF3 + eIF1A] + [ARNtinitMet~Met-eIF2:GTP] => 43S Complexe d’initiation formé au niveau de la coiffe o Recrutement par le biais du complexe multiprotéique eIF4F o eIF4E reconnait spécifiquement la coiffe m7Gppp Scan de la région 5’UTR => hydrolyse d’ATP et arrêt au premier codon AUG rencontré. Libération des facteurs d’initiation, hydrolyse du GTP Recrutement d’un complexe [60S-eIF6, eIF5 :GTP] pour la reconstitution d’un ribosome actif Le site P est occupé par l’ARNtinitMet~Met communication entre les deux extrémités des messagers L’élongation de la traduction : activité peptidyl transférase : - - Les ARNt élongateurs aminoacylés sont associés au facteur EF-Tu :GTP chez les bactéries (EF1αé GTP chez les eucaryotes) Les complexe [ARNt~AA-EF-Tu :GTP] s’associent au site A du ribosome Si l’ARNt correspondant au codon à traduire est incorporé : activation de l’activité GTP-ase => hydrolyse du GTP et libération de EF-Tu :GDP qui sera recyclé en EF-Tu :GTP par échange d GTP avec EF-Ts :GTP Création de la liaison peptidique : attaque nucléophile du groupement NH2 de l’AAN dans le site A sur le groupement carboxyle de la liaison ester reliant l’AAN-1 à l’ARNt dans le site P SCHEMAS 17 3.01A Bruno Charpentier Translocation du ribosome de 3 nucléotides dans le sens 5’=>3’ sur le messager ; need l’intervention du facteur EF-G :GTP et l’hydrolyse de GTP Qui occupe alors les différents sites ? o Site E : un ARNt désacylé o Site P : un ARNt portant la chaine peptidique o Site A : vide L’ARNt désacylé se décroche du site E Recrutement d’un nouvel ARNt aminoacylé dans le site A… SCHEMA Terminaison de la traduction : libération du polypeptide Se déroule quand : un des 3 codons de terminaison apparait dans le site A du ribosome Le site A est alors occupé par un des facteurs de libération (release factors) : o RF1 pour es codons UAA et UAG o RF2 pour les codons UAA et UGZ Puis arrivée de RF3 :GTP, activité GTP-ase Hydrolyse de liaison ester du peptidyl-ARNt présent dans le site P : libération du polypeptide SCHEMA A ce stade, o Le site E est vide o Le site P est occupé par un ARNt désacylé o Le site A occupé temporairement par facteurs RF : libération de RF3 :GDP Fixation du facteur RRF (Ribosome Recycling Factor) dans le site A Ce facteur mime un complexe [ARNt-peptide] afin de leurrer [EF-G :GTP] Translocation Le dernier ARNt désacylé se retrouve dans le site E et se décroche Les SU ribosomiques se dissocient ainsi que le facteur RRF E) Notions de maturation post-traductionnelle et trafic/adressage Ribosomes libres VS polysomes Après étape de terminaison de la traduction, les SU se réassocient soit - Au même messager A un autre messager Sur elles-mêmes, conduisant à des ribosomes libres dans le cytoplasme Un même ARNm est traduit par plusieurs ribosomes, on parle de polysome, chaque ribosome recouvre environ 100 nucléotides du messager Devenir des prot produites : prot chaperonne et reploiement : La prot ne peut guere se structurer quand le chaine peptidique est encore dans le tunnel du ribosome A sa sortie dans le cytoplasme elle adopte sa structure 3D : spontanément ou par action de prot chaperonne 18 3.01A Bruno Charpentier Chez les euc celles qui devront pénétrer à l’intérieur d’organites (mitochondries ou peroxysomes) pourront être prises en charge par des prot chaperonnes qui les maintiendront dans un état déplié pour faciliter leur passage à travers les membranes des organites Comment est assuré l’acheminement des prot prod : (modèle de Blobel) - Comment les prot nouvellement synth arrivent-elles à leur site d’activité ? Comment est effectué leur tri ? Comment traversent-elles les membranes intracellulaires ? Deux grandes voies du trafic des prot : - - Les prot secrétées par des vésicules et les port insérées dans la membrane plasmique sont synth par des ribosomes liés aux membranes du RE (REG). Elles traversent ces membranes par translocation co-traductionnelle Les prot du noyau, des mitochondries, des chloroplastes, des peroxysomes sont synth dans le cytosol des ribosomes libres. Elles pénètrent à l’intérieur des organites par translocation post-traductionnelle Ciblage et translocation co-traductionnelle à travers la membrane du RE : Le peptide signal est clivé par une activité peptidase et la prot est libérée dans le lumen du RE Ciblage et translocation post-traductionnelle : mitochondrie : - - La vaste majorité des prot nécessaires au fonctionnement de la mitochondrie est codée par ADN nucléaire et les prot sont synth dans le cytoplasme sous forme de pré-prot Séq signal présente au sein des pré-prot reconnues par le récepteur TOM présent dans la membrane externe des mitochondries Translocation à travers membrane interne par activité du complexe TIM (insertion du peptide signal de la pré-prot dans le membrane interne par un processus nécessitant un gradient électrochimique de H+ ou hydrolyse d’ATP) Clivage de la séq signal, intervention des chaperonnes Hsp70 ou Hsp90 Ciblage et translocation post-traductionnelle : noyau : - Pas de translocation à travers une membrane mais passage par les pores nucléaire (diamètre =45nm) 19 3.01A - Bruno Charpentier Les prot de petites tailles peuvent y pénétrer par diffusion, celles ayant un poids moléc >20kDa portent une séq dite NLS (nuclear localization signal) pour un transport orienté actif par une importine Devenir des prot prod : maturation-modification : - - Maturation par protéolyse ménagée : o Pré-prot o Pro-prot (pro-hormones…) o Pré-pro-prot Modifications post-traductionnelles : o Phosphorylation par des prot kinases o Formation de ponts di-sulfures o Glycosylations : addition d’une chaine polysaccharidique RE : N-glycosylations (liaisons au NH2 des chaines latérales des asparagines) Golgi : O-glycosylations (liaison au OH des chaines latérales des Ser et Thr) o Ubiquitination, sumoylation : liaison covalente avec prot (lysine) Grande importance de la machinerie de modification : - Expression des gènes : modulation de la demi-vie des prot par ubiquitination Pathologies dues à des déficiences dans la synth des glycoprot o Syndrome CGS (congenital disorders of glycosylation) CDG-La dans laquelle une mutation conduit à la perte de la phosphomannomutase 2, l’enzyme responsable de la conversion du mannose-6-phosphatase en mannose-1-phosphate => perte des précurseurs pour la N-glycosylation des prot o Diabètes, Alzheimer , maladies à prions III) Principe généraux de la régulation de l’expression des gènes La concentration intracellulaire en ARN et prot est la résultante de 2 processus : synth et dégradation A) Régulations transcriptionnelles et post-transcriptionnelles Principes et acteurs généraux de la régulation de l’expression génique Accessibilité à l’ADN de la machinerie de transcription - Modulation de la structure de la chromatine ; contrôle épigénétique B) Facteurs trans et éléments cis SCHEMA - Couple cis/ trans => tout repose dessus (facteur trans se fixe sur élément cis) o Intervention de facteurs agissant en trans = tout produit de gène capable de diffuser dans la cellule et trouver sa cible o Se fixent sur des éléments de séquences nucléotidiques présent en cis sur le gène régulé o Toute mutation au niveau de l’un de ces acteurs peut conduire à la perte de la régulation 20 3.01A - Bruno Charpentier Contrôle positif = facteur trans régulateur = activateur (cas prédominant chez les euc) Contrôle négatif = facteur trans régulateur = répresseur C) Contrôles positifs et négatifs, activateur/ répresseur Schemas contrôle négatif (ici élément cis = opérateur) Schema contrôle positif (élément cis ne doit pas gêner les boites -10 et -35) D) Modulation des contrôles : effecteurs Fixation d’un ligand au facteur trans = molécule effecteur (permet un changement de conformation) SCHEMA Inducteur VS co-répresseur SCHEMAS Exemple de la régulation de l’initiation de la transcription bactérienne - Contrôle positif par induction : CRP-AMPc et l’opéron lactose Contrôle négatif par co-répresseur : répresseur RTrp et l’opéron tryptophane Contrôle négatif par induction : répresseur LacI et l’opéron lactose E) Régulons Notion de régulon et réseaux de régulation Ensemble des gènes régulés par un même facteur trans appartiennent au même régulon Régulation directe VS indirecte => facteur trans peut lui même être régulé Un gène peut être régulé par plusieurs facteurs trans Principes généraux de la régulation post-transcriptionnelle : SCHEMA Repose comme la régulation transcriptionnelle sur des couples éléments cis/ facteurs trans Les facteurs trans peuvent agir en tant qu’activateurs ou répresseurs Des ARN non codant peuvent remplir les fonctions de facteurs trans pour réguler expression génique : notion de riborégulateur F) Riborégulateurs SCHEMA 21
