CES

I. Introduction:
La chromatographie d’exclusion stérique (CES) permet de séparer les molécules suivant leur taille. Elle
utilise pour cela des phases stationnaires qui comportent des pores dans lesquels les composés vont pouvoir
diffuser, plus ou moins suivant leur volume. La vitesse de migration d’un composé va donc dépendre, pour
une même famille de molécules, de sa masse moléculaire. Bien que l’efficacité des séparations n’atteigne
pas celle que l’on observe habituellement en CLHP, la CES est devenue irremplaçable aussi bien dans le
domaine de la séparation des macromolécules naturelles que dans l’étude de la répartition en masses des
polymères de synthèse.
les principales applications se trouvent dans le domaine de l’analyse des polymères, qu’ils soient d’origine
naturelle ou de synthèse. L’absence d’interaction chimique avec la phase stationnaire, associée à une élution
rapide et la récupération totale des analytes, constituent autant d’avantages. La mise au point des analyses
est rapide, sachant aussi qu’on n’utilise pas de gradient d’élution puisqu’il n’y a pas d’interaction
soluté/phase mobile La technique est utile pour analyser les échantillons de composition inconnue,
susceptibles de contenir à la fois des polymères et des petites molécules, ce qui est le cas de nombreux
produits commerciaux ou industriels, tels les produits de biodégradation des polymères.
II. Principe de la Chromatographie d’Exclusion Stérique (CES):
1La chromatographie d’exclusion stérique (CES) est basée sur la différence de pénétration des molécules de
l’échantillon dans la phase stationnaire. Qui est un gel un milieu d’aspect homogène formé par deux phases:
- une phase dispersée qui est la substance solide constituant le substrat du gel
- une phase dispersante qui est le solvant
Le substrat du gel est constitué de petites particules très régulières, grain, billes ou perles parfaitement
calibrées, chaque grain résulte de la liaison de macromolécules assemblées les unes aux autres de façon à
former un ensemble régulièrement réticulé.
Mis en leur présence le solvant pénètre à l’intérieur de chaque particule est provoque leur gonflement. Si
dans ce solvant des substances sont dissoutes, celles dont les molécules sont de tailles inférieures aux
diamètres des mailles du réseau diffusent à l’intérieur des grains de ce gel, alors que les molécules plus
volumineuses restent à l’extérieur.
Donc on peut représenter schématiquement cette technique chromatographie en envisageant une colonne
remplie de gel sur laquelle on dépose une solution renfermant deux types de molécules de dimensions
différentes.

Les plus petites diffusent et se répartissent entre les phases intra et extragranulaires dans des proportions qui
ne dépendent que de leur nature et de celle du gel.
L‘éluant entraine en premier lieu les grosses molécules qui restent dans le liquide extragranulaire, alors que
les petites sont ralenties par leur diffusion à l’intérieur du gel.
la poursuite de l’élution accentue leur séparation et l’ordre de sortie à l’extrémité de la colonne est fonction
de leur taille.
III. INSTRUMENTATION:
Le matériel est comparable à celui qui est employé en CLHP si ce n’est que les colonnes ont des volumes
plus importants. Pour améliorer la résolution il est assez courant de mettre en série deux ou trois colonnes
aux porosités complémentaires. Le détecteur le plus employé est le réfractomètre différentiel. Pour les
polymères, la variation d’indice de réfraction étant généralement indépendante de la masse moléculaire, ce
détecteur est considéré comme universel. D’autres détecteurs sont parfois ajoutés au réfractomètre. Ils sont
basés sur l’absorption lumineuse (détecteur UV) la diffusion de la lumière et la viscosimètre. Ils donnent des
indications complémentaires sur lescomposés séparés.
Caractères et nature des gels :
Les phases stationnaires sont constituées par des polymères réticulés organiques ou minéraux (silices
greffées de substituants hydroxylés), qui se présentent sous forme de grains sphèriques de 3 à 10 µm de
diamètre avec des pores compris entre 4 nm et 200 nm. Ces matériaux, communément appelés gels, doivent
résister à l’effet d’écrasement dû à la pression en tête de colonne et à une température de plus de 100 ◦ C
pour la technologie actuelle.
Les colonnes standards ont une longueur de 30 cm (diamètre interne de 7,5 mm). Leur efficacité N peut
atteindre 105 plateaux/m.

La nature des phases en présence dépend du type de CES :
pour la perméation de gel (GPC) la phase stationnaire la plus courante est un polymère styrène-
divinylbenzèneet la phase mobile un solvant organique). Le tétrahydrofuranne, le benzène, le
trichlorométhane ainsi que le trichlorobenzène (réservé aux polymères de synthèse difficiles à
solubiliser) sont utilisés.
pour la filtration sur gel on utilise des phases stationnaires polyhydroxylées à base d’alcools
polyvinyliques purs ou copolymérisés avec des polyglycérométhacrylates, ou bien des polyacétates de
vinyle). Ces phases portent le nom de gels car elles gonflent en présence des phases mobiles aqueuses.
On fait également appel à des gels de silice poreuse dont la surface est hydrophile (présence du
groupement glycéropropyle [ ≡ Si(CH2)3–O–CH2CH(OH)CH2OH)]). Les phénomènes d’adsorption
sont faibles, même pour les petites molécules. Elles servent pour séparer les bio-polymères (ex.
polysaccharides) ou les macromolécules biologiques (les protéines par exemple), qui exigent une phase
mobile aqueuse.
a. le diamètre des pores :la capacité de gonflement d’un gel sert souvent à caractériser sa porosité c’est la
quantité de solvant capable d’’être adsorbée par gramme de el sec, elle s’exprime par un chiffre d’autant
plus élevé que les mailles sont plus grandes.
Exp:Sephadex G10 quantité d’eau absorbée est 1ml pour 1g de gel sec
Sephadex G200 quantité d’eau absorbée est 20ml pour 1g de gel sec
b. la taille et la forme des particules :elles doivent favoriser au maximum la rapidité des équilibres de
diffusion, il s’agit donc de petites perles de formes sphériques dont la granulométrie est variable selon la
nature des gels et les buts recherchés
Exp:Chom. Classique les Gels Sephadex 40-120 µm, Les Gels d’agarose 60-300 µm
Chrom. Moderne microparticules 10 µm,
b. Consistance:la rigidité est une caractéristique des gels, elle varie selon leur nature et leur degré de
réticulation on distingue :
- les Gels mous dont la capacité de gonflement et les porosités sont les plus grandes.
-les Gels Semi-rigides qui sont les plus couramment utilisés.
- les Gels rigides recherchés lorsque l’on désire opérer avec des débits élevés ou sous forte pression.
c. Inertie:les gels ne doivent pas réagir avec les solvants .
d. l’affinité des gels pour les substances dissoutes:elles doitêtreextrémement réduite afin d’éviter les
phénomenes d’adsorption qui se superposeraient aux phénoménes de diffusion.
Gels de dextrane (dextran) :(commercialisés sous le nom de Sephadex)

LeDextrane est formé de molécules de glucose reliées entre elle par des liaisons α-1,6glucosidiques ainsi
qu’un petit nombre de liaison α-1,3pour obtenir un substrat réticulé, on fait réagit le dextrane en milieu
alcalin avec un réactif bifonctionnel: l’épichlorhydrine du glycérol qui forme avec deux hydroxyles portés
par des chaines différentes des liaisons éther oxyde.
Propriétés:
- Insoluble dans l’eau, mais la présence de nombreux OH les rend particulièrement hydrophiles, ils gonflent
en milieux aqueux et dans des solvants comme l’éthyléneglycol, le diméthylsulfoxyde, le formamide et dans
les mélanges eau-alcool
-sont relativement fragile au : PH, des oxydes
-Ils permettent d’obtenir la séparation de molécule dont la masse moléculaires vont 700 à 800 000
Gels d’agar-agar et d’agarose:
L’agar-agar ou gélose est un polysaccharide extrait d’algues, il serait formé de deux constituants:
-l’agaropectinerenformant des groupements carboxyliques ou sulfuriques.
-l’agarose sudstance non ionique, est un polysaccharide linéaire de D galactose et de 3-6anhydro L-galactose
qui ne contient pas de groupements ionisables
Propriétés:
- très sensible aux solvants organiques, et aux températures élevées
-acceptent tout les solutions salines comme éluant sauf celles renfermant des borates.
-possèdent une porosité beaucoup plus élevée que le Sephadex, permettent la séparation des molécules dont
la masse moléculaires vont 10 000 à 150 millions
Gels de polyacrylamide:(commercialisés sous le nom de Biogel)
Ils sont obtenus par polymérisation de l’amide acrylique en présence d’un amide acrylique bifonctionnel le
N-N' méthyléne bis acrylamide (CH2=CHCONH)2CH2 qui agit comme agent de réticulation.
Propriétés:
-Insoluble dans l’eau, mais gonflent facilement dans les solutions aqueuses car ils ont une forte polarité due
aux nombeux groupements amides.
- ils se présentent sous forme de perles régulières de porosité variable.
-peu résistants aux solutions très acides ou alcalines, ils acquièrent également des propriétés d’échangeurs
d’ions par hydrolyse de certains groupements amide en groupements carboxyle.
-possèdent une porosité variable, ils permettent la séparation des molécules dont la masse moléculaires
vont 200 à 400 000 .

Gels depolystyréne:(commercialisés sous le nom de Styragel)
Ils sont obtenus par la polymérisation de dérivés du vinyl benzène ou styrène en présence d’un agent
réticulant le divinyl benzène.
Propriétés:
-possèdent une porosité élevée
-présentent une rigidité remarquable.
-ils sont livrés sous forme de perles en suspension dans le divinyl benzène ils doivent etre utilisés avec des
solvants non polaire comme toluène ou le chloroforme.
-ils permettent la séparation des substances peu polaires telles les lipides.
IV. Etude Théorique:
a. Coefficient de diffusion:
C’est le rapport de la concentration de la substance dans la phase intragranulaire (phase Stationnaire Cs) et
la concentration de la même substance dans le liquide extragranulaire (phase Mobile CM).
 ,     
Lorsqueles molécules sont totalement exclues de la phase stationnaire Cs=0 donc Kd=0
Lorsqueles molécules diffusent parfaitement, elles se répartissent de manière identique entre les deux
phases: Kd=1
Kd dépende des propriétés physiques de chaque molécule, de leur taille, de leur volume et de leur
masse moléculaire.
   intervention d’un phénoméne adsorption ou échange d’ions.
b. Volume de Rétention ou Volume d’élution:
c’est le volume de solvant recueilli entre le moment ou la substance est déposée au sommet de la colonne et
celui de son apparition à sa concentration maximale dans l’éluant.
VM: est le volume de phase mobile de la colonne, c’est en fait le volume de la phase dispersante, ou volume
interstitiel laissé libre entre les grains du gel.
VP:est le volume de phase stationnaire, c’est-à-dire le volume du liquide se trouvant à l’intérieur des grains,
il dépend essentiellement de leur porosité.
-lorsqu’une molécule ne diffuse pas à l’intérieur des grains, Kd=0 son volum d’élution est:
Le volume total de la colonne est:   
VG:est le volume occupé par le substrat du gel, il est très faible en général par rapport aux deux autres.
- pour une substance qui diffuse totalement Kd=1 et son volume d’élution est inférieur au volume total de la
colonne.   