I. Introduction: La chromatographie d’exclusion stérique (CES) permet de séparer les molécules suivant leur taille. Elle utilise pour cela des phases stationnaires qui comportent des pores dans lesquels les composés vont pouvoir diffuser, plus ou moins suivant leur volume. La vitesse de migration d’un composé va donc dépendre, pour une même famille de molécules, de sa masse moléculaire. Bien que l’efficacité des séparations n’atteigne pas celle que l’on observe habituellement en CLHP, la CES est devenue irremplaçable aussi bien dans le domaine de la séparation des macromolécules naturelles que dans l’étude de la répartition en masses des polymères de synthèse. les principales applications se trouvent dans le domaine de l’analyse des polymères, qu’ils soient d’origine naturelle ou de synthèse. L’absence d’interaction chimique avec la phase stationnaire, associée à une élution rapide et la récupération totale des analytes, constituent autant d’avantages. La mise au point des analyses est rapide, sachant aussi qu’on n’utilise pas de gradient d’élution puisqu’il n’y a pas d’interaction soluté/phase mobile La technique est utile pour analyser les échantillons de composition inconnue, susceptibles de contenir à la fois des polymères et des petites molécules, ce qui est le cas de nombreux produits commerciaux ou industriels, tels les produits de biodégradation des polymères. II. Principe de la Chromatographie d’Exclusion Stérique (CES): 1La chromatographie d’exclusion stérique (CES) est basée sur la différence de pénétration des molécules de l’échantillon dans la phase stationnaire. Qui est un gel un milieu d’aspect homogène formé par deux phases: - une phase dispersée qui est la substance solide constituant le substrat du gel - une phase dispersante qui est le solvant Le substrat du gel est constitué de petites particules très régulières, grain, billes ou perles parfaitement calibrées, chaque grain résulte de la liaison de macromolécules assemblées les unes aux autres de façon à former un ensemble régulièrement réticulé. Mis en leur présence le solvant pénètre à l’intérieur de chaque particule est provoque leur gonflement. Si dans ce solvant des substances sont dissoutes, celles dont les molécules sont de tailles inférieures aux diamètres des mailles du réseau diffusent à l’intérieur des grains de ce gel, alors que les molécules plus volumineuses restent à l’extérieur. Donc on peut représenter schématiquement cette technique chromatographie en envisageant une colonne remplie de gel sur laquelle on dépose une solution renfermant deux types de molécules de dimensions différentes. Les plus petites diffusent et se répartissent entre les phases intra et extragranulaires dans des proportions qui ne dépendent que de leur nature et de celle du gel. L‘éluant entraine en premier lieu les grosses molécules qui restent dans le liquide extragranulaire, alors que les petites sont ralenties par leur diffusion à l’intérieur du gel. la poursuite de l’élution accentue leur séparation et l’ordre de sortie à l’extrémité de la colonne est fonction de leur taille. III. INSTRUMENTATION: Le matériel est comparable à celui qui est employé en CLHP si ce n’est que les colonnes ont des volumes plus importants. Pour améliorer la résolution il est assez courant de mettre en série deux ou trois colonnes aux porosités complémentaires. Le détecteur le plus employé est le réfractomètre différentiel. Pour les polymères, la variation d’indice de réfraction étant généralement indépendante de la masse moléculaire, ce détecteur est considéré comme universel. D’autres détecteurs sont parfois ajoutés au réfractomètre. Ils sont basés sur l’absorption lumineuse (détecteur UV) la diffusion de la lumière et la viscosimètre. Ils donnent des indications complémentaires sur lescomposés séparés. Caractères et nature des gels : Les phases stationnaires sont constituées par des polymères réticulés organiques ou minéraux (silices greffées de substituants hydroxylés), qui se présentent sous forme de grains sphèriques de 3 à 10 µm de diamètre avec des pores compris entre 4 nm et 200 nm. Ces matériaux, communément appelés gels, doivent résister à l’effet d’écrasement dû à la pression en tête de colonne et à une température de plus de 100 ◦C pour la technologie actuelle. Les colonnes standards ont une longueur de 30 cm (diamètre interne de 7,5 mm). Leur efficacité N peut atteindre 105 plateaux/m. La nature des phases en présence dépend du type de CES : pour la perméation de gel (GPC) la phase stationnaire la plus courante est un polymère styrènedivinylbenzèneet la phase mobile un solvant organique). Le tétrahydrofuranne, le benzène, le trichlorométhane ainsi que le trichlorobenzène (réservé aux polymères de synthèse difficiles à solubiliser) sont utilisés. pour la filtration sur gel on utilise des phases stationnaires polyhydroxylées à base d’alcools polyvinyliques purs ou copolymérisés avec des polyglycérométhacrylates, ou bien des polyacétates de vinyle). Ces phases portent le nom de gels car elles gonflent en présence des phases mobiles aqueuses. On fait également appel à des gels de silice poreuse dont la surface est hydrophile (présence du groupement glycéropropyle [≡Si(CH2)3–O–CH2CH(OH)CH2OH)]). Les phénomènes d’adsorption sont faibles, même pour les petites molécules. Elles servent pour séparer les bio-polymères (ex. polysaccharides) ou les macromolécules biologiques (les protéines par exemple), qui exigent une phase mobile aqueuse. a. le diamètre des pores :la capacité de gonflement d’un gel sert souvent à caractériser sa porosité c’est la quantité de solvant capable d’’être adsorbée par gramme de el sec, elle s’exprime par un chiffre d’autant plus élevé que les mailles sont plus grandes. Exp:Sephadex G10 quantité d’eau absorbée est 1ml pour 1g de gel sec Sephadex G200 quantité d’eau absorbée est 20ml pour 1g de gel sec b. la taille et la forme des particules :elles doivent favoriser au maximum la rapidité des équilibres de diffusion, il s’agit donc de petites perles de formes sphériques dont la granulométrie est variable selon la nature des gels et les buts recherchés Exp:Chom. Classique les Gels Sephadex 40-120 µm, Les Gels d’agarose 60-300 µm Chrom. Moderne microparticules 10 µm, b. Consistance:la rigidité est une caractéristique des gels, elle varie selon leur nature et leur degré de réticulation on distingue : - les Gels mous dont la capacité de gonflement et les porosités sont les plus grandes. -les Gels Semi-rigides qui sont les plus couramment utilisés. - les Gels rigides recherchés lorsque l’on désire opérer avec des débits élevés ou sous forte pression. c. Inertie:les gels ne doivent pas réagir avec les solvants . d. l’affinité des gels pour les substances dissoutes:elles doitêtreextrémement réduite afin d’éviter les phénomenes d’adsorption qui se superposeraient aux phénoménes de diffusion. Gels de dextrane (dextran) :(commercialisés sous le nom de Sephadex) LeDextrane est formé de molécules de glucose reliées entre elle par des liaisons α-1,6glucosidiques ainsi qu’un petit nombre de liaison α-1,3pour obtenir un substrat réticulé, on fait réagit le dextrane en milieu alcalin avec un réactif bifonctionnel: l’épichlorhydrine du glycérol qui forme avec deux hydroxyles portés par des chaines différentes des liaisons éther oxyde. Propriétés: - Insoluble dans l’eau, mais la présence de nombreux OH les rend particulièrement hydrophiles, ils gonflent en milieux aqueux et dans des solvants comme l’éthyléneglycol, le diméthylsulfoxyde, le formamide et dans les mélanges eau-alcool -sont relativement fragile au : PH, des oxydes -Ils permettent d’obtenir la séparation de molécule dont la masse moléculaires vont 700 à 800 000 Gels d’agar-agar et d’agarose: L’agar-agar ou gélose est un polysaccharide extrait d’algues, il serait formé de deux constituants: -l’agaropectinerenformant des groupements carboxyliques ou sulfuriques. -l’agarose sudstance non ionique, est un polysaccharide linéaire de D galactose et de 3-6anhydro L-galactose qui ne contient pas de groupements ionisables Propriétés: - très sensible aux solvants organiques, et aux températures élevées -acceptent tout les solutions salines comme éluant sauf celles renfermant des borates. -possèdent une porosité beaucoup plus élevée que le Sephadex, permettent la séparation des molécules dont la masse moléculaires vont 10 000 à 150 millions Gels de polyacrylamide:(commercialisés sous le nom de Biogel) Ils sont obtenus par polymérisation de l’amide acrylique en présence d’un amide acrylique bifonctionnel le N-N' méthyléne bis acrylamide (CH2=CHCONH)2CH2 qui agit comme agent de réticulation. Propriétés: -Insoluble dans l’eau, mais gonflent facilement dans les solutions aqueuses car ils ont une forte polarité due aux nombeux groupements amides. - ils se présentent sous forme de perles régulières de porosité variable. -peu résistants aux solutions très acides ou alcalines, ils acquièrent également des propriétés d’échangeurs d’ions par hydrolyse de certains groupements amide en groupements carboxyle. -possèdent une porosité variable, ils permettent la séparation des molécules dont la masse moléculaires vont 200 à 400 000 . Gels depolystyréne:(commercialisés sous le nom de Styragel) Ils sont obtenus par la polymérisation de dérivés du vinyl benzène ou styrène en présence d’un agent réticulant le divinyl benzène. Propriétés: -possèdent une porosité élevée -présentent une rigidité remarquable. -ils sont livrés sous forme de perles en suspension dans le divinyl benzène ils doivent etre utilisés avec des solvants non polaire comme toluène ou le chloroforme. -ils permettent la séparation des substances peu polaires telles les lipides. IV. Etude Théorique: a. Coefficient de diffusion: C’est le rapport de la concentration de la substance dans la phase intragranulaire (phase Stationnaire Cs) et la concentration de la même substance dans le liquide extragranulaire (phase Mobile C M). 𝐶𝑠 𝐾𝑑 = 𝐶𝑀 , 0 < 𝐾𝑑 < 1 Lorsqueles molécules sont totalement exclues de la phase stationnaire Cs=0 donc Kd=0 Lorsqueles molécules diffusent parfaitement, elles se répartissent de manière identique entre les deux phases: Kd=1 Kd dépende des propriétés physiques de chaque molécule, de leur taille, de leur volume et de leur masse moléculaire. 𝐾𝑑 > 1 intervention d’un phénoméne adsorption ou échange d’ions. b. Volume de Rétention ou Volume d’élution: c’est le volume de solvant recueilli entre le moment ou la substance est déposée au sommet de la colonne et celui de son apparition à sa concentration maximale dans l’éluant. 𝑉𝐸 = 𝑉𝑀 + 𝐾𝑑 × 𝑉𝑝 VM: est le volume de phase mobile de la colonne, c’est en fait le volume de la phase dispersante, ou volume interstitiel laissé libre entre les grains du gel. VP:est le volume de phase stationnaire, c’est-à-dire le volume du liquide se trouvant à l’intérieur des grains, il dépend essentiellement de leur porosité. -lorsqu’une molécule ne diffuse pas à l’intérieur des grains, Kd=0 son volum d’élution est: 𝑉𝐸 = 𝑉𝑀 Le volume total de la colonne est:𝑉𝐸 = 𝑉𝑝 + 𝑉𝑀 + 𝑉𝐺 VG:est le volume occupé par le substrat du gel, il est très faible en général par rapport aux deux autres. - pour une substance qui diffuse totalement Kd=1 et son volume d’élution est inférieur au volume total de la colonne. 𝑉𝐸 = 𝑉𝑝 + 𝑉𝑀 LogMr Kd=0 Exclusion 6 5 0 < 𝐾𝑑 < 1 3 VS VM Kd=1 VE 0 VE Relation entre la masse moléculaire et volume d’élution Volume interstitiel = volume de solvant entre les pores = volume mort Vp = volume poreux = volume de solvant dans les pores Volume total solvant dans la colonne = Vi+ Vp volume d'exclusion totale VI particules de gel de phase stationnaire domaine de perméation sélective Log M volume de perméation totale volume d'élution VI c. Facteur influençant sur la séparation: VP VM V e = VI+ kVP 1. le facteur de sélectivité αs: Représente la différence de comportement des molécules étudiées, il est ici lié à leur taille, dépend de la porosité des gels et surtout de leur uniformité.les faibles différences de diffusion de molécules voisines étant pratiquement compensées par la dimension variable des pores, pour obtenir une bonne sélectivité on recherchera des gels dont les diamètres sont proches de ceux des molécules et dont les porosités sont très homogènes. 2. le facteur de rétention K'B: En chromatographie sur gel est faible, compris entre 0,5et 2 et peut difficilement être amélioré. 𝑉𝑝 𝐾′𝐵 = 𝐾𝑑 𝑉𝑀 ,Kd est au mieux voisin de 1. Ce rapport 𝑉𝑝 𝑉𝑀 dépende de la porosité du gel choisi en fonction de la masse moléculaire des substances à séparer. 3. le nombre de plateau théoriques N: Le nombre de plateaux théorique est modifié par variation de la longueur de la colonne, ou variation du débit de la phase mobile. La longueur de la colonne ne peut être beaucoup allongée, on préfère d’augmenter le nombre des échanges en utilisant un procédé par recyclage qui permet d’obtenir une bonne séparations tout en utilisant des colonnes courts. Pour les petites molécules la constante de diffusion est proche de 1, les équilibres s’instaurent rapidement et sont peu affectés par la vitesse de l’éluant, par contre pour les molécules plus volumineuses dont la diffusion est ralentie, les équilibres mettent plus de temps à s’établir et ceci d’autant mieux que la vitesse de la phase mobile est plus lente: un débit trop rapide augmente la HEPT et diminue l’efficacité. V. Les Applications: Les très nombreuses applications peuvent se répartir en quatre groupes suivants: Les applications de C.E.S. Séparation des molécules de tailles différentes Choisir un gel retient les petites molécules tamisage Séparation des molécules de tailles voisines Détermination de la distribution des masses moléculaires Chromatographie sur gel et chromatographie d’affinité La séparation repose sur les différences souvent faibles des constantes de diffusion Chromatographie l’échantillon sur une colonne étalonnée et sa masse est déduit de son volume d’élution Traitée le gel pour retient les molécules spécifiques par adsorption ou échange d’ions Les gels hydrophiles retient les molécules très polaire
