Cytogénétique humaine Pr H. HARDIZI UPR Biologie Histologie Embryologie Cytogénétique [email protected] 1 Objectifs du cours • Connaître l’aspect morphologique d’un chromosome. • Reconnaître un caryotype normal avec les différents groupes de chromosomes qu’il contient. • Décrire les différentes techniques utilisées en cytogénétique. • Expliquer le principe de l’hybridation In Situ Fluorescente (FISH). • Décrire les anomalies chromosomiques chez l’homme. 2 Cytogénétique - Historique • • • • • • • • 1956 : caryotype humain (46 chromosomes) 1959 : J. Lejeune : 1ère anomalie décrite : trisomie 21 1970 : découverte du banding 1980 : technique des caryotypes en prométaphase (microdélétions) et collaboration avec la biologie moléculaire (localisation génique) 1985 : techniques d ’hybridation in situ fluorescente permettant l’étude des anomalies chromosomiques et la localisation des gènes. 1990 : RT-PCR, CGH, CGH array 2000 : Puces à ADN « microarrays, transcriptome, bioinformatique…. 2010: NGS (Next Generation Sequencing) 3 Les échelles du génome • • • • • • • Génome haploïde : 3x109 pb chromosome 1: 2,5 X 108 pb chromosome X : 1,5x 108 pb chromosome 21 : 5x107 pb une bande : 1 -2 x107 pb une sous-bande : 1 à 5x106 pb un centimorgan : 1x106 pb • YAC : 1x106 à 5x104 pb • • • • fragment cloné dans un cosmide : 5x104 pb gène moyen : 2x104 pb exon : 0,5 - 1 x103 pb nucléotide : 1pb Cytogénétique Cytogénétique moléculaire Génétique Génétique moléculaire ADN - les différentes échelles GENES CHROMOSOMES GENOME HUMAIN Hybridation in situ CGH Clonage M-FISH Cytogénétique conventionnelle PCR Champ pulsé Southern blot Séquence 103 104 105 Cartographie génique 106 107 108 Complémentarité 109 Introduction • Étude morphologique du matériel chromosomique se présentant sous la forme de chromosomes dans les cellules des eucaryotes. 6 Introduction • L ’étude du caryotype correspond au dénombrement et à l ’identification de tous les chromosomes. • Cellules en métaphase (prophase). • Anomalies de nombre et anomalies de structure 7 Introduction • Technique de cytogénétique conventionnelle: réalisation du caryotype (Vision globale de l’ensemble des chromosomes) • Technique de cytogénétique moléculaire : techniques d’hybridation in situ en fluorescence • Biologie moléculaire : analyse ciblée sur un gène donné 8 Qu’est ce qu’un chromosome? 9 10 Chromosome = une molécule d ’ADN + protéines Les chromosomes servent de support à l ’information génétique 11 • Nombre de chromosomes par cellule caractéristique d ’une espèce • Chez l ’homme 46 chromosomes • (2 jeux haploïdes de 23 chromosomes) 12 • Chromosomes visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire • Forme la plus condensée que peut prendre une molécule d’ADN • Cette condensation empêche toute transcription des gènes mais permet une ségrégation correcte des molécules entre 2 cellules filles au cours des divisions cellulaires 13 14 15 Les différentes étapes de la mitose (1) Les différentes étapes de la mitose (2) Cytogénétique - définitions • Cytogénétique : étude morphologique du matériel génétique se présentant sous forme de chromosomes (corps colorés) dans les cellules eucaryotes – conventionnelle • étude morphologique des chromosomes (nombre et structure - ADN condensé) – moléculaire • métaphasique : organisation des gènes / chromosomes • interphasique (ADN décondensé, domaines chromosomiques 18 19 Cytogénétique - définitions • Caryotype : identification et dénombrement de tous les chromosomes d’une cellule bloquée au stade métaphase (parfois pro-métaphase) du cycle cellulaire. 20 21 22 Centromère • Constriction primaire • Structure complexe • Sépare en 2 le chromosome : – bras court p – Bras long q – Index centromérique = p/p+q 23 Centromère • Étroitement lié à une structure protéique: le kinétocore sur lequel s’insère les fibres fusoriales lors de la métaphase • Ce complexe joue un rôle essentiel dans la séparation des chromosomes) 24 25 Centromère • Dernière région chromosomique à se scinder au moment de l’anaphase. 26 Centromère • Sur le plan moléculaire : il est composé de séquences d’ADN répétées en tandem un grand nombre de fois sans rôle de transcription connu. 27 28 Télomères • Maintiennent l’intégrité des chromosomes. • Constitué d’une séquence de 6pb 5’TTAGGG3’ longueur 2 à 30 kb. 29 Télomères • Le nombre de répétitions diminue avec l’âge. • Rôle fondamental de stabilisation et de protection du génome. 30 31 Techniques d ’obtention des préparations métaphasiques • Chromosomes visibles que pendant une courte période du cycle cellulaire : division. • Toutes les techniques visent à obtenir un maximum de cellules bloquées à ce stade. • Cellules en multiplication active soit spontanément soit par une culture. 32 Prélèvements • Sang • Fibroblastes • Cellules amniotiques, villosités choriales, sang fœtal • Moelle osseuse • Tissu tumoral ou ganglionnaire 33 Prélèvements • Cellules à haut index mitotique: • Cellules du trophoblaste • Cellules de la moelle sanguine et cellules cancéreuses • Cellules à bas index mitotique: • Lymphocytes sanguins • Cellules amniotiques 34 Indication du caryotype 35 Indication du caryotype 36 Indication du caryotype 37 38 39 Techniques avant obtention de caryotype 40 Prélèvements • Sang • Fibroblastes • Cellules amniotiques, villosités choriales, sang fœtal • Moelle osseuse • Tissu tumoral ou ganglionnaire 41 Prélèvement 42 Prélèvement 43 Prélèvement 44 Prélèvement 45 Culture cellulaire •Stérilité +++ •Milieu de culture stérile avec des antibiotiques et antifungiques. 46 Culture cellulaire •Milieu de culture : milieu synthétique enrichi en sels minéraux, glucose et acides aminés auquel on additionne du sérum de veau fœtal. 47 Culture cellulaire Temps de culture variable en fonction de : • Type cellulaire • La quantité du matériel biologique. 48 Sang :caryotype constitutionnel • Sang total + milieu de culture • phytohémaglutinine (stimulation des lymphocytes T) • 72 heures à l ’étuve 49 Sang et moelle : hémopathies malignes • Rincer les cellules dans du milieu de culture puis centrifugation • récupération de l ’anneau des cellules mononuclées 50 Sang et moelle : hémopathies malignes • numération cellulaire • mise en culture en flacon • +/- mitogènes (en fonction de la pathologie) 51 52 53 54 Tissus solides • Dilacération du fragment dans une boite stérile avec un milieu de culture. 55 Tissus solides • Dilacération du fragment dans une boîte stérile avec un milieu de culture. 56 Tissus solides • numération des cellules du surnageant. • mise en culture en flacon Falcon. • surveillance quotidienne au microscope inversé. 57 Tissus solides 58 59 Les cellules du liquide amniotique • Cellules fœtales : peau, appareils respiratoire, digestif et urinaire • Membrane amniotique • Cellules trophoblastiques • Cellules maternelles • Culture nécessite 2-3 semaines. 60 61 Cultures cellulaires • • • • Air enrichi en CO2 pH compris entre 7.2 et 7.4 Température stable de 37°C Temps de culture variable en fonction du prélèvement – 72h pour caryotype constitutionnel – 24 à 96h pour le sang et la moelle – 1 à plusieurs jours pour les autres tissus 62 63 Arrêt de la culture • Agent bloquant du fuseau mitotique (colchicine ou sulfate de vinblastine) • Permet de bloquer les cellules en métaphase (empêchant la progression de la cellule vers l’anaphase) 64 65 Choc hypotonique Indispensable à l ’obtention d ’un étalement correct des chromosomes • KCl ou MgCl2 • éclatement des membranes cellulaires et dispersion des chromosomes 66 Fixation des préparations métaphasiques • 3 fixations avec un mélange éthanol/acide acétique • on obtient un culot de cellules fixées que l ’on remettra en suspension pour l ’étape suivante : étalement sur lame 67 Etalement des préparations chromosomiques sur lame Faire tomber une ou 2 gouttes de suspension cellulaire sur une lame 68 étape dépendantes des conditions atmosphériques enceinte thermostable 69 L ’étalement a pour but d ’obtenir des métaphases avec des chromosomes bien séparés et non réfringents 70 Technique de coloration des chromosomes métaphasiques 1/ TK directe Giemsa permet de compter les chromosomes classement en fonction de: • la taille et de • l ’index centromérique 71 72 Dénaturation des préparations chromosomiques • Les préparations sont ensuite dénaturées afin d’obtenir la visualisation de bandes sur les chromosomes. • Ces techniques sont basées sur le principe de la dénaturation de l’ADN par la chaleur ou les agents chimiques (trypsine). • Permet la mise en évidence d’une striation en bandes transversales ( alternance de bandes sombres et de bandes claires). • Puis on colore les lames au Giemsa. 73 74 75 Technique de dénaturation des chromosomes métaphasiques 1/ Techniques de dénaturation: Bandes G • coloration au Giemsa après dénaturation à la trypsine • avantage : technique rapide • inconvénients : les télomères apparaissent peu colorés 76 77 Technique de coloration des chromosomes métaphasiques 2/ Techniques de dénaturation: Bandes R • coloration au Giemsa après dénaturation thermique en milieu salin à pH déterminé • résultat en négatif des bandes G. • avantage : les télomères sont bien colorés. • inconvénients : technique longue et dépendante de nombreux paramètres. 78 79 Chromosome 4 Bandes G Bandes R 80 81 Observation au microscope • Visualisation des lames au microscope optique • 20 métaphases au moins sont photographiées et analysées • Logiciel de saisie d'image et logiciel d ’analyse 82 83 Aperçu au microscope objectif 10 x Aperçu au microscope objectif 100x Classement du caryotype Caryotype humain : 46 chromosomes • autosomes : 1 au 22 • gonosomes: X et Y – femme : 46,XX – homme : 46,XY 86 87 88 Classement du caryotype Index centromérique rapport p/(p+q) • chromosomes métacentriques – IC=0.5 (chr 1,3,16,19,20) • chromosomes submétacentriques – IC=0.4 (chr 2,6,7,X,8,9,10,11,12) • chromosomes subtélocentriques – IC=0.2 (chr 4,5,17,18,Y) • chromosomes acrocentriques – (chr 13,14,15,21,22) 89 Subtélocentriqu ese 90 Classement du caryotype • • • • • • • Groupe A : 1, 2, 3 Groupe B : 4, 5 Groupe C : 6 à 12, X Groupe D : 13, 14, 15 Groupe E : 16, 17, 18 Groupe F :19, 20 Groupe G :21, 22, Y 91 92 Classement des chromosomes • Fonction de leur taille • de leur index centromérique • de la reconnaissance après marquage de chaque chromosome : nombre et répartition des bandes spécifique à chaque paire chromosomique => Nomenclature internationale définit pour chaque chromosome des régions chromosomiques qui comporte des bandes et des sous-bandes A retenir 93 94 21 q 22.3 N°chromosome bras région: 1 - 4 bande sous-bande 95 Limites du caryotype • Difficulté d ’obtention de métaphases pathologiques en raison du faible indice de prolifération du clone malin (cancérologie) • Nombre important de métaphases normales résiduelles (maladie résiduelle)(cancérologie) Limites du caryotype • Problèmes de résolution : – Anomalies parfois non visibles, de taille inférieure au seuil de résolution de la cytogénétique – Mauvaise qualité des métaphases obtenues Cytogénétique - définitions • Cytogénétique : étude morphologique du matériel génétique se présentant sous forme de chromosomes (corps colorés) dans les cellules eucaryotes – conventionnelle • étude morphologique des chromosomes (nombre et structure - ADN condensé) – moléculaire • métaphasique : organisation des gènes / chromosomes • interphasique (ADN décondensé, domaines chromosomiques 98 Les échelles du génome • • • • • • • Génome haploïde : 3x109 pb chromosome 1: 2,5 X 108 pb chromosome X : 1,5x 108 pb chromosome 21 : 5x107 pb une bande : 1 -2 x107 pb une sous-bande : 1 à 5x106 pb un centimorgan : 1x106 pb • YAC : 1x106 à 5x104 pb • • • • fragment cloné dans un cosmide : 5x104 pb gène moyen : 2x104 pb exon : 0,5 - 1 x103 pb nucléotide : 1pb Cytogénétique Cytogénétique moléculaire Génétique Génétique moléculaire ADN - les différentes échelles GENES CHROMOSOMES GENOME HUMAIN Hybridation in situ CGH Clonage M-FISH Cytogénétique conventionnelle PCR Champ pulsé Southern blot Séquence 103 104 105 Cartographie génique 106 107 108 Complémentarité 109 Intérêt de la cytogénétique moléculaire 101 Principes de la cytogénétique moléculaire 102 103 Intérêt FISH : défaut de résolution de la cytogénétique conventionnelle Cytogénétique conventionnelle : 22 apparemment normaux Cytogénétique moléculaire : Délétion interstitielle 22q11.2 Syndrome de Di George - microdélétion 22qter vert (contrôle) DGCR2-Tuple rouge Intérêt FISH : caractérisation précise d ’un remaniement identifié en cytogénétique conventionnelle DXZ1 vert Les différentes classes de sondes Hybridation in situ fluorescente interphase Chromosome Bras Peinture interphase Centromère Subtélomère Gènes A connaître FISH - les différentes sondes Hybridation in situ fluorescente FISH Sonde locus spécifique: centromère, télomère, interstitielle. 108 Peinture chromosomique 109 110 Territoires chromosomiques 111 FISH 24 couleurs Marquage combinatoire • Position stable d’un chromosome au sein du noyau • Voisins variables – En fonction des types cellulaires – Variable pour un même type cellulaire – Association préférentielle avec hétérologues 112 CGH-array • Hybridation génomique comparative (CGH): • Permet de détecter les variations du nombre de copies dans l’ADN. • Mélange équimolaire d’ADN témoin et d’ADN patient. 113 Principe de la CGH ou ACPA • Hybridation sur un support avec effet de compétitivité permettant de détecter les excès ou défaut d’ADN patient par rapport au témoin. 114 CGH-array • Hybridation sur un support avec effet de compétitivité permettant de détecter les excès ou défaut d’ADN patient par rapport au témoin. 115 CGH-array • Également appelée ACPA (analyse chromosomique par puce à ADN. • Utilise en même temps de nombreuses sondes spécifiques du génome. • Sondes pouvant représenter tout ou une partie du génome, résolution variable en fonction du nombre et position des sondes. • Obtention de spots couleur pour chaque sonde. 116 CGH-array • La détection du désordre est réalisée à l’aide d’un automate car l’analyse du marquage est difficile à l’oeil nu. • Chaque sonde est reliée à une position chromosomique. 117 CGH-array • Les résultats sont compilés sur un caryogramme, faisant apparaitre les sondes ayant reconnu leur cible (patient ou témoin) autour d’une ligne de base. 118 CGH-array • La ligne de base est déterminée selon le ratio de fluorescence de chacun des ADN marqués. • Pour un résultat normal, il y a à la fois des sondes témoins et patients autour de la ligne de base. 119 CGH-array Pour une délétion: • les sondes vertes sont en défaut, au profit des sondes rouges. • Il y a alors selon l’algorithme utilisé un décalage par rapport à la ligne de base vers la gauche. 120 CGH-array Pour une duplication: • compétitivement les sondes rouges sont en excès et il y a un décalage vers la droite de la ligne de base. 121 122 123 Principe de l’ACPA Pas de culture, pas de chromosome ADN témoin ADN patient Hybridation Sur des oligonucléotides 1 copie / 2 copies + → 3 copies / 2 copies Principe de l’ACPA Pas de culture, pas de chromosome ADN témoin ADN patient Hybridation Sur des oligonucléotides 1 copie / 2 copies + Log2 -1 → 3 copies / 2 copies Log2 +0,58 Variations du nombre de copie CNV Principe de l’ACPA Sur le chromosome X : calcul différent Garçon contre Garçon ADN témoin ADN patient Hybridation Sur des oligonucléotides 0 copie / 1 copie + Log2 -infini → 2 copies / 1 copie Log2 +1 Variations du nombre de copie CNV Principe de l’ACPA Sur le chromosome X : calcul différent Garçon contre Fille ADN témoin ADN patient Hybridation Sur des oligonucléotides 0 copie / 2 copies + Log2 -infini → 2 copies / 2 copies Log2 0 Variations du nombre de copie CNV FIN 128
