Chez le même éditeur Guide des analyses en immunologie – Indications, critères de réalisation et limites, par l’Association des enseignants d’immunologie (ASSIM) et la Société française d’immunologie (SFI), 2014, 284 pages. Immunologie fondamentale et immunopathologie – Enseignements thématique et intégré - Tissu lymphoïde et sanguin / Immunopathologie et immuno-intervention, par le Collège des enseignants d’immunologie, 2013, 280 pages. Guide des analyses en hématologie Coordination : Pr Marie Christine Béné CHU et Faculté de médecine de Nantes Co-coordination anomalies érythrocytaires : Pr Patricia Martinez-Aguilar CHU et Faculté de médecine, Montpellier Co-coordination hémostase Dr Dominique Lasne AP-HP Hôpital Necker-Enfants Malades, Paris Co-coordination immuno-hématologie Pr France Pirenne EFS Île-de-France Sous l’égide de la Commission de biologie de la Société française d’hématologie Animateurs Pr Valérie Ugo CHU et Faculté de médecine d’Angers Pr Anne-Marie Fischer HEGP et Faculté de médecine Paris-Descartes Pr Nadine Ajzenberg Hôpital Bichat et Faculté de médecine Paris-Diderot Pr Claude Preudhomme CHRU et Faculté de médecine de Lille et du Collège national des enseignants d’hématologie, Société française d’hématologie Président Pr Marc Maynadié CHU et Faculté de médecine de Dijon Elsevier Masson SAS, 65, rue Camille-Desmoulins, 92442 Issy-les-Moulineaux cedex, France Guide des analyses en hématologie de la Société française d’hématologie. © 2018 Elsevier Masson SAS ISBN : 978-2-294-75359-6 e-ISBN : 978-2-294-75428-9 Tous droits réservés. Les indications et posologies de tous les médicaments cités dans ce livre ont été recommandées dans la littérature médicale et concordent avec la pratique de la communauté médicale. Elles peuvent, dans certains cas particuliers, différer des normes définies par les procédures d’AMM. De plus, les protocoles thérapeutiques pouvant évoluer dans le temps, il est recommandé au lecteur de se référer en cas de besoin aux notices des médicaments, aux publications les concernant et à l’Âgence du médicament. L’auteur et l’éditeur ne sauraient être tenus pour responsables des prescriptions de chaque médecin. Tous droits de traduction, d’adaptation et de reproduction par tous procédés, réservés pour tous pays. Toute reproduction ou représentation intégrale ou partielle, par quelque procédé que ce soit, des pages publiées dans le présent ouvrage, faite sans l’autorisation de l’éditeur est illicite et constitue une contrefaçon. Seules sont autorisées, d’une part, les reproductions strictement réservées à l’usage privé du copiste et non destinées à une utilisation collective et, d’autre part, les courtes citations justifiées par le caractère scientifique ou d’information de l’œuvre dans laquelle elles sont incorporées (art. L. 122-4, L. 122-5 et L. 335-2 du Code de la propriété intellectuelle). Ce logo a pour objet d’alerter le lecteur sur la menace que représente pour l’avenir de l’écrit, tout particulièrement dans le domaine universitaire, le développement massif du « photo-copillage ». Cette pratique qui s’est généralisée, notammentdans les établissements d’enseignement, provoque une baisse brutale des achats de livres, au point que la possibilité même pour les auteurs de créer des œuvres nouvelles et de les faire éditer correctement est aujourd’hui menacée. Nous rappelons donc que la reproduction et la vente sans autorisation, ainsi que le recel, sont passibles de poursuites. Les demandes d’autorisation de photocopier doivent être adressées à l’éditeur ou au Centre français d’exploitation du droit de copie : 20, rue des Grands-Augustins, 75006 Paris. Tél. 01 44 07 47 70. Contributeurs Nadine Ajzenberg, AP-HP, CHU hôpital Bichat, Paris. Lydie Da Costa, AP-HP, CHU hôpital Robert Debré, Paris. Marie-Christine Alessi, AP-HM, CHU La Timone, Marseille. Luc Darnige, AP-HP, CHU hôpital européen Georges Pompidou, Paris. Martine Alhenc- Gelas, AP-HP, CHU hôpital européen Georges Pompidou, Paris. Frédéric Davi, AP-HP, CHU hôpital de la PitiéSalpêtrière, Paris. Véronique Baccini, CHU de Pointe-à-Pitre. Emmanuel De Maistre, CHU de Dijon. Anne Bauters, CHU de Lille. Emmanuelle De Raucourt, AP-HP, CHU hôpital Beaujon, Clichy. Marie-Christine Béné, CHU de Nantes. Sébastien Bertil, AP-HP, CHU hôpital européen Georges Pompidou, Paris. Odile Blanchet, CHU d’Angers. Élodie Boissier, CHU de Nantes. Marie- Charlotte Bourrienne, AP-HP, CHU hôpital Bichat, Paris. Anne Bouvier, CHU d’Angers. Leyla Calmette, AP-HP, CHU, hôpital Ambroise Paré, Boulogne-Billancourt. Laurence Camoin, AP-HM, CHU La Timone, Marseille. Claudine Caron, CHU de Lille. Jean Michel Cayuela, AP-HP, CHU hôpital Saint–Louis, Paris. Jacques Chiaroni, EFS Provence-Alpes-Côted’Azur-Corse. Emmanuelle Clappier, AP-HP, CHU hôpital Robert Debré, Paris. Pascale Cornillet-Lefebvre, CHU de Reims. Nathalie Couque, AP-HP, CHU hôpital Robert Debré, Paris. Laure Croisille, EFS Créteil. Bénédicte Delahousse, CHU hôpital Trousseau, Tours. Maxime Delrue, AP-HP, hôpital Lariboisière, Paris. Céline Desconclois, CHU, hôpital Antoine Béclère, Clamart. Bernard Drenou, CH de Mulhouse. Georges Jourdi, AP-HP, CHU hôpital Cochin, Paris. Marion Éveillard, CHU de Nantes. Pascale Flandrin Gresta, CHU de Saint-Étienne. Claire Flaujac, CH de Versailles. Michaela Fontenay, AP-HP, CHU hôpital Cochin, Paris. Loïc Garçon, CHU d’Amiens. Pascale Gaussem, AP-HP, CHU hôpital européen Georges Pompidou, Paris. Muriel Giansily-Balizot, CHU de Montpellier. Stéphane Giraudier, AP-HP, CHU hôpital Saint-Louis, Paris. Isabelle Gouin, CHU de Rennes. Jean Christophe Gris, CHU de Nîmes. XII Contributeurs Yves Gruel, CHU hôpital Trousseau, Tours. France Pirenne, EFS Île-de-France. Michel Hanss, hospices civils, CHU de Lyon. Serge Pissard, AP-HP, CHU Henri Mondor, Créteil. Nathalie Hézard, AP-HM, CHU La Timone, Marseille. Claire Pouplard, CHU hôpital trousseau, Tours. Marie-Françoise Hurtaud, AP-HP, CHU hôpital Robert Debré, Paris. Annabelle Prado-Dupont, CHU de Lille. Emmanuelle Jeanpierre, CHU de Lille. Valérie Proulle, AP-HP, CHU Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre. Philippe Joly, CHU de Lyon. Claude Preudhomme, CHU de Lille. Olivier Kosmider, AP-HP CHU hôpital Cochin, Paris. Antoine Rauch, CHU de Lille. Dominique Lasne, AP-HP, CHU hôpital Necker-Enfants malades, Paris. Anne Ryman, CHU de Bordeaux. Élodie Lainey, AP-HP, CHU hôpital Robert Debré, Paris. Nicolas Le Chevallier, CHU de Bordeaux. Maïlys Le Guyader, CHU d’Amiens. Éric Lippert, CHU de Brest. Laurent Macchi, CHU de Poitiers. Elizabeth MacIntyre-Davi, AP-HP, CHU hôpital Necker-Enfants malades, Paris. Patricia Martinez, CHU de Montpellier. Lætitia Mauge, AP-HP, CHU hôpital européen Georges Pompidou, Paris. Sophie Raynaud, CHU de Nice. Marie-Hélène Schlageter, AP-HP, CHU hôpital Saint-Louis, Paris. Gérard Sébahoun, hôpital européen, Marseille. Pierre Sié, CHU, hôpital Rangueil, Toulouse. Virginie Siguret, AP-HP, CHU hôpital Lariboisière, Paris. Alain Stépanian, AP-HP, CHU hôpital Lariboisière, Paris. Pierre Suchon, AP-HM, CHU La Timone, Marseille. Sophie Susen, CHU de Lille. Brigitte Tardy, CHU de Saint-Étienne. Pierre Morange, AP-HM, CHU La Timone, Marseille. Catherine Ternisien, CHU de Nantes. Philippe Nguyen, CHU de Reims. Agnès Veyradier, AP-HP, CHU hôpital Lariboisière, Paris. Florence Nguyen Khac, AP-HP, CHU hôpital de la Pitié-Salpêtrière, Paris. Pierre Toulon, CHU de Nice. Christophe Zawadzki, CHU de Lille. Abréviations 2 HG 2,3-DPG ACC ACD aCL ADAMTS13 2 Hydroglutarate 2,3-diphosphoglycérate Anticoagulant circulant Anemia of Chronic Disease Anticorps anti-cardiolipine A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats, member 13 AFC Association française de cytométrie AH Anémie hémolytique AHAI Anémie hémolytique auto-immune Allo-SCT Allogeneic Stem Cell Transplantation ANSM Agence nationale de sécurité du médicament et des produits de santé AOD Anticoagulant oral direct Apl Anticorps antiphospholipide ARN Acide ribonucléique AT Antithrombine AVWS Acquired von Willebrand syndrome BCR B-Cell Receptor BTK Bruton Tyrosine Kinase CALR Calréticuline CCMH Concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine CD Cluster of differentiation CDAII Congenital Dyserythropoietic Anemia type 2 CDR3 3 Complementarity Determining Region CFU-GEMM Colony Forming Unit-Granulocyte CGR Concentré de globules rouges CHIP Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential CIVD Coagulation intravasculaire disséminée CMF Cytométrie en flux CNGOF Collège national des gynécologues et obstétriciens français CNRHP Centre national de référence en hémobiologie périnatale CNV Copy Number Variation CSP Cellule souche périphérique CSTf CTAD CV DDi DdPCR DImax DLI DRVVT EC ECAT EDTA ELN EMA EPO ERIC ESLHO EVTE FFPE Fg FISH FLIPI FT FVIII:C GAT GBMHM GEIL GFHC GFHT GIFT GIHP GPI GPIb Coefficient de saturation de la transferrine Citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole Coefficient de variation D-Dimères Digital droplet PCR Index de déformabilité maximale Donor Lymphocyte Infusion Test au venin de vipère Russel dilué Électrophorèse capillaire External quality control of diagnostic assays and tests Éthylène diamine tétra-acétique European LeukemiaNet Éosine MAléimide Érythropoïétine European Research Initiative on CLL European Scientific Foundation of Hemato-Oncology Évènement veineux thromboembolique Formalin Fixed Paraffin Embedded Fibrinogène Fluorescence In Situ Hybridization Follicular Lymphoma International Prognostic Index Facteur tissulaire Facteur VIII coagulant Granulocyte Agglutination Test Groupe de biologie moléculaire des hémopathies malignes Groupe d’étude immunologique des leucémies Groupe francophone d’hématologie cellulaire Groupe français d’étude sur l’hémostase et la thrombose Granulocyte Immunofluorescence Test Groupe d’intérêt en hémostase périopératoire Glycosyl-phosphatidyl-inositol Glycoprotéine Ib plaquettaire XIV GR GS HAS Hb HbS HBS HbF HBPM HMW HNA HNF HPA HPLC HPN HRM IAC IG IGH IGHV IGK IGL INR IPSS IRP KHPM LA LAL LBA LCM LCR LF LLC LMC LMCa LMMC LNC LYSA MAIGA MAIPA MAT Abréviations Globule rouge Groupe sanguin Haute autorité de santé Hémoglobine Hémoglobine S Heparin Binding Site (site de liaison à l’héparine) Hémoglobine fœtale Héparines de bas poids moléculaire High Molecular Weight (haut poids moléculaire) Human Neutrophil Antigens Héparine non fractionnée Human Platelet Antigens Chromatographie liquide haute pression Hémoglobinurie paroxystique nocturne High Resolution Melting Indice d’anticoagulant circulant Immunoglobuline Gène de chaîne lourde des immunoglobulines Gène de chaîne lourde des immunoglobulines, domaine variable Gène de chaîne légère kappa Gène de chaîne légère lambda International Normalized Ratio International Prognostic Scoring System Index de réactivité plaquettaire Kininogène de haut poids moléculaire Lupus anticoagulant Leucémie aiguë lymphoblastique Lavage broncho-alvéolaire Lymphome à cellules du manteau Liquide céphalo-rachidien Lymphome folliculaire Leucémie lymphoïde chronique Leucémie myéloïde chronique Leucémie myéloïde chronique atypique Leucémie myélomonocytaire chronique Leucémie neutrophile chronique LYmphoma Study Association Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Granulocyte Antigens Monoclonal Antibody-specific Immobilization of Platelet Antigens Microangiopathie thrombotique MCL MGG MK MLPA MM MRD MTEV MYH9 NASDA NFS NGS NK NMP NP NTBI PCME PCR PDF PE PFA PHHF PIVKA PK PL PLG PML PPP PRP PS PTI PTT PV Q-PCR RAI RCP RCP RIPA RMM Mantle Cell Lymphoma May-Grünwald Giemsa Mégacaryocytes MK Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification Myélome multiple Minimal Residual Disease ou Measurable Residual Disease (maladie résiduelle) Maladie thromboembolique veineuse Myosin Heavy chain 9 Naphtol ASD acétate estérase Numération formule sanguine Next Generation Sequencing (séquençage haut débit) Natural Killer Néoplasie myéloproliférative Numération plaquettaire Non-Transferrin Bound Iron Pathologie constitutionnelle de la membrane érythrocytaire Polymerase Chain Reaction Produit de dégradation de la fibrine Phycoérythrine Platelet Function Analyzer Persistance héréditaire d’hémoglobine fœtale Protein Induced by Vitamin K Prékallicréine Phospholipide Plasminogène ProMyelocytic Leukemia Plasma pauvre en plaquettes Plasma riche en plaquettes Protéine S Purpura thrombopénique idiopathique Purpura thrombotique thrombocytopénique Polycythemia Vera Polymerase Chain Reaction Quantitative Recherche d’agglutinines irrégulières Résumés et caractéristiques du produit Réunion de concertation pluridisciplinaire Ristocetin Induced Platelet Aggregation (Agrégation plaquettaire induite par la Ristocétine) Réponse moléculaire majeure RPT RSTf SAO SAPL SBS SCA SFH SFNV SH SHU SLP SM SMD SMP SMYH9 SNP SRA SSC TAFI TCA TCK TCMH TCR Réaction post-transfusionnelle Récepteur soluble de la transferrine Ovalocytose mélanésienne Syndrome des antiphospholipides Syndrome de Bernard Soulier Syndrome coronarien aigu Société française d’hématologie Société française neuro-vasculaire Sphérocytose héréditaire Syndrome hémolytique urémique Syndrome lymphoprolifératif Spectrométrie de masse Syndrome myélodysplasique Syndrome myéloprolifératif Syndrome MYosin Heavy chain 9 Single Nucleotide Polymorphism Serotonin Release Assay (test de libération de la sérotonine radiomarquée) Side SCatter Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor Temps de céphaline avec activateur Temps de céphaline kaolin Teneur corpusculaire moyenne en hémoglobine T-cell Receptor (récepteur à l’antigène des lymphocytes T) Abréviations TDA TE TFPI TGMH TIH t-PA TPO TQ TRALI TT USS VASP VGM VPM VWD VWF VWF:Act VWF:Ag VWFpp Test direct à l’antiglobuline Thrombocythémie essentielle Tissue Factor Plasma Inhibitor Teneur globulaire moyenne en hémoglobine Thrombopénie induite par l’héparine Tissue Plasminogen Activator/ Activateur tissulaire du plasminogène Thrombopoïétine Temps de Quick Transfusion Related Acute Lung Injury Temps de thrombine Syndrome d’Upshaw-Schulman Vasodilatator Stimulated Phosphoprotein Volume globulaire moyen Volume plaquettaire moyen Von Willebrand Disease (maladie de Willebrand) Von Willebrand Factor (facteur von Willebrand) Facteur Willebrand activité Facteur Willebrand antigène Propeptide du facteur von Willebrand XV Chapitre 1 Cytologie Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 4 Cytologie : tests généraux Fiche 1.1 Hémogramme Code NABM 1104 Signification biologique du paramètre L’hémogramme est une ponction de sang veineux ou capillaire réalisée sur anticoagulant EDTA. L’hémogramme permet l’analyse quantitative et qualitative des éléments figurés du sang (hématies, plaquettes et globules blancs). Pour la lignée érythrocytaire, il mesure l’hématocrite (en %), le nombre de globules rouges (en Tera [1012] par litre), le taux d’hémoglobine (en g/dL ou en g/L), le volume globulaire moyen (VGM, en fL), la teneur globulaire (ou corpusculaire) moyenne en hémoglobine (TGMH ou TCMH, en pg/cellule, qui correspond à la masse moyenne d’hémoglobine présente dans un globule rouge [hémoglobine divisée par le nombre d’érythrocytes]), la concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (CCMH en g/dL ou g/L qui correspond à la concentration moyenne en hémoglobine par hématie [hémoglobine divisée par hématocrite]). Pour la lignée plaquettaire, il mesure le nombre de plaquettes (en Giga [109] par litre), et le volume plaquettaire moyen (en fL). Pour les globules blancs, il mesure le nombre total de leucocytes (en Giga [109] par litre). L’ensemble de ces paramètres représente la numération sanguine. Un examen plus complet est représenté par la numération formule sanguine (NFS) qui évalue de plus, en fonction de leurs caractéristiques physiques mesurées, les nombres de polynucléaires neutrophiles, éosinophiles et basophiles, de monocytes et de lymphocytes (en Giga [109] par litre). Chaque fournisseur d’analyseur d’hémogramme automatisé peut ajouter d’autres paramètres, en particulier de dispersion, aidant à l’interprétation et à l’analyse qualitative des différentes lignées. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Un hémogramme est réalisé devant tout tableau clinique évocateur d’une anomalie qualitative et/ou quantitative d’une ou plusieurs lignées hématopoïétiques : c’est-à-dire pâleur, tachycardie, dyspnée, infections, syndrome hémorragique avec purpura, syndrome tumoral, altération de l’état général... Un hémogramme est également nécessaire dans le suivi de certaines pathologies (leucémies) ou dans la surveillance de traitements connus pour avoir un retentissement hématologique (héparine, antibiotiques cytopéniants, cytotoxiques). Les caractéristiques des hématies, et en premier lieu l’hémoglobine, permettent de suspecter une anémie (normocytaire, microcytaire ou macrocytaire (VGM), normochrome ou hypochrome (CCMH) ou de détecter une polyglobulie (néoplasie myéloproliférative [NMP] de type Polycythemia Vera (PV) ou maladie de Vaquez). Les variations des taux de plaquettes sont associées aux diagnostics de thrombopénies (centrales ou périphériques) et de thrombocytose (NMP de type thrombocythémie essentielle [TE]). Une diminution du taux de leucocytes définit une leucopénie alors qu’une leucocytose est associée aux infections ou aux leucémies. Les cytopénies peuvent toucher toutes les lignées (pancytopénie) ou une seule. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’hémogramme est un examen biologique de première intention devant toute symptomatologie clinique évocatrice d’une anomalie quantitative ou qualitative d’une ou plusieurs lignées hématopoïétiques. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Chapitre 1. Cytologie Sang sur tube EDTA di ou tripotassique. Examen à réaliser idéalement dans les 12 heures maximum suivant le prélèvement. Température ambiante. Réfrigéré 24 heures maximum. Impédance, cytométrie en flux, cytochimie, spectrophotométrie, calcul sur automate dédié. Méthode automatisée. Mesure quantitative et qualitative. CIQ Commercial. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les automates de numération sont extrêmement précis et surveillés par des contrôles de qualité internes et externes. Les valeurs de référence dépendent de l’âge et du sexe. De manière très schématique, l’hématocrite est d’environ 40 %, le taux d’hémoglobine est entre 11 et 16 g/dL, le nombre de globules rouges autour de 5 T/L, le VGM entre 80 et 100 fL, la TGMH de 27 à 32 pg/cellule, la CCMH de 32 à 36 g/dL. Le taux de plaquettes est entre 150 et 400 G/L avec un VPM de 7,5 à 12 fL. Le taux normal de leucocytes est entre 4 et 10 G/L. Les polynucléaires neutrophiles sont les plus nombreux (2 à 7 G/L) chez l’adulte, suivis des lymphocytes (1 à 4 G/L) et des monocytes (0,2 à 0,7 G/L). Les éosinophiles et les basophiles sont en nombre très faible, inférieur à 0,5 G/L. La formule sanguine peut également être exprimée en % des leucocytes, mais c’est la valeur absolue qui doit être interprétée. Les automates sont programmés pour générer des alarmes en présence de résultats anormaux, initiant soit une « repasse » soit une formule manuelle. Cette dernière consiste, après avoir étalé et séché sur une lame de verre une petite goutte d’échantillon, à colorer cette lame avec par exemple, la séquence de colorants d’un May Grünwald Giemsa. Cette lame est ensuite examinée au microscope pour effectuer une analyse morphologique des hématies, leucocytes et plaquettes orientant le diagnostic. Cette évaluation « manuelle » fait partie intégrante de l’hémogramme. Voir aussi Fiche 1.6. Causes d’erreur, limites du test Pseudo-thrombopénie liée à l’anticoagulant EDTA (nécessite un examen microscopique à la recherche d’agrgats plaquettaires et une nouvelle numération plaquettaire sur tube citraté). Conditions pré-analytiques diverses : ponction diluée (prélèvement à proximité d’une perfusion), coagulation partielle de l’échantillon, échantillon trop âgé. 5 6 Cytologie : tests généraux Fiche 1.2 Hématocrite Code NABM 2108 Signification biologique du paramètre La mesure de l’hématocrite fait partie de l’hémogramme et est réalisée par les automates de numération ou évaluée par microcentrifugation. Il représente le volume, exprimé en pourcentage, occupé par les globules rouges dans le sang total. Les variations de valeur de l’hématocrite sont liées à celles du nombre de globules rouges, de leur volume et du taux d’hémoglobine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’hématocrite est un examen de routine de la numération formule sanguine ou hémogramme et n’est plus prescrit de façon isolée. Cependant une vérification par centrifugation, ou de préférence par microcentrifugation, peut s’avérer nécessaire pour une mesure précise. Une baisse de l’hématocrite est observée en cas d’anémie ou lorsque le volume de plasma augmente. C’est le cas dans l’hémodilution physiologique de la grossesse ou des hémodilutions pathologiques associées aux œdèmes des insuffisances hépatiques ou cardiaques. La polyglobulie de Vaquez ou Polycythemia Vera (PV) est une néoplasie myéloproliférative caractérisée par une activation spontanée du récepteur Nature du prélèvement Sang périphérique sur EDTA. Recommandations pour la qualité du prélèvement Analyse dans les 24 heures. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique de l’érythropoïétine liée à la mutation V617F de JAK2. Chez ces patients, on observe une augmentation de l’hématocrite en raison de la production exagérée d’hématies. Selon les critères OMS 2016, une PV doit être suspectée devant un hématocrite supérieur à 49 % chez l’homme ou à 48 % chez la femme. L’hémoglobine est dans ce cas supérieure à 16,5 g/dL ou 16 g/dL respectivement. Ces valeurs sont plus basses, voire normales, en cas de carence martiale associée. C’est alors le nombre de globules rouges qui permet de suspecter le diagnostic. On observe également une augmentation de l’hématocrite si le volume des globules rouges est augmenté. Enfin, la déshydratation entraîne une fausse augmentation de l’hématocrite. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure de l’hématocrite fait partie de l’hémogramme qui est un examen de première intention (c’est l’examen biologique le plus prescrit au monde). L’hématocrite peut être perturbé en cas de signes cliniques évocateurs d’anémie (pâleur, fatigue, essoufflement) ou de polyglobulie (érythrose, sensibilité à l’eau, maux de tête). NA. Réfrigéré 24 heures maximum. Les automates de numération sanguine calculent l’hématocrite à partir du nombre et du volume des globules rouges. Il est également possible de mesurer la hauteur des globules rouges par rapport au sang total après microcentrifugation dans un tube capillaire calibré (75 mm de hauteur, 1 mm de diamètre). Nature du prélèvement Type de méthode Type de test Chapitre 1. Cytologie Sang périphérique sur EDTA. Méthode manuelle ou automatisée. À noter qu’il existe des instruments de mesure rapide de l’hémoglobine et de l’hématocrite en biologie délocalisée, disponibles près des blocs opératoires pour guider les choix transfusionnels. Mesure quantitative. CIQ Commercial. EEQ Commercial Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test L’hématocrite d’un sujet adulte a une valeur de 36-48 % chez la femme et 40-52 % chez l’homme. Des taux plus élevés sont observés chez les nouveau-nés, les sujets âgés ou en situation d’hypoxie (pathologique ou simplement lors de séjours en altitude où le nombre de globules rouges augmente pour favoriser l’oxygénation des tissus en atmosphère moins riche en oxygène). Il existe également des variations ethniques de l’hématocrite qui est plus élevé chez les Caucasiens. Hémolyse, hyperleucocytose. À noter aussi que le dopage, notamment par l’administration d’érythropoïétine, entraîne une augmentation de la production d’hématies et donc de l’hématocrite. 7 8 Cytologie : tests généraux Fiche 1.3 Numération des réticulocytes Code NABM 1109 Signification biologique du paramètre Le réticulocyte est une hématie riche en ARN qui vient de parvenir dans la circulation. Il est identifiable pendant 24 heures environ, tant que persistent des organites cytoplasmiques : mitochondries, ribosomes et centriole. Le taux de réticulocytes sanguin est un reflet de la production médullaire érythrocytaire. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription certains traitements (fer, vitamine B12, érythropoïétine [EPO]) et après une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La numération des réticulocytes est un examen de deuxième intention destiné à caractériser l’origine centrale ou périphérique d’une anémie objectivée par un hémogramme. La numération des réticulocytes est nécessaire à l’exploration d’une anémie lors du suivi de Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Sang sur tube EDTA. Examen à réaliser dans les 12 heures suivant le prélèvement. Température ambiante. Réfrigéré 24 heures maximum. Cytométrie en flux sur automate dédié ou coloration par des colorants supravitaux (bleu de crésyl brillant ou bleu de méthylène) puis numération sur frottis sanguin. Méthodes automatisées et manuelles. Mesure quantitative. CIQ Commercial. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Les automates de numération sont extrêmement précis et vérifiés par des contrôles de qualité internes et externes. Pour la numération manuelle, un compte doit être fait sur un minimum de 1000 hématies sur deux lames différentes (500 hématies/lame). Causes d’erreur, limites du test Conditions pré-analytiques diverses : ponction diluée (prélèvement à proximité d’une perfusion), échantillon trop âgé, prélèvement hémolysé. Décompte manuel insuffisant (< 1000 hématies). Confusion avec les corps de Heinz. Chapitre 1. Cytologie Fiche 1.4 Plaquettes (thrombocytes), étude isolée Code NABM 1107 Signification biologique du paramètre La numération plaquettaire fait partie de l’hémogramme et est réalisée par les automates de numération. Dans certaines circonstances, il peut être nécessaire de procéder à un examen cytologique spécifique des plaquettes, mettant en évidence des anomalies de taille ou de coloration. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription En présence d’un nombre anormal de plaquettes, l’examen microscopique peut compléter le bilan. Des plaquettes de grande taille, voire géantes, sont présentes en cas d’anomalies du cytosquelette ou des glycoprotéines membranaires. C’est le cas par exemple dans le syndrome MYH91 (SMYH9) et dans le syndrome de Bernard Soulier (SBS) par ailleurs caractérisé par un défaut d’adhésion des plaquettes au facteur Willebrand. Dans la thrombopénie congénitale associée au syndrome des plaquettes grises, les plaquettes sont de taille augmentée (mais moins que dans le SBS et dans Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation le SMYH9) et ne sont pratiquement pas colorées par le May-Grünwald Giemsa (MGG), en raison de l’absence de granules alpha. Certaines fausses thrombopénies sont liées à la présence d’agrégats plaquettaires en présence d’EDTA, détectables au microscope et qui nécessitent parfois un contrôle sur un nouveau prélèvement recueilli sur citrate de sodium. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’étude isolée des plaquettes est un examen de seconde intention qui peut néanmoins être réalisé sans qu’il soit nécessaire de prélever de nouveau le patient lorsque le laboratoire est alerté par un hémogramme anormal. C’est également un examen à prescrire après avoir exclu les causes fréquentes de thrombopénie telles que les fausses thrombopénies (agrégats) ou le purpura thrombopénique auto-immun, accompagnant souvent une infection virale chez l’enfant, et en cas de suspicion de thrombopénie congénitale. Sang périphérique sur EDTA ou sur citrate de sodium. Analyse dans les 24 heures. NA. Température ambiante. Principe méthodologique La numération plaquettaire est effectuée par les automates de numération, éventuellement après marquage par un fluorochrome (fluorimétrie). Une numération plaquettaire en hématimètre peut être indiquée en cas de thrombopénie profonde. L’analyse morphologique des plaquettes est réalisée sur un frottis sanguin après coloration classique au MGG. Les automates de numération peuvent renseigner sur la taille des plaquettes (volume plaquettaire moyen, VPM). Les résultats doivent être interprétés en fonction du type d’automate utilisé. Certains automates ne sont, en effet, pas capables de repérer une augmentation de VPM. Les automates utilisant la fluorimétrie permettent d’évaluer le contenu en ARN des plaquettes qui peut être un indicateur de la taille plaquettaire. La littérature montre que, plus il y a d’ARN, plus la plaquette est grosse. Ceci est bien documenté pour le syndrome MYH9. Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée. 9 10 Cytologie : tests généraux Type de test Mesure quantitative et qualitative. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Le volume plaquettaire moyen (VPM) déterminé par les automates de numération est de 7 à 10 fL. L’examen morphologique doit être effectué par un hématologiste cytologiste spécialiste. Les plaquettes normales sont de petits éléments granuleux irréguliers de 2 à 4 µm de diamètre, colorés en pourpre au MGG. Mauvaise coloration, prélèvement coagulé. À noter que l’absence de proportions adéquates sang/ anticoagulant peut activer les plaquettes et gêner l’interprétation. Ce test est indiqué comme ne devant pas être cumulé avec une numération formule. Cette fiche a essentiellement été rédigée pour préciser les caractéristiques plaquettaires à examiner lors de l’observation d’une lame de sang. 1. MYH9 : MYosin Heavy chain 9. Les mutations de ce gène sont associées à différentes anomalies congénitales de transmission autosomique dominante. Chapitre 1. Cytologie 11 Fiche 1.5 Dosage de la thrombopoïétine (TPO) sérique ou plasmatique Code RIHN E032 Signification biologique du paramètre La thrombopoïétine (TPO) est une cytokine qui stimule la formation et la prolifération des mégacaryocytes (MK) et des cellules souches, mais aussi certaines fonctions des plaquettes. La TPO est synthétisée essentiellement par le foie (cellules parenchymateuses, cellules endothéliales sinusoïdales) et le micro-environnement médullaire. Elle est également produite dans une moindre mesure par le rein (cellules des tubules proximaux) et par les muscles striés. La synthèse hépatique de la TPO est régulée par l’interleukine-6 (IL-6) et son élimination par son récepteur MPL (CD110). La fixation de la cytokine sur son récepteur induit une internalisation du couple cytokine/récepteur conduisant ainsi à une diminution de la quantité de TPO disponible pour stimuler les autres cellules portant ce récepteur. De ce fait, la masse plaquettaire et de MK conditionne directement les taux de TPO. Un taux bas de plaquettes et de MK induit une augmentation des taux de TPO et donc une plus grande quantité de cytokine potentiellement disponible pour se fixer, stimuler, faire proliférer et maturer les progéniteurs mégacaryocytaires. Inversement, un taux élevé de plaquettes est censé induire une diminution des taux de TPO par captation accrue de la cytokine. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription 1. Thrombopénies : déterminer si la thrombopénie est liée à une anomalie de production (défaut de MK) ou à une anomalie par excès de destruction (purpura thrombopénique idiopathique, PTI). Les taux de TPO les plus élevés sont retrouvés dans les thrombopénies par défaut de production dans les aplasies médullaires. Dans ce cas, une corrélation inverse est observée entre le taux de TPO et le nombre de plaquettes. Chez les patients avec PTI, on trouve des taux de TPO variables selon les études : soit normaux, soit plus élevés que la normale, mais inférieurs à ceux des patients ayant une aplasie médullaire. 2. Thrombocytoses : déterminer chez les rares pa­ tients sans anomalies moléculaires caractéristiques des néoplasies myéloprolifératives (thrombocytémie essentielle, TE) si une production de TPO augmentée est responsable de la thrombocytose. Les résultats de la littérature sont variables, avec des taux normaux ou élevés. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le dosage de la TPO est un élément de seconde intention dans l’évaluation des thrombopénies et des thrombocytoses. Sang sur tube sec ou EDTA ou hépariné : à vérifier auprès du laboratoire exécutant. Néant. Contraintes d’acheminement Température ambiante si transport rapide, sinon isolement du plasma ou du sérum réfrigéré à + 4 °C ou congelé à – 20 °C (à vérifier auprès du laboratoire exécutant). Mode de conservation Réfrigération pendant 2-3 jours, congélation au-delà. Éviter les congélations et décongélations répétées. Aliquoter les échantillons avant de les congeler. Éviter les échantillons hémolysés ou lipidiques. En cas de dosage sur plasma, préparer un plasma pauvre en plaquettes. Conditions à vérifier auprès du laboratoire exécutant. Principe méthodologique Type de méthode Immunodosage de type sandwich. Méthode manuelle (ELISA). 12 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Type de test Sang sur tube sec ou EDTA ou hépariné : à vérifier auprès du laboratoire exécutant. Mesure quantitative. CIQ CIQ du fournisseur de réactifs, pool de sérums. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Les performances du dosage de TPO ne sont pas établies en termes de sensibilité et de spécificité. Par ailleurs, les résultats de la littérature ne sont pas tous concordants. Un fait est cependant retrouvé dans toutes les études : des taux très élevés de TPO sont mesurés dans les thrombocytopénies par défaut de production de plaquettes comme dans les aplasies médullaires. Des taux normaux ou moyennement élevés de TPO sont mesurés chez les patients avec PTI. Dans les thrombocytoses, les taux de TPO sont variables : normaux ou élevés et peuvent permettre dans certains cas d’orienter vers un diagnostic. Causes d’erreur, limites du test En cas de dosage sur plasma, la préparation du plasma est un facteur de variation du taux de TPO. Il faut autant que possible préparer un plasma pauvre en plaquettes car le récepteur à la TPO est présent sur les plaquettes. Chapitre 1. Cytologie 13 Fiche 1.6 Frottis sanguin. Frottis : immunomarquage sur lame par Ac Code LC E157 Signification biologique du paramètre Le frottis sanguin est un étalement sur lame d’une goutte de sang veineux ou capillaire prélevé sur anticoagulant EDTA. Il permet, par observation microscopique après coloration, la réalisation de la formule leucocytaire sanguine, l’évaluation de la morphologie des différents éléments figurés du sang (leucocytes, hématies, plaquettes) et la recherche de cellules anormales. Il est également possible d’utiliser les frottis sanguins pour détecter certains antigènes cellulaires par immunomarquage, mais ceci reste exceptionnel. Ce code concerne seulement les immunomarquages mais cette fiche détaille les analyses manuelles d’identification des éléments figurés du sang, qui font partie intégrante de l’hémogramme, suite à la génération d’alarmes par les automates (cf. Fiche 1.1). Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le frottis sanguin est réalisé devant certaines alarmes analytiques déclenchées par les automates, devant des anomalies quantitatives de l’hémogramme, notamment à la recherche de cellules anormales ou pour une analyse morphologique spécifique. La recherche d’antigènes cellulaires par immunomarquage concerne des marqueurs non détectables en cytométrie en flux, par exemple les PML2-bodies ou NPM13 dont la localisation est modifiée en conditions pathologiques (translocation du noyau au cytoplasme). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le frottis sanguin coloré est un examen biologique de deuxième intention faisant suite à un hémogramme pathologique. Sang sur tube EDTA. Étalement sur lame à réaliser dans les 12 heures suivant le prélèvement. La coloration et la lecture peuvent être différées. Il en va de même pour les immunomarquages. Température ambiante. Température ambiante dans un endroit sec et à l’abri de la poussière. Étalement manuel ou réalisé par un automate étaleur-colorateur. Coloration des frottis au May-Grünwald Giemsa puis lecture microscopique aux objectifs × 10, ×50 et ×100. Immunomarquage avec révélation en fluorescence ou en immunocytochimie. Méthode manuelle automatisable par analyse d’image. Mesure quantitative et qualitative. CIQ Maison. EEQ Oui. 14 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Sang sur tube EDTA. Le frottis sanguin doit être lu par un cytologiste averti, qu’il s’agisse de l’observation microscopique ou de la validation du classement proposé par l’analyseur d’image. En plus des décomptes des types cellulaires, il permet la mise en évidence et la caractérisation de cellules anormales, et/ou d’anomalies morphologiques d’éléments normalement présents. Conditions pré-analytiques : - échantillon trop âgé altérant la morphologie des cellules ; - mauvaise homogénéisation du prélèvement avant réalisation de l’étalement. Conditions analytiques : - qualité de la coloration au MGG, notamment le pH de l’eau ; - expérience du cytologiste. 2. PML-bodies : granules nucléaires délocalisés dans le cytoplasme des blastes des leucémies promyélocytaires (ProMyelocytic Leukemia PML). 3. NPM : NnucléoPhosMine délocalisée dans le cytoplasme des blastes leucémiques en cas de mutation. Chapitre 1. Cytologie 15 Fiche 1.7 Cytologie des liquides et appositions Code LC E200 Signification biologique du paramètre Plusieurs types de liquides biologiques peuvent contenir, de façon normale ou anormale, des éléments cellulaires. L’analyse cytologique de ces liquides permet de dénombrer et caractériser ces cellules. À noter que, dans de nombreux cas, cet examen cytologique peut être complété utilement par une étude en cytométrie en flux. Les appositions consistent à effleurer la surface d’une lame de verre avec la tranche d’une pièce biopsique (en hématologie essentiellement un ganglion excisé et coupé ou une biopsie ostéomédullaire) de manière à déposer une couche des cellules composant ce tissu. L’examen cytologique après coloration permet alors de déterminer si l’échantillon est normal ou contient des éléments tumoraux. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Les objectifs et les indications hématologiques varient selon les échantillons : • liquide céphalo-rachidien (LCR, aussi appelé fluide cérébro-spinal) : la plupart du temps, il s’agit du bilan d’extension d’une leucémie aiguë ou d’une suspicion de lymphome du système nerveux central ; Nature du prélèvement • vitré : recherche d’un lymphome oculaire ; dans ce cas, l’analyse en cytométrie en flux et un dosage d’IL-10 sont indiqués ; • lavage broncho-alvéolaire (LBA) : suspicion de syndrome lymphoprolifératif, de sarcoïdose, d’alvéolite allergique, de pneumonie à éosinophiles, de métastases d’une tumeur solide ; • liquide pleural, liquide d’ascite : suspicion de lymphome ; • ganglion : suspicion de lymphome, d’envahissement métastatique d’une tumeur solide. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’examen du LCR fait partie du bilan d’extension des leucémies aiguës lymphoblastiques et des leucémies aiguës myéloblastiques hyperleucocytaires ou accompagnées de signes neurologiques. Il est également indiqué en première ligne en cas de suspicion d’un lymphome du système nerveux central. La décision de ponctionner un liquide ou de réaliser un LBA fait rapidement suite à l’examen clinique ou d’imagerie dans la prise en charge initiale des patients ou en cas de suspicion de rechute. L’excision ou la biopsie de ganglions suspects sont fréquemment remplacées ou précédées par une ponction à l’aiguille, moins invasive, qui peut aussi être analysée en anatomocytopathologie. Dépend du site prélevé. Recommandations pour la qualité du prélèvement Les liquides non hémorragiques peuvent être recueillis sur tube sec sans anticoagulant. Certains centres utilisent des produits de conservation pour le LCR mais ces derniers diluent l’échantillon et faussent la numération des éléments cellulaires. Les appositions doivent être faites très légèrement pour déposer une couche cellulaire la plus fine possible (monocellulaire) et sans mouvement latéral pour ne pas déformer les cellules. Contraintes d’acheminement Le plus rapidement possible, idéalement l’analyse doit être réalisée dans les 2 heures. Mode de conservation À température ambiante. 16 Cytologie : tests généraux Principe méthodologique Pour les liquides, une numération est d’abord réalisée au microscope à l’aide d’un hématimètre, éventuellement après dilution en tampon salin, dont il faudra tenir compte pour exprimer les résultats (en nombre de cellules par mm3). Seuls les éléments nucléés, repérables en augmentant le contraste de phase, sont énumérés. Il est possible d’ajouter un colorant vital (bleu trypan) pour évaluer le nombre de cellules mortes. Un aliquote de l’échantillon est ensuite étalé sur lame à l’aide d’une cytocentrifugeuse, éventuellement en ajoutant un peu de sérum de veau fœtal ou d’albumine humaine pour protéger les cellules. Après séchage de l’étalement, une coloration MGG classique est réalisée avant l’examen microscopique. À noter que des éléments microbiens ou certains parasites peuvent également être détectés dans certains liquides (surtout LBA). Une coloration de Perls des LBA peut être réalisée pour évaluer la présence d’hémosidérine dans les macrophages, associée aux hémorragies intra-alvéolaires. Pour les appositions, après séchage, une coloration classique est réalisée avant examen au microscope. Type de méthode Méthode manuelle. Certains automates de numération proposent un module « liquides ». Type de test Mesure quantitative et qualitative. CIQ Non. EEQ Commerciaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Normalement le LCR et le vitré sont acellulaires. La composition normale d’un LBA est connue, comportant essentiellement des macrophages (∼90 %), quelques lymphocytes T avec un rapport CD4/CD8 normal (∼2), des polynucléaires neutrophiles et éosinophiles. Un épanchement pleural ou ascitique est par définition anormal mais peut ne contenir que des éléments inflammatoires réactionnels. Causes d’erreur, limites du test Les liquides hémorragiques peuvent être contaminés par des éléments anormaux présents dans le sang (blastes, cellules lymphomateuses) et peuvent être ininterprétables. Les LBA contenant trop de cellules bronchiques (cellules ciliées, normalement < 5 %) peuvent également donner des résultats erronés non représentatifs du contenu alvéolaire. Chapitre 1. Cytologie 17 Fiche 1.8 Myélogramme Code NABM 1101 Signification biologique du paramètre Le myélogramme est une ponction-aspiration de moelle osseuse permettant l’analyse cytologique, cytochimique, phénotypique, caryotypique et moléculaire des précurseurs des cellules sanguines matures. Il permet de distinguer les anomalies hématologiques d’origine médullaire centrale des anomalies hématologiques d’origine périphérique mais nécessite de bien connaître le contexte clinique et biologique au préalable. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le myélogramme est réalisé pour le diagnostic d’une ou plusieurs anomalies hématologiques d’origine centrale, pour évaluer les réserves médullaires en fer (très rarement), pour le suivi de certaines hémopathies malignes, pour l’évaluation de la maladie résiduelle, mais aussi devant certaines situations cliniques particulières. Un myélogramme doit être réalisé devant : • une thrombopénie significative non expliquée en première intention par la présence d’agrégats plaquettaires, une prise médicamenteuse, une maladie auto-immune ou une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) ; • une neutropénie significative non expliquée en première intention par une prise médicamenteuse, une infection bactérienne ou virale ; • une anémie non régénérative macrocytaire non expliquée en première intention par une consommation alcoolique ; • une pancytopénie non expliquée en première intention par une prise de cytotoxiques ou un hypersplénisme ; • la présence sur le frottis sanguin de cellules hématopoïétiques anormales (blastes) ; • une compression médullaire, qui ne fait pas sa preuve rapidement (c’est-à-dire myélome) ; • une insuffisance rénale ou une neuropathie périphérique non expliquée (c’est-à-dire myélome). Un myélogramme est également réalisé pour : • effectuer une étude des molécules membranaires et cytoplasmiques par cytométrie en flux des cellules hématopoïétiques normales, anormales ou extra hématopoïétiques ; • réaliser un examen cytogénétique et/ou moléculaire médullaire ; • évaluer la maladie résiduelle ; • effectuer une congélation de cellules médullaires. Il peut aussi être utile pour rechercher une extension médullaire d’un cancer chez un patient porteur d’une tumeur solide. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le myélogramme n’est pas un examen de première intention en dehors de l’observation sur le frottis sanguin de cellules anormales (blastes, cellules lymphomateuses). Il est indispensable avant sa réalisation d’éliminer toutes les causes périphériques possibles des anomalies observées (en particulier les cytopénies). Ainsi, on doit établir la liste des médicaments pris par le patient à la recherche d’une éventuelle toxicité (thrombopénie, neutropénie), réaliser un bilan infectieux (neutropénie) à la recherche d’une infection bactérienne, virale ou parasitaire, mesurer le taux de réticulocytes devant une anémie normocytaire ou macrocytaire, effectuer des dosages vitaminiques et un bilan thyroïdien devant une anémie normocytaire ou macrocytaire non régénérative. Il faut également rechercher un hypersplénisme, donc effectuer un bilan hépatique. Cet examen peut aussi présenter également une valeur médico-légale et il est possible de réaliser un prélèvement post mortem. 18 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Suc médullaire sur seringue sèche, héparinée ou sur tube EDTA. Les frottis destinés à la coloration MGG doivent être étalés immédiatement. Les prélèvements destinés aux analyses cytogénétiques (héparinés), phénotypiques et moléculaires (EDTA) doivent être homogénéisés. Température ambiante. Température ambiante 12 heures maximum, prélèvement sur milieu de conservation spécial au-delà. Coloration des frottis médullaires au MGG. Mise en culture avec des agents mitotiques pour l’analyse caryotypique. Extraction de l’ADN et/ou de l’ARN pour les analyses moléculaires. Type de méthode Méthode manuelle. Type de mesure Mesure qualitative et semi-quantitative. CIQ Maison. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Le myélogramme s’il est correctement réalisé et cellulaire permet l’analyse cyto-morphologique des cellules médullaires et la réalisation des analyses complémentaires phénotypiques, cytogénétiques et moléculaires. En cas d’hémodilution du prélèvement, l’analyse est non contributive. En cas de myélofibrose, la ponction-aspiration peut être un échec et contraindre à la réalisation d’une biopsie ostéomédullaire, indispensable en cas de prélèvement paucicellulaire. Dans certaines hémopathies focales (myélome), le myélogramme peut être négatif en raison de l’absence de cellule pathologique dans la zone de prélèvement. La présence d’une thrombopénie, l’utilisation d’anticoagulants ou d’antiagrégants plaquettaires ne contre-indiquent pas le myélogramme. Chapitre 1. Cytologie 19 Fiche 1.9 Étude complémentaire de cytochimie (moelle ou sang) Code NABM 1102 Signification biologique du paramètre L’observation microscopique des éléments figurés du sang et de la moelle, après coloration, fournit beaucoup d’indications sur la nature et les proportions des populations cellulaires présentes. Plusieurs techniques cytochimiques peuvent apporter des informations complémentaires. La recherche d’activités enzymatiques comme la myéloperoxydase ou la butyrate estérase confirme l’appartenance des cellules aux lignées granulocytaire ou monocytaire. La recherche de fer mitochondrial ou macrophagique par la coloration de Perls caractérise les sidéroblastes et les dépôts d’hémosidérine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription d’appartenance des blastes de leucémie aiguë. La recherche de dépôts de fer est un élément du diagnostic des syndromes myélodysplasiques (cytopénie avec sidéroblastes en couronne) ou d’hémophagocytose (macrophages contenant de l’hémosidérine). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Ces examens sont de seconde intention après l’examen morphologique. Ils peuvent être réalisés sans nouveau prélèvement sur un frottis sanguin ou médullaire (lames blanches effectuées à partir d’une goutte de sang de l’hémogramme ou lors de l’aspiration médullaire). Les recherches d’activités enzymatiques sont des éléments de confirmation de la lignée Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Sang ou moelle sur EDTA, étalés sur lame de verre. Étalements de bonne qualité. NA Température ambiante. Lames d’étalement non colorées. La recherche de myéloperoxydase et de butyrate estérases repose sur une réaction enzymatique (activité fonctionnelle de l’enzyme) avec un substrat générant un dépôt coloré dans les cellules. Pour la myéloperoxydase, il s’agit d’une réaction cytochimique basée sur l’oxydation d’un substrat chromogène, la benzidine, précipitant sous forme de granulations marron-vert ou l’alpha-naphtol pyronine qui précipite en un produit rouge. Pour les butyrates estérases, on réalise une hydrolyse de l’alpha-naphtyl butyrate qui produit une coloration rouge brun. Il est également possible de rechercher les estérases non spécifiques (NASDA) par hydrolyse du Naphtol-ASD-Acétate qui produit des précipités bleus. À noter que la recherche de l’antigène myéloperoxydase est couramment réalisée en cytométrie en flux. Cette méthode permet aussi l’identification antigénique du lysozyme dans les cellules engagées dans la lignée monocytaire. La coloration de Perls repose sur une coloration du fer ferreux (Fe3+), coloré en bleu par le bleu de Prusse. 20 Cytologie : tests généraux Type de méthode Type de test Méthode manuelle. Mesure qualitative mais numération des sidéroblastes en couronne et des blastes positifs pour la myéloperoxydase. CIQ Témoins maison. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation L’interprétation est aidée par la présence de ces enzymes dans les éléments résiduels et performances d’hématopoïèse normale (polynucléaires neutrophiles, monocytes). Classiquement, le seuil de 3 % de cellules marquées est retenu pour la MPO. Un taux de sidéroblastes en couronne entre 5 et 15 % peut justifier la demande d’une recherche de mutation de SF3B1. Causes d’erreur, limites du test Certains marquages très faibles peuvent être difficiles à interpréter et nécessitent de répéter la réaction ou d’utiliser une autre technique comme la cytométrie en flux. Chapitre 1. Cytologie 21 Fiche 1.10 Diagnostic des hémopathies malignes (moelle ou sang) Code NABM 1105 Signification biologique du paramètre Les hémopathies malignes constituent un groupe de pathologies cancéreuses du système hématopoïétique hétérogènes aussi bien par leur présentation clinique que par leur gravité, leur traitement et leur pronostic. Ces différences dépendent en grande partie du caractère aigu ou chronique de l’installation de l’hémopathie mais aussi de la lignée hématopoïétique concernée (lymphoïde ou myéloïde) et du stade de différenciation à l’origine du processus malin. De plus, pour la majorité des hémopathies malignes, les traitements restent très lourds, souvent basés sur des associations de chimiothérapies, et le pronostic demeure souvent sombre. Le diagnostic d’une hémopathie maligne est donc une étape essentielle qui consiste non seulement à affirmer le caractère tumoral et malin des cellules hématopoïétiques en cause, mais aussi à typer avec précision la nature, la lignée et les propriétés particulières de ces cellules. Cette démarche diagnostique est indispensable pour délivrer le traitement le plus adapté au patient. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Une hémopathie maligne peut survenir à tous les âges de la vie. Elle peut être suspectée devant des signes cliniques évocateurs d’un processus tumoral (altération de l’état général, perte de poids, sueurs nocturnes, adénopathies, saignements, infections, asthénie, etc.) mais peut aussi être découverte de manière complètement fortuite sur un bilan sanguin systématique. Le diagnostic est apporté par un prélèvement de sang périphérique et/ou de moelle osseuse (myélogramme ou biopsie ostéo-médullaire) et/ou d’un ganglion ou masse tumorale. Certains épanchements permettent également de porter ce type de diagnostic. Le typage de l’hémopathie maligne doit ensuite être précisé et complété afin d’orienter au mieux le traitement mais aussi de permettre son suivi, aussi bien pour affirmer la rémission que pour détecter précocement une rechute. Il repose à l’heure actuelle sur une démarche intégrée associant un faisceau d’arguments et d’examens : la cytologie, l’immunophénotypage, la cytogénétique et la bio­ logie moléculaire. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Selon l’hémopathie suspectée, un ou plusieurs de ces examens complémentaires devront être réalisés afin d’établir le diagnostic. Pour les leucémies aiguës, ces quatre examens sont requis. En revanche, le diagnostic d’une leucémie lymphoïde chronique pourra être réalisé simplement par un immunophénotypage sur le sang périphérique, les autres explorations ne devenant utiles qu’en cas d’évolution de la pathologie nécessitant l’initiation d’un traitement. La cytologie reste à l’heure actuelle le premier examen à réaliser et le point d’appel des autres examens complémentaires. Depuis de nombreuses années, elle est épaulée et consolidée dans la foulée par l’immunophénotypage, qui permet de compléter et de conforter le diagnostic dans la même journée. La cytogénétique et la biologie moléculaire demandent des délais plus longs (quelques jours). L’immunophénotypage est une technique de cytométrie en flux qui permet de déterminer précisément le lignage de l’hémopathie en mettant en évidence les antigènes présents à la surface ou à l’intérieur des cellules hématopoïétiques tumorales. D’autre part, la cytogénétique et la biologie moléculaire présentent un intérêt pronostic par la mise en évidence de réarrangements chromosomiques et/ou de mutations géniques. 22 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Sang, moelle osseuse, ganglions, tumeurs, épanchements. Prélèvement sur tube EDTA, sans autre condition particulière. Moelle osseuse : limiter au maximum l’hémodilution en ne prélevant que le volume minimal requis. Pas d’anticoagulant pour les épanchements. Biopsies à l’état frais en anatomocytopathologie qui peut éventuellement réaliser des appositions et/ou demander une cytométrie en flux avant de réaliser la fixation et l’inclusion en paraffine pour examen de coupes tissulaires. Température ambiante. Mode de conservation Température ambiante ou congélation. Fixation pour une partie des pièces biopsiques. Principe méthodologique Cytologie, immunophénotypage, cytogénétique, biologie moléculaire (voir items correspondants). Type de méthode Type de test Méthodes manuelles ou semi-automatisées. Mesure qualitative et quantitative. CIQ Maison et commerciaux. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Ces examens spécialisés dépendent des compétences des biologistes entraînés qui les réalisent. Causes d’erreur, limites du test Prélèvements coagulés, ponctions blanches, hémodilution. Chapitre 1. Cytologie 23 Fiche 1.11 Vitesse de sédimentation Signification biologique du paramètre Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La vitesse de sédimentation est la mesure de la hauteur de plasma surmontant les éléments figurés du sang après incubation à 1g dans un tube vertical calibré pendant respectivement une heure et deux heures. Normalement, les hématies, leucocytes et plaquettes, en suspension dans du sang anticoagulé, sédimentent très lentement dans le plasma. Les protéines de l’inflammation, qui peuvent être en grande quantité dans le sang, accélèrent la vitesse de sédimentation. Il en va de même pour les immunoglobulines monoclonales ou paraprotéines du myélome multiple et des pathologies apparentées qui empilent les hématies en « rouleaux » (visibles sur un état frais ou un frottis sanguin) qui sédimentent plus vite. La vitesse de sédimentation est donc un reflet de l’état inflammatoire du patient. Cet examen est maintenant obsolète. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Une vitesse de sédimentation – ou actuellement, de préférence, une mesure des protéines de l’inflammation comme la protéine C réactive, les alpha2 globulines ou le fibrinogène – est indiquée en cas de suspicion d’une pathologie inflammatoire, aiguë ou chronique. Les principales indications sont les infections et les pathologies chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde. Elle peut être augmentée dans certains cancers, ainsi que dans les anémies hémolytiques auto-immunes où les anticorps agglutinent les hématies. Il s’agit également d’un moyen de suivi thérapeutique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure des protéines de l’inflammation est un examen de première ou deuxième ligne, à réaliser en même temps qu’un hémogramme ou en fonction des résultats de ce dernier. Sang sur tube EDTA. Examen à réaliser rapidement suivant le prélèvement. Température ambiante. Réfrigéré 24 heures maximum. Des tubes calibrés sont positionnés de façon verticale dans un endroit stable et calme après avoir été remplis de sang anticoagulé bien homogénéisé. La hauteur de plasma est mesurée à 1 h, 2 h, voire 24 h, sans que le tube ait été déplacé. Il existe des techniques rapides de mesure de la vitesse de sédimentation par centrifugation standardisée en tubes calibrés. Méthode manuelle ou automatisée. Mesure quantitative. CIQ Non. EEQ Oui, commerciaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test La vitesse de sédimentation normale est de 2 à 5 mm à la première heure, 5 à 10 mm à la deuxième heure, un peu plus rapide chez la femme. Sang coagulé, déplacement des tubes de mesure. 24 Cytologie : tests généraux Bibliographie du chapitre 1 FICHE 1.1 – Hémogramme y compris plaquettes Geneviève F, Godon A, Marteau-Tessier A, et al. Anomalies et erreurs de détermination de l’hémogramme avec les automates d’hématologie cellulaire. Partie 1. Les plaquettes sanguines. Ann Biol Clin 2010;68:393–407. Geneviève F, Godon A, Marteau-Tessier A, et al. Anomalies et erreurs de détermination de l’hémogramme avec les automates d’hématologie cellulaire Partie 2. Numération et formule leucocytaires. Ann Biol Clin 2012;70:141–54. Geneviève F, Godon A, Marteau-Tessier A, et al. Anomalies et erreurs de détermination de l’hémogramme avec les automates d’hématologie cellulaire Partie 3. Hémoglobine, hématies, indices érythrocytaires, réticulocytes. Ann Biol Clin 2012;70:155–68. Lecture critique de l’hémogramme. ANAES. Septembre 1997. Troussard X, Vol S, Cornet E, et al. pour le Groupe francophone d’hématologie cellulaire (GFHC). Étude des valeurs normales de l’hémogramme chez l’adulte : un besoin pour une meilleure interprétation et pour l’accréditation du laboratoire. Ann Biol Clin 2014;72:561–81. FICHE 1.2 – Hématocrite Rudolf J, Douglass J, Baron J, et al. Évaluation of the i-STAT point-of-care capillary whole blood hematocrit and hemoglobin : comparison to the siemens RAPIDLab 1200, Sysmex XE5000, and manual spun hematocrit. Clin Chim Acta 2015;446:37–42. Maffioli M, Mora B, Passamonti F. Polycythemia Vera : from new, modified diagnostic criteria to new therapeutic approaches. Clin Adv Hematol Oncol 2017;15:700–7. Höpfl G, Ogunshola O, Gassmann M. Hypoxia and high altitude. The molecular response. Adv Exp Med Biol 2003;543:89–115. FICHE 1.3 – Numération des réticulocytes Geneviève F, Godon A, Marteau-Tessier A, et al. Anomalies et erreurs de détermination de l’hémogramme avec les automates d’hématologie cellulaire Partie 3. Hémoglobine, hématies, indices érythrocytaires, réticulocytes. Ann Biol Clin 2012;70:155–68. FICHE 1.4 – Plaquettes (thrombocytes), étude isolée Rosa JP. Le syndrome des plaquettes grises. Hématologie 2013;19:123–35. Trichet C, Beauchamp-Nicoud A, Proulle V, et al. Les thrombopénies constitutionnelles : de la clinique à la biologie. Hématologie 2003;9:439–55. Miyazaki K ; Koike Y, Kunishima S, et al. Hematology (Amsterdam, Netherlands). 2015 ;20 :587-592. Noris P, Klersy C, Gresele P, Giona, et al. Italian Gruppo di Studio delle Piastrine. Platelet size for distinguishing between inherited thrombocytopenias and immune thrombocytopenia : a multicentric, real life study. Br J Haematol 2013;162:112–9. FICHE 1.5 – Dosage de la Thrombopoïétine (TPO) sérique ou plasmatique Gouin-Thibault I, Cassinat B, Chomienne C, et al. Is the thrombopoietin assay useful for differential diagnosis of thrombocytopenia ? Analysis of a cohort of 160 patients with thrombocytopenia and defined platelet life span. Clin Chem 2001;47:1660–5. Vianello F, Vettore S, Tezza F, et al. Serum Thrombopoietin and cMpl Expression in thrombocytopenia of different atiologies. Hematol Rep 2014;6:4996. 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Dans tous les cas, ces cellules sont absentes du sang ou de la moelle normale ou y sont très peu représentées. L’immunophénotypage par cytométrie en flux est une technique qui permet d’analyser les cellules en mettant en évidence des antigènes spécifiques de lignée à leur surface, dans leur cytoplasme ou dans leur noyau, grâce à des anticorps monoclonaux couplés chacun à un fluorochrome et dirigés spécifiquement contre les antigènes recherchés. Dans le cas des hémopathies malignes, les cellules suspectes sont analysées vis-à-vis de chacun des marqueurs testés. Ces marqueurs sont combinés entre eux afin de déterminer le lignage de l’hémopathie et d’en préciser le diagnostic. À ce jour, les cytomètres utilisés en routine peuvent combiner jusqu’à 13 anticorps dans un même tube, ce qui porte à 15 le nombre de paramètres analysés par tube en tenant compte des paramètres optiques de taille et de structure. Les combinaisons des anticorps conjugués dans les tubes analysés en cytométrie constituent un « panel ». Certains panels comportent plusieurs tubes. Pour une meilleure analyse comparative, certains panels comportent quelques anticorps identiques dans chaque tube. On parle de backbone. D’une manière générale, l’utilisation de CD45 est une constante dans ces panels. Cet anticorps panleucocytaire permet de réaliser une « cartographie » des cellules nucléées sanguines et médullaires. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Toutes les cellules présentent à leur surface des protéines, dénommées Cluster of Differentiation (ou CD) dont les propriétés sont multiples pour la cellule : présentation ou reconnaissance de l’antigène, activation cellulaire, adhésion, activité enzymatique, etc. Il en existe à ce jour plus de 360 qui permettent, indépendamment de ces fonctions cellulaires, la classification des cellules. C’est sur la reconnaissance de ces antigènes par des anticorps monoclonaux couplés chacun à un fluorochrome que s’appuie la technique d’immunophénotypage en cytométrie en flux. Celleci est essentielle dans le diagnostic de la majorité des hémopathies malignes afin d’affirmer d’une part le caractère malin des cellules suspectes et d’autre part de préciser leur lignage (lymphoïde B, T, NK, myéloïde [progéniteurs]), granuleux, monocytaire, plaquettaire, érythroblastique, etc.). Un immunophénotypage doit ainsi être réalisé lors d’une suspicion d’hémopathie maligne. Il est indispensable au diagnostic des leucémies aiguës. Dans les SLP, il permet d’affirmer la monotypie B, de déterminer les caractéristiques spécifiques de certaines entités (LLC, LCM, LF, MM1, etc.) et d’identifier les trous phénotypiques des proliférations T/NK. Il prend une place croissante dans le diagnostic intégré des SMD. Il est plus rarement demandé dans les NMP, mais a une place dans le dépistage sanguin des leucémies myélomonocytaires chroniques (LMMC). Il est aussi utile pour la recherche de maladie résiduelle (MRD)2. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’immunophénotypage est essentiel pour le diagnostic et le suivi de la majorité des hémopathies, en seconde ligne après l’examen morphologique, ou de façon concomitante. C’est une technique rapide qui permet de préciser le diagnostic dans les heures qui suivent l’arrivée du prélèvement. Elle présente également l’avantage de pouvoir être réalisée sur différents liquides biologiques, les plus communs étant le sang et la moelle osseuse, voire sur des tissus (ganglion, leucémide, plasmocytome, etc.). Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Chapitre 2. Cytométrie en flux Sang, moelle osseuse, ganglion, tissu. LCR dans les deux heures. Prélèvement sur tube EDTA, sans autre condition particulière. Moelle osseuse : limiter au maximum l’hémodilution en ne prélevant que le volume minimal requis (1 mL maximum, idéalement dans une nouvelle logette). Liquides : sans anticoagulant sauf si hémorragique. LCR et vitré dans les deux heures. Tissus : dans une compresse imbibée de sérum physiologique. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Mode de conservation Température ambiante, de préférence à plat. Exceptionnellement à + 4 °C. Principe méthodologique Type de méthode Type de test 29 Après une première phase fluidique où les cellules marquées par les anticorps sont guidées par un liquide de gaine, elles passent une par une devant un faisceau laser (excitation) qui provoque l’émission d’une lumière dans une autre longueur d’onde (émission) par les fluorochromes. Cette lumière émise est recueillie et transformée en signal électronique. Concomitamment, les caractéristiques de taille et de granularité des cellules sont recueillies en fonction de la diffraction du faisceau laser par les cellules seules. Méthode manuelle, le cytomètre n’est pas un automate. Il existe cependant des automates de préparation des échantillons. La phase d’interprétation des signaux acquis est cruciale. Mesure qualitative et quantitative. CIQ Commerciaux EEQ Oui mais peu. Valeurs de référence/ Interprétation et performances La présence de cellules anormales est par définition une anomalie. Par convention, le marquage de 10 % des cellules d’un échantillon est considéré comme significatif. Une meilleure appréciation consiste à comparer l’expression d’un marqueur sur une population cellulaire à celle des éléments « normaux » de l’échantillon. Un moyen efficace est de travailler sur des échantillons dans lesquels les globules rouges ont été lysés, mais conservant toutes les populations leucocytaires. Une comparaison simple sur un histogramme biparamétrique de la diffraction cellulaire (SSC, Side SCatter) versus chaque fluorochrome permet une approche rapide de la « positivité » d’un marqueur. Cependant, l’interprétation d’un immunophénotypage doit intégrer l’ensemble des paramètres mesurés, par l’utilisation d’histogrammes biparamétriques de marqueurs deux à deux sur des populations ciblées et en ayant recours à la projection de la population identifiée sur une cartographie CD45/SSC. Causes d’erreur, limites du test L’identification des cellules anormales est une technique très sensible, mais qui souffre de façon récurrente dans les prélèvements médullaires, de l’hémodilution des échantillons. Pour les SLP-B, la nécessité de se débarrasser des immunoglobulines solubles du plasma, par un lavage préalable de l’échantillon, fausse les données quantitatives. La perméabilisation, pour l’identification de marqueurs intracellulaires, a le même effet. La préparation manuelle des mélanges d’anticorps est une source d’erreur (oubli d’un marqueur, saturation par double pipettage). La nécessité de compenser les signaux de fluorochromes émettant à des longueurs d’onde voisines peut également conduire à de faux résultats (surcompensation ou souscompensation). Les stratégies de fenêtrage lors de l’analyse doivent être rigoureuses. 1. LLC : Leucémie lymphoïde chronique ; LCM : Lymphome à cellules du manteau ; LF : Lymphome folliculaire ; MM : Myélome multiple. 2. MRD: Minimal Residual Disease ou Measurable Residual Disease. 30 Cytologie : tests généraux Fiche 2.2 Quantification des cellules CD34+ Code LC E018 Signification biologique du paramètre L’antigène de différenciation CD34 est une sialomucine, protéine fortement glycosylée, exprimée sur les cellules souches hématopoïétiques et les précurseurs les moins différenciés. La quantification des cellules exprimant le marqueur de surface CD34, qui reflète la quantité de ces progéniteurs, permet d’évaluer la capacité de reconstitution hématopoïétique de l’échantillon cellulaire testé. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Déterminer : • la possibilité d’effectuer une cytaphérèse de cellules souches périphériques (CSP) par analyse Nature du prélèvement dans le sang des cellules mobilisées (facteurs de croissance et/ou chimiomobilisation). La quantification des cellules CD34 est effectuée avant de réaliser une autogreffe de CSP ou chez un donneur sain avant allogreffe de CSP ; • la qualité hématopoïétique d’un greffon prélevé ; • la valeur pronostique du nombre de cellules CD34+ dans le sang d’un patient atteint de myélofibrose primitive (plus rare). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration C’est un examen de première intention avant quantification des CFU-GM en culture pour l’analyse d’un greffon (seule analyse dans le sang). Sang sur EDTA, greffon hématopoïétique (pour les cytaphérèses ou la greffe de cellules hématopoïétiques médullaires Recommandations pour la qualité du prélèvement Limiter au maximum le délai d’analyse car la viabilité est un facteur évalué par le test. Contraintes d’acheminement Non. Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Température ambiante et analyse rapide. Il s’agit d’une approche en immunofluorescence directe en cytométrie en flux utilisant les marqueurs CD45 couplé au FITC (Fluorescein isotyhiocyanate) et CD34 couplé à la PE (phycoerythrine), associés à une élimination des cellules mortes par exclusion des cellules marquées par le 7AAD. Une adjonction de billes de quantification à l’échantillon permet une numération du nombre de cellules CD34+ vivantes directement (valeur absolue) en s’affranchissant des calculs incluant la viabilité ou la détermination du nombre de cellules nucléées (Malassez/automate). Cette technique est dite en « simple plateforme ». Des trousses sont disponibles, rassemblant les principaux réactifs pour la réalisation de la technique. Certaines sociétés mettent à disposition un logiciel simplifiant l’analyse ou la ré-analyse sur leurs cytomètres. Des systèmes commerciaux intégrés sont prévus pour automatiser la totalité du processus, simplifiant ainsi l’accréditation. Méthode de quantification du nombre de cellules CD34+. CIQ Oui, commerciaux. EEQ Oui, commercial. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Le but est d’obtenir, en règle, une sensibilité de moins de 2 cellules/mm3 pour un chiffre absolu de 10 cellules CD34+/mm3 qui est le seuil de déclenchement usuel du prélèvement par cytaphérèse. La présence de plaquettes en grand nombre ou de cellules en apoptose est la cause la plus fréquente d’erreurs. Ce phénomène est normalement limité avec l’utilisation des trousses qui intègrent un marqueur de viabilité. Chapitre 2. Cytométrie en flux 31 Fiche 2.3 Hémoglobinurie paroxystique nocturne (HPN) Code NABM 1119 Signification biologique du paramètre La détection d’un clone HPN, en cytométrie en flux (CMF), correspond à l’observation de cellules déficitaires en molécules membranaires caractérisées par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI). La perte de CD55 (DAF) et de CD59 (MIRL), molécules « GPI liées », régulatrices du complément, à la surface des hématies, est responsable de l’hémolyse nocturne « complément médiée » caractéristique de la maladie HPN classique. Ce déficit en molécules GPI liées concerne plusieurs lignées sanguines et est total ou partiel, définissant respectivement les clones de type III ou II, les cellules normales étant dites de type I. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le but de ce test est de mettre en évidence des « clones HPN » habituellement prépondérants dans la maladie HPN classique qui est rare. Des clones de petite taille sont observés plus fréquemment dans les insuffisances médullaires. Ainsi les indications du test sont : une hémoglobinurie, Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test toute hémolyse à test de Coombs négatif, les aplasies médullaires, les myélodysplasies à moelle pauvre, les cytopénies inexpliquées et les thromboses profondes, en particulier les thromboses splanchniques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La CMF est la technique de référence pour la détection des clones HPN. Elle doit être réalisée en première intention sur les leucocytes (polynucléaires neutrophiles et monocytes). La détection sur les hématies doit être réalisée en deuxième intention dans certains cas (cf. infra). La biologie moléculaire n’a pas sa place en dehors des protocoles de recherche. Les techniques in vitro d’hémolyse des hématies en gradient de pH ou en gradient de pI sont désuètes. L’analyse peut se faire avec deux niveaux de sensibilité pour la détection de clones de taille de plus de 1 % dans « l’HPN maladie » ou avec une forte sensibilité pour la détection de petits clones dans les autres situations. Sang sur EDTA. À garder à température ambiante mais pas plus de 24 heures. Non. Température ambiante. En CMF multiparamétrique, le clone est recherché en première intention sur les leucocytes avec des marqueurs de fenêtrage (CD45 Ag pan-leucocytaire, CD15 pour les polynucléaires [PN], CD33 ou CD64 pour les monocytes [MN]) associés à des marqueurs « GPI liés » tels que CD24 ou CD16 (à noter que les éosinohiles n’expriment pas CD16) pour les PN et CD14 pour les MN. FLAER, toxine bactérienne, couplée à un fluorochrome, marque toutes les molécules « GPI liées » et est recommandée dans ces combinaisons. CD157 est aussi informatif sur les PN et les MN. Dans un second temps, une recherche est effectuée sur les hématies avec CD235 (glycophorine A) pour le fenêtrage et CD55 + CD59. Les lymphocytes ou les basophiles sont utilisés comme contrôles internes positifs. Méthode manuelle, aucune trousse ni logiciel n’est disponible. Mesure quantitative. La sensibilité du test dépend du nombre de marqueurs et des cellules analysées. En fonction du nombre d’événements HPN, un résultat détectable ou quantifiable (limites de détection ou de quantification) est obtenu. 32 Cytologie : tests généraux CIQ Une mesure de la sensibilité de la combinaison utilisée doit être définie dans chaque laboratoire sur des échantillons normaux. Il n’existe pas de CIQ. EEQ Différents EEQ sont disponibles. La recommandation en France est de participer à l’échange interlaboratoires qui est organisé avec l’Association Française de Cytométrie (AFC) à partir d’échantillons frais et de cas virtuels à analyser. Valeurs de référence/Interprétation et performances La sensibilité de 1 % est obtenue avec 2/3 marqueurs pour diagnostiquer l’HPN classique. La haute sensibilité (0,01 %), avec 5 marqueurs, nécessite l’analyse de plus de 200 000 cellules pour avoir un nuage de 20 cellules en cas de positivité. En cas de leucopénie qui ne permet pas d’atteindre la limite de détection, il faut avoir recours à l’étude des hématies. Causes d’erreur, limites du test La mortalité cellulaire est certainement une cause de détection de « faux petits clones », ce qui nécessite de réaliser l’analyse aussi rapidement que possible. Les échantillons avec « myélémie » génèrent des erreurs peu connues. Il ne faut pas effectuer ce test sur la moelle osseuse. Il faut être prudent dans l’utilisation de CD16, GPI-lié sur les PN mais transmembranaire sur les cellules NK qui peuvent être un bon témoin, mais il faut noter que les éosinophiles sont CD16-. En cas de cytopénies, limitant l’analyse de nombreux PN, il faut effectuer l’analyse des hématies. L’étude du clone sur les hématies donne néanmoins en règle une taille plus petite du clone du fait de l’hémolyse et de la possibilité de transfusion d’hématies normales. Chapitre 2. Cytométrie en flux 33 Fiche 2.4 Marquage cellulaire quel qu’il soit en cytométrie en flux (par anticorps) Code LC G0653 Signification biologique du paramètre Le développement des anticorps monoclonaux a conduit à la découverte de nombreux antigènes de différenciation leucocytaire. Leurs fonctions et les cellules auxquelles ils sont associés ont donné lieu à de nombreux travaux. Il existe désormais un consensus sur les marqueurs à rechercher sur des cellules normales ou anormales pour déterminer leur lignée et poser un diagnostic reposant sur des proportions anormales ou une expression atypique d’antigènes. Les mélanges d’anticorps, dans un ou plusieurs tubes, constituent des panels. Il est possible d’appliquer cette méthode à un grand nombre de types d’échantillons : sang, moelle, liquides biologiques, liquides de lavage, cellules tissulaires dissociées, etc. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Les panels d’anticorps utiles pour le diagnostic de pathologies hématologiques ou immunologiques peuvent comporter un nombre de marqueurs dépassant les 8 anticorps figurant dans le code NABM 1103. C’est le cas pour les leucémies aiguës ou certains syndromes lymphoprolifératifs. Nature du prélèvement Analyse dans les 24 heures. Contraintes d’acheminement NA. Mode de conservation Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit d’examens de première/deuxième intention dans le diagnostic d’une suspicion d’hémopathie sur la base d’un hémogramme anormal ou d’images morphologiques atypiques. Un immunophénotypage exhaustif permet de poser un diagnostic en quelques heures, facilitant la prise en charge rapide des patients. Sang périphérique ou moelle osseuse sur EDTA. Tube sec pour la majorité des liquides. Cellules fraîchement dissociées (ex. ganglion). Recommandations pour la qualité du prélèvement Principe méthodologique Par exemple, l’immunophénotypage d’une leucémie à tricholeucocytes nécessite dans un premier temps d’identifier l’existence d’une restriction isotypique (monotypie des chaînes légères) sur une population B CD19+ CD5- puis de confirmer l’expression sur ces cellules des antigènes CD11c, CD25, CD103 et/ou CD123. La recherche de sous-populations fonctionnelles spécialisées de lymphocytes T nécessite également de vérifier la co-expression ou l’expression sélective de certains marqueurs. Cet item de la nomenclature a été proposé pour pouvoir tenir compte des marqueurs additionnels nécessaires, en sus des 8 premiers et jusqu’à 24 au total pour réaliser ces immunophénotypages. Température ambiante. L’immunophénotypage repose sur l’incubation de l’échantillon à tester avec un mélange d’anticorps monoclonaux conjugués à des fluorochromes. La technique la plus simple est dite de « lyse sans lavage » et consiste à incuber directement l’échantillon avec les anticorps, à lyser les hématies si nécessaire et à analyser l’échantillon avec un cytomètre en flux (il est également possible de les examiner en microscopie UV). Les lavages peuvent parfois améliorer la résolution des signaux mais entraînent une perte aléatoire de cellules. Dans certains cas, s’il est nécessaire d’augmenter la concentration cellulaire, une lyse préalable des hématies peut être réalisée dans ce qui est appelé une lyse macrovolume. 34 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Type de méthode Type de test Méthode manuelle. Le cytomètre en flux n’est pas un automate. À noter qu’il existe des automates de préparation. Mesure quantitative. CIQ Commerciaux pour certains marqueurs. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test 3. Sang périphérique ou moelle osseuse sur EDTA. Tube sec pour la majorité des liquides. Cellules fraîchement dissociées (ex. ganglion). Il est nécessaire de bien connaître les caractéristiques immunophénotypiques associées aux pathologies suspectées. L’interprétation nécessite un biologiste expérimenté capable d’analyser les marquages parfois complexes impliquant des stratégies de fenêtrage pouvant être sophistiquées pour certaines populations rares, notamment dans le cadre de la recherche de maladie résiduelle (MRD). Hémodilution pour les prélèvements de moelle osseuse, inadéquation des quantités d’anticorps. Voir aussi la fiche 2.1, Phénotypage des cellules anormales, NABM 1103. Chapitre 2. Cytométrie en flux 35 Fiche 2.5 Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux Code RIHN E003 Signification biologique du paramètre Le contenu en ADN d’une cellule peut être mesuré de façon précise en cytométrie en flux en utilisant un intercalant fluorescent, se liant à l’ADN cellulaire de façon stœchiométrique. Ainsi, les différentes phases du cycle cellulaire, de G0 à G2 se traduisent par une fluorescence croissante de la cellule. Appliquée à une population tumorale, cette méthode permet de mesurer le taux de prolifération cellulaire. Une évaluation précise des populations en phase G0/G1, en phase S et en phase G2 peut être dérivée des histogrammes de fluorescence. Cette méthode permet aussi d’évaluer la ploïdie, les cellules hypoploïdes ayant une fluorescence diminuée par rapport à des cellules témoins quiescentes (par exemple des lymphocytes) alors que les clones hyperploïdes ont une fluorescence augmentée. Enfin, les cellules en apoptose présentent une fluorescence en sub-G1 caractéristique traduisant la perte progressive d’ADN consécutive à la fragmentation des nucléosomes. Nature du prélèvement La mesure du cycle cellulaire en cytométrie en flux permet d’apprécier la ploïdie et le taux de prolifération des leucémies aiguës. C’est un examen qui n’a pas d’application directe, sauf pour une appréciation rapide de la ploïdie qui a une valeur pronostique dans les leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL) de l’enfant. Ce résultat est également obtenu, mais après quelques jours, par l’étude du caryotype en cytogénétique hématologique ou en SNP (Single Nucleotide Polymorphism) array qui qualifie les gains et les pertes de chromatine. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de seconde intention après le diagnostic. Sang périphérique ou aspiration médullaire. Recommandations pour la qualité du prélèvement Acheminement rapide au laboratoire. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Mode de conservation Température ambiante. Principe méthodologique Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette technique de cytométrie en flux consiste à incuber un aliquote de sang ou de moelle osseuse (100 µL) avec une solution contenant un perméabilisant des membranes, de la RNAse (pour éviter le marquage de l’ARN) et un intercalant fluorescent tel que l’iodure de propidium. Le perméabilisant lyse les hématies et permet à l’intercalant de pénétrer jusqu’au noyau des leucocytes. L’ADN des cellules devient alors fluorescent avec une intensité proportionnelle à sa quantité. Les cellules quiescentes ou en phase G1 (2 N d’ADN) émettent une fluorescence deux fois moindre que les cellules en phase G2 (4 N). La quantité d’ADN peut être évaluée de façon plus précise en utilisant un étalon interne (hématies de poussin haploïdes, ou lymphocytes sanguins humains diploïdes). Les cellules en phase S émettent une fluorescence intermédiaire entre ces deux valeurs. Des logiciels spécifiques établissent les gaussiennes des pics G1 et G2 et extrapolent la courbe de la phase S. Ils permettent une quantification de chaque population. Un marquage préalable d’antigènes de différenciation exprimés à la surface des sous-populations cellulaires permet d’isoler la population d’intérêt (blastes) de façon précise. 36 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Sang périphérique ou aspiration médullaire. Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure quantitative. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Les logiciels d’intégration des signaux de fluorescence permettent de déterminer précisément le pourcentage de cellules à chaque phase du cycle cellulaire ou aneuploïdes. Il est important, lors de l’analyse, d’éliminer les doublets qui par définition donnent un signal 4N et peuvent être confondus avec des cellules en phase G2. Chapitre 2. Cytométrie en flux 37 Fiche 2.6 Lymphocytes T helper/suppresseurs Code NABM 1122 Signification biologique du paramètre Les lymphocytes T représentent la population lymphocytaire sanguine majoritaire. Ces lymphocytes matures sont caractérisés par l’expression du complexe moléculaire CD3 (chaînes gamma, delta, epsilon (× 2), zeta-zeta ou zeta-eta : γε, εδ, ζζ/ζη). Ils comportent deux sous-populations caractérisées par l’expression (normalement mutuellement exclusive) des antigènes de différenciation CD4 et CD8. Les lymphocytes T CD4+ sont aussi appelés lymphocytes helper ou auxiliaires. Leur rôle est de reconnaître des antigènes exogènes présentés par une molécule de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH, système HLA chez l’homme). La reconnaissance d’un fragment d’antigène (épitope), niché dans le sillon d’une molécule CMH II, par le récepteur du lymphocyte T (T-cell Receptor, TCR), n’entraîne l’activation du lymphocyte que si la molécule CD4 se fixe à la molécule de CMH. L’activation des lymphocytes CD4 est nécessaire à la mise en place d’une réponse immunitaire spécifique, de par le rôle de ces cellules pour stimuler les autres acteurs de cette réponse. Les lymphocytes T CD8+ sont aussi appelés lymphocytes suppresseurs ou cytotoxiques. À l’instar des CD4, ils assurent que l’épitope reconnu par le TCR est niché dans le sillon d’une molécule CMH I. L’antigène est dans ce cas endogène et les réponses CD8 visent essentiellement à éliminer les cellules qui Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation le présentent (cellules tumorales ou infectées par un virus). Les nombres et proportions de ces différentes populations sont très régulés et leurs variations sont indicatives de divers types de pathologies. La mesure des lymphocytes T helper/ suppresseurs est le plus souvent associée à celle des autres types lymphocytaires, lymphocytes B (CD19+) et cellules Natural Killer (NK, CD16+ et/ou CD56+ et/ou CD57+). Tous ces éléments cellulaires peuvent également être recherchés dans d’autres échantillons (voir infra). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’immunophénotypage lymphocytaire vise à évaluer les proportions des différentes sous-populations, le plus souvent à la suite d’un hémogramme anormal, ou sur la base d’éléments cliniques. Les sous-populations lymphocytaires sont perturbées en cas de syndrome lymphoprolifératif, de déficit immunitaire, d’infections, de maladies autoimmunes ou de lymphocytose réactionnelle. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration C’est un examen le plus souvent de seconde intention, parfois réalisé concomitamment à l’hémogramme. Il peut également être réalisé dans le suivi des patients. Sang ou moelle sur EDTA. Liquides d’épanchement, liquide céphalo-rachidien (aussi appelé fluide cérébro-spinal), liquides de lavage bronchoalvéolaire, tissus frais dissociés. L’utilisation d’un anticoagulant n’est pas nécessaire en dehors du sang et de la moelle, mais il convient de vérifier la qualité hémorragique ou non du prélèvement. Examen à réaliser de préférence dans les 24 h. Température ambiante ou + 4 °C. 38 Cytologie : tests généraux Principe méthodologique Type de méthode Type de test Cet examen est réalisé en cytométrie en flux multiparamétrique, généralement avec un seul mélange d’anticorps monoclonaux (panel), conjugués à différents fluorochromes, dans un seul tube. Il existe des variantes selon les laboratoires quant au panel utilisé et à la réalisation d’une lyse des hématies avec ou sans lavage après l’incubation. Pour la réalisation d’une numération concomitante des sous-populations, il convient de ne pas laver l’échantillon après la lyse et d’utiliser un volume connu de billes calibrées permettant, par une série de règles de trois, d’obtenir la valeur absolue de chaque sous-population (technique single platform). Sinon, les proportions en pourcentages peuvent être rapportées à la valeur absolue des lymphocytes obtenue sur un hémogramme. Méthode manuelle pouvant être semi (préparation) ou totalement automatisée. Mesure qualitative et quantitative. CIQ Maison. EEQ Oui, commerciaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les valeurs de référence publiées dans la littérature tiennent compte de l’âge et du genre. De manière schématique, les lymphocytes T totaux CD3+ représentent 70 à 80 % des lymphocytes, avec 6 à 15 % de lymphocytes B et 6 à 15 % de cellules NK. Les cellules CD3+/ CD4+ et CD3+/CD8+ sont dans des proportions 2/3-1/3, soit globalement 45 % et 25 % des lymphocytes totaux. Il existe dans le sang périphérique normal de petites proportions de lymphocytes T double positifs ou double négatifs pour CD4 et CD8. Ces petites populations peuvent augmenter en cas d’infection ou de syndrome lymphoprolifératif T. L’index d’immunorégulation CD4/CD8 est typiquement inversé (abaissé) en cas d’infection virale et augmenté en cas d’infection bactérienne ou de maladie auto-immune, attirant l’attention vers la recherche d’autres signes cliniques ou perturbations biologiques. Causes d’erreur, limites du test Échantillon coagulé, lyse défectueuse, oubli d’un anticorps, stratégie de gating inappropriée. Bibliographie du chapitre 2 FICHE 2.1 – Phénotypage des cellules anormales (moelle ou sang) Matutes E, Owusu-Ankomah K, Morilla R, et al. The immunological profile of B-cell disorders and proposal of a scoring system for the diagnosis of CLL. Leukemia 1994;8:1640–5. Béné MC, Castoldi G, Knapp W, et al. Proposals for the immunological classification of acute leukemias. European Group for the Immunological Characterization of Leukemias (EGIL). Leukemia 1995;9:1783–6. Lacombe F, Durrieu F, Briais A, et al. Flow cytometry CD45 gating for immunophenotyping of acute myeloid leukemia. Leukemia 1997;11:1878–86. Arnoulet C, Béné MC, Durrieu F, et al. Fourand five-color flow cytometry analysis of leukocyte differentiation pathways in normal bone marrow: a reference document based on a systematic approach by the GTLLF and GEIL. Cytometry B Clin Cytom 2010;78:4–10. Béné MC, Nebe T, Bettelheim P, et al. Immunophenotyping of acute leukemia and lymphoproliferative disorders: a consensus proposal of the European LeukemiaNet Work Package 10. Leukemia 2011;25: 567–74. Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VH, et al. EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHB-CT-2006-018708). EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia 2012;26:1986–2010. Porwit A, van de Loosdrecht AA, Bettelheim P, et al. Revisiting guidelines for integration of flow cytometry results in the WHO classification of myelodysplastic syndromes-proposal from the International/European LeukemiaNet Working Group for Flow Cytometry in MDS. Leukemia 2014;28:1793–8. Selimoglu-Buet D, Wagner-Ballon O, Saada V, et al. Francophone Myelodysplasia Group. Characteristic repartition of monocyte subsets as a diagnostic signature of chronic myelomonocytic leukemia. Blood 2017;130:832–5. Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S, et al. Minimal/ measurable residual disease in AML: consensus document from ELN MRD Working Party. Blood 2018;. 131:1275-91. FICHE 2.2 – Quantification des cellules CD34+ Sutherland DR, Keating A, Nayar R, et al. Sensitive detection and enumeration of CD34+ cells in peripheral and cord blood by flow cytometry. Exp. Hematol 1994;22:1003–10. Chapitre 2. Cytométrie en flux 39 Krause DS, Fackler MJ, Civin CI, et al. CD34 : structure, biology, and clinical utility. Blood 1996;87:1–13. Gratama JW, Kraan J, Keeney M, et al. Validation of the single-platform ISHAGE method for CD34+ hematopoietic stem and progenitor cell enumeration in an international multicenter study. Cytotherapy 2003;5:55–65. FICHE 2.3 – Hémoglobinurie Paroxystique Nocturne (HPN) Borowitz MJ, Craig FE, Digiuseppe JA, et al. Clinical Cytometry Society. Guidelines for the diagnosis and monitoring of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow cytometry. Cytometry part B 2010;78:211–30. Debliquis A, Wagner-Ballon O, Le Garff-Tavernier M, et al. HPN-AFC Group. Évaluation of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria screening by flow cytometry through multicentric interlaboratory comparison in four countries. Am J Clin Pathol 2015;144:858–68. FICHE 2.4 – Marquage cellulaire quel qu’il soit en cytométrie en flux (par anticorps) Porwit A, Béné MC. Multiparameter Flow Cytometry in the Diagnosis of Hematologic Malignancies. Cambridge University Press; 2018. FICHE 2.5 – Analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux Lacombe F, Belloc F. Flow cytometry study of cell cycle, apoptosis and drug resistance in acute leukemia. Hematol Cell Ther 1996;38:495–504. Noh OK, Park SJ, Park HJ, et al. Re-evaluation of DNA Index as a Prognostic Factor in Children with Precursor B Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Ann Clin Lab Sci 2017;47:535–40. FICHE 2.6 – Lymphocytes T helper/suppresseurs Wucherpfennig KW, Gagnon E, Call MJ, et al. Structural biology of the T-cell receptor: insights into receptor assembly, ligand recognition, and initiation of signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol 2009;2:a0051401. Maecker HT, McCoy JP, Nussenblatt R. Standardizing immunophenotyping for the Human Immunology Project. Nat Rev Immunol 2012;12:191–200. Kalina T, Flores-Montero J, van der Velden VH, et al. EuroFlow Consortium (EU-FP6, LSHBCT-2006-018708). EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia 2012;26:1986–2010. Rajab A, Axler O, Leung J, et al. Ten-color 15-antibody flow cytometry panel for immunophenotyping of lymphocyte population. Int J Lab Hematol 2017;39(Suppl 1):76–85. Chapitre 3 Exploration des pathologies érythrocytaires Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 42 Cytologie : tests généraux Fiche 3.1 Recherche d’anomalies morphologiques des globules rouges sur frottis (recherche de schizocytes, hématies cibles, drépanocytes, elliptocytes, sphérocytes, etc.) Code RIHN E011 Signification biologique du paramètre Tests cytologiques permettant la mise en évidence et l’évaluation d’anomalies morphologiques des hématies et/ou d’inclusions intra-érythrocytaires. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : mise en évidence d’hématies de morphologie anormale ou contenant des inclusions. Ces anomalies permettent souvent d’orienter le diagnostic et de guider les explorations nécessaires en seconde intention, réduisant ainsi le temps et le coût des investigations. Indications : test à réaliser dans un contexte d’anémie arégénérative ou régénérative, dans le cadre d’une hémolyse chronique ou aiguë ou d’une hémolyse compensée sans anémie. L’analyse peut être globale ou orientée par la clinique : • recherche de paludisme et parasitémie ; • recherche et compte de schizocytes : hémolyses mécaniques, syndrome hémolytique urémique (SHU), purpura thrombotique thrombocyto­ pénique (PTT), prothèse cardiaque, coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), gros angiomes ; • hématies cibles : carences en fer, certaines hémoglobinopathies ; • drépanocytes : syndromes drépanocytaires majeurs ; • elliptocytes : selon le nombre, elliptocytose héréditaire, pyropoïkilocytose (HPP) ; • sphérocytes : sphérocytose héréditaire (SH), anémies hémolytiques auto-immunes de l’adulte ou incompatibilité ABO du nouveau-né/anémies allo-immunes, sphérocytes de reformation dans les hémoglobinopathies, HPP ; • autres anomalies associées à la SH : cellules en forme de champignon, acanthocytes, sphéroacantocytes ; • stomatocytes : stomatocytose héréditaire ; • ponctuations basophiles : intoxication au plomb, déficit en pyrimidine 5’ nucléotidase, thalassémies ; • « hémighosts » et « ghosts » dans un déficit en G6PD en crise ; • acanthocytes dans un contexte d’hépatopathie. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de première intention permettant d’orienter le diagnostic étiologique d’une anémie ou d’une hémolyse. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé, retournement du tube afin d’homogénéiser le sang. Avant transfusion, pour une analyse de la morphologie des hématies du patient. Délai le plus court possible entre la réalisation du prélèvement, l’envoi au laboratoire d’hématologie et l’étalement du frottis. Impossibilité de délai dans la réalisation du frottis pour l’analyse de la morphologie des hématies. Une fois le frottis réalisé et coloré, conservation possible des lames lutées à température ambiante. Technique cytologique. Frottis sanguin coloré au MGG et examiné au microscope optique. Méthode manuelle ou automatisée de réalisation de frottis et de coloration MGG. Mesure qualitative : description des anomalies morphologiques des hématies. Méthode semi-quantitative : pourcentage de cellules affectées (schizocytes, hématies infectées par du paludisme). CIQ Non. EEQ EEQ national sous forme de lames. Programme européen HEMAtimage. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Test très performant dans le bilan d’une anémie ou d’une hémolyse, compensée ou non, pour le diagnostic étiologique, l’orientation diagnostique et la prescription des examens complémentaires. Test rapide, peu coûteux, réalisable sans automatisation poussée mais nécessitant une expertise humaine. Causes d’erreur, limites du test Tenant à la technique : délai de réalisation du frottis trop long par rapport au prélèvement, responsable d’anomalies morphologiques artéfactuelles, problèmes de coloration (réactifs ou problème d’étaleur/colorateur si frottis automatisé) responsables souvent de la perte du halo central des hématies rendant tout examen cytologique des hématies impossible. Tenant à l’échantillon : cellules d’intérêt fragiles et détruites (hémolyse). Analyse morphologique des hématies du patient impossible après transfusion. Limites : nécessite des examinateurs entraînés. 43 44 Cytologie : tests généraux Fiche 3.2 Drépanocytes : recherche (test de falciformation) Code NABM 1111 Signification biologique du paramètre Le test de falciformation est un test cytologique permettant la mise en évidence et l’évaluation du nombre d’hématies falciformes, contenant de grandes quantités d’hémoglobine S (HbS), dans un échantillon sanguin. C’est un test dynamique, basé sur la propriété de polymérisation de l’HbS en situation d’hypoxie, entraînant in vitro la déformation des hématies en forme de faux ou faucille (hématies falciformées ou falciformes). Le terme « drépanocytes » est plutôt réservé à la mise en évidence d’hématies falciformes à l’examen d’un frottis sanguin coloré au MGG. Le test de falciformation est aussi appelé test d’Emmel, du nom de son découvreur en 1917, Victor E. Emmel. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Ce test est réalisé pour le diagnostic d’un syndrome drépanocytaire majeur en situation d’urgence, lorsqu’une étude de l’hémoglobine et un dosage d’HbS, qui sont des techniques longues, sont impossibles à réaliser chez un sujet non connu pour cette pathologie. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de première intention et d’urgence. Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement : 2 h. Température ambiante ou + 4 °C. Technique cytologique. Le sang total est mis en contact avec une solution de métabilsufite de sodium (agent réducteur) à 2 % préparée extemporanément, qui accélère la falciformation en induisant une hypoxie rapide. Incubation en chambre humide et lecture entre lame et lamelle à l’objectif × 40. Méthode manuelle. Mesure qualitative et semi-quantitative. CIQ Pas de CQI commercial, il est recommandé de tester en parallèle un contrôle négatif (sujet non drépanocytaire) et si possible un contrôle positif (sujet drépanocytaire majeur connu) EEQ Contrôles interlaboratoires. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Le test permet d’identifier la présence d’hématies falciformes. Des faux négatifs peuvent être liés à une transfusion récente ou à des taux élevés d’hémoglobine fœtale (HbF). Chez les sujets porteurs d’un trait drépanocytaire (hétérozygotie AS de la globine), le test peut être très faiblement positif ou négatif. Attention : la présence de rouleaux d’hématies (hématies vues de profil) peut faire croire à tort à la présence d’hématies falciformes. D’autres variants de la globine peuvent entraîner une falciformation (HbC Harlem). Le test ne permet pas d’apprécier le taux d’HbS. Cependant, en cas de falciformation importante, le diagnostic de syndrome drépanocytaire majeur est probable. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 45 Fiche 3.3 Corps de Heinz (recherche) Code NABM 1110 Signification biologique du paramètre Les corps de Heinz sont des inclusions intra-érythrocytaires liées à la précipitation d’hémoglobine dénaturée/oxydée (hémichromes). Ils se recherchent par coloration supra-vitale d’un frottis sanguin telle que les colorations au bleu de crésyl brillant ou au violet de méthyle. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette recherche est indiquée dès lors qu’une dénaturation oxydative de l’hémoglobine est suspectée : dans les hémolyses dues à une hémoglobine instable (anémie hémolytique de transmission dominante), mais aussi crise hémolytique aiguë d’un déficit en G6PD. Enfin, elle montre des images caractéristiques en « balles de golf » dans les thalassémies α du fait de la formation de Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation tétramères de chaînes de β globine très instables (surtout visibles en cas d’hémoglobinose H). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration • Examen de seconde intention devant une hémolyse chronique inexpliquée à test de Coombs négatif, après élimination de causes plus fréquentes (hémoglobinopathies, sphérocytose héréditaire, déficit enzymatique en pyruvate kinase) dans le but de rechercher une hémoglobine instable. • Examen pouvant être réalisé à but diagnostique en phase aiguë devant une crise d’hémolyse intravasculaire avec suspicion de déficit en G6PD (contexte clinique, présence d’hémighost ou hématies « mordues » sur le frottis sanguin coloré au MGG). • Les corps de Heinz sont décrits dans d’autres causes plus rares de stress oxydatif in vivo, notamment la maladie de Wilson. Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 24 h et le plus rapide possible. Conservation à + 4 °C. Principe méthodologique Il s’agit d’une technique cytologique. Dilution de 1 mL sang dans 0,5 mL d’une solution de bleu de crésyl. Incubation à + 37 °C pendant 20 min, 2 h, 4 h et 24 h. Étalement sur lames à chaque temps d’incubation. Lecture au microscope à immersion. Les corps de Heinz typiques sont des inclusions intra-érythrocytaires dont l’aspect dépend du degré d’instabilité de l’hémoglobine. Dans les alpha-thalassémies, ils prennent l’aspect de ponctuations fines réparties sur toute la surface érythrocytaire, en « balles de golf », associées souvent à de plus grosses inclusions. Il ne faut pas les confondre avec les réticulocytes dont les inclusions ont un aspect réticulé. En cas d’hémoglobine instable, l’aspect typique des hémichromes est une (ou plusieurs) inclusion(s) juxta-membranaire(s) de plus ou moins grande taille, en « méduse ». À noter que leur nombre augmente après splénectomie. Type de méthode Méthode manuelle. Une nouvelle méthode en cytométrie en flux a été publiée en 2017, mais reste à valider à ce jour. Type de test Mesure qualitative. 46 Cytologie : tests généraux CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Test permettant avant tout une orientation diagnostique rapide d’hémoglobine instable (hémolyse chronique) ou de déficit en G6PD (hémolyse intravasculaire aiguë) avant examens de confirmation. Sensibilité faible. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 47 Fiche 3.4 Test de Kleihauer Code NABM2109 Signification biologique du paramètre Ce test cytologique permet la mise en évidence et l’évaluation du nombre d’hématies fœtales (contenant majoritairement de l’hémoglobine fœtale, HbF) parmi les hématies présentes dans un échantillon sanguin. Il est basé sur les propriétés de résistance de l’HbF aux agents acides. Il permet de calculer le volume de sang fœtal correspondant à ce nombre d’hématies. Synonyme : élution acide. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif dépend de l’indication. Les principales indications sont : • prévention de l’immunisation rhésus fœtomaternelle : l’objectif est de quantifier le pourcentage d’hématies fœtales circulant dans le sang maternel en post-partum ou pendant la grossesse, afin d’adapter la dose d’immunoglobulines (Ig) anti-D à injecter à la mère. Toute femme RhD- ayant un bébé RhD+ doit obligatoirement recevoir une dose standard d’Ig anti-D. Celle-ci est de 1 000 UI (200 µg en France) et permet de neutraliser au maximum 4 mL de sang fœtal transfusé. Si la quantité de sang fœtal calculée à Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique partir du test est supérieure à 4 mL, des doses supplémentaires doivent être administrées à la mère dans un délai de 72 h maximum ; • évaluation de pertes fœtales (transfusion fœtomaternelle) durant la grossesse, quel que soit le rhésus de la mère. Lors de traumatismes ou de gestes invasifs, de souffrance ou de mort fœtale durant la grossesse, un passage d’hématies fœtales peut survenir. Le test de Kleihauer permet de quantifier ce volume afin d’envisager la prise en charge obstétricale adéquate. Deux situations sont plus rares : • identification de la distribution pan ou hétérocellulaire de l’HbF en cas de suspicion de persistance héréditaire d’HbF (PHHF), de thalassémie, etc. ; • transfusion ou greffe non compatible RhD afin d’adapter la prise en charge. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit d’un examen de première intention. La quantification par cytométrie en flux peut être indiquée en cas de difficulté diagnostique ou afin de quantifier plus précisément un passage important d’hématies fœtales. Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 48 h et la plus rapide possible afin de respecter le délai de 72 h pour une éventuelle réinjection d’Ig anti-D dans le cas de la prévention de l’immunisation Rh materno-fœtale. Température ambiante ou + 4 °C. Technique cytologique. Frottis sanguin coloré. Élution acide des hémoglobines non fœtales. L’HbF résiste à l’élution acide et peut être colorée par de l’érythrosine. 48 Cytologie : tests généraux Type de méthode Type de test Méthode manuelle. Mesure semi-quantitative. CIQ Des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine. Des contrôles internes positifs et négatifs peuvent être utilisés : sang adulte masculin sans anomalie de l’hémogramme et sang fœtal. EEQ Pas d’EEQ national. EEQ européen (UK NEQAs). Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Peu sensible mais doit permettre de repérer les cas rares de passage massif d’hématies fœtales (< 1 % des femmes RHD- d’après la BSH) afin d’éviter l’immunisation. Les principales causes d’erreur sont la présence d’hématies maternelles contenant de l’HbF (thalassémie, PHHF) ou la présence d’hématies fœtales dégradées provenant d’un passage fœto-maternel ancien, rendant la lecture difficile au microscope, voire impossible. Un contrôle en cytométrie en flux est alors souhaitable. Cette technique cytologique comporte une part de subjectivité. Il est important de disposer de contrôles internes réguliers encadrant la technique. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 49 Fiche 3.5 Résistance globulaire osmotique Code NABM 1112 Signification biologique du paramètre La résistance globulaire osmotique teste in vitro la fragilité des globules rouges en les plaçant dans des solutions salines de concentrations progressivement décroissantes. La résistance globulaire est diminuée (décalage de la courbe vers la droite) dans les formes acquises de sphérocytose (anémie hémolytique auto-immune notamment) et dans la sphérocytose héréditaire (SH, maladie de Minkowski Chauffard). La résistance globulaire est augmentée (décalage de la courbe vers la gauche) dans les thalassémies, la drépanocytose, l’hémoglobinose C. Le test peut être sensibilisé par une incubation des globules rouges à + 37 °C pendant 24 h. Synonyme : test de sensibilité globulaire à l’hypotonie. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Ce test a été utilisé historiquement pour le diagnostic de thalassémie (déviation de courbe vers la gauche), puis pour celui de SH (déviation de la Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique courbe vers la droite). Le diagnostic de SH repose désormais sur des tests plus sensibles et plus spécifiques comme le test à l’éosine maléimide ou 5’ eosine maléimide (EMA) en cytométrie en flux, complété, si nécessaire, d’une ektacytométrie. Ce test n’est donc pas indiqué en première intention pour le diagnostic d’une SH. Il peut être utile pour une orientation diagnostique de SH ou dans de rares formes d’associations complexes, SH plus thalassémie, par exemple. Ce test peu sensible et peu spécifique est amené à disparaître avec le développement d’autres méthodes plus facilement standardisables. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Ce test n’est pas indiqué en première intention pour le diagnostic de la SH en raison de sa faible spécificité et sensibilité. Il est désormais remplacé par des analyses plus sensibles. Il peut être utilisé en examen de deuxième intention à réserver à des patients présentant des pathologies complexes ou très rares de la membrane érythrocytaire. Sang total sur héparine (2 tubes pour la résistance après 24 h d’incubation). Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 3 h. Température ambiante. Il s’agit d’une technique biochimique. Le test est effectué sur un culot globulaire lavé. Une gamme de solutions d’osmolarité décroissante est établie à partir d’une solution isotonique. Le sang du patient (et en parallèle d’un témoin) est mis au contact et la densité optique est mesurée après centrifugation afin d’évaluer le pourcentage d’hémolyse pour chaque tube de la gamme. Une courbe d’hémolyse peut être tracée. Les valeurs du patient sont comparées aux valeurs cibles établies sur une population contrôle ainsi qu’à celle du témoin. 50 Cytologie : tests généraux Type de méthode Type de test Méthode manuelle. Méthode qualitative : déviation à droite → résistance diminuée ou à gauche → résistance augmentée. CIQ Pas de CIQ commercial, il est recommandé de tester en parallèle un contrôle. EEQ Contrôles interlaboratoires. Valeurs de référence/Interprétation et performances La résistance globulaire est diminuée dans la maladie de Minkowski-Chauffard (SH), l’elliptocytose héréditaire, les anémies hémolytiques auto-immunes (AHAI). La résistance est augmentée dans les syndromes thalassémiques, la drépanocytose, la xérocytose héréditaire (stomatocytose déshydratée). La sensibilité du test a été estimée à 68 % sur sang frais et 81 % sur sang incubé pour le diagnostic de SH. Causes d’erreur, limites du test Une transfusion récente, les déficits enzymatiques (G6PD, pyruvate kinase), les hémoglobines instables et la présence de taux d’HbF élevés peuvent modifier la sensibilité aux solutions hypotoniques. L’association de pathologies (par exemple SH plus thalassémie) peut normaliser le test. La sensibilité du test est faible pour la SH. Ce test ne doit pas être utilisé en première intention pour cette indication, d’autres tests (pink test, test à l’EMA en cytométrie en flux) permettant un diagnostic plus fiable. Le test garde un intérêt pour mettre en évidence une augmentation de la résistance globulaire dans certaines pathologies rares (xérocytose) ou des associations complexes. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 51 Fiche 3.6 Mise en évidence d’anomalies du cytosquelette du globule rouge en cytométrie en flux (test à l’EMA) Code RIHN E149 Signification biologique du paramètre La sphérocytose héréditaire (SH) est une pathologie constitutionnelle de la membrane du globule rouge (GR) faisant partie des anémies hémo­ lytiques (AH) corpusculaires. Elle est due à des mutations dans une des protéines de la membrane du GR, impliquées dans les connexions verticales au sein du complexe protéique ankyrine du cytosquelette. La déstabilisation de la membrane des GR entraîne une perte de surface, sous forme de gouttelettes lipidiques, responsable de la formation de sphérocytes (GR sphériques sans halo central, hyperdenses et de petite taille). Ceci entraîne une réduction des sites de fixation du 5’ eosine maléimide (EMA) qui se fixe sur une lysine de la protéine Band 3, majoritaire à la membrane du GR. Dans la SH, la cytométrie en flux objective cette perte de fluorescence après marquage à l’EMA des GR. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le test EMA est prescrit dans le bilan d’une AH, pour le diagnostic de SH et le diagnostic différentiel SH/anémie hémolytique auto-immune (AHAI)/incompatibilité ABO (incABO) du Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test CIQ nouveau-né. Dans ces pathologies, la perte de surface de la membrane du GR conduit à la formation de sphérocytes, avec des mécanismes différents. Dans la SH, le test EMA est positif si > 21 % alors qu’il est négatif si < 16 %5 dans les AHAI. Ce seuil (cut-off) reste discuté selon les équipes. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le test EMA est un test de première intention dans le diagnostic étiologique d’une AH, devant des signes cliniques d’hémolyse chronique (ictère, splénomégalie), confirmée par l’hémogramme : anémie de sévérité variable, microcytaire si taux élevé de sphérocytes, normo ou hyperchrome (CCMH > 36 g/dL car perte de surface à contenu érythrocytaire identique) régénérative (petits réticulocytes > 150.109/L). S’y associent des signes biochimiques d’hémolyse : bilirubine libre ou indirecte élevée, haptoglobine effondrée (interprétable après 1 an de vie) et LDH élevée. Un test limite (16-21 % ou 11-21 % selon les publications) impose une ektacytométrie. Un test de Coombs érythrocytaire est systématiquement associé au test EMA dans le bilan diagnostique étiologique d’une AH pour le diagnostic différentiel SH/AHAI/incABO. Sang veineux sur EDTA (minimum 500 microlitres). À réception, choisir 3 à 6 prélèvements témoins appariés en âge, avec indices érythrocytaires normaux, conservés dans les mêmes conditions que le prélèvement du patient. Avant toute transfusion au diagnostic ou 3 mois après la dernière transfusion. Associer un frottis sanguin fait sur place. Envoi à + 4 °C, tube non en contact direct avec la glace ou la source de froid. Délai maximum de 7 jours entre le prélèvement et le test, à + 4 °C. Cytométrie en flux après marquage des hématies à l’EMA. Cytométrie en flux, interprétation par un spécialiste. Mesure quantitative. Non. 52 Cytologie : tests généraux EEQ Non commercialisé. Valeurs de référence/Interprétation et performances Pour le diagnostic de SH : sensibilité 97,4 % ; spécificité 93,4 %. Causes d’erreur, limites du test Faux positifs : pyropoïkilocytose, ovalocytose mélanésienne (SAO), dysérythropoïèse congénitale de type II, cryohydrocytose. Faux négatifs : transfusion récente, SH associée à une autre pathologie du GR. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 53 Fiche 3.7 Recherche des pathologies constitutionnelles de la membrane du globule rouge en ektacytométrie Code RIHN E027 Signification biologique du paramètre Les pathologies constitutionnelles de la membrane érythrocytaire (PCME) sont un groupe hétérogène de pathologies constitutionnelles qui se caractérisent par une anémie hémolytique corpusculaire se manifestant cliniquement par les signes classiques de l’anémie (pâleur, asthénie, dyspnée d’effort, tachycardie avec souffle systolique anorganique) associés aux signes de l’hémolyse chronique (ictère, splénomégalie). Ceci se traduit par une anémie régénérative (compte réticulocytaire > 150.109/L) avec un volume des hématies et une chromie variables selon les PCME. Des mutations dans des gènes de protéines de la membrane érythrocytaire ou dans des transporteurs membranaires sont responsables de ces pathologies. Les complexes protéiques ankyrine et 4,1 R sont majeurs au sein de la membrane du globule rouge. Ils permettent un ancrage des protéines au sein de la bicouche phospholipidique en lien avec le cytosquelette de spectrine. Le complexe ankyrine est impliqué dans les connexions protéiques verticales de la membrane érythrocytaire alors que le complexe 4.1R est impliqué dans les connexions protéiques horizontales. Une mutation dans une des protéines du complexe ankyrine est responsable d’une sphérocytose héréditaire (SH). La perte de cohésion de la membrane et la formation de vésicules lipidiques entraînent une perte de surface et la formation de sphérocytes. Une mutation dans le complexe 4.1R, est responsable d’une elliptocytose héréditaire avec une stabilité membranaire diminuée conduisant à une fragmentation devenant majeure dans la forme sévère de l’elliptocytose ou pyropoïkilocytose (association d’une mutation du gène de la spectrine au polymorphisme alpha Lely en trans). Les stomatocytoses sont des PCME très hétérogènes caractérisées par une fuite cationique. Il en résulte un contenu cationique anormal et des altérations du volume et de la chromie érythrocytaire. Les PCME sont phénotypiquement très hétérogènes, asymptomatiques à sévères, de révélation in utero parfois par un hydrops fetalis. Les formes asymptomatiques doivent être également diagnostiquées, notamment les stomatocytoses, en raison de la surcharge en fer qui conditionne le pronostic. La technique de référence pour le diagnostic de ces pathologies est l’ektacytométrie. L’ektacytomètre est un viscosimètre qui mesure la déformabilité des globules rouges dilués dans une solution visqueuse de PVP, soumis à des forces de cisaillement définies et à un gradient osmolaire. La courbe ektacytométrique obtenue permet d’individualiser 3 points : • le point Omin qui correspond à l’osmolarité à laquelle 50 % des GR sont lysés dans le test de résistance osmotique et représente le rapport surface/volume ; • l’index de déformabilité maximale (DImax) ; • le point O’ ou hyper, osmolarité à la moitié de la DImax qui reflète l’état d’hydratation des GR. La courbe ektacytométrique doit toujours s’interpréter avec les indices érythrocytaires, réticulocytaires, l’analyse des graphes des automates de NFS, l’examen microscopique d’un frottis sanguin, le test EMA, le bilan d’hémolyse et les autres bilans d’une anémie hémolytique (électrophorèse de l’hémoglobine, mesure des activités G6PD/PK, test de Coombs). Dans les cas difficiles de PCME sans diagnostic établi par l’ektacytométrie, chez les patients polytransfusés sans réalisation possible des tests fonctionnels ou dans les associations de pathologies érythrocytaires, un bilan moléculaire peut être associé (Next Generation Sequencing [NGS] ciblé). 54 Cytologie : tests généraux L’électrophorèse des protéines de la membrane érythrocytaire reste surtout utile dans le diagnostic différentiel d’une SH avec une CDAII (Congenital Dyserythropoietic Anemia type 2, faux positif de la courbe ektacytométrique pour le diagnostic de SH). Dans ce cas, on observe un pincement de la protéine band 3. Elle est en revanche de sensibilité plus faible que le NGS ciblé et difficile d’interprétation compte tenu du nombre important de réticulocytes qui surestiment la quantité des protéines de la membrane et peut masquer le défaut protéique. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’ektacytométrie est prescrite dans le cadre général du bilan d’une anémie hémolytique. Elle est utilisée dans le diagnostic des PCME, en particulier de la sphérocytose héréditaire, de l’elliptocytose héréditaire non sévère et sévère (HPP ou pyropoïkilocytose), de l’ovalocytose mélanésienne Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement et des stomatocytoses deshydratées (xérocytose) ou hyperhydratées. L’ektacytométrie est la technique de référence pour ces diagnostics. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Elle dépend de la disponibilité sur le site d’un ektacytomètre car cet examen spécialisé est réalisé dans des laboratoires de référence. Elle est le plus souvent faite en deuxième intention après les tests de routine, le test EMA et lorsque les autres examens à visée diagnostique réalisés dans le cadre d’une anémie hémolytique sont négatifs. Elle est réalisée en bilan initial dans un site spécialisé avec l’ensemble du bilan diagnostique des PCME incluant maintenant des tests moléculaires. Ces derniers sont réalisés en seconde intention et selon les résultats des tests fonctionnels de la NFS/réticulocytes/morphologie des GR/test EMA et ektacytométrie. Sang veineux sur EDTA (minimum 500 microlitres). À réception, choisir un témoin apparié en âge, avec indices érythrocytaires normaux, conservé dans les mêmes conditions que le prélèvement du patient. Avant toute transfusion au diagnostic ou 3 mois après la dernière transfusion. Associer un frottis sanguin fait sur place. Acheminement Envoi rapide à + 4 °C, tube non en contact direct avec la glace ou la source de froid. Mode de conservation Délai maximum de 48 h maximum entre le prélèvement et la réalisation de l’examen. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Mesure de la déformabilité des hématies en gradient osmolaire et soumises à des forces de cisaillements définies. Méthode automatisée, interprétation par un spécialiste. Mesure quantitative. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Examen de référence. Faux positifs : CDAII, Anémie Hémolytique auto-immune, incompatibilité ABO, qui miment la courbe ektacytométrique d’une sphérocytose héréditaire. Faux négatifs : ektacytométrie réalisée après une transfusion récente, association d’une pathologie de la membrane à une autre pathologie du globule rouge qui peut fausser l’aspect caractéristique de la courbe pour une PCME donnée. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires 55 Fiche 3.8 Facteur de croissance : dosage de l’erythropoïétine sérique ou plasmatique Code NABM 0763 Signification biologique du paramètre L’érythropoïétine (EPO) est une cytokine qui stimule la formation et la croissance des globules rouges (GR). Elle est principalement produite par le rein. Elle est sécrétée en cas de baisse de la concentration du sang artériel en oxygène, de diminution des GR ou par une augmentation des besoins en oxygène, sa synthèse rénale étant directement et inversement régulée par la tension intra-artérielle rénale en oxygène. L’EPO est le facteur primaire d’induction de l’érythropoïèse par l’hypoxie, car la production de l’EPO par le rein est régulée par l’apport en oxygène. Le dosage de l’EPO sérique participe au diagnostic étiologique d’anémie ou d’érythrocytose (voir ci-dessous). L’administration d’EPO recombinante est un traitement destiné à augmenter le nombre d’érythrocytes. Le dosage d’EPO est utilisé pour établir un pronostic et prédire l’efficacité du traitement chez les individus anémiés. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La concentration sérique en EPO peut être déterminée dans différentes situations cliniques. • La première indication est d’évaluer les capacités de production d’EPO chez les sujets atteints d’insuffisance rénale chronique ou de déterminer si la production d’EPO est adaptée à la sévérité d’une anémie. L’aplasie médullaire, l’anémie hémolytique et l’anémie par carence martiale entraînent une augmentation de l’EPO sérique proportionnelle à la profondeur de l’anémie. Dans l’anémie associée à l’insuffisance rénale, le taux d’EPO est plus bas qu’attendu en fonction de l’hématocrite. • La seconde indication est le diagnostic différentiel des polyglobulies. Un taux bas est un critère de diagnostic de polyglobulie de Vaquez. Un taux élevé dans un contexte de polyglobulie permet d’affirmer l’existence d’une polyglobulie secondaire. Certaines tumeurs secrètent de l’EPO entraînant une polyglobulie secondaire et, dans ce cas, on peut utiliser le dosage d’EPO comme un marqueur tumoral, afin de suivre l’efficacité du traitement. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans les anémies chroniques, le dosage d’EPO est recommandé en cas d’insuffisance rénale afin d’adapter la posologie à la sécrétion d’EPO. Ainsi, dans les syndromes myélodysplasiques, un dosage d’EPO endogène supérieur à 500 mUI/ mL est un argument pour ne pas utiliser d’EPO dans le traitement. A contrario, un taux inférieur à 500 mUI/mL est un argument en faveur d’une bonne réponse au traitement par EPO. Dans l’anémie de l’insuffisance rénale, le taux résiduel d’EPO permet d’orienter sur la nécessité d’une substitution en EPO. Le dosage de l’EPO est indispensable en première intention devant une suspicion de polyglobulie : un taux abaissé ou normal signe la très forte probabilité d’une maladie de Vaquez. A contrario, un taux d’EPO augmenté est un argument fort pour un diagnostic de polyglobulie secondaire. 56 Cytologie : tests généraux Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Sang sur tube sec ou EDTA : à vérifier auprès du laboratoire exécutant. L’indication précise de l’horaire est utile. Il est recommandé de faire le recueil de l’échantillon entre 7 h 30 et 12 h en raison des variations diurnes. Il existe en effet une variation circadienne du taux d’EPO avec des taux circulants plus bas entre 4 h et 12 h par rapport à la période de 16 h à 24 h. Température ambiante si transport rapide, sinon, isolement du plasma ou du sérum réfrigéré à + 4 °C ou congelé à – 20 °C (à vérifier auprès du laboratoire exécutant). Réfrigération pendant 2-3 jours, congélation au-delà. La stabilité à – 15 °C est de 12 mois. Éviter les congélations et décongélations répétées. Aliquoter les échantillons avant de les congeler. Éviter les échantillons hémolysés ou lipidiques. Conditions à vérifier auprès du laboratoire exécutant. Immunodosage de type sandwich manuel ou automatisé sur automate dédié. Méthode manuelle (ELISA) ou automatisée. Mesure quantitative. CIQ CIQ du fournisseur de réactifs, d’un fournisseur de contrôles, pool de sérums. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances La sensibilité du dosage d’EPO pour le diagnostic de polyglobulie primitive (Vaquez) est de l’ordre de 80 % (plus faible que la sensibilité de la mutation JAK2 V617F qui est supérieure à 95 %). Un taux d’EPO élevé est retrouvé dans environ un cas sur deux de polyglobulies secondaires. Causes d’erreur, limites du test Les anticorps utilisés dans les dosages d’EPO reconnaissent les EPO de synthèse. Pour mesurer le taux d’EPO endogène, il faut s’abstenir de faire cette mesure dans les deux semaines suivant la dernière administration. De même, les transfusions ou les saignées modifient les taux d’EPO. Chapitre 3. Exploration des pathologies érythrocytaires Bibliographie du chapitre 3 FICHE 3.1 – Recherche d’anomalies morphologiques des globules rouges sur frottis (recherche de schizocytes, hématies cibles, drépanocytes, elliptocytes, sphérocytes, etc.). Fenneteau O, Hurtaud-Roux MF, Schlegel N. Normal and abnormal cytological aspects of peripheral blood cells in neonates and young children. Ann Biol Clin 2006;64:17–36. Fenneteau O, Maier-Redelsperger M. Apport de l’examen du frottis de sang pour le diagnostic de la pathologie constitutionnelle du globule rouge. 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(http://www.cngof.fr). BCSH Guidelines for the Estimation of Fetomaternal Haemorrhage ; 2009. (British Society for Haematology). FICHE 3.5 – Résistance globulaire osmotique. King MJ, Garçon L, Hoyer JD, et al. International Council for Standardization in Haematology. ICSH guidelines for the laboratory diagnosis of nonimmune hereditary red cell membrane disorders. Int J Lab Hematol 2015;37:304–25. Bianchi P, Fermo E, Vercellati C, et al. Diagnostic power of laboratory tests for hereditary spherocytosis: a comparison study in 150 patients grouped according to molecular and clinical characteristics. Haema­ tologica 2012;97:516–23. Miraglia del Giudice E, Perrotta S, Nobili B, et al. Coexistence of hereditary spherocytosis (HS) due to band 3 deficiency and beta-thalassaemia trait: partial correction of HS phenotype. Br J Haematol 1993;85:553–7. 57 FICHE 3.6 – Mise en évidence d’anomalies du cytosquelette du globule rouge en cytométrie en flux (test à l’EMA). King MJ, Behrens J, Rogers C, et al. Rapid flow cytometric test for the diagnosis of membrane cytoskeleton-associated haemolytic anaemia. Br J Haematol 2000;111:924–33. Kedar PS, Colah RB, Kulkarni S, et al. Experience with eosin-5’-maleimide as a diagnostic tool for red cell membrane cytoskeleton disorders. Clin Lab Haematol 2003;25:373–6. King MJ, Smythe JS, Mushens R. Eosin-5-maleimide binding to band 3 and Rh-related proteins forms the basis of a screening test for hereditary spherocytosis. Br J Haematol 2004;124:106–13. Kar R, Mishra P, Pati HP. Évaluation of eosin-5-maleimide flow cytometric test in diagnosis of hereditary spherocytosis. Int J Lab Hematol 2010;32:8–16. Girodon F, Garçon L, Bergoin E, et al. Usefulness of the eosin-5’-maleimide cytometric method as a first-line screening test for the diagnosis of heredi­tary spherocytosis: comparison with ektacytometry and protein electrophoresis. Br J Haematol 2008;140:468–70. Mayeur-Rousse C, Gentil M, Botton J, et al. 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Mechanical properties of the red cell membrane in relation to molecular structure and genetic defects. Annu Rev Biophys Biomol Struct 1994;23:787–818. Mohandas N, Clark MR, Jacobs MS, et al. Ektacytometric analysis of factors regulating red cell deformability. Blood Cells 1980;6:329–34. Mohandas N, Clark MR, Health BP, et al. A technique to detect reduced mechanical stability of red cell membranes: relevance to elliptocytic disorders. Blood 1982;59:768–74. 58 Cytologie : tests généraux Da Costa L, Mohandas N, Sorette M, et al. Temporal differences in membrane loss lead to distinct reticulocyte features in hereditary spherocytosis and in immune hemolytic anemia. Blood 2001;98:2894–9. Da Costa L, Galimand J, Fenneteau O, et al. Hereditary spherocytosis, elliptocytosis, and other red cell membrane disorders. Blood Rev 2013;4:167–78. Da Costa L, Suner L, Galimand J, et al. Society of Hematology and Pediatric Immunology (SHIP) group; French Society of Hematology (SFH). Diagnostic tool for red blood cell membrane disorders: Assessment of a new generation ektacytometer. Blood Cells Mol Dis 2016;56:9–22. FICHE 3.8 – Facteur de croissance dosage de l’erythropoïétine sérique ou plasmatique. Schlageter MH, Dosquet C, Chomienne C. Erythropoïétine. Encyclopédie médico chirurgicale ; 2015. Chapitre 4 Exploration des anomalies du métabolisme du fer et hémolyse Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 60 Cytologie : tests généraux Fiche 4.1 Ferritine Code NABM 1213, non cumulable avec 1833 Signification biologique du paramètre La ferritine est considérée comme le meilleur marqueur des réserves globales de fer dans l’organisme. Les études de corrélation ont montré un lien étroit entre ces deux paramètres, puisque 1 µg/L de ferritine correspond à environ 9 mg de réserve de fer dans l’organisme. La ferritine sérique est un reflet global de la ferritine tissulaire qui correspond à la mise en réserve de fer rapidement mobilisable en cas de besoin. Une diminution de la ferritine sérique est le meilleur moyen et le seul examen de première intention à prescrire dans le diagnostic de carence en fer dans la population générale selon la Haute autorité de santé (rapport HAS 2011). Si la baisse de la ferritine n’a pas d’autre signification que la carence martiale, avec anémie ou non, l’interprétation d’une hyperferritinémie est plus complexe. En effet, la ferritine est une protéine de la phase aiguë de l’inflammation, et s’élève également dans les cytolyses hépatiques, l’alcoolisme chronique, l’hémolyse, les surcharges métaboliques et au cours de pathologies macrophagiques aiguës (syndrome d’activation macrophagique, SAM,) ou métaboliques (maladie de Gaucher). Ainsi, en cas d’inflammation ou de pathologies chroniques, une carence martiale peut être présente alors que la ferritine est normale ou haute. La mesure des autres paramètres du bilan martial afin de disposer du coefficient de saturation de la transferrine (CSTf) prend alors toute sa place. Dans le diagnostic d’une surcharge en fer, une hyperferritinémie doit toujours s’interpréter en fonction du contexte, du bilan inflammatoire et de la valeur du CSTf. Dans les formes classiques d’hémochromatoses génétiques HFE évoquées devant une hyperferritinémie avec élévation du CSTf ainsi que dans les surcharges post-transfusionnelles, la valeur de la ferritine sérique reste un bon reflet global de la surcharge tissulaire et permet de guider le traitement déplétif. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La mesure de la ferritine est utilisée pour évaluer les réserves en fer de l’organisme. Sa principale indication est le diagnostic biologique d’une carence martiale et la vérification de l’efficacité du traitement après supplémentation. Elle est également prescrite dans le diagnostic des surcharges en fer, qu’elles soient génétiques ou acquises, et dans la surveillance du traitement déplétif. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La ferritine est l’examen de première intention dans le diagnostic de la carence martiale où son dosage est suffisant dans la grande majorité des cas, sauf s’il existe un syndrome inflammatoire ou une autre cause intercurrente associée. C’est également un examen de première intention (en combinaison avec le CSTf) dans le diagnostic d’une surcharge en fer et dans la surveillance du traitement déplétif de ces pathologies. Chapitre 4. Exploration des anomalies du métabolisme du fer et hémolyse Nature du prélèvement Sang sur tube sec ou héparinate de lithium. Recommandations pour la qualité du prélèvement Acheminement rapide. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Température ambiante ou + 4 °C. Sérum congelé à – 20 °C. Il existe plusieurs trousses de dosage de la ferritine reposant sur une immunodétection par des anticorps spécifiques. La technique de révélation peut être de la néphélémétrie, de la turbidimétrie ou une méthode optique dans un ELISA sandwich ou de compétition. Les techniques isotopiques initialement développées ne sont plus réalisées. Il est possible d’utiliser la spectrométrie de masse. Méthode automatisée. Mesure quantitative. CIQ Oui, commerciaux. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les valeurs sont plus élevées chez l’homme que chez la femme mais varient selon les trousses et les laboratoires. On peut considérer comme « normales » les fourchettes 18 à 270 µg/L chez l’homme, et 18 à 160 µg/L chez la femme. Il faut souligner néanmoins l’absence de consensus sur l’interprétation de ce dosage chez la femme enceinte et chez l’enfant (rapport HAS 2011). La valeur seuil en deçà de laquelle on définit une carence martiale absolue n’est pas consensuelle. Selon les publications, le seuil est de 12 ou 15 µg/L en l’absence de facteur intercurrent. Dans des situations pathologiques complexes comme en anesthésie-réanimation, en néphrologie ou en cancérologie, les seuils sont différents, habituellement de 30 ou 100 µg/L chez l’adulte. De plus, les seuils utilisés pour le diagnostic des carences martiales absolues ou fonctionnelles au cours des pathologies inflammatoires chroniques sont également différents (cf. ci-dessous). En ce qui concerne les surcharges martiales, la HAS a défini des valeurs seuil de 200 et de 300 µg/L respectivement chez l’homme et la femme pour décider d’une prise en charge par saignées thérapeutiques d’une hémochromatose (Recommandations HAS 2005). Ces seuils de prise en charge clinique peuvent également varier selon les pathologies, notamment dans les surcharges d’origine transfusionnelle. Causes d’erreur, limites du test L’interprétation du dosage doit tenir compte du fait que le taux de ferritine est dépendant de nombreux facteurs et notamment de l’inflammation. Dans cette situation, la valeur de la ferritine ne reflète pas la quantité de fer « fonctionnel » disponible pour l’érythropoïèse. L’utilisation du Coefficient de Saturation de la Transferrine (nécessitant de doser conjointement fer sérique et transferrine), qui reflète la quantité de fer circulant et donc accessible à l’érythroblaste, est alors utile dans ces situations, ou en cas de suspicion forte de carence alors que la ferritine est normale (rapport HAS 2011). Ainsi, les valeurs seuils habituelles de ferritine ne sont pas adaptées aux pathologies chroniques inflammatoires. Un groupe de travail international propose dans l’insuffisance cardiaque chronique, les pathologies inflammatoires digestives et l’insuffisance rénale chronique, les seuils de 100 µg/L pour la ferritine et/ou de 20 % pour le CSTf pour définir une carence martiale dans cette population de patients. 61 62 Cytologie : tests généraux Fiche 4.2 Fer sérique et coefficient de saturation de la transferrine (Ces analyses ne peuvent et ne doivent pas être découplées.) Code NABM 2002 Signification biologique du paramètre La mesure concomitante des taux de fer sérique et de transferrine (transporteur plasmatique du fer) permet de calculer le coefficient de saturation de la transferrine (CSTf). Le dosage du fer sérique seul, sans celui de la transferrine et du CSTf, n’a donc aucun intérêt en pratique, comme cela est souligné dans le rapport HAS 2011. • Baisse du CSTf : elle traduit une diminution du fer circulant disponible pour la synthèse de l’hémoglobine au cours de l’érythropoïèse. Elle reflète donc soit une carence absolue (sa détermination est alors utile lorsque la ferritine n’est pas diminuée du fait d’un syndrome inflammatoire associé, par exemple), soit une carence « fonctionnelle » où le fer est présent dans l’organisme mais insuffisamment disponible pour l’érythropoïèse. Ces carences fonctionnelles reflètent une inadéquation entre la quantité totale de fer présente dans l’organisme et l’utilisation insuffisante de ce fer par l’érythropoïèse et peuvent se rencontrer dans deux situations. La première correspond à la séquestration du fer dans les macrophages, typiquement observée dans les anémies inflammatoires au cours desquelles la production d’hepcidine empêche la sortie cellulaire et le recyclage du fer, en particulier dans ces cellules phagocytaires. La seconde situation correspond à une augmentation des besoins en fer pour l’érythropoïèse que les réserves ne peuvent assurer. Il s’agit typiquement des patients insuffisants rénaux chroniques traités par érythropoïétine (EPO) chez lesquels la consommation de fer pour l’érythropoïèse est accrue. • Augmentation du CSTf : elle est observée au cours de la majorité des hémochromatoses génétiques (hors mutation de la ferroportine) et des surcharges secondaires, post-transfusionnelles ou au cours des dysérythropoïèses, ainsi qu’au cours des hépatopathies cytolytiques (par baisse de synthèse de la transferrine par le foie et libération du fer cytoplasmique). Une augmentation du CSTf au-delà de 70 % traduit l’apparition dans la circulation de fer libre non lié à la transferrine le NTBI (Non-Transferrin Bound Iron), source à terme de lésions tissulaires oxydatives à l’origine des défaillances d’organes observées au cours des hémochromatoses. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le dosage du CSTf est utilisé pour : • l’identification des surcharges martiales : c’est le test biologique le plus sensible dans le diagnostic des hémochromatoses de type 1 ; • l’identification d’une carence martiale vraie ou fonctionnelle lorsque la ferritine est peu contributive, notamment dans en cas de pathologie inflammatoire associée (en particulier dans l’exploration des ACD, Anemia of Chronic Disease, anémies inflammatoires en français). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration C’est un dosage de première intention dans le diagnostic d’une hyperferritinémie. Ce dosage peut être prescrit en seconde intention dans le diagnostic d’une carence martiale, seulement dans les cas où la ferritine est difficile à interpréter (du fait d’une pathologie inflammatoire associée ou d’une insuffisance rénale chronique, par exemple) ou en cas de forte suspicion de carence martiale malgré une ferritine normale. Chapitre 4. Exploration des anomalies du métabolisme du fer et hémolyse Nature du prélèvement Sang sur tube sec ou héparinate de lithium. Recommandations pour la qualité du prélèvement Acheminement rapide. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Température ambiante ou + 4 °C. Le fer sérique est dosé par colorimétrie après dissociation de sa liaison avec la transferrine. Cette dernière est dosée par des techniques immunologiques en turbidimétrie ou néphélémétrie à l’aide d’anticorps spécifiques. La capacité totale de fixation du fer par la transferrine (CTF) est calculée par la formule « transferrine (g/L) × 25 » et le coefficient de saturation de la transferrine par la formule « Fer sérique (µmol/L)/CTF (µmol/L) ». Méthodes automatisées. Mesures quantitatives. CIQ Oui, commerciaux. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les valeurs de référence peuvent être variables selon les trousses de dosage et les laboratoires. À titre indicatif, le taux de fer sérique se situe entre 10 et 40 µmol/L (facteur de conversion : µmol/L = µg/L × 0,018) et les valeurs de référence de la transferrine entre 1,6 et 4 g/L. Les valeurs normales du CSTf sont entre 20 et 40 %. Causes d’erreur, limites du test Le fer sérique subit de grande variation nycthémérale intra-individuelle et doit être dosé à jeun le matin, à distance de toute prise d’alcool. Le dosage du fer sérique ne doit jamais être prescrit seul ou associé à la ferritine, mais toujours associé au dosage de la transferrine, permettant ainsi le calcul du CSTf. 63 64 Cytologie : tests généraux Fiche 4.3 Récepteur soluble de la transferrine Code NABM 1822 non cumulable avec 1213 Signification biologique du paramètre Le récepteur soluble de la transferrine (RSTf) est libéré par clivage protéolytique de la forme membranaire et son dosage est un reflet de l’activité érythropoïétique globale dans la moelle osseuse. La libération du RSTf est proportionnelle à son expression à la surface des érythroblastes, qui est elle-même dépendante de la production érythroblastique et des besoins en fer de l’érythropoïèse. La carence martiale se traduit donc par une augmentation du RSTf. Le taux plasmatique de récepteur soluble est indépendant de l’inflammation aiguë ou chronique, contrairement à celui de la ferritine. Le dosage du RSTf (voire des index RsTf/log ferritine ou RsTf/ferritine, qui seraient plus sensibles) a donc été proposé pour rechercher une carence en fer quand les autres paramètres classiques du bilan martial peuvent être pris en défaut, au cours des inflammations (ferritine normale ou augmentée) ou des maladies hépatiques. Nature du prélèvement Acheminement rapide. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Cette prescription hautement spécialisée doit être limitée à quelques cas complexes et doit être placée dans l’algorithme d’exploration après tous les autres marqueurs du statut martial. Le récepteur de la transferrine, sous sa forme tronquée soluble, est dosé par des méthodes immunologiques : turbidimétrie, néphélémétrie ou ELISA. Méthode automatisée. Mesure quantitative. CIQ Oui, commerciaux. Oui. Causes d’erreur, limites du test Le dosage du RSTf est indiqué en dernière ligne pour étayer un diagnostic de carence martiale lorsque les autres paramètres d’évaluation du statut martial peuvent être pris en défaut : inflammation, maladie hépatique. Température ambiante ou + 4 °C. EEQ Valeurs de référence/Interprétation et performances Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Sang sur tube sec ou héparinate de lithium. Recommandations pour la qualité du prélèvement Mode de conservation Son élévation traduit une érythropoïèse accrue, qu’elle soit régénérative ou inefficace, ainsi qu’une augmentation des besoins en fer pour l’érythropoïèse : le dosage est donc élevé dans les carences martiales vraies ou fonctionnelles. Les valeurs de référence peuvent varier selon les trousses mais se situent entre 0,76 et 1,76 mg/L. La ferritine est un marqueur plus précoce que le RSTf pour reconnaître une carence martiale dans la population générale. Le dosage du RSTf n’a pas d’indication en pratique courante, comme le rappelle le rapport de la HAS en 2011. Ce test manque de spécificité, les valeurs étant augmentées dans les stimulations érythroblastiques, les régénérations médullaires et dans les érythropoïèses inefficaces telles que dans les thalassémies. Chapitre 4. Exploration des anomalies du métabolisme du fer et hémolyse 65 Fiche 4.4 Haptoglobine Code NABM 1813 Signification biologique du paramètre L’haptoglobine est une protéine produite par le foie dont le rôle principal est la chélation de l’hémoglobine libre libérée après hémolyse intravasculaire. Les complexes haptoglobine-hémoglobine sont phagocytés par les macrophages, principalement au niveau de la rate. L’haptoglobine est saturée dès que l’hémolyse libère entre 500 et 1 500 mg d’hémoglobine. Le taux d’haptoglobine est augmenté au cours des syndromes inflammatoires. Son élévation est corrélée à celle de l’orosomucoïde. Il y a deux causes principales de diminution du taux d’haptoglobine : • elle est classiquement indosable dans les hémolyses intravasculaires, mais elle est aussi diminuée dans les hémolyses à prédominance extravasculaire, au cours desquelles survient souvent une lyse intravasculaire des globules rouges altérés ; • on peut observer une baisse de la production d’haptoglobine dans les insuffisances hépatocellulaires. Nature du prélèvement Acheminement rapide. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Rechercher, en association avec le dosage des LDH, de la bilirubine totale et libre, une hémolyse dans un tableau d’anémie régénérative. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Exploration d’une anémie régénérative, en seconde intention après la NFS, la numération de réticulocytes et l’analyse cytologique du frottis sanguin. Sang sur tube sec ou héparinate de lithium. Recommandations pour la qualité du prélèvement Mode de conservation Il existe une anhaptoglobinémie (phénotype HP0) ou une hypohaptoglobinémie constitutives, rencontrées fréquemment en Afrique, surtout dans les zones d’endémie palustre, mais aussi parfois associées à des mutations du promoteur. Ce phénotype est rare en Europe. Des délétions homozygotes du gène codant pour l’haptoglobine ont été décrites dans les pays du Sud-Est asiatique, et peuvent être responsables de réactions transfusionnelles graves. Température ambiante ou + 4 °C. L’haptoglobine est dosée par des tests immunologiques, immunonéphélémétrie ou immunoturbidimétrie, à l’aide d’anticorps spécifiques. Méthode automatisée. Mesure quantitative. CIQ Oui, commerciaux. EEQ Oui, commerciaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Valeur de référence chez l’adulte : 0,25 à 2 g/L. Le dosage de l’haptoglobine est un test de très grande sensibilité diagnostique en l’absence de syndrome inflammatoire. Causes d’erreur, limites du test Le dosage de l’haptoglobine n’est pas interprétable chez le nouveau-né, du fait de l’immaturité hépatique. Le taux d’haptoglobine se stabilise entre 6 et 10 mois. L’interprétation est difficile en cas d’hémolyse concomitante à un syndrome inflammatoire, le taux d’haptoglobine pouvant alors être normal. Son élévation étant corrélée à celles d’autres protéines de l’inflammation, il faut disposer des dosages de CRP et surtout d’orosomucoïde pour interpréter le taux d’haptoglobine dans ces situations. 66 Cytologie : tests généraux Fiche 4.5 Hémochromatose - Mutation p.Cys282Tyr (C2822Y) du gène HFE Code NABM 8000 Signification biologique du paramètre L’hémochromatose est une maladie génétique caractérisée par une absorption accrue de fer au niveau des entérocytes, entraînant une accumulation de ce métal dans les organes. Les signes cliniques sont tardifs, la maladie restant asymptomatique dans la majorité des cas. Les atteintes liées à l’accumulation du fer concernent les articulations, le cœur, le foie et le pancréas (diabète). La surcharge en fer expose à un risque accru de cancer hépatique. Le génotype responsable de la majorité des cas est l’homozygotie pour la mutation p. Cys2822Tyr (C282Y) du gène HFE, localisé sur le chromosome 6. Seul un petit nombre de sujets porteurs de ce génotype devient symptomatique. L’association de la mutation C282Y au variant p.His63Asp (H63D) est responsable de formes moins sévères. Chez les patients porteurs d’une surcharge martiale avérée, plusieurs autres gènes peuvent être le siège de mutations conduisant à une hémochromatose. L’hémochromatose juvénile, rare, est due à des mutations du gène HJV codant pour l’hémojuveline, ou, plus rarement du gène HAMP codant pour l’hepcidine. Les mutations des gènes du récepteur 2 de la transferrine (TFR2), de BMP6 ou de la ferroportine (SLC40A1), sont impliquées dans des formes génétiques d’hémochromatose. Ces dernières analyses ne sont réalisées en France que dans quelques laboratoires spécialisés. Un arbre diagnostique, validé par l’association nationale des praticiens de génétique moléculaire (ANPGM), précise la démarche en cas de suspicion de l’une de ces formes rares. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche de la mutation C282Y doit être faite en première intention devant une suspicion d’hémochromatose (recommandation HAS 2005). Cet examen est l’un des quelques tests génétiques inscrits à la nomenclature des actes de biologie médicale. Cette recherche est prise en charge par l’assurance maladie dans les seules indications suivantes : « - cadre individuel : à la suite d’un bilan général, au cours duquel une augmentation du coefficient de saturation de la transferrine est observée (CSTf supérieur à 45 %, confirmé sur un deuxième prélèvement) ; - cadre familial : chez les sujets ayant un parent au premier degré porteur de la mutation C282Y à l’état homozygote, à l’exclusion des sujets mineurs et des mères ménopausées, ou ne désirant plus avoir d’enfant ». Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche de la mutation C282Y est évoquée le plus souvent après la découverte d’une hyperferritinémie sur un bilan réalisé de manière systématique ou en présence de signes cliniques évocateurs d’une surcharge martiale. Avant de prescrire la recherche du test génétique HFE, il est indispensable d’éliminer les principales causes acquises d’hyperferritinémie (syndrome inflammatoire, alcoolisme, cancer, syndrome dysmétabolique, etc.) et de réaliser un dosage du coefficient de saturation dela transferrine, à jeun, contrôlé au moins une fois. La recherche s’effectue également dans le cadre du dépistage familial chez les apparentés de premier degré d’un sujet homozygote. Chapitre 4. Exploration des anomalies du métabolisme du fer et hémolyse Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA. Recommandations pour la qualité du prélèvement Acheminement : le tube ne doit pas être ouvert. Toute prescription de test génétique doit être accompagnée d’une attestation de consultation du prescripteur et d’un consentement écrit du patient, selon la règlementation en vigueur. Contraintes d’acheminement Température ambiante. Mode de conservation Température ambiante ou + 4 °C. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Le diagnostic repose sur la détection de la mutation C282Y du gène HFE. Plusieurs techniques sont disponibles : techniques « maison » basées sur le principe de PCR-digestion (RFLP : Restriction Fragments Length Polymorphism), kits commerciaux sous la forme de bandelettes ou de PCR quantitative… Méthodes semi-automatisées. Mesure qualitative. CIQ Toute analyse doit être accompagnée de contrôles internes positifs et négatifs. EEQ Tout laboratoire réalisant le test doit être inscrit à un contrôle de qualité externe. En l’absence de contrôle national, il s’agit le plus souvent de contrôles européens ou anglais. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Le test est rendu habituellement de la manière suivante : mutation C282Y : 1/ absente ; 2/ présente à l’état homozygote ou hétérozygote. Le résultat doit être accompagné d’un commentaire. Seule la présence de la mutation à l’état homozygote est associée à un terrain génétique d’hémochromatose. Ainsi seul un petit nombre de sujets porteurs du génotype développe des signes cliniques, la plupart reste asymptomatique. Toutefois, la découverte de ce génotype doit conduire à une évaluation d’une surcharge en fer et à une prise en charge par saignées si nécessaire (recommandation HAS 2005). Les sujets simples hétérozygotes C282Y ne développent pas la maladie, sauf s’il existe un autre facteur acquis ou génétique associé. En cas d’hétérozygotie C282Y associée à une surcharge martiale, il est possible de rechercher le variant H63D. Cette recherche n’est pas prise en charge par la sécurité sociale et peut donc rester à la charge du patient. L’hétérozygotie composite C282Y et H63D est associée à des surcharges martiales modérées, le plus souvent biologiques, sauf en présence de cofacteurs. Aucun des autres génotypes (hétérozygotie ou homozygotie H63D) n’est responsable de surcharge en fer. Si une surcharge martiale est présente chez le patient et confirmée notamment par une élévation de la concentration hépatique en fer (CHF) à l’IRM, la recherche d’autres causes génétiques doit être envisagée après avoir éliminé notamment toutes les causes acquises. Causes d’erreur, limites du test Les principales causes d’erreur sont liées à des problèmes pré-analytiques (erreur d’identité), ou à une inversion de tube lors de l’analyse (évènement très rare). Le test est habituellement robuste dans les laboratoires spécialisés en génétique, En l’absence de la mutation C282Y à l’état homozygote, le diagnostic d’hémochromatose HFE peut être écarté. La démarche diagnostique doit comporter une l’élimination des causes acquises d’hyperferritinémie et de surcharge en fer avant d’envisager la recherche de causes génétiques rares. 67 68 Cytologie : tests généraux Bibliographie du chapitre 4 FICHE 4.1 – Ferritine Cook JD, Skikne BS. Serum ferritin: a possible model for the assessment of nutrient stores. Am J Clin Nutr 1982;35:1180–5. Flowers CA, Kuizon M, Beard JL, et al. A serum ferritin assay for prevalence studies of iron deficiency. Am J Hematol 1986;23:141–51. Worwood M. The laboratory assessment of iron status-an update. Clin Chim Acta 1997;259:3–23. Muñoz M, Laso-Morales MJ, Gómez-Ramírez S, et al. Pre-operative haemoglobin levels and iron status in a large multicentre cohort of patients undergoing major elective surgery. Anaesthesia 2017;72:826–34. Cappellini MD, Comin-Colet J, de Francisco A, et al. IRON CORE Group. Iron deficiency across chronic inflammatory conditions: International expert opinion on definition, diagnosis, and management. Am J Hematol 2017;92:1068–78. Recommandations HAS 2005 : « Prise en charge de l’hémochromatose liée au gène HFE (hémochromatose de type 1) ». www.has.fr. Rapport HAS 2011 : « Choix des examens du métabolisme du fer en cas de suspicion de carence en fer ». www.has.fr. FICHE 4.2 – Fer sérique et Coefficient de Saturation de la Transferrine Makino T, Kiyonaga M, Kina K. A sensitive, direct colorimetric assay of serum iron using the chromogen, nitro-PAPS. Clin Chim Acta 1988;171:19–27. Revised recommendations for the measurements of the serum iron in human blood. Iron Panel of the International Committee for Standardization in Haematology. Br J Haematol. 1990;75 :615-6. Gambino R, Desvarieux E, Orth M, et al. The relation between chemically measured total iron-binding capacity concentrations and immunologically measured transferrin concentrations in human serum. Clin Chem 1997;43:2408–12. Vernet M, Corberand J, David V, et al. Algorithmes de prescription recommandés pour le diagnostic d’un déficit et d’une surcharge en fer. Ann Biol Clin 2001;59:149–55. Makino T, Nakamura K, Takahara K. A high-performance liquid immunoaffinity chromatography method for determining transferrin-bound iron in serum. Clin Chim Acta 2011;412:914–9. Rapport HAS 2011 : Examens du métabolisme du fer dans les carences. www.has.fr. FICHE 4.3 – Récepteur Soluble de la Transferrine Béguin Y. Intérêt du dosage du Récepteur Soluble de la Transferrine (sTFr) pour l’évaluation de l’érythropoïèse et de l’état du fer. Hématologie 2001;7:161–9. Khumalo H, Gomo ZA, Moyo VM, et al. Serum transferrin receptors are decreased in the presence of iron overload. Clin Chem 1998;44:40–4. Thomas C, Thomas L. Biochemical markers and hematologic indices in the diagnosis of functional iron deficiency. Clin Chem 2002;48:1066–7. Rapport HAS 2011 : « Choix des examens du métabolisme du fer en cas de suspicion de carence en fer ». www.has.fr. FICHE 4.4 – Haptoglobine Barcellini W, Fattizzo B. Clinical applications of hemolytic markers in the differential diagnosis and management of hemolytic anemia. Dis Markers 2015;2015:635670. Delanghe J, Langlois M, de Buyzere M. Congenital anhaptoglobinemia versus acquired hypohaptoglobinemia. Blood 1998;91:3524. Carter K, Worwood M. Haptoglobin: a review of the major allele frequencies worldwide and their association with diseases. Int J Lab Hematol 2007;29:92–110. Koda Y, Soejima M, Yoshioka N, et al. The haptoglobingene deletion responsible for anhaptoglobinemia. Am J Hum Genet 1998;62:245–52. FICHE 4.5 – Hémochromatose Mutation p.Cys282Tyr (C2822Y) du gène HFE Feder JN, Gnirke A, Thomas W, et al. A novel MHC class I-like gene is mutated in patients with hereditary haemochromatosis. Nat Genet 1996;13:399–408. Jouannolle AM, Gérolami V, Ged C, et al. Recommandations pour la (bonne) pratique du diagnostic moléculaire de l’hémochromatose liée au gène HFE *Synthèse d’une enquête réalisée auprès du Réseau national des laboratoires pratiquant le diagnostic de maladies rares du métabolisme du fer. Ann Biol Clin 2012;70:305–13. EASL clinical practice guidelines for HFE hemochromatosis. European Association For The Study Of The Liver. J Hepatol. 2010;53 :3-22. Recommandation HAS « Prise en charge de l’hémochromatose liée au gène HFE (hémochromatose de type 1) », 2005. www.has-sante.fr. Chapitre 5 Exploration des anomalies de l’hémoglobine Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 70 Cytologie : tests généraux Fiche 5.1 Électrophorèse de l’hémoglobine (gel polyacrylamide) Code NABM 1113 Signification biologique du paramètre L’électrophorèse de l’hémoglobine (Hb) sur gel de polyacrylamide est un test de dépistage d’une anomalie le plus souvent constitutionnelle des fractions protéiques de l’Hb (globine). L’analyse doit être capable de séparer, d’identifier et de quantifier les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et les variants fréquents (HbS, HbC, etc.) ou plus rares de l’Hb. La technique d’électrophorèse devrait être maintenant remplacée par une autre méthode de screening de première intention comme la chromatographie liquide haute performance (High Performance Liquid Chromatograpy, HPLC) ou l’électrophorèse capillaire, plus sensibles et plus spécifiques. Certains laboratoires utilisent une ou deux méthodes de screening, certains variants pouvant ne pas être décelés par l’une ou l’autre méthode. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test L’intitulé de cette analyse est donc amené à évoluer. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette analyse doit permettre la mise en évidence d’anomalies : • quantitatives : évaluations du pourcentage des fractions mineures (HbA2 et HbF) et d’éventuelles fractions anormales ; • qualitative : présence de fractions anormales d’Hb (variants). Indications : diagnostic d’une thalassémie (beta, alpha), dépistage de variants de l’Hb. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test de dépistage à réaliser en première intention dans le bilan diagnostique d’une hémoglobinopathie. Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 24 h, à adapter en fonction du diagnostic suspecté (existence de fractions fragiles, Hb instables, etc.). Température ambiante ou + 4 °C. Plusieurs techniques permettent de séparer les fractions d’Hb selon leur charge électrique et leur migration : HPLC, électrophorèse capillaire (automatisables), électrophorèse en gel (de moins en moins utilisée). Méthodes automatisées (HPLC et EPC : automates dédiés disponibles sur le marché). Méthode quantitative : évaluation du pourcentage des fractions présentes, normales et anormales. Méthode qualitative : la nature des variants fréquents et rares est présomptive et doit être impérativement confirmée par une ou deux autres techniques, y compris pour l’HbS. CIQ Pour chaque méthode, des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine. EEQ Un EEQ national (Probioqual) et existence d’autres EEQ européens. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Test peu performant isolément, qui doit être associé à une (pour le dépistage) ou plusieurs autres techniques (pour l’identification d’un variant de l’Hb). Causes d’erreur, limites du test Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et peuvent interférer avec leur quantification, fausser leur dosage ou ne pas être détectés. C’est la raison pour laquelle l’utilisation d’au moins deux méthodes de screening est souvent recommandée. Si un variant est dépisté, l’utilisation d’au moins 3 techniques est recommandée pour son identification. Chapitre 5. Exploration des anomalies de l’hémoglobine 71 Fiche 5.2 Électrophorèse de l’hémoglobine (citrate agar) Code NABM 1114 Signification biologique du paramètre L’électrophorèse de l’hémoglobine (Hb) en citrate agar est un test de caractérisation d’une anomalie, le plus souvent constitutionnelle, des fractions protéiques de l’Hb (globine). L’analyse permet d’identifier les fractions normales (HbA, et HbF) et certains variants fréquents (HbS, HbC, etc.) ou plus rares de l’Hb dont la migration est caractéristique. Analyse complémentaire de l’étude de l’Hb (électrophorèse de l’Hb) : ce test n’est habituellement pas réalisé de manière isolée mais il est associé à d’autres tests. L’analyse correspond alors au code NABM 1120 (3 méthodes au minimum). Les variants de l’hémoglobine ont une migration différente selon leur charge électrique et peuvent être séparés différemment et identifiés lorsqu’ils migrent à différents pH (alcalin pour le dépistage, acide pour la caractérisation). Synonyme : électrophorèse à pH acide. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de Méthode Type de test Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette analyse doit permettre la mise en évidence d’Hb migrant différemment de l’HbA à pH acide, notamment, HbS, HbC, Oarab. L’HbE co-migre avec l’HbA à pH acide, mais co-migre avec ou migre à proximité de l’HbA2 en chromatographie liquide haute performance (HPLC) et électrophorèse capillaire respectivement. Indications : technique contributive au diagnostic d’un variant de l’hémoglobine. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test à réaliser en seconde intention dans le bilan diagnostique d’une hémoglobinopathie en association à d’autres techniques d’identification. Un panel de méthodes ainsi que les données de l’hémogramme et la numération des réticulocytes sont souvent nécessaires à la caractérisation ou à l’orientation diagnostique d’un variant de l’hémoglobine. Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 24 h à adapter en fonction du diagnostic suspecté (existence de fractions fragiles (Hb instables, etc.). Température ambiante ou + 4 °C. Électrophorèse d’un hémolysat de globules rouges dans un gel d’électrophorèse avec un tampon acide. Méthodes manuelles ou semi-automatisées (automates). Mesure qualitative : la nature des variants fréquents et rares est présomptive et doit être impérativement confirmée par l’utilisation de plusieurs techniques, y compris pour l’HbS. CIQ Pour chaque méthode des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine. EEQ Un EEQ national (Probioqual) et d’autres EEQ européens sont disponibles pour l’identification de l’HbS. Pour les autres variants, contrôles interlaboratoires. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Test peu performant isolément, qui doit être associé à plusieurs autres techniques pour l’identification d’un variant de l’Hb. Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et peuvent interférer avec leur identification ou ne sont pas détectés par la méthode. C’est la raison pour laquelle l’utilisation de plusieurs méthodes est recommandée. 72 Cytologie : tests généraux Fiche 5.3 Test de solubilité de l’hémoglobine (Itano, falciformation) Code NABM 1115 Signification biologique du paramètre Le test d’Itano est un test biochimique permettant la mise en évidence d’HbS présente dans un échantillon sanguin. C’est un test de solubilité de l’hémoglobine (Hb), il repose sur la précipitation de l’HbS désoxygénée. Le test de falciformation (fiche 3.3) peut être une alternative au test d’Itano. Les deux analyses sont rassemblées sous le même code NABM. Les résultats doivent toujours être confrontés à l’hémogramme et à un frottis de sang frais coloré au MGG. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Ce test permet le diagnostic d’un syndrome drépanocytaire majeur en situation d’urgence, lorsqu’une étude de l’hémoglobine et un dosage d’HbS sont impossibles (techniques longues). Le test peut être également utilisé comme troisième technique dans le cadre de l’identification ou de l’élimination de la présence d’HbS. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de première intention en urgence permettant de confirmer la présence d’HbS. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Sang total sur EDTA. Sang non hémolysé, non centrifugé. Le prélèvement doit être acheminé rapidement ou, à défaut, peut être conservé à + 4 °C pendant une semaine au maximum. Température ambiante ou + 4 °C. Technique biochimique. L’HbS précipite en milieu réducteur (dithionite de sodium) à forte concentration saline. La turbidité de la solution est proportionnelle à la quantité d’HbS présente dans l’échantillon. Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure qualitative. CIQ Pas de CIQ commercial, il est recommandé de tester en parallèle un contrôle normal (sujet non drépanocytaire) et si possible un contrôle positif (sujet drépanocytaire majeur connu). EEQ Contrôle interlaboratoires. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Le test permet d’identifier la présence d’HbS, mais de rares autres variants de l’Hb précipitent également. De fausses réactions négatives sont observées avec des hémolysats trop dilués, ayant une concentration d’HbS égale ou inférieure à 20 % ou en présence d’un pourcentage important de méthémoglobine. Le test ne permet pas d’apprécier le taux d’HbS et ne différencie pas les sujets hétérozygotes des homozygotes. Le test peut être faussement négatif en cas de transfusion récente, chez les nouveaunés et les bébés de moins de 6 mois qui peuvent avoir des taux d’HbS très faibles, chez les sujets ayant des taux d’HbF élevés ou chez les sujets très anémiques (Hb < 7 g/dL). D’autres variants, qui entraînent une falciformation, peuvent également donner un test d’Itano positif (HbC Harlem, HbS Travis, HbC Ziguinchor). Il est donc rappelé que l’identification précise d’un variant de l’Hb nécessite la mise en œuvre d’au moins trois techniques de principe différent. Chapitre 5. Exploration des anomalies de l’hémoglobine 73 Fiche 5.4 Test à l’isopropanol (Hb instable) Code NABM 1115 Signification biologique du paramètre Il existe de nombreux variants des protéines de la globine de l’hémoglobine (Hb) dont certains présentent une instabilité in vivo et in vitro. Cette instabilité a pour conséquence une hémolyse chronique et des crises hémolytiques aiguës. Le test à l’isopropanol est un test biochimique qui a pour objet de mettre en évidence une hémoglobine instable dans un échantillon sanguin. Synonymes : test de stabilité de l’hémoglobine, recherche d’hémoglobine instable. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Ce test recherche une hémoglobine instable dans le bilan étiologique d’une hémolyse chronique ou Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test aiguë. Il doit être prescrit en association avec une étude complète de l’hémoglobine (recherche de variant, code NABM 1120) et éventuellement une recherche de corps de Heinz (précipitation intraérythrocytaire de l’hémoglobine instable) qui est habituellement positive dans cette situation. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de seconde intention permettant de confirmer la présence d’un variant instable de l’hémoglobine. Il peut aussi être utilisé en situation d’urgence lorsqu’un tel variant est suspecté. C’est toutefois un test peu disponible qui n’est réalisé que dans des laboratoires spécialisés. Sang total sur EDTA, citrate ou héparine. Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 2 h. Température ambiante ou + 4 °C. Technique biochimique. En présence d’une solution contenant de l’isopropanol, les hémoglobines normales (et les variants stables) restent solubles jusqu’au temps 50 min, alors que les hémoglobines instables précipitent. Si l’hémoglobine à tester est instable, la solution devient trouble dès la 5e minute, et le précipité flocule à la 20e minute. Méthode manuelle. Mesure qualitative. Toutefois, la rapidité avec laquelle le précipité se forme permet d’apprécier le degré d’instabilité du variant. CIQ Pas de CIQ commercial, il est indispensable de tester en parallèle un témoin normal. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Le test permet de mettre en évidence la présence de variants instables, mais certains variants de l’Hb faiblement instables peuvent ne pas être mis en évidence. Une transfusion récente peut entraîner un faux négatif. Certaines hémoglobines très instables peuvent avoir précipité juste après le prélèvement ou durant le transport et ne pourront pas être mises en évidence. L’HbS et l’HbF ainsi que l’HbC commencent à précipiter à partir de 30 min. La concentration d’hémoglobine doit être rigoureusement déterminée. La méthémoglobine en quantité appréciable peut donner des réactions faussement positives ainsi que les stromas érythrocytaires. 74 Cytologie : tests généraux Fiche 5.5 Recherche d’une anomalie de l’hémoglobine (3 techniques au minimum) Code NABM 1120 Signification biologique du paramètre Ensemble de tests destinés à dépister et caractériser une fraction anormale des protéines de la globine de l’hémoglobine (Hb). L’analyse doit être capable de séparer, d’identifier et de quantifier les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et les variants fréquents (HbS, HbC, etc.) ou plus rares de l’Hb. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette analyse doit permettre la mise en évidence d’anomalies : • quantitatives : évaluation du pourcentage des fractions mineures : HbA2 et HbF et d’éventuelles fractions anormales ; Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique • qualitatives : présence et caractérisation de fractions anormales d’Hb (variants). Indications : diagnostic d’une thalassémie bêta (variants à effet thalassémiants) ou alpha (présence d’Hb Barts ou d’HbH), dépistage et caractérisation de fractions anormales (variants de l’hémoglobine). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test à réaliser en seconde intention après isolement d’une fraction anormale par un test de dépistage (électrophorèse de l’Hb) ou en première intention si une hémoglobinopathie est suspectée cliniquement ou dans le cadre d’une enquête familiale. Sang total sur EDTA ou ACD (acide citrique-dextrose). Sang non hémolysé, non centrifugé. Durée d’acheminement < 24 h, à adapter en fonction du diagnostic suspecté (existence de fractions fragiles (Hb instables, etc.). Température ambiante ou + 4 °C. Plusieurs techniques disponibles permettent de séparer les fractions d’Hb selon leur charge électrique et leur migration : chromatographie liquide haute pression (HPLC), électrophorèse capillaire, électrophorèse à pH acide, isofocalisation électrique, séparation des chaînes de globine, test d’Itano (HbS). Au moins 3 méthodes, dont une d’électrophorèse, doivent être utilisées. Type de méthode Certaines méthodes automatisées (HPLC et EPC : automates dédiés disponibles sur le marché) et semi-automatisées ou manuelles (isofocalisation électrique, électrophorèse à pH acide, etc.) sont utilisables. Type de test Mesure quantitative : évaluation du pourcentage des fractions présentes, normales et anormales. Mesure qualitative : permet de préciser la nature des variants fréquents et peut orienter sur la nature des variants plus rares (variant de type alpha ou bêta, instabilité). CIQ Pour chaque méthode des CIQ commerciaux sont disponibles et utilisés en routine. EEQ Un EEQ national (Probioqual) et d’autres EEQ européens sont disponibles. Chapitre 5. Exploration des anomalies de l’hémoglobine Nature du prélèvement Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Sang total sur EDTA ou ACD (acide citrique-dextrose). Les anomalies des chaînes de globine sont associées à des pathologies spécifiques. La recommandation d’utiliser trois tests différents témoigne des sensibilités variables de ces techniques. Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF) et peuvent interférer avec leur quantification, induire une confusion avec un autre variant, fausser leur dosage ou ne pas être détectés. C’est la raison pour laquelle l’utilisation d’au moins deux méthodes de screening est recommandée. Si un variant est dépisté, l’utilisation d’autres techniques est nécessaire pour son identification. 75 76 Cytologie : tests généraux Fiche 5.6 Exploration de l’affinité de l’hémoglobine (oxymétrie : mesure de la p50) Code RIHN E156 Signification biologique du paramètre La mesure de l’affinité de l’hémoglobine pour l’oxygène peut s’effectuer soit par le tracé complet de la courbe de Barcroft, soit par obtention de la p50 calculée par un automate de gaz du sang sur un prélèvement veineux. La p50 correspond à la pression partielle en oxygène (exprimée en KPa ou en mmHg) pour laquelle la molécule d’hémoglobine est saturée à 50 % en oxygène (2 molécules d’oxygène fixées sur les 4 possibles). Une courbe de Barcroft décalée à gauche ou une p50 basse sont le reflet d’une hyperaffinité du sang pour l’oxygène et de son mauvais relargage tissulaire, entraînant une polyglobulie réactionnelle. À l’inverse, une courbe de Barcroft décalée à droite ou une p50 élevée témoignent d’une hypo-affinité du sang pour l’oxygène, ce qui favorise son relargage tissulaire mais peut en revanche gêner l’oxygénation correcte des molécules d’hémoglobine au niveau pulmonaire. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette analyse est le plus souvent prescrite dans un bilan de polyglobulie vraie caractérisée par une augmentation de la masse sanguine. Dans ce contexte, une hyperaffinité du sang pour l’oxygène témoigne de la présence d’un variant de l’hémoglobine hyperaffin ou d’un déficit en Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode 2,3-diphosphoglycérate (2,3-DPG) qui, dans ce cas, résulte d’une anomalie de la DPG mutase. Il est fortement recommandé de prescrire concomitamment une étude de l’hémoglobine par au moins trois techniques (code NABM 1120) afin de rechercher un éventuel variant hyperaffin de l’hémoglobine. Cette analyse phénotypique doit être complétée par une étude des gènes de globine (alpha et/ou bêta) et de la DPG mutase si l’identification d’un variant par l’étude de l’hémoglobine n’est pas concluante ou est négative. Ceci permet également de ne pas omettre l’identification d’un variant hyperaffin non séparé par les techniques phénotypiques (dans environ 10 % des cas). Une p50 diminuée avec un bilan de l’hémoglobine normal oriente alors fortement vers un déficit en 2,3-DPG. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de seconde intention dans l’exploration d’une polyglobulie, après élimination d’une fausse polyglobulie (hémoconcentration), d’une polyglobulie secondaire à une hypoxie tissulaire (tabac, BPCO, shunts, apnées du sommeil, intoxication chronique au CO ou à des produits méthémoglobinisants), liée à une sécrétion inappropriée d’EPO, ou primitive (maladie de Vaquez et autres néoplasies myéloprolifératives). Sang total sur EDTA pour Hemox-Analyzer, seringue gaz du sang veineux pour la p50. Prélèvement non hémolysé. Conditions d’oxygénation normales pour le sujet. Analyse à faire dans les 4 h suivant le prélèvement. Température ambiante ou + 4 °C (recommandé). Tracé complet de la courbe de Barcroft sur automate Hemox-Analyzer (réservé aux laboratoires spécialisés ou de recherche) OU obtention de la p50 calculée. Méthode automatisée de gazométrie sanguine pour obtention de la p50 calculée à partir de la pO2, de la SaO2 et de la concentration totale en oxygène. Chapitre 5. Exploration des anomalies de l’hémoglobine Nature du prélèvement Type de test Sang total sur EDTA pour Hemox-Analyzer, seringue gaz du sang veineux pour la p50. Mesure quantitative puisque l’interprétation est faite sur la valeur de la p50. CIQ CIQ des automates de gazométrie sanguine. EEQ EEQ des automates de gazométrie sanguine. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test VPP de 100 % mais VPN non évaluable. Un variant alpha de l’hémoglobine à l’état hétérozygote peut ne modifier que très faiblement la p50. L’estimation de la p50 peut être faussée sur gaz du sang artériel. 77 78 Cytologie : tests généraux Fiche 5.7 Recherche des anomalies de l’hémoglobine sur carton de Guthrie dans le cadre du dépistage néonatal Code RIHN E143 Signification biologique du paramètre Ce test est réalisé pour le dépistage néonatal de la drépanocytose. L’analyse doit être capable d’identifier les fractions d’hémoglobine (Hb) F, d’HbA et d’HbS. L’analyse doit être faite par une technique de séparation des différentes fractions d’hémoglobine. Plusieurs techniques sont disponibles : chromatographie liquide haute performance (CHLP), électrophorèse capillaire (EC) ou spectrométrie de masse (SM). Si une anomalie est détectée, au moins deux techniques doivent être réalisées. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette analyse doit permettre la mise en évidence d’anomalies : • qualitatives : présence de fractions anormales, d’HbS ; • quantitatives : évaluation du pourcentage des fractions HbA, HbF et HbS. Indications : diagnostic d’un syndrome drépanocytaire majeur (SS, SC ou S-beta-thalassémies). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test de dépistage à réaliser si les parents sont à risque d’être porteurs d’une hémoglobine S, en fonction de l’origine géographique. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Sang total capillaire prélevé au talon du nouveau-né au 3e jour de vie. Sang non hémolysé, non centrifugé. Envoi le jour même dans une enveloppe papier (plastique à proscrire). Température ambiante ou + 4 °C. Toutes méthodes de séparation des protéines : chromatographie, électrophorèse capillaire, spectrométrie de masse. Méthodes automatisées : HPLC, SM et EC : automates dédiés disponibles sur le marché. Mesure qualitative : la nature des variants fréquents et rares est présomptive et doit être impérativement confirmée par une ou deux autres techniques (y compris pour l’HbS). Évaluation semi-quantitative du pourcentage des fractions présentes normales et anormales. CIQ CIQ fournisseurs. EEQ UKNEQAS. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Bonnes sensibilité et spécificité. Prématurité, transfusion. Certains variants co-migrent avec les fractions normales (HbA, HbA2 et HbF), ce qui peut interférer avec leur quantification, ou empêcher leur détection. C’est la raison pour laquelle l’utilisation d’au moins deux méthodes de screening est recommandée. Si un variant est dépisté, l’utilisation d’autres techniques est indiquée pour son identification. Bibliographie du chapitre 5 FICHE 5.1 – Électrophorèse de l’hémoglobine (gel polyacrylamide) Aguilar-Martinez P, Badens C, Bonello-Palot Réseau DHOS Pathologie héréditaire de cyte. Flowcharts for the diagnosis and the characterization of hemoglobinopathies. Clin 2010;68:4554–64. http://globin.bx.psu.edu/hbvar. N, et al. l’érythromolecular Ann Biol FICHE 5.2 – Électrophorèse de l’hémoglobine (citrate agar) Aguilar-Martinez P, Badens C, Bonello-Palot Réseau DHOS Pathologie héréditaire de cyte. Flowcharts for the diagnosis and the characterization of hemoglobinopathies. Clin 2010;68:455–64. http://globin.bx.psu.edu/hbvar. 79 Chapitre 5. Exploration des anomalies de l’hémoglobine N, et al. l’érythromolecular Ann Biol FICHE 5.3 – Test de solubilité de l’hémoglobine (Itano, falciformation) Itano HA. Solubilities of naturally occurring mixtures of human hemoglobin. Arch Biochem Biophys 1953;47:148–59. Aguilar-Martinez P, Badens C, Bonello-Palot N, et al. Réseau DHOS Pathologie héréditaire de l’érythrocyte. Flowcharts for the diagnosis and the molecular characterization of hemoglobinopathies. Ann Biol Clin 2010;68:455–64. http://globin.bx.psu.edu/hbvar. FICHE 5.4 – Test à l’isopropanol (Hb instable) Aguilar-Martinez P, Badens C, Bonello-Palot N, et al. Réseau DHOS Pathologie héréditaire de l’érythrocyte. Flowcharts for the diagnosis and the molecular characterization of hemoglobinopathies. Ann Biol Clin 2010;68:455–64. http://globin.bx.psu.edu/hbvar. Laboratory Protocols [Internet]. 2nd edition. Chapter haematological methods. FICHE 5.5 – Recherche d’une anomalie de l’hémoglobine Aguilar-Martinez P, Badens C, Bonello-Palot Réseau DHOS Pathologie héréditaire de cyte. Flowcharts for the diagnosis and the characterization of hemoglobinopathies. Clin 2010;68:455–64. http://globin.bx.psu.edu/hbvar. N, et al. l’érythromolecular Ann Biol FICHE 5.6 – Exploration de l’affinité de l’hémoglobine (oxymétrie : mesure de la p50) Orvain C, Joly P, Pissard S, et al. Diagnostic approach to hemoglobins with high oxygen affinity: experience from France and Belgium and review of the literature. Ann Biol Clin 2017;75:39–51. Rumi E, Passamonti F, Pagano L, et al. p50 evaluation enhances diagnostic definition of isolated erythrocytosis. J Intern Med 2009;265:266–74. FICHE 5.7 – Recherche des anomalies de l’hémoglobine sur carton de Guthrie dans le cadre du dépistage néonatal http://www.afdphe.org/sites/default/files/3j_le_depistage_neonatal_0.pdf. Chapitre 6 Tests globaux et facteurs de coagulation Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 84 Hémostase et coagulation Fiche 6.1 Temps de Quick (taux de prothrombine/INR) en l’absence de traitement par antivitamine K NABM 0126 Signification biologique du paramètre Le temps de Quick (TQ) est le temps de coagulation, mesuré à + 37 °C, d’un plasma citraté pauvre en plaquettes (PPP), après addition de thromboplastine calcique. C’est un test chronométrique semi-global qui permet d’explorer les déficits en facteurs de la voie du facteur tissulaire, aussi appelée voie extrinsèque de la coagulation, impliquant les facteurs VII, X, V, II et le fibrinogène. La thromboplastine, d’origine humaine (recombinante ou placentaire) ou animale (lapin), mime l’activation de la coagulation par le facteur tissulaire en présence d’un excès de phospholipides. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : dépistage d’un déficit en un ou plusieurs facteurs (II, V, VII, X ou en fibrinogène). Le déficit peut être lié à un défaut de synthèse et/ou à une consommation excessive, et/ou à un déficit constitutionnel, ou exceptionnellement à la présence d’un anticorps (inhibiteur, antiphospholipides). Indications : • exploration d’un syndrome hémorragique (voir Synopsis IV : orientation clinique devant un syndrome hémorragique, p. 108 (Figure 7.1) ; • évaluation du risque hémorragique dans un contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique est indiqué ; • suivi biologique des traitements par antivitamine K (résultat en INR) (voir Synopsis I : stratégie diagnostique devant un allongement du TQ, p. 108 (Figure 6.1) ; • diagnostic et suivi d’une hépatopathie, d’une hypovitaminose K ; • diagnostic et suivi d’une coagulopathie de consommation : coagulation intravasculaire disséminée. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le TQ étant le seul test global explorant le facteur VII, la mesure du TQ associée à celle du temps de céphaline avec activateur (TCA) permet l’exploration de l’ensemble des facteurs de la coagulation, à l’exception du facteur XIII. Le TQ fait ainsi partie du bilan d’hémostase de première intention. Selon la NABM, un TQ allongé peut être exploré à l’initiative du biologiste lors de la première visite ou en cas de discordance franche avec les antériorités, en ajoutant sur le même prélèvement la mesure de la concentration du fibrinogène et du taux de trois facteurs parmi les suivants : II, V, VII, X ou VII + X. L’allongement du TQ, isolé ou associé à un allongement du TCA, lié au déficit en un ou plusieurs facteurs, oriente vers différents diagnostics (cf. arbres décisionnels). Un TQ raccourci peut être expliqué par une hypercoagulabilité dans un contexte inflammatoire ou un problème pré-analytique. Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Recommandations pour la qualité du prélèvement Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Renseigner impérativement tout traitement anticoagulant en cours ou récemment arrêté. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C. Les délais de stabilité et de réalisation de l’INR après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total et plasma : recommandé à température ambiante jusqu’à 24 h, acceptable jusqu’à 4 h à température réfrigérée ou jusqu’à 2 h entre + 25 ° et + 30 °C. Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Test chronométrique réalisé en un temps. La thromboplastine calcique est ajoutée au PPP pré-incubé à + 37 °C. Le facteur tissulaire se lie au facteur VIIa qui active les facteurs X en Xa et IX en IXa. Le complexe prothrombinase active la prothrombine en thrombine qui transforme le fibrinogène en caillot de fibrine. La détection du caillot est, selon les systèmes, soit électromécanique, soit photométrique. Le TQ est exprimé en secondes. Les Anglo-Saxons l’expriment en ratio TQ patient/TQ témoin (moyenne géométrique des TQ d’au moins 20 sujets sains). En France, il est converti en pourcentage d’activité (taux de prothrombine-TP) à partir d’une droite d’étalonnage (Thivolle). Il peut être rendu en INR (International Normalized Ratio), égal au rapport TQ patient/TQ témoin élevé à la puissance ISI (index de sensibilité international de la thromboplastine). Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation interlaboratoire possible (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Un TP normal chez les adultes sains est compris entre 70 et 120 %. Il est peu informatif chez le nouveau-né (préférer la mesure des facteurs). Normes maximales acceptables (95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation de reproductibilité du TP ( %) (GFHT 2015) : TP < 43 % ; CV < 7,9 % / TP > 43 % ; CV < 5,6 % Causes d’erreur, limites du test Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Le TQ/ INR est sensible à des concentrations d’héparine non fractionnée > 1,0 UI/mL et de bas poids moléculaire > 1,5 UI anti-Xa/mL. Le TQ ne permet pas d’évaluer l’effet des anticoagulants oraux directs (AOD). Des interférences en cas de fibrinogène élevé sont également observées avec certains réactifs. 85 86 Hémostase et coagulation Synopsis I Stratégie diagnostique devant un allongement du TQ Figure 6.1. Stratégie diagnostique devant un allongement du TQ. Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation 87 Fiche 6.2 Temps de céphaline avec activateur (TCA) NABM 1127 et 1128 Signification biologique du paramètre Le temps de céphaline avec activateur (TCA) est le temps de coagulation, mesuré à + 37 °C, d’un plasma pauvre en plaquettes (PPP) citraté en présence d’un excès de phospholipides (céphaline) et d’un activateur de la voie des facteurs contacts après ajout d’ions calcium. C’est un test semiglobal chronométrique permettant de dépister les déficits en facteurs de la voie commune (fibrinogène, II, V, X) et de la voie des facteurs contacts (ou voie endogène ; facteurs VIII, IX, XI, XII, prékallikréine, kininogènes de haut poids moléculaire). Les différents réactifs disponibles varient en termes de nature et de concentration des phospholipides (céphaline d’origine animale, végétale, phospholipides synthétiques, etc.) et d’activateur (silice, acide ellagique, célite, kaolin [TCK], etc.) ce qui conduit à une sensibilité variable aux déficits en facteurs et aux anticoagulants circulants (ACC), quelle que soit leur nature (antiphospholipides, anti-facteurs, héparines, anticoagulants oraux directs, etc.). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : • dépistage d’un déficit en un ou plusieurs facteurs de la coagulation lié à un déficit constitutionnel, un défaut de synthèse et/ou une consommation excessive en facteur(s), ou à un anticorps dirigé contre un facteur (inhibiteur). S’agissant d’un test semi-global, l’augmentation d’un des facteurs peut se traduire par un raccourcissement du TCA ; • surveillance de l’héparinothérapie par héparine non fractionnée (HNF) en l’absence d’activité anti-Xa disponible. Indications : • exploration d’un syndrome hémorragique (voir (voir Synopsis IV : orientation clinique devant un syndrome hémorragique, p. 114 (Figure 7.1)) ; • évaluation du risque hémorragique dans un contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique est indiqué ; • suivi d’un traitement par HNF à dose curative en l’absence d’activité anti-Xa disponible. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration • Dans l’exploration d’un syndrome hémorragique, réaliser en première intention : hémogramme, TP, TCA, mesure du fibrinogène fonctionnel. En cas de syndrome hémorragique avéré, la mesure de l’activité coagulante des facteurs VIII, IX et XI, ainsi que l’activité et l’antigène du facteur Willebrand peuvent être réalisés d’emblée. • Lorsqu’un bilan pré-opératoire est justifié, comme chez l’enfant n’ayant pas acquis la marche (cf. recommandation de la SFAR 2012) en plus de l’hémogramme, un TCA est le plus souvent prescrit en première intention en association avec un TP. Dans ces indications, privilégier un réactif sensible aux déficits en facteurs VIII, IX et XI, comme par exemple, le Kaolin (TCK). • Pour le suivi d’un traitement par HNF à dose curative, le TCA mesuré à l’aide d’un réactif adapté peut être utilisé lorsque l’activité anti-Xa n’est pas disponible. • L’allongement du TCA doit être interprété en fonction des résultats d’examens effectués parallèlement (TP, fibrinogène), ainsi que du contexte clinique et thérapeutique. • En cas d’allongement du TCA associé à une diminution du TP, en l’absence de traitement anticoagulant, l’exploration est habituellement poursuivie par la mesure de l’activité coagulante des facteurs II, V, VII et X et du fibrinogène. Un ACC de type lupique de titre élevé peut aussi, outre l’allongement du TCA, entraîner une diminution du TP. • Devant un allongement inexpliqué et isolé du TCA, le biologiste peut réaliser une épreuve de correction du TCA, mesurer l’activité coagulante 88 Hémostase et coagulation des facteurs VIII, IX, XI, voire rechercher un inhibiteur spécifique anti-facteur VIII, IX ou XI, si le contexte clinique et biologique est évocateur. L’épreuve de correction du TCA par addition de plasma normal dit « plasma témoin » au plasma du patient dit « plasma malade » permet d’orienter le diagnostic soit vers un déficit en facteur, soit vers la présence d’un ACC. Il consiste à mesurer le TCA du malade (M), du témoin (T) et du mélange à volume égal (M + T), puis à calculer l’indice d’anticoagulant circulant (correspondant à l’ancienne dénomination Indice de Rosner) (IAC) : = [TCA (M + T) − TCA(T)] × 100 / TCA (M) Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique • La correction du TCA malade après addition de plasma témoin, (IAC < 15) est en faveur d’un déficit en facteur ; l’absence de correction (IAC > 15) est en faveur de la présence d’un ACC lupique ou d’un inhibiteur anti-facteur. Le résultat de l’épreuve de correction du TCA ne permet pas d’exclure un déficit en facteur de la voie endogène. Ainsi, quel que soit le résultat de l’IAC, il est recommandé de doser les taux de facteurs VIII, IX et XI si le contexte clinique le justifie. La confirmation d’un ACC lupique ne se justifie que dans un contexte clinique de maladie auto-immune ou de maladie thromboembolique. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]) ou CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dypiridamole). Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C. Les délais de stabilité et de réalisation du TCA après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. Dans le cas d’un TCA (sans HNF) : - en sang total sur tube citraté : à température ambiante jusqu’à 4 h si mesure des facteurs de la voie endogène et jusqu’à 6 h sans mesure des facteurs de la voie endogène ; - en PPP sur tube citraté, si centrifugation dans les 2 heures, jusqu’à 4 h à température ambiante si mesure des facteurs de la voie endogène ; jusqu’à 8 h à température ambiante et toléré jusqu’à 8 h à température réfrigérée sans mesure des facteurs de la voie endogène. Dans le cas d’un TCA (avec HNF) : - en sang total sur tube citraté : jusqu’à 2 heures, à température ambiante ; - en PPP sur tube citraté : jusqu’à 4 h si centrifugation dans l’heure, plasma décanté ou non, conservation à température réfrigérée (+ 2 à + 8 °C) ou ambiante ; - en sang total ou plasma sur tube CTAD : jusqu’à 6 h à température ambiante. Test chronométrique réalisé en deux temps : le PPP est pré-incubé à + 37 °C en présence d’un excès de phospholipides (céphaline) et d’activateur, la coagulation est ensuite déclenchée par l’addition d’ions calcium. La détection du caillot est, selon les systèmes, soit électro-mécanique, soit photométrique. Le « TCA malade » exprimé en secondes est rapporté à un « TCA témoin » défini pour chaque lot de réactif permettant de calculer un ratio (malade/témoin). Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation - Les intervalles de référence du TCA ratio (malade/témoin) varient en fonction des systèmes de mesure (le plus souvent 0,80 à 1,19 chez l’adulte ; le TCA ratio est plus élevé à la naissance et diminue avec l’âge). - Le choix du réactif du TCA par le biologiste doit tenir compte de l’indication et du contexte clinique. Les renseignements cliniques et les traitements anticoagulants (nom, posologie et heures d’administration), indispensables pour l’interprétation du TCA, doivent être obligatoirement mentionnés sur la prescription. Un traitement par héparine, antagoniste de la vitamine K ou anticoagulant oral direct peut allonger le TCA. - Le TCA peut être allongé dans des situations n’exposant pas à un risque hémorragique : déficit en facteur de la phase contact (facteur XII, kininogènes de haut poids moléculaire et prékallicréine), présence d’un anticoagulant circulant phospholipo-dépendant, interférence in vitro de la CRP avec certains réactifs de TCA. - La surveillance d’un traitement par HNF par le TCA présente des inconvénients majeurs, car le TCA n’est pas spécifique de l’héparine et peut être modifié dans de nombreux contextes cliniques (hémodilution, déficit en facteurs, traitement par AVK, présence d’un anticoagulant lupique, et/ou augmentation du taux de facteur VIII dans les syndromes inflammatoires, taux de CRP élevés, etc.). Le risque est de conduire à des ajustements posologiques erronés. Le Groupe français d’étude sur l’hémostase et la thrombose (GFHT) préconise d’effectuer le suivi des traitements par HNF en mesurant l’activité anti-Xa. - Normes maximales acceptables (95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation de reproductibilité du TCA en ratio (GFHT 2014) : ratio < 1,1 ; CV < 4,1 % / ratio > 1,1 ; CV < 5,3 %. Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin : ponction veineuse difficile, non-respect de la nature ou du volume de l’anticoagulant, délai trop long avant la réalisation du test, prélèvement hémolysé, initiation in vitro de la coagulation ou présence d’héparine souillant le prélèvement, traitement anticoagulant non signalé. Un deuxième prélèvement est alors recommandé. 89 90 Hémostase et coagulation Synopsis II Conduite à tenir devant un TCA allongé Figure 6.2. . Conduite à tenir devant un TCA allongé. M : malade ; T : témoin ; AVK : antivitamine K ; AOD : anticoagulants oraux directs. Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Synopsis III Démarche diagnostique devant un allongement isolé du TCA Figure 6.3. . Démarche diagnostique devant un allongement isolé du TCA. D’après Calmette et al., EMC Traité de Médecine Akos, 2017. 91 92 Hémostase et coagulation Fiche 6.3 Dosage du fibrinogène fonctionnel (facteur I) NABM 0174 Signification biologique du paramètre Synthétisé et libéré dans le plasma par les hépatocytes, le fibrinogène (Fg) peut être transformé, lors de l’activation de la coagulation, en un réseau de fibrine englobant les cellules circulantes. De la sorte, il permet la structuration du caillot sanguin. Sa fixation aux plaquettes (comme à d’autres cellules) est une autre composante de sa fonction hémostatique. Sa concentration peut diminuer en cas de dysfonction hépatique, d’hémodilution, de consommation, d’activation de la fibrinolyse, de processus protéolytiques pathologiques, et s’élever en cas de réaction inflammatoire. Un certain nombre de variants constitutionnels ont été recensés, quantitatifs et/ou qualitatifs, dont les expressions cliniques sont variables (syndromes hémorragiques, thromboses artérielles, thromboses veineuses, amylose, absence de symptomatologie). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : recherche d’une anomalie du fibrinogène dans le cadre d’un syndrome hémorragique, d’un bilan préopératoire lorsque le bilan biologique est indiqué, d’une maladie thromboembolique veineuse, d’une pathologie susceptible d’affecter sa synthèse ou sa consommation. Il a été aussi décrit comme marqueur de l’athérosclérose. Les variants constitutionnels sont rares mais justifient une caractérisation précise dont dépendra la prise en charge, variable selon le type (afibrinogénémie, Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement hypofibrinogénémie, dysfibrinogénémie) et l’identification moléculaire. Indications : évaluation d’une anomalie de synthèse (dysfonction hépatique, traitement par Lasparaginase), d’une réaction inflammatoire, d’une hémodilution (pertes sanguines importantes, échanges plasmatiques, etc.), bilan pré-opératoire si celui-ci est indiqué (cf. recommandation de la SFAR 2012), recherche d’une consommation intravasculaire (disséminée ou localisée), d’une fibrinolyse primitive (par libération d’enzymes protéolytiques au cours d’affections pancréatiques, de certains néoplasmes, d’envenimations). En cas de résultat pathologique, le suivi peut être indiqué, après substitution à visée corrective, ou comme marqueur de sévérité et d’évolution. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure fonctionnelle du fibrinogène est habituellement un examen de première intention en cas d’hémorragie, de maladie thromboembolique, de dysfonction hépatique, de recherche d’un syndrome inflammatoire, d’une consommation ou d’une fibrinolyse, de traitement par L-asparaginase. Elle peut être effectuée en seconde intention en cas d’anomalie d’un test global de la coagulation comme un allongement du temps de Quick et/ou du temps de céphaline avec activateur (TCA) non lié à un anticoagulant. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation du dosage du fibrinogène après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total et plasma, stabilité jusqu’à 24 h à température ambiante ; en plasma jusqu’à 24 h entre + 4 et + 25 °C ; en plasma congelé (<– 20 °C) jusqu’à 24 mois. Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation La mesure habituelle est chronométrique par méthode de Clauss, le temps de formation du caillot obtenu avec une concentration importante de thrombine étant corrélé à la quantité de fibrinogène coagulant. La détection peut être mécanique ou optique. Dans ce dernier cas, la mesure peut être également dérivée de la courbe de formation du caillot du temps de Quick (amplitude maximale), à la condition que ce temps soit normal. Une mesure immunologique peut compléter la mesure chronométrique afin de caractériser un déficit. Une évaluation sur sang total est possible par thromboélastographie. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en g/L. Concentrations plasmatiques dès la naissance 1,5 à 3,5 g/L, pouvant augmenter avec l’âge et varier selon l’origine ethnique. Un déficit inattendu doit être confirmé sur un second prélèvement. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation (CV) de reproductibilité du Fg (GFHT 2015) : CV < 7,6 % quelle que soit la concentration. Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin ; présence de PDF, d’héparine (au-delà de 2 UI/mL), d’argatroban, de bivalirudine, de dabigatran (selon le réactif employé). En cas de détection optique : lipémie et autres interférents à la lecture de l’opacité du caillot. L’existence d’un syndrome inflammatoire peut masquer un déficit modéré. 93 94 Hémostase et coagulation Fiche 6.4 Dosage de l’activité coagulante du facteur II (prothrombine) Code NABM 1014 Signification biologique du paramètre Le facteur II (FII) ou prothrombine est une protéine vitamine K dépendante, appartenant au complexe prothrombinique : II, V, VII, X. Il est synthétisé par le foie et a une masse moléculaire de 72 kDa. Sa demi-vie plasmatique est de 50 à 120 h. Il intervient dans la voie commune de la coagulation. La prothrombine est activée par le complexe prothrombinase (facteur Xa, facteur Va, ions calcium et phospholipides) en thrombine (FIIa). La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre formation et active les plaquettes et le système inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Objectifs de l’analyse et principales indications Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou constitutionnel en FII. Les déficits acquis sont le plus souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs de la coagulation rencontrés dans les hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellulaires et les coagulopathies de consommation. Les déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps antifacteur II ou associés à un anticoagulant circulant lupique ou à une infection virale sont plus rares. Le déficit constitutionnel sévère en FII de transNature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement mission autosomale récessive est exceptionnel (prévalence des formes homozygotes estimée à 1/2 000 000), caractérisé par des hémorragies cutanéo-muqueuses d’autant plus sévères que le taux de FII est bas. Indications : devant un allongement du temps de Quick et du temps de céphaline avec activateur (TCA) lors de l’exploration d’un syndrome hémorragique (voir Synopsis I (Figure 6.1) : stratégie diagnostique devant un allongement du TQ, Synopsis II (Figure 6.2) : conduite à tenir devant un TCA allongé et Synopsis IV (Figure 7.1) : orientation clinique devant un syndrome hémorragique), de l’évaluation du risque hémorragique dans un contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique est indiqué, du diagnostic et du suivi d’une hépatopathie, d’une hypovitaminose K, du diagnostic et suivi d’une coagulopathie de consommation. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit d’un test de seconde intention indiqué devant un allongement associé du temps de Quick et du TCA. La mesure de l’antigène par méthode immunologique est indiquée pour typer un déficit isolé en FII (quantitatif ou qualitatif), en laboratoire spécialisé. L’analyse moléculaire est possible mais n’est pas nécessaire pour le diagnostic. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du FII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total d’au moins 24 h à température ambiante ; - en plasma inférieure à 4 h à température ambiante ; - en plasma congelé inférieure à 12 mois. Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Test fonctionnel chronométrique, basé sur la mesure du temps de Quick d’un mélange à volume égal du plasma malade dilué au 1/10 le plus souvent et d’un plasma réactif déficitaire en FII. Une droite d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec activité du FII proche de 100 %) mélangées au plasma réactif déficitaire en FII. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance > 25 %, chez l’enfant à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %. Le diagnostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième prélèvement et après avoir éliminé un déficit acquis. Normes maximales acceptables (95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation de reproductibilité du FII (GFHT 2015) : FII < 90 % ; CV < 7,5 % / FII > 90 % ; CV < 6,3 %. Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagulants oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FII et entraîner une sous-estimation du taux de FII, variable suivant l’AOD et sa concentration. 95 96 Hémostase et coagulation Fiche 6.5 Dosage de l’activité coagulante du facteur V (proaccélérine) Code NABM 1015 Signification biologique du paramètre Le facteur V plasmatique (FV) est une glycoprotéine essentielle à la génération de thrombine et à la coagulation. Il est synthétisé par le foie et activé par la thrombine. Il existe un pool plaquettaire de facteur V (environ 20 % du pool plasmatique). Sa masse moléculaire est d’environ 330 KDa et sa demi-vie plasmatique de 12 à 36 h. Il intervient dans la voie commune de la coagulation. Le facteur Va forme un complexe équimoléculaire avec le facteur Xa en présence d’ions calcium et de phospholipides. Ce complexe « prothrombinase » transforme la prothrombine en thrombine. La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre formation, active les plaquettes et le système inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Le facteur Va est inactivé par la protéine C activée, en présence de protéine S, d’ions calcium et de phospholipides. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou constitutionnel en FV. Les déficits acquis sont le plus souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs de la coagulation, rencontrés dans les hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellulaires et les coagulopathies de consommation. Les déficits acquis isolés liés Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement à un auto-anticorps anti-facteur V sont plus rares. Le déficit constitutionnel sévère en FV de transmission autosomale récessive est très rare (prévalence des formes homozygotes 1/106), caractérisé par des hémorragies cutanéo-muqueuses d’autant plus sévères que le taux de FV est bas. À noter l’existence de déficits constitutionnels combinés des facteurs V et VIII (prévalence 1/105 à 1/106). Indications : devant un allongement du temps de Quick et du temps de céphaline avec activateur (TCA) lors de l’exploration d’un syndrome hémorragique (voir Synopsis IV : orientation clinique devant un syndrome hémorragique, p. 114 (Figure 7.1)), de l’évaluation du risque hémorragique dans un contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique est indiqué, du diagnostic et du suivi d’une hépatopathie, d’une hypovitaminose K, du diagnostic et du suivi d’une coagulopathie de consommation. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit d’un examen de seconde intention indiqué devant un allongement associé du temps de Quick et du TCA. La mesure de l’antigène par méthode immunologique est indiquée pour typer un déficit isolé en FV (quantitatif ou qualitatif), en laboratoire spécialisé. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du FV. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total de 8 h à température ambiante ; - en plasma inférieure à 4 h à température ambiante ; - en plasma congelé d’au moins 24 mois. Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique, basé sur la mesure du temps de Quick d’un mélange à volume égal du plasma malade dilué au 1/10e et d’un plasma réactif déficitaire en FV. Une droite d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec une activité du FV proche de 100 %) mélangées au plasma réactif déficitaire en FV. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique chez le nouveau-né > 40 %, à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %. Le diagnostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième prélèvement et après avoir éliminé un déficit acquis. L’analyse moléculaire est possible mais n’est pas nécessaire pour le diagnostic. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation de reproductibilité du FV (GFHT 2015) : FV < 90 % ; CV < 8,3 % / FV > 90 % ; CV < 7,2 %. Causes d’erreur, limites Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagulants oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FV et entraîner une sous-estimation du taux de FV, variable suivant l’AOD et sa concentration. 97 98 Hémostase et coagulation Fiche 6.6 Dosage de l’activité coagulante du facteur VII (proconvertine) Code NABM 1016 Signification biologique du paramètre Le facteur VII (FVII) ou proconvertine est une protéine vitamine K dépendante, appartenant au complexe prothrombinique : II, V, VII, X. Il est synthétisé par le foie et a une masse moléculaire de 50 KDa. Sa demi-vie est brève (4 à 6 h). Le facteur VII est présent dans la circulation à l’état de traces, sous sa forme activée et forme un complexe avec le facteur tissulaire (FT). Il possède un rôle essentiel dans l’initiation de la coagulation in vivo. Le complexe FT/FVIIa, en activant le facteur X et le facteur IX, participe à la génération de thrombine (FIIa). La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre formation et active les plaquettes et le système inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Objectifs de l’analyse et principales indications Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou consti­ tutionnel en FVII. Les déficits acquis sont le plus souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs de la coagulation rencontrés dans les hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellulaires et les coagulopathies de consommation. Du fait de sa demi-vie très courte, le FVII est le premier à diminuer. Les déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps anti-FVII sont plus rares. Le Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement déficit constitutionnel en FVII est le moins rare parmi les déficits en protéines de la coagulation (prévalence estimée à 1/300 000), il est de transmission autosomique récessive. Les manifestations hémorragiques sont variables et ne sont pas corrélées aux taux résiduels d’activité du FVII. Généralement, seuls les taux de FVII coagulant < 30 % peuvent être symptomatiques. Indication : devant un allongement du temps de Quick lors de l’exploration d’un syndrome hémorragique (voir Synopsis IV : orientation clinique devant un syndrome hémorragique, p. 114 (Figure 7.1), de l’évaluation du risque hémorragique dans un contexte de bilan préopératoire lorsque le bilan biologique est indiqué, du diagnostic et suivi d’une hépatopathie, d’une hypovitaminose K, du diagnostic et suivi d’une coagulopathie de consommation. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit d’un examen de seconde intention indiqué devant un allongement du temps de Quick. La mesure de l’antigène par méthode immunologique est indiquée pour typer un déficit isolé en FVII (quantitatif ou qualitatif), en laboratoire spécialisé. En cas de déficit congénital, l’analyse du gène du FVII peut être demandée. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant la conservation du prélèvement pour la mesure du FVII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total d’au moins 24 h à température ambiante ; - en plasma inférieure à 4 h à température ambiante ; - en plasma congelé de 6 mois. Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Test fonctionnel chronométrique, basé sur la mesure du temps de Quick d’un mélange à volume égal du plasma malade dilué au 1/10e et d’un plasma réactif déficitaire en FVII. Il existe aussi des réactifs composés d’un mélange de protéines de la coagulation excluant le FVII. L’utilisation de réactif déficient en facteur VII et X permet une mesure combinée du couple VII + X. Une droite d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec une activité du FVII proche de 100 %) mélangées au réactif déficitaire en FVII. Le temps mesuré est transformé en % d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance > 30 %, à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %. Le diagnostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième prélèvement et après avoir éliminé un déficit acquis. Le taux de FVII n’est pas toujours corrélé à la sévérité du syndrome hémorragique. Normes acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation de reproductibilité du FVII (GFHT 2015) : FVII < 97 % ; CV < 8,9 % / FVII > 97 % ; CV < 7,6 %. Causes d’erreur, limites Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagulants oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FVII et entraîner une sous-estimation du taux de FVII, variable suivant l’AOD et sa concentration. 99 100 Hémostase et coagulation Fiche 6.7 Dosage de l’activité coagulante du facteur X (facteur Stuart) Code NABM 1017 Signification biologique du paramètre Le facteur X (FX) ou facteur Stuart est une protéine vitamine K dépendante, appartenant au complexe prothrombinique : II, V, VII, X. Il est synthétisé par le foie et a une masse moléculaire de 59 kDa. Sa demi-vie plasmatique est de 36 à 48 h. Le FX intervient dans la voie commune de la coagulation. Il est activé en facteur Xa par le complexe facteur tissulaire/FVIIa et par le complexe tenase (facteur VIIIa/IXa), en présence de phospholipides et d’ions calcium. Le facteur Xa forme avec le facteur Va le complexe prothrombinase qui catalyse la conversion de la prothrombine en thrombine (FIIa). La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre formation et active les plaquettes et le système inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Le facteur Xa est neutralisé par le TFPI (Tissue Factor Plasma Inhibitor) et l’antithrombine. Objectifs de l’analyse et principales indications Objectifs : dépistage d’un déficit acquis ou constitutionnel en FX. Les déficits acquis sont le plus souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs de la coagulation, rencontrés dans les hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellulaires et les coagulopathies de consommation. Les déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps antiNature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement FX ou lors d’amylose sont plus rares. Le déficit constitutionnel en FX est très rare (prévalence des formes homozygotes estimée à 1/500 000), il est de transmission autosomique récessive. Les manifestations hémorragiques sont d’autant plus sévères que le taux de FX est bas. Indications : devant un allongement du temps de Quick et du temps de céphaline avec activateur (TCA) lors de l’exploration d’un syndrome hémorragique (voir Synopsis IV : orientation clinique devant un syndrome hémorragique, p. 114 (Figure 7.1), de l’évaluation du risque hémorragique dans un contexte de bilan pré-opératoire lorsque le bilan biologique est indiqué, du diagnostic et du suivi d’une hépatopathie, d’une hypovitaminose K, du diagnostic et du suivi d’une coagulopathie de consommation. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de seconde intention indiqué devant un allongement associé du temps de Quick et du TCA. La mesure de l’antigène par méthode immunologique est indiquée pour typer un déficit isolé en FX (quantitatif ou qualitatif), en laboratoire spécialisé. L’analyse moléculaire est possible mais n’est pas nécessaire au diagnostic. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du FX. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total d’au moins 24 h à température ambiante ; - en plasma inférieure à 4 h température ambiante ; - en plasma congelé de 4 mois. Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique, basé sur la mesure du temps de Quick d’un mélange à volume égal du plasma malade dilué au 1/10e et d’un plasma réactif déficitaire en FX. À noter qu’il existe aussi des réactifs composés d’un mélange de protéines de la coagulation excluant le FX. L’utilisation de réactif déficient en facteur VII et X permet une mesure combinée du couple VII + X. Une droite d’étalonnage est établie avec des dilutions d’un plasma de référence (calibrant avec une activité du FX proche de 100 %) mélangées au réactif déficitaire en FX. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité par rapport à cette droite d’étalonnage. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance >20 %, à partir de 3 mois et chez l’adulte : 60-140 %. Le diagnostic de déficit constitutionnel est posé si le déficit est confirmé sur un deuxième prélèvement et après avoir éliminé un déficit acquis. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation de reproductibilité du FX (GFHT 2015) : FX < 90 % ; CV < 8 % / FX > 90 % ; CV < 7 %. Causes d’erreur, limites Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte clinique. Les anticoagulants oraux directs (AOD) peuvent interférer sur la mesure du FX et entraîner une sous-estimation du taux de FX, variable suivant l’AOD et sa concentration. 101 102 Hémostase et coagulation Fiche 6.8 Dosage de l’activité coagulante du facteur VIII (anti-hémophilique A) Code NABM 0178 Signification biologique du paramètre Le facteur VIII (FVIII) ou anti-hémophilique A est une glycoprotéine plasmatique essentielle à la génération de thrombine et à la coagulation. Il est synthétisé principalement par le foie et il est également présent dans de nombreux tissus. Sa masse moléculaire est voisine de 300 KDa et sa demi-vie plasmatique de 12 heures. Il circule dans le plasma sous une forme liée au facteur Willebrand qui le protège de la dégradation. Le FVIII est un cofacteur enzymatique de la coagulation. Il joue un rôle majeur dans la cascade de la coagulation puisqu’après activation par la thrombine, il s’associe au facteur IXa en présence de phospholipides et contribue à l’activation du facteur X en facteur X activé, capable de transformer la prothrombine en thrombine, enzyme clé de la coagulation. La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre formation, active les plaquettes et le système inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Le facteur VIIIa est inactivé par la protéine C activée, en présence de protéine S, d’ions calcium et de phospholipides. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : dépistage d’un déficit constitutionnel ou acquis en FVIII. Le déficit en FVIII:C permet d’évoquer une hémophilie A constitutionnelle ou acquise, une maladie de Willebrand ou exceptionnellement un déficit combiné en FV et Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement FVIII. Le déficit constitutionnel (hémophilie A) est de transmission récessive liée à l’X (prévalence 1/5 000 garçons). Indications : en cas d’allongement isolé du temps de céphaline avec activateur (TCA) et/ou de survenue de manifestations hémorragiques non expliquées car, selon les réactifs utilisés, des déficits modérés en FVIII peuvent ne pas allonger significativement le TCA. La mesure du FVIII:C est également utile dans le suivi du traitement des patients hémophiles A ou atteints d’une maladie de Willebrand recevant des concentrés de FVIII ou de la desmopressine. Le taux minimal de FVIII:C pour assurer une hémostase normale est de l’ordre de 30 %. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure de l’activité coagulante du FVIII réalisée par une technique chronométrique est un examen de première intention chez les patients symptomatiques (manifestations hémorragiques) ou de seconde intention devant un allongement isolé du TCA. En cas de déficit constitutionnel, une mesure par technique chromogénique ou immunologique du FVIII (FVIII:Ag, RIHN 140 code E081) et une analyse du gène en biologie moléculaire (chromosome X) devront être réalisées dans un laboratoire spécialisé. La mesure chromogénique pourrait être à l’avenir la méthode optimale pour surveiller les patients substitués par les concentrés de FVIII à demi-vie prolongée. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du FVIII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total de 4 h à température ambiante ; - en plasma de 8 h à température ambiante ; - en plasma congelé de 6 mois. Test fonctionnel chronométrique basé sur la mesure du TCA d’un mélange à volume égal du plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FVIII. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité via une gamme d’étalonnage établie à partir d’un plasma de référence (calibrant avec une activité du FVIII proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FVIII. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 103 Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance augmenté (> 80 %) quel que soit le groupe sanguin. Les valeurs de l’adulte, atteintes vers l’âge de 1 mois, sont comprises entre 50 et 150 %. Compte tenu de sa liaison au facteur Willebrand, dont le taux est dépendant du groupe sanguin, les sujets du groupe sanguin O ont des taux de FVIII physiologiquement plus bas. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation de reproductibilité du FVIII (GFHT 2015) : CV < 9,5 %, quel que soit le taux de FVIII. Interférence possible des anticoagulants circulants (ACC) de type lupique. Pour s’en affranchir, il est recommandé : - d’utiliser un réactif pour le TCA peu sensible aux ACC lupiques ; - de tester le plasma sur au moins 2 dilutions (au minimum : 1/10 et 1/20). En cas d’ACC lupique, le taux se normalise avec les dilutions les plus élevées. 104 Hémostase et coagulation Fiche 6.9 Dosage de l’activité coagulante du facteur IX (anti-hémophilique B) Code NABM 0179 Signification biologique du paramètre Le facteur IX (FIX) ou anti-hémophilique B est une glycoprotéine plasmatique de synthèse hépatique vitamine K dépendante. Sa masse moléculaire est voisine de 60 KDa et sa demi-vie plasmatique de 20 à 24 heures. Le FIX, zymogène du facteur IX activé (sérine protéase), joue un rôle majeur dans la cascade de la coagulation : après activation, il contribue à l’activation du facteur X en facteur X activé, qui transforme la prothrombine en thrombine, enzyme clé de la coagulation. La thrombine transforme le fibrinogène en fibrine, amplifie sa propre formation et active les plaquettes et le système inhibiteur de la coagulation de la protéine C. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : dépistage d’un déficit constitutionnel ou acquis en FIX. Les déficits acquis sont le plus souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs de la coagulation rencontrés dans les hypovitaminoses K, les insuffisances hépatocellulaires et les coagulopathies de consommation. Les déficits acquis isolés liés à un auto-anticorps antifacteur IX sont rares. Le déficit constitutionnel (hémophilie B) est de transmission récessive liée à l’X (prévalence 1/30 000 garçons). Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Indications : en cas d’allongement isolé du temps de céphaline avec activateur (TCA) et/ou de survenue de manifestations hémorragiques non expliquées, car, selon les réactifs utilisés, des déficits modérés en FIX peuvent ne pas allonger significativement le TCA. La mesure du FIX:C est également utile dans le suivi du traitement des patients hémophiles B. Le taux minimal de FIX:C pour assurer une hémostase normale est de l’ordre de 30 %. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure du FIX:C par technique chronométrique est un examen de première intention chez les patients avec des manifestations hémorragiques, ou de seconde intention devant un allongement isolé du TCA. Devant une diminu­ tion du FIX:C, une origine acquise du déficit doit toujours être éliminée. En cas de déficit constitutionnel, une mesure immunologique du FIX (FIX:Ag, NABM 1028) et une analyse du gène en biologie moléculaire (chromosome X) devront être réalisées dans un laboratoire spécialisé. Les mesures par technique chromogénique ou amidolytique sont actuellement réservées aux dosages du FIX dans les concentrés de FIX. Cette méthode pourrait être à l’avenir la méthode optimale pour surveiller les patients substitués par les concentrés de FIX à demi-vie prolongée. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation 105 Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du FIX. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total de 48 h à température ambiante ; - en plasma de 8 h à température ambiante ; - en plasma congelé de 8 mois. Principe méthodologique Test fonctionnel chronométrique basé sur la mesure du TCA d’un mélange à volume égal du plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FIX. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité via une gamme d’étalonnage établie à partir d’un plasma de référence (calibrant avec activité du FIX proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FIX. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/mL (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance > 20 %, entre 3 et 6 mois > 40 %, entre 6 mois et 15 ans > 50 %, 60-140 % chez l’adulte. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation (CV) de reproductibilité du FIX (GFHT 2015) : FIX < 102 % ; CV < 10,1 % / FIX > 102 % ; CV < 7,5 %. Interférence possible des anticoagulants circulants (ACC) de type lupique. Pour s’en affranchir, il est recommandé : - d’utiliser un réactif pour le TCA peu sensible à la présence d’un ACC lupique ; - de tester le plasma sur au moins 2 dilutions (au minimum : 1/10 et 1/20). En cas d’ACC lupique, le taux se normalise avec les dilutions les plus élevées. 106 Hémostase et coagulation Fiche 6.10 Dosage de l’activité coagulante du facteur XI (facteur Rosenthal) Code NABM 0180 Signification biologique du paramètre Le FXI est une proenzyme qui circule sous une forme dimérique inactive. Sa forme activée (FXIa) est une sérine protéase qui intervient essentiellement dans l’amplification de la voie endogène de la coagulation sanguine, ainsi que, de façon indirecte, dans la fibrinolyse via l’activation du TAFI (Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor). Le FXI est synthétisé par les hépatocytes et vraisemblablement les mégacaryocytes. Il circule à une concentration plasmatique comprise entre 3 et 7 µg/mL avec une demi-vie comprise entre 40 et 80 heures. Sa stabilisation en circulation est assurée par le kininogène de haut poids moléculaire. Le déficit en FXI est un déficit rare qui expose à un risque hémorragique modéré, souvent de type provoqué, cutanéo-muqueux ou relatif aux tissus à forte activité fibrinolytique (sphère ORL, tractus urogénital, muqueuse digestive). Les accidents hémorragiques sont observés essentiellement dans les situations chirurgicales ou post-traumatiques. Le taux plasmatique de FXI est faiblement corrélé au phénotype hémorragique. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectif : dépistage d’un déficit constitutionnel ou acquis en FXI. Les déficits acquis sont le plus Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement souvent des déficits combinés de plusieurs facteurs de la coagulation rencontrés dans les insuffisances hépatocellulaires et les coagulopathies de consommation. Les déficits acquis isolés liés à un autoanticorps anti-facteur XI sont rares. Le déficit constitutionnel en FXI est principalement de transmission autosomale récessive (prévalence 1/106). Indication : en cas d’allongement isolé du temps de céphaline avec activateur (TCA) et/ou de survenue de manifestations hémorragiques non expliquées, car, selon les réactifs utilisés, des déficits modérés en FXI peuvent ne pas allonger significativement le TCA. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure de l’activité coagulante du FXI réalisée par une technique chronométrique est un examen de première intention chez les patients symptomatiques (manifestations hémorragiques), ou de seconde intention devant un allongement isolé du TCA. La mesure de l’antigène par méthode immunologique est indiquée pour typer un déficit isolé en FXI (quantitatif ou qualitatif), en laboratoire spécialisé. L’analyse moléculaire est possible mais n’est pas nécessaire pour le diagnostic de déficit en FXI. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant la conservation du prélèvement pour la mesure de l’activité du FXI. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indiquait une stabilité : - en sang total de 48 h à température ambiante ; - en plasma de 8 h à température ambiante ; - en plasma congelé de 6 mois. Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation 107 Test fonctionnel chronométrique basé sur la mesure du TCA d’un mélange à volume égal du plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FXI. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité via une gamme d’étalonnage établie à partir d’un plasma de référence (calibrant avec activité du FXI proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FXI. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Intervalle de référence/interprétation/Performances Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/dL (1 UI/ml = 100 %). Les valeurs de référence du FXI sont comprises entre 60 et 140 %. Un déficit en FXI est considéré comme sévère pour les taux < 20 % ; il est généralement observé chez des patients porteurs de mutations homozygotes ou hétérozygotes composites du gène du FXI (F11). Il est considéré comme modéré pour les taux compris entre 20 et 50 %. La très grande majorité des déficits est de type quantitatif ; de rares cas de déficits qualitatifs ont été décrits. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation (CV) de reproductibilité du FXI (GFHT 2015) : FXI < 97 % ; CV < 9,7 % / FXI > 97 % ; CV < 8 %. Causes d’erreur, limites Interférence possible des anticoagulants circulants (ACC). Pour s’en affranchir, il est recommandé : - d’utiliser un réactif pour le TCA peu sensible aux ACC lupiques ; - de tester le plasma sur au moins 2 dilutions (au minimum : 1/10 et 1/20). En présence d’ACC, les dilutions successives permettent une levée de l’interférence. 108 Hémostase et coagulation Fiche 6.11 Dosage de l’activité coagulante du facteur XII (facteur Hageman) Code NABM 0181 Signification biologique du paramètre Le FXII est une proenzyme qui circule sous forme monomérique inactive. Essentiellement synthétisé par les hépatocytes, le FXII circule à une concentration plasmatique comprise entre 30 et 35 µg/mL (0,37 µM) avec une demivie comprise entre 50 et 70 heures. Sa forme activée (FXIIa) est une sérine protéase qui active d’une part le FXI de l’hémostase et d’autre part la prékallicréine (PK), proenzyme impliquée dans l’inflammation, via la synthèse de bradykinine. Le FXI et la PK sont stabilisés sur les surfaces cellulaires par le kininogène de haut poids moléculaire (KHPM). Physiologiquement, le FXII peut être activé par l’héparine dérivée des mastocytes, le collagène, les acides nucléiques (ADN, ARN), les polyphosphates et les agrégats de protéines comme la protéine bêta-amyloïde. Le FXII est également activé par la liaison (ou « contact ») avec des surfaces chargées négativement. Inversement, l’inhibiteur physiologique principal du FXII est la C1 estérase (C1inh). Les déficits en protéines de la « phase contact » (FXII, PK et KHPM) ne sont pas associés à un syndrome hémorragique, Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement ni à un risque hémorragique accru. Ces déficits allongent cependant les tests de coagulation de type TCA. L’implication de la voie du contact et en particulier du FXII, dans certains phénomènes thrombotiques, est par contre suggérée par différentes études. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de la mesure de l’activité du FXII est d’exclure ou de confirmer un déficit en FXII. Ce test peut être indiqué en cas d’allongement isolé significatif du temps de céphaline avec activateur (TCA). Selon les réactifs utilisés, des déficits modérés en FXII peuvent ne pas allonger significativement le TCA. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure de l’activité coagulante du FXII réalisé par une technique chronométrique est un examen de seconde intention en cas d’un allongement isolé du TCA. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de l’activité du FXII. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité : - en sang total de 4 h à température ambiante ; - en plasma de 8 h à température ambiante ; - en plasma congelé de 6 mois. Principe méthodologique Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Test fonctionnel chronométrique basé sur la mesure du TCA d’un mélange à volume égal du plasma du malade dilué et d’un plasma réactif déficitaire en FXII. Le temps mesuré est transformé en pourcentage d’activité via une courbe de calibration établie à partir d’un plasma de référence (calibrant avec une activité du FXII proche de 100 %) mélangé au plasma réactif déficitaire en FXII. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Intervalle de référence/interprétation/Performances Causes d’erreur, limites 109 Les résultats sont exprimés en pourcentage ou en UI/dL (1 UI/ml = 100 %). Les valeurs usuelles du FXII sont comprises entre 60 et 140 %. Normes maximales acceptables (95e percentiles) pour les coefficients de variation (CV) de reproductibilité du FXII (GFHT 2015) : FXII < 100 % ; CV < 12,3 % / FXII > 100 % ; CV < 7,9 %. Interférence possible avec les anticoagulants circulants (ACC). Pour s’en affranchir, il est recommandé : - d’utiliser un réactif pour le TCA peu sensible aux ACC lupiques ; - de tester le plasma sur au moins 2 dilutions (au minimum : 1/10 et 1/20). En présence d’ACC, les dilutions successives permettent une levée de l’interférence. 110 Hémostase et coagulation Fiche 6.12 Le thromboélastogramme (TEG®/ROTEM®) Code RIHN E148 Signification biologique du paramètre Le terme thromboélastogramme est ancien, et décrit le changement de viscosité sanguine lié à la polymérisation de la fibrine au cours de la coagulation. Par le biais du TEG® (Haemonetics) et du ROTEM® (Tem International GmbH / Werfen) le principe de cette mesure a été réactualisé. L’utilisation d’activateurs et d’inhibiteurs spécifiques, associée à un outil informatique performant, permet de réduire les temps d’analyse et d’augmenter la spécificité des tests. Avec des réactifs appropriés, il est possible d’explorer chacune des étapes de l’hémostase : hémostase primaire (plaquettes), coagulation et fibrinolyse, mais seuls sont identifiés les troubles majeurs de l’hémostase pouvant faire discuter un support transfusionnel. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Compte tenu d’un délai de résultats réduit (moins de 15 minutes), ce test apparaît adapté à la gestion de l’urgence. La dernière génération de ces automates qui ne nécessite plus aucune étape de pipetage, est Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique L’utilisation du TEG®/ROTEM® peut être discutée en première intention, dans certaines situations hémorragiques, en particulier en fin de chirurgie cardiaque, au cours de l’hémorragie du post-partum, chez le polytraumatisé. L’installation de ces automates dans les services cliniques (au plus près du patient) doit se faire sous la responsabilité du biologiste et doit être associée à des arbres décisionnels permettant de guider la prise en charge transfusionnelle. Absence de recommandations spécifiques. Aucune en mode délocalisé. Au laboratoire, l’utilisation du pneumatique doit être validée par le laboratoire. À température ambiante. Mesure viscoélastique. La mesure de la formation du caillot fibrino-plaquettaire et d’une éventuelle fibrinolyse est transformée en signal graphique (thromboélastogramme). Méthode automatisée. Type de mesure Mesure semi-quantitative. CIQ CIQ commerciaux. EEQ Oui (NEQAS, www.ukneqas.org.uk). Causes d’erreur, limites Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Sang total citraté 0,105 M, 0,109 M (3,2 %), 0,129 M (3,8 %) ou natif (rapid TEG®). Type de méthode Valeurs de référence/Interprétation et performances désormais compatible avec un usage délocalisé. La connaissance rapide de l’hémostase du patient (estimation de la concentration de fibrinogène, présence ou non d’héparine dans le prélèvement, temps de formation du caillot fibrinoplaquettaire, détection d’une fibrinolyse) permet d’orienter rapidement la prise en charge transfusionnelle (plasma frais congelé, concentrés plaquettaires, concentrés en fibrinogène) en cas de profil anormal, dans un contexte d’urgence et dans un souci d’épargne sanguine. Deux générations d’automates sont actuellement disponibles. Les automates de première génération (TEG® 5000, ROTEM® delta) nécessitent des étapes de pipetage complexes et ne semblent pas adaptés à un usage au lit du patient. La simplification extrême des automates de deuxième génération (TEG®6S, ROTEM® sigma) pourrait en faire de véritables automates d’hémostase délocalisée permettant l’étude de l’hémostase sur sang total au lit du patient. Toutefois, les valeurs de référence doivent être établies pour chaque génération d’appareil. Résultats à interpréter en fonction du contexte clinique. Il convient de valider des arbres décisionnels propres à chaque dispositif, dans chacune des situations cliniques, avec des seuils d’intervention validés lors d’études cliniques (études en cours). Chapitre 6. Tests globaux et facteurs de coagulation Bibliographie du chapitre 6 FICHE 6.1 – temps de Quick (taux de prothrombine/INR) en l’absence de traitement par antivitamine K Jourdi G, Calmette L, de Maistre E, et al. Groupe français d’études sur l’hémostase et la thrombose (GFHT). temps de Quick (taux de prothrombine). INR EMC Traité de Médecine Akos 2017;12:1–7. [Article 1-1167]. FICHE 6.2 – temps de céphaline avec activateur (TCA) Calmette L, Jourdi G, de Maistre E, et al. Groupe français d’études sur l’hémostase et la thrombose (GFHT). Allongement du temps de céphaline avec activateur EMC Traité de Médecine Akos 2017;0:1–8. [Article 1-1164]. http://sfar.org/examens-preinterventionnels-systematiques. FICHE 6.3 – Dosage du fibrinogène fonctionnel (facteur I) Clauss A. Rapid physiological coagulation method in determination of fibrinogen. Acta Haematol 1957;17:237–46. Mackie I, Cooper P, Lawrie A, et al. British Committee for Standards in Haematology. Guidelines on the laboratory aspects of assays used in haemostasis and thrombosis. Int J Lab Hematol 2013;35:1–13. FICHE 6.4 – Dosage de l’activité coagulante du facteur II (prothrombine) Aillaud MF. Facteur V : proaccélérine. EMC Biologie médicale 2012;7:1–4. Palla R, Peyvandi F, Shapiro AD. Rare bleeding disorders : diagnosis and treatment. Blood 2015;125:2052–561. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. FICHE 6.5 – Dosage de l’activité coagulante du facteur V (proaccélérine) Aillaud MF. Facteur V : proaccélérine. EMC Biologie médicale 2012;7:1–4. Palla R, Peyvandi F, Shapiro AD. Rare bleeding disorders : diagnosis and treatment. Blood 2015;125:2052–561. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. FICHE 6.6 – Dosage de l’activité coagulante du facteur VII (proconvertine) Aillaud MF. Facteur V : proaccélérine. EMC Biologie médicale 2012;7:1–4. Palla R, Peyvandi F, Shapiro AD. Rare bleeding disorders : diagnosis and treatment. Blood 2015;125:2052–561. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. 111 FICHE 6.7 – Dosage de l’activité coagulante du facteur X (facteur Stuart) Aillaud MF. Facteur V : proaccélérine. EMC Biologie médicale 2012;7:1–4. Palla R, Peyvandi F, Shapiro AD. Rare bleeding disorders : diagnosis and treatment. Blood 2015;125:2052–561. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. FICHE 6.8 – Dosage de l’activité coagulante du facteur VIII (anti-hémophilique A) Kitchen S, Preston FR. Quality in Laboratory Haemostasis and Thrombosis. 2nd edition 2013;10. « Assay of factor VIII and other clotting factors ». Kitchen S, Kershaw G, Tiefenbacher S. Recombinant to modified factor VIII and factor IX chromogenic and one-stage assays issues. Haemophilia 2016;22:72–7. Pouplard C, Ternisien C, Desconclois C, et al. Discrepancies between one stage assay and chromogenic substrate assay in patients treated with recombinant or plasma-derived FVIII and usefulness of a specific standard in ReFacto AF® -treated patients. Haemophilia 2016; Online only. FICHE 6.9 – Dosage de l’activité coagulante du facteur IX (anti-hémophilique B) Henneuse A, Frere C. Facteur IX ou antihémophilique B. EMC Biologie médicale 2017;12:1–5. Mackie I, Cooper P, Lawrie A, et al. British Committee for Standards in Haematology. Guidelines on the laboratory aspects of assays used in haemostasis and thrombosis. Int J Lab Hematol 2013;35:1–13. Kitchen S, Kershaw G, Tiefenbacher S. Recombinant to modified factor VIII and factor IX chromogenic and one-stage assays issues. Haemophilia 2016;22:72–7. FICHE 6.10 – Dosage de l’activité coagulante du facteur XI (facteur Rosenthal) Gailani D, Smith SE. Structural and functional features of factor XI. Thromb Haemost 2009;7:75–8. Seligsohn U. Factor XI deficiency in humans. J Thromb Haemost 2009;7:84–7. Mumford AD, Ackroyd S, Alikhan R, et al. BCSH Committee. Guideline for the diagnosis and management of the rare coagulation disorders: a United Kingdom Haemophilia. Centre Doctors’ Organization guideline on behalf of the British Committee for Standards in Haematology. Br J Haematol 2014;167:304–26. Bowyer A, Kitchen S, Makris M. The responsiveness of different APTT reagents to mild factor VIII, IX and XI deficiencies. Int J Lab Hematol 2011;33:154–8. Toulon P, Eloit Y, Smahi M, et al. In vitro sensitivity of different activated partial thromboplastin time reagents to mild clotting factor deficiencies. Int J Lab Hematol 2016;38:389–96. 112 Hémostase et coagulation FICHE 6.11 – Dosage de l’activité coagulante du facteur XII (facteur Hageman) Björkqvist J, Nickel KF, Stavrou E, et al. In vivo activation and functions of the protease factor XII. Thromb Haemost 2014;112:868–75. de Maat S, Maas C. Factor XII : form determines function. J Thromb Haemost 2016;14:1498–506. Nickel KF, Long AT, Fuchs TA, et al. Factor XII as a therapeutic target in thromboembolic and inflammatory diseases. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2017;37:13–20. FICHE 6.12 – Le thromboélastogramme (TEG®/ ROTEM®) Mace H, Lightfoot N, McCluskey S, et al. Validity of thromboelastometry for rapid assessment of fibrinogen levels in heparinized samples during cardiac surgery: a retrospective, single-center, observational study. J Cardiothorac Vasc Anesth 2016;30:90–5. Karkouti K, Callum J, Wijeysundera DN, Rao, et al. TACS investigators. Point-of-care hemostatic testing in cardiac surgery: a stepped-wedge clustered randomized controlled trial. Circulation 2016;134:1152–62. Collins PW, Lilley G, Bruynseels D, et al. Fibrin-based clot formation as an early and rapid biomarker for progression of postpartum hemorrhage: a prospective study. Blood 2014;124:1727–36. Rugeri L, Levrat A, David JS, et al. Diagnosis of early coagulation abnormalities in trauma patients by rotation thrombelastography. J Thromb Haemost 2007;5:289–95. Chitlur M, Sorensen B, Rivard GE, et al. Standardization of thromboelastography: a report from the TEG-ROTEM working group. Haemophilia 2011;17:532–7. Quarterman C, Shaw M, Johnson I, et al. Intraand inter-centre standardisation of thromboelastography (TEG®). Anaesthesia 2014;69:883–90. Chapitre 7 Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 114 Hémostase et coagulation Synopsis IV Orientation clinique devant un syndrome hémorragique Figure 7.1. Orientation clinique devant un syndrome hémorragique. * Molliex S et al, Annales Françaises d’Anesthésie et de Réanimation 31 (2012) 752–763. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 115 Fiche 7.1 Dosage fonctionnel du facteur Willebrand par mesure de l’activité cofacteur de la ristocétine (ou autre méthode évaluant la liaison à la glycoprotéine Ib plaquettaire) NABM 0192 Signification biologique du paramètre Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine multimérique plasmatique, d’origine endothéliale ou plaquettaire, qui permet l’adhésion des plaquettes au sous-endothélium et au collagène en se liant à la glycoprotéine Ib plaquettaire (GPIb), ainsi que l’agrégation des plaquettes entre elles. In vivo, le VWF se lie aux plaquettes après activation par les forces de cisaillement élevées, dans la microcirculation, par exemple. En effet, ces dernières induisent un changement conformationnel du VWF (étirement) qui expose ses sites de liaison. In vitro, l’activation du VWF peut nécessiter l’utilisation d’agents non physiologiques comme la ristocétine. La maladie de Willebrand (VWD pour von Willebrand disease) est la plus fréquente des pathologies hémorragiques constitutionnelles. Elle résulte d’un défaut héréditaire de la concentration, de la structure ou de la fonction du VWF. Selon la nature quantitative ou qualitative du déficit, la classification de la VWD comprend 3 types : • le type 1 déficit quantitatif partiel ; • le type 2 déficit qualitatif ; • le type 3 déficit quasi-total. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectif : la mesure de l’activité cofacteur ristocétine (VWF:RCo) constitue l’examen de référence qui permet de mesurer l’activité du VWF in vitro. Elle consiste à évaluer la liaison du VWF plasmatique au récepteur plaquettaire GPIb en présence de ristocétine. Le test de référence nécessite l’utilisation de plaquettes et de ristocétine. Par ailleurs, il existe trois méthodes de dosage fonctionnel du VWF répertoriées à la nomenclature internationale qui évaluent également la liaison du VWF plasmatique à la GPIb: VWF:Ab, VWF:GPIbR et VWF:GPIbM. Indications: dépistage ou exploration de la VWD, quel que soit son mécanisme (déficit quantitatif et/ou qualitatif) ou son étiologie (constitutionnelle ou acquise). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Une mesure du VWF:RCo (ou l’emploi d’une autre méthode évaluant la liaison du VWF à la GPIb) est indiquée en première intention pour dépister une VWD. La mesure de cette activité est indissociable de la mesure du taux antigénique du VWF (VWF:Ag) et de l’activité coagulante du facteur FVIII de la coagulation. Elle permet également le calcul du ratio VWF:RCo/VWF:Ag orientant vers le type de maladie de Willebrand. Un ratio VWF:RCo/VWF:Ag > 0,6 – 0,7 oriente a priori vers une VWD de type 1. Un ratio VWF:RCo/VWF:Ag < 0,6 – 0,7 oriente a priori vers une VWD de type 2 A, 2 B ou 2 M. 116 Hémostase et coagulation Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de VWF :RCo. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température <– 20 °C ou < – 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001). Principe méthodologique - Le VWF:RCo est un test d’agglutination qui nécessite l’utilisation de plaquettes lyophilisées et de ristocétine. - Le VWF:Ab est une méthode immunoturbidimétrique utilisant des billes de latex recouvertes d’un anticorps monoclonal anti-VWF reconnaissant sur le domaine A1 un épitope fonctionnel pour la liaison à la GPIb. Cette méthode s’affranchit du recours aux plaquettes ou à la ristocétine. - Le VWF:GPIbR mesure l’interaction du VWF avec un fragment recombinant de GPIb capturé sur des billes par un anticorps monoclonal. Il existe deux variantes qui diffèrent selon le mode de lecture par turbidimétrie ou chimiluminescence. Cette méthode s’affranchit de l’utilisation de plaquettes mais nécessite l’emploi de ristocétine. - Le VWF:GPIbM mesure l’interaction du VWF avec un fragment recombinant de GPIb muté (présence de deux mutations « gain de fonction ») permettant une liaison spontanée du VWF à la GPIb sans ristocétine. La lecture est effectuée par turbidimétrie. Type de méthode VWF:RCo : agglutination sur lame (méthode manuelle), en agrégométrie (méthode semi-automatisée.). Les autres méthodes VWF:RCo, VWF:Ab, VWF:GPIbR, VWF:GPIbM sont automatisées avec une lecture par immunoturbidimétrie ou par chimiluminescence. Type de mesure VWF:RCo : agglutination sur lame, méthode semi-quantitative. Les autres méthodes VWF:RCo, VWF:Ab, VWF:GPIbR, VWF:GPIbM sont quantitatives. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Résultats exprimés en pourcentage ou en UI/mL (100 % = 1 UI/mL) = Taux plasmatique à la naissance > 80 %, large distribution des valeurs normales à l’âge adulte : 50-200 %. Les facteurs modulant le taux de VWF sont : l’âge, la grossesse, le cycle menstruel, le phénoype ABO, le syndrome inflammatoire, le stress, l’origine ethnique, ainsi que les variations de gènes VWF ou d’autres gènes régulateurs. Les méthodes diffèrent par : - leur sensibilité aux taux bas de VWF. Limite de quantification : VWF:GPIbM (4 UI/dL), VWF:GPIbR (< 1 % en chimiluminescence et 3,5 % en immunoturbidimétrie), VWF :Ab (6 à 8 %), VWF:RCo sur lame (2 %), VWF en agrégométrie (10 %), VWF :RCo automatisé (de 3 à 10 % selon l’adaptation) ; - leur reproductibilité (CV inter-séries) : > 15 % pour le VWF :RCo en agrégométrie ; < 5 % pour le VWF :GPIbR et VWF:GPIbM ; < 10 % pour le VWF:Ab, de 2 à 15 % pour le VWF:RCo automatisé selon l’adaptation. Il faut donc privilégier les méthodes automatisées au test sur lame de reproductibilité médiocre. Causes d’erreur, limites - Cet examen doit être réalisé à distance d’une grossesse ou d’un syndrome inflammatoire, conditions associées à une augmentation physiologique des taux de VWF. - Les résultats doivent être interprétés en fonction du contexte clinique, du groupe sanguin ABO et des taux de VWF:Ag et FVIII. - Certains polymorphismes diminuant la liaison de la ristocétine au VWF : risque de faux positif commun à l’ensemble des tests ristocétine-dépendants. - Interférence du facteur rhumatoïde pour les méthodes immunoturbidimétriques. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 117 Fiche 7.2 Dosage immunologique du facteur Willebrand (VWF:Ag) NABM : 1013 Signification biologique du paramètre Le facteur Willebrand (VWF) est une glycoprotéine multimérique synthétisée par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes. Il joue un rôle essentiel dans l’hémostase primaire en assurant l’adhésion des plaquettes au sous-endothélium et l’agrégation des plaquettes entre elles ; par ailleurs, il transporte et stabilise le facteur VIII (FVIII) et détermine ainsi le taux plasmatique de ce dernier. Des taux diminués de VWF favorisent un syndrome hémorragique mais des taux élevés peuvent être associés à un risque augmenté de thrombose artérielle ou veineuse. Le VWF intervient aussi dans d’autres processus pathologiques comme l’angiogenèse, la prolifération cellulaire, l’inflammation et l’apoptose. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription concentration de la protéine en circulation. Il est indiqué dans le dépistage ou l’exploration de la maladie de Willebrand (VWD), quel que soit son mécanisme (déficit quantitatif. et/ou qualitatif) ou son étiologie (constitutionnelle ou acquise). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de première intention pour le diagnostic d’une VWD, indissociable de la mesure de l’activité du VWF et du FVIII, ainsi que du calcul des ratios FVIII/VWF:Ag et VWF activité/ VWF:Ag. En effet, si la mesure isolée du VWF:Ag peut permettre de détecter les VWD de type 3 (si la méthode choisie a une sensibilité aux taux < 1 UI/dL) et la majorité des VWD type 1, un taux normal n’exclut pas une VWD, en particulier de type 2. Cet examen consiste à mesurer l’antigène du facteur Willebrand (VWF:Ag) et reflète ainsi la Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du VWF:Ag. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température <– 20 °C ou < – 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001). Principe méthodologique Les différentes méthodes immunologiques varient par la nature de l’anticorps dirigé contre le VWF et/ou le mode de lecture : immunoenzymatique (ELISA, colorimétrique), immunofluorimétrique (ELFA, fluorescence), immuno-turbidimétrique (LIA, optique) ou en immunochimiluminescence (CHIM). Le plasma à tester est mis en contact avec un support (microcupules pour ELISA et ELFA, billes de latex pour LIA, billes magnétiques pour CHIM) recouvert d’anticorps anti-VWF polyclonal (LIA, ELISA) ou monoclonal (ELFA, CHIM). La quantité de VWF fixée est mesurée par turbidimétrie (LIA) ou après ajout d’un conjugué anti-VWF couplé à la peroxydase (ELISA), à un fluorochrome (ELFA) ou à l’isoluminol (CHIM). Type de méthode Méthode automatisée (LIA, ELFA ou CHIM) ou manuelle : ELISA. 118 Hémostase et coagulation Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Résultats exprimés en pourcentage ou en UI/mL (100 % = 1 UI/mL). Taux plasmatique à la naissance > 80 %, large distribution des valeurs normales à l’âge adulte : 50-200 %. Les facteurs modulant le taux de VWF sont : l’âge, la grossesse, le cycle menstruel, le phénoype ABO, le syndrome inflammatoire, le stress, l’origine ethnique et les variations de gènes VWF ou d’autres gènes régulateurs. La connaissance du contexte clinique est indispensable pour l’interprétation. Les méthodes se distinguent par : - leur sensibilité aux faibles taux de VWF : CHIM et ELISA < 1 %, ELFA 1-5 %, LIA 4-6 %, donc par leur capacité à différencier une VWD type 3 d’une VWD type 1 sévère (ELISA et CHIM) ; - leur adaptation à une mesure unitaire dans un contexte d’urgence : LIA, ELFA et CHIM ; - l’interférence du facteur rhumatoïde avec une surestimation possible du taux avec la méthode LIA. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 119 Fiche 7.3 Temps d’occlusion plaquettaire - Platelet Function Analyzer (PFA) Code RIHN E112 Signification biologique du paramètre Le temps d’occlusion plaquettaire est un test d’exploration globale de l’hémostase primaire, simulant le processus d’adhésion et d’agrégation plaquettaire après lésion vasculaire, dans un système reproduisant in vitro les conditions de flux de la microcirculation sanguine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Dépistant l’ensemble des anomalies de l’hémostase primaire dues à une maladie de Willebrand (VWD), à un défaut des plaquettes ou à la prise d’inhibiteurs de l’agrégation plaquettaire, il n’est donc pas spécifique d’une pathologie. Il présente une excellente sensibilité aux anomalies constitutionnelles du facteur Willebrand (VWF) et a un intérêt en pathologie acquise du VWF comme marqueur de flux (appréciation de la correction des anomalies de flux dans le suivi des implantations percutanées de bioprothèse aortique de Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement type TAVI, authentification d’une VWD acquise après implantation d’une assistance circulatoire chez l’insuffisant cardiaque). Sa sensibilité est médiocre dans le dépistage des thrombopathies modérées et la mesure de l’efficacité biologique des traitements antiplaquettaires. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test d’orientation simple et rapide pouvant être réalisé avant des investigations plus approfondies des pathologies de l’hémostase primaire, tout particulièrement dans la maladie de Willebrand constitutionnelle ou acquise, mais aussi les thrombopathies sévères telles que la thrombasthénie de Glanzmann ou le syndrome de Bernard-Soulier, le monitoring des traitements par desmopressine. Il peut être normal dans les thrombopathies modérées et lors des traitements antiagrégants par aspirine, thienopyridines ou apparentés. Inversement, il peut s’allonger de façon non spécifique. Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]). Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C. L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour cet examen. L’industriel indique une stabilité du sang total d’au maximum 4 h à température ambiante. Pas de conservation possible. Principe méthodologique Test réalisé sur un analyseur (PFA-100® ou INNOVANCE® PFA-200, Siemens) à l’aide de cartouches intégrées. Le sang citraté est déposé dans le réservoir. L’échantillon est aspiré à travers un capillaire exposant les plaquettes à une membrane operculée recouverte d’agonistes de l’adhésion et de l’agrégation plaquettaire ; le temps de formation du thrombus plaquettaire au niveau de l’orifice définit le temps d’occlusion (TO). Trois types de cartouches sont commercialisées : collagène/épinéphrine (Coll/EPI), collagène/ADP (Coll/ADP) et Innovance PFA P2Y. Le TO maximum mesuré est de 300 sec. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. 120 Hémostase et coagulation CIQ Non. Il est préconisé de constituer un groupe de donneurs contrôle. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Résultat exprimé en secondes. Des valeurs de référence établies sur sang citraté 0,129 ou 0,109 M (environ 12 % plus courts) sont proposées par l’industriel, mais il est recommandé à chaque laboratoire de déterminer son intervalle de référence. Le TO est influencé par la numération et/ou la fonction des plaquettes, le taux et/ou la fonction du VWF, et l’hématocrite. Un TO normal permet d’exclure une VWD ou une thrombopathie sévère. Causes d’erreur, limites Le résultat doit être interprété au regard de l’hémogramme : les valeurs de référence sont établies pour des valeurs d’hématocrite supérieures à 35 % et de numération plaquettaire supérieures à 150 × 109/L. Pour des valeurs d’hématocrite ou de numérations plaquettaires plus basses, l’allongement des TO peut être au moins partiellement expliqué par l’anémie ou la thrombopénie. De nombreux médicaments influencent le TO. L’aspirine peut allonger le TO de la cartouche Coll/EPI ; la desmopressine raccourcit le TO des cartouches Coll/EPI et Coll/ADP. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 121 Fiche 7.4 Dosage fonctionnel du facteur Willebrand par mesure de la fixation au collagène (liaison VWF-collagène) Code RIHN E046 Signification biologique du paramètre Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine multimérique plasmatique, d’origine endothéliale ou plaquettaire, qui permet l’adhésion des plaquettes au sous-endothélium et au collagène en se liant à la glycoprotéine Ib plaquettaire (GPIb), ainsi que l’agrégation des plaquettes entre elles. La maladie de Willebrand (VWD) est la plus fréquente des pathologies hémorragiques constitutionnelles. Elle résulte d’un défaut héréditaire de la concentration, de la structure ou de la fonction du VWF. Selon la nature quantitative ou qualitative du déficit, la classification de la VWD comprend 3 types : • le type 1 (déficit quantitatif partiel) ; • le type 2 (déficit qualitatif) ; • le type 3 (déficit quasi total). Le type 2 comprend 4 sous-types : 2A, 2B, 2M et 2N. Il existe également de rares formes acquises de maladie de Willebrand (ou syndrome de Willebrand acquis) secondaires le plus souvent à une gammapathie monoclonale ou à une cardiopathie à l’origine d’anomalies de flux. Objectifs de l’analyse et principales indications Une diminution de la liaison du VWF au collagène peut être observée : • en cas de diminution des multimères de haut poids moléculaire d’origine constitutionnelle (variants 2A et 2B) ou acquise (gammapathies monoclonales, cardiopathies avec anomalies de flux) ; • en cas d’anomalies des sites de liaison aux collagènes dans les domaines A1 et A3 du VWF. Une étude de la liaison du VWF au collagène est donc utile au typage de la maladie de Willebrand constitutionnelle et au diagnostic des syndromes de Willebrand acquis. Elle revêt une importance particulière pour le diagnostic des variants 2 M « type collagène » où le VWF:Ag et le VWF:Act sont peu ou pas diminués et l’étude du profil multimérique normale. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’étude de la liaison du VWF au collagène est un test de seconde intention permettant le soustypage 2M de la VWD. 122 Hémostase et coagulation Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandation concernant les conditions de conservation du prélèvement pour cet examen. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température <– 20 °C ou <– 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001). Principe méthodologique Méthode ELISA avec lecture colorimétrique à 450 nM. Les échantillons plasmatiques ajustés en fonction du taux de VWF:Ag sont incubés dans des plaques de microtitration sensibilisées par du collagène (le plus souvent cheval, type I + III). Après lavage, le VWF fixé est révélé grâce à un anticorps marqué à la peroxydase. L’intensité du signal coloré est proportionnelle à la concentration de VWF lié au collagène. Type de méthode Méthode manuelle ELISA (commerciale ou maison). Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Oui, commerciaux. EEQ Oui, commerciaux (ECAT). Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Résultats exprimés en pourcentage ou en UI/mL (100 % = 1 UI/mL). Les performances diagnostiques (sensibilité) varient selon les techniques utilisées (type de collagène variable pour le coating des plaques). Certaines techniques peuvent manquer de sensibilité. Le résultat doit de préférence être confronté à l’étude du profil multimérique. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 123 Fiche 7.5 Agrégation plaquettaire induite par la ristocétine (RIPA) Code LC E132 Signification biologique du paramètre Cet examen évalue l’agrégation d’un plasma riche en plaquettes (PRP) en présence de ristocétine. La ristocétine est un antibiotique glycopeptidique qui, in vitro, se lie au facteur Willebrand (VWF) et à son récepteur la glycoprotéine Ib (GPIb) plaquettaire, induisant une agrégation Willebrand dépendante. Une concentration minimale de 1 mg/mL de ristocétine est nécessaire pour induire l’agrégation d’un PRP normal. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le test RIPA consiste à évaluer la sensibilité du facteur Willebrand à la GPIb plaquettaire en présence de différentes concentrations de ristocétine. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Objectifs : recherche d’une agrégation paradoxale pour de faibles concentrations de ristocétine ≤ 0,7 mg/mL. Indications : diagnostic ou exclusion de la maladie de Willebrand (VWD) de type 2B (hyperaffinité du VWF pour la GPIb) et du pseudo-VWD (hyperaffinité de la GPIb pour le VWF). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Lors du diagnostic de VWD, le test RIPA doit être réalisé d’emblée lors du prélèvement de contrôle afin de ne pas méconnaître certaines formes de VWD 2B qui peuvent se présenter sans anomalie des dosages du VWF:Ag, du VWF:RCo et du FVIII, et aussi sans thrombopénie. Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M ([3,8 %]) permettant la préparation du PRP. Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué. Se référer à la fiche 7.11 « Agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes ». Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement possible. L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire. Mode de conservation La stabilité du sang total est au maximum de 3 h à température ambiante. Pas de conservation possible. Principe méthodologique Technique en agrégométrie optique mesurant la variation de transmission lumineuse d’un PRP soumis à une agitation mécanique, à + 37 °C, en présence de différentes concentrations de ristocétine (fortes concentrations entre 1,2 et 1,5 mg/mL, faibles concentrations entre 0,5-0,6 mg/mL). Il est judicieux de recourir à des concentrations progressivement décroissantes pour déterminer la concentration la plus faible induisant une agrégation et optimiser l’interprétation du test. L’amplitude d’agrégation du PRP en présence de ristocétine dépend de sa concentration en VWF. Le diagnostic différentiel entre VWD 2B et pseudo-VWD fait appel à des RIPA croisées entre PRP patient/PPP (plasma pauvre en plaquettes) témoin et PRP témoin/PPP patient. Type de méthode Méthode manuelle. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage d’agrégation maximale et de vélocité (pente de la courbe). Test peu sensible aux déficits quantitatifs modérés en VWF où la RIPA est souvent normale. RIPA positive à faible concentration (≤ 0,7 mg/mL) dans la VWD 2B et la pseudo-VWD. Causes d’erreur, limites Thrombopénie sévère/Macro-plaquettes. Présence de globules rouges dans le PRP : intensité d’agrégation diminuée, résultats ininterprétables. Variabilité des lots de ristocétine : nécessité de contrôles internes à chaque laboratoire pour déterminer la concentration seuil de réponse. 124 Hémostase et coagulation Fiche 7.6 Mesure de la capacité de liaison du facteur Willebrand au FVIII (VWF:FVIIIB) Code LC E047 Signification biologique du paramètre Le variant 2N de la maladie de Willebrand (VWD Normandie) est caractérisé par une diminution de l’affinité du facteur Willebrand pour le facteur VIII. Sa transmission est récessive. Son phénotype biologique associe une diminution de l’activité coagulante du FVIII (FVIII:C) et un rapport FVIII:C/VWF:Ag < 0,6. Le diagnostic biologique est réalisé grâce à un test mesurant la capacité de liaison du VWF au FVIII (VWF:FVIIIB). Un VWF:FVIIIB nul ou très diminué permet de porter le diagnostic de VWD de type 2N. Si le VWF:FVIIIB n’est que modérément diminué ou normal, le déficit en FVIII ne pourra pas être attribué à un VWD de type 2N et il faudra rechercher une autre étiologie, notamment une hémophilie A constitutionnelle (sujet hémophile ou femme conductrice) ou acquise. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Ce test évalue la fonction du VWF dans la stabilisation et le transport du FVIII. La mesure de ce paramètre est cruciale pour différencier la VWD de type 2N d’une hémophilie A mineure ou modérée (ou avec un statut de conductrice d’hémophilie A) avec un impact direct sur la prise en charge clinique, les choix thérapeutiques et le conseil génétique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test de deuxième intention utile pour l’orientation du diagnostic et des choix thérapeutiques chez les patients présentant une discordance FVIII:C/VWF:Ag < 0,6 quel que soit le taux de VWF:Ag. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de VWF:FVIIIB. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température <– 20 °C ou < – 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001). Principe méthodologique Méthode ELISA avec lecture colorimétrique à 450 nM. Les échantillons plasmatiques ajustés à 5 % (technique maison) ou à 10 % (kit commercial) de VWF:Ag sont incubés dans des plaques de microtitration sensibilisées avec un anticorps de lapin anti-VWF humain. Après élimination du FVIII endogène, une quantité constante de FVIIII recombinant (rFVIII) est déposée. Le rFVIII lié est ensuite quantifié grâce à un anticorps de souris anti-FVIII humain marqué à la peroxydase. L’intensité du signal coloré est proportionnelle à la concentration de FVIII lié. Le pourcentage de fixation est défini dans la méthode maison par le rapport des pentes de fixation du plasma testé par rapport à un plasma de référence et dans la technique commerciale par lecture directe sur la courbe de calibration. Type de méthode Méthode manuelle. Type de mesure Mesure quantitative mais interprétation qualitative. Liaison normale (pourcentage de fixation > 80 %) : exclusion VWD 2N. Liaison nulle ou très diminuée (pourcentage de fixation < 20 %) : VWD 2N. Liaison modérément diminuée (pourcentage de fixation entre 35 et 65 %) : Hétérozygote 2N. CIQ Contrôle normal (kit commercial), plasma « hétérozygote » ou 2 N (technique maison). Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique EEQ Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Non. Les résultats sont exprimés en pourcentage de fixation. 100 % de sensibilité et de spécificité pour le diagnostic de VWD 2N. Le test doit être réalisé sur un plasma contenant plus de 5 % (technique maison) et 15 % (kit commercial) de VWF:Ag. La présence d’anticorps anti-lapin chez certains sujets peut conduire à des résultats erronés. 125 126 Hémostase et coagulation Fiche 7.7 Mesure de la capacité de liaison du facteur Willebrand à la GPIb (liaison VWF-GPIb) Code RIHN E131 Signification biologique du paramètre Le facteur Willebrand (VWF) est une protéine multimérique plasmatique, d’origine endothéliale ou plaquettaire, qui permet l’adhésion des plaquettes au sous-endothélium et au collagène en se liant à la glycoprotéine Ib plaquettaire (GPIb), ainsi que l’agrégation des plaquettes entre elles. La maladie de Willebrand (VWD pour von Willebrand disease) est la plus fréquente des pathologies hémorragiques constitutionnelles. Elle résulte d’un défaut héréditaire de la concentration, de la structure ou de la fonction du VWF. Selon la nature quantitative ou qualitative du déficit, la classification de la VWD comprend 3 types : le type 1 (déficit quantitatif partiel), le type 2 (déficit qualitatif) et le type 3 (déficit quasi total). La VWD de type 2B résulte de mutations du gène VWF qui augmentent anormalement l’affinité du VWF pour la GPIb. Ceci se traduit par une liaison paradoxale du VWF à la GPIb en présence de faibles concentrations de ristocétine (≤ 0,8 mg/mL). Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : cet examen consiste à mesurer la liaison du VWF à un fragment recombinant de GPIbα en présence de concentrations croissantes de ristocétine. Il permet ainsi de mettre en évidence une affinité anormalement élevée du VWF pour la GPIbα. Indications : • Diagnostic de la VWD de type 2B. • Diagnostic différentiel entre la VWD de type 2B et le pseudo-Willebrand plaquettaire, thrombopathie due à une mutation « gain de fonction » sur le gène codant pour la GPIbα. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le test de liaison VWF-GPIb est un examen de deuxième intention dans l’exploration d’une VWD, utile au diagnostic de VWD de type 2B. Il constitue dans cette indication une alternative à la RIPA (agrégation plaquettaire induite par la ristocétine) qui nécessite d’être réalisé sur un plasma riche en plaquettes, immédiatement après le prélèvement. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de VWF:Ag. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température <– 20 °C ou <– 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001). Principe méthodologique Méthode ELISA basée sur l’utilisation d’un fragment recombinant de GPIbα immunofixé auquel est ajouté l’échantillon à tester (plasma pauvre en plaquettes), pré-incubé avec un immunoconjugué anti-VWF et différentes dilutions de ristocétine. La présence d’une liaison paradoxale du VWF à la GPIb aux faibles concentrations de ristocétine permet de poser le diagnostic de VWD de type 2B. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique Type de méthode Méthode manuelle. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 127 Performances observées dans une série monocentrique : vrais positifs : 28/31 plasmas 2B testés ; faux négatifs : 3/31 plasmas 2B testés (Caron 2006). Risque de faux négatif pour certains variants 2 B associés à une perte des formes multimériques les plus fonctionnelles (intérêt de renouveler le test avec le VWF d’un lysat plaquettaire, qui permet une détection plus sensible de ces variants 2B). 128 Hémostase et coagulation Fiche 7.8 Facteur Willebrand, analyse des multimères Code RIHN E044 Signification biologique du paramètre La maladie de Willebrand (VWD pour von Willebrand disease) est la maladie hémorragique la plus fréquente, due à une anomalie quantitative et/ou qualitative du facteur Von Willebrand (VWF). Le VWF est un peptide multimèrique synthétisé dans les cellules endothéliales et les mégacaryocytes : formation de dimères dans le réticulum endoplasmique puis multimérisation dans l’appareil de Golgi. Les multimères sont ensuite libérés directement ou stockés dans les corps de Weibel-Palade ou les granules alpha-plaquettaires. Lors d’une brèche vasculaire, le VWF permet l’adhésion des plaquettes au sous-endothélium grâce à des sites de liaison à la GPIb plaquettaire et au collagène. Ce sont les multimères de plus haut poids moléculaire (HMW) qui portent l’activité biologique du VWF. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Les anomalies de liaison du VWF à la GPIb plaquettaire peuvent être dues à une diminution des HMW, ce qui est le cas dans la VWD de type 2A et certains types 2B, ou à une diminution de l’affinité du VWF pour la GPIb plaquettaire, Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement ce qui est le cas dans le type 2M. L’électrophorèse des multimères permet de faire la différence. Une diminution des HMW (plus ou moins importante en fonction du type d’anomalie génétique) est mise en évidence dans les types 2A et le plus souvent dans les types 2B alors que le profil multimérique est normal dans le type 2M. La particularité du profil multimérique (renforcement des fragments de protéolyse, assemblage des multimères de plus forte masse entraînant une trainée [smear] sur l’électrophorèse, etc.) permet également de subdiviser les VWD de type 2A en 2A (IIA), 2A (IIE). De plus, cette analyse permet de mettre en évidence la perte des multimères de très haut poids moléculaire, retrouvée dans le syndrome de Willebrand acquis lié aux anomalies de flux. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Cette analyse de la répartition des multimères du VWF est un test de seconde intention permettant le sous-typage de la VWD chez un patient présentant des FVIII:C, VWF:Ag et VWF:Act diminués et/ou un ratio VWF:Act/VWF:Ag < 0,7. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de VWF:Ag. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit être effectuée dans les 2 h suivant le prélèvement. La stabilité en plasma congelé (température <– 20 °C ou <– 70 °C) est d’au moins 24 mois (Woodhams 2001). Principe méthodologique Électrophorèse en gel d’agarose-SDS (1,4 à 2 %). En milieu non réducteur, les différents multimères sont séparés par électrophorèse (environ 18 h) en fonction de leur masse moléculaire puis révélés par un anticorps anti-VWF marqué à la phosphatase alcaline. La lecture au densitomètre permet de quantifier les différentes formes : bas PM (≤ 5 mers), PM intermédiaire (6-10 mers), haut PM (> 10 mers), voire très haut PM (> 15 mers si gel sensible). Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique Type de méthode Méthode manuelle ou semi-automatisée. Type de mesure Mesure semi-quantitative. CIQ Plasma de référence titré en VWF:Ag intégré dans chaque série. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 129 Le gel d’agarose à 1,42 % permet d’observer toutes les formes multimériques ainsi que la structure en triplet de l’unité multimérique. D’autres concentrations de gel 2,3-3 % (haute résolution) ou 0,6-1,2 % (faible résolution) permettent respectivement de détailler la structure de l’unité multimérique ou de mettre en évidence des formes supranormales. Technique longue, complexe, limitée à très petit nombre de laboratoires spécialisés, nécessitant un personnel technique expérimenté. 130 Hémostase et coagulation Fiche 7.9 Propeptide du facteur Willebrand Code RIHN E130 Signification biologique du paramètre Le propeptide du facteur Willebrand (VWFpp) agit comme protéine chaperonne du VWF, glycoprotéine multimérique synthétisée par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes. Après sécrétion dans le plasma, VWF et VWFpp circulent indépendamment l’un de l’autre avec des demivies respectives d’environ 12 h et 2 h. Le VWFpp est donc le reflet de la synthèse du VWF. En association à la mesure du VWF, le VWFpp est utile pour identifier une clairance accélérée du VWF mature dans la maladie de Willebrand, constitutionnelle (VWD sous-type Vicenza ou 1C) ou acquise (syndrome de VWD acquis [AVWS]) associée à une gammapathie monoclonale de type IgG. C’est également un biomarqueur permettant de distinguer une activation endothéliale aiguë ou chronique dans diverses pathologies vasculaires. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de mesure CIQ EEQ Performances du test Causes d’erreur, limites du test Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Associé au dosage du VWF antigène (VWF:Ag), celui du VWFpp permet le calcul du rapport VWFpp/VWF:Ag dont l’augmentation est proportionnelle au raccourcissement de la demi-vie du VWF mature. La mesure de ce paramètre est donc un élément d’appréciation de la synthèse et de la clairance du VWF mature dans certains types de VWD constitutionnelle ou acquise, avec un impact direct sur les choix thérapeutiques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test de seconde intention utile pour l’orientation des choix thérapeutiques chez les patients présentant une clairance augmentée du VWF mature, comme les VWD de type 1C (desmopressine inefficace) et les AVWS associés à une IgG monoclonale (efficacité démontrée des IgIV). Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Se référer au dosage immunologique du facteur Willebrand (antigène). Méthode ELISA sandwich avec lecture colorimétrique. Seuls les anticorps sont commercialisés. Le plasma à tester est mis en contact d’une microplaque recouverte d’un anticorps monoclonal antiVWFpp. Après lavage, un conjugué anti VWFpp couplé à la peroxydase est ajouté. L’intensité du signal coloré est proportionnelle à la concentration en VWFpp. Méthode manuelle. Mesure quantitative. Pas ce CIQ commerciaux. Non. Les résultats sont exprimés en UI/dL. Sensibilité d’un test ELISA, <1 UI/dL. On considère qu’un rapport VWFpp:VWF supérieur à 4 permet d’identifier les patients VWD de type 1C (avec clairance augmentée du VWF) mais le seuil définissant un phénotype avec clairance accélérée reste à définir précisément en pathologie acquise. Le test n’étant pas commercialisé sous la forme d’une trousse prête à l’emploi, il doit faire l’objet d’un développement et d’une validation de méthode par le laboratoire avec la préparation propre de CIQ. Les sujets de groupe sanguin O ont des taux de VWF:Ag plus bas que les sujets non-O et un rapport VWFpp/VWF:Ag légèrement plus élevé. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 131 Fiche 7.10 Facteur Willebrand, activité inhibitrice (anti-facteur Willebrand) Code RIHN E043 Signification biologique du paramètre Le syndrome de Willebrand acquis (AVWS) est une entité rare, d’étiologie multifactotrielle, souvent associée à une pathologie sous-jacente (contexte auto-immun, syndrome lymphoprolifératif ou myéloprolifératif, anomalies de flux sanguin). Dans la plupart des cas, la synthèse du facteur Willebrand (VWF) dans les mégacaryocytes et cellules endothéliales, ainsi que sa sécrétion sont normales. L’antigène (VWF:Ag) ou l’activité (VWF:Act) du VWF diminué dans le AVWS peut être la conséquence de différents mécanismes : • la présence d’un anticorps spécifique dirigé contre le VWF ou d’un anticorps non spécifique formant des complexes avec le VWF et accélérant ainsi sa clairance ; • l’adsorption du VWF à la surface des cellules malignes ; • la perte des multimères de haut poids moléculaire due à une anomalie de flux ou à une protéolyse accrue. Par ailleurs, les patients atteints de maladie de Willebrand (VWD) de type 3 peuvent potentiellement développer des allo-anticorps dirigés contre le VWF, en cas de traitement substitutif. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche d’une activité inhibitrice du VWF, par des tests de neutralisation ou par la détection d’anticorps anti-VWF, est indiquée pour le diagnostic du AVWS (hors anomalies de flux) et pour la recherche d’une allo-immunisation chez un patient atteint de VWD de type 3. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche d’un anticorps anti-VWF ou celle d’une activité inhibitrice par un test de neutralisation sont des examens de seconde intention. Ils permettent, en association avec la mesure du taux de propeptide du VWF, de confirmer le caractère acquis du déficit en VWF. Ce diagnostic peut être évoqué chez un patient présentant des taux de FVIII, VWF:Ag et VWF:Act diminués en association avec un syndrome hémorragique d’apparition récente, sans antécédents familiaux. Le diagnostic différentiel entre un AVWS et une VWD congénitale est indispensable, car il conditionne la prise en charge thérapeutique. Cet examen fait par ailleurs partie du bilan de suivi des patients atteints de VWD de type 3 ayant été exposés à des concentrés de VWF. Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Recommandations pour la qualité du prélèvement Pas de recommandations spécifiques disponibles ; le même prélèvement étant le plus souvent utilisé pour la mesure du facteur Willebrand, suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour cet examen. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Principe méthodologique Cf. recommandation pour la qualité du prélèvement. - ELISA (recherche d’anticorps anti-VWF) : VWF plasmatique ou recombinant fixé sur plaque, incubation avec le plasma du patient et révélation par un anticorps anti-IgG humaine couplé à la peroxydase. - Tests de neutralisation : incubation (le plus souvent 2 h) à + 37 °C d’un mélange du plasma à tester avec un plasma normal, puis mesure de l’activité résiduelle VWF:Act (activité cofacteur de la ristocétine ou collagène binding) ou VWF:Ag. L’interprétation est faite par analogie avec la méthode Bethesda. La définition des seuils de positivité doit être établie pour chaque laboratoire dans son système d’analyse. 132 Hémostase et coagulation Type de méthode Méthode manuelle pour l’ELISA (VWF plasmatique ou recombinant). Méthode manuelle/automatisée pour les tests de neutralisation selon le mode de révélation. Type de mesure Mesure qualitative (ELISA) ou semi-quantitative (inhibition). CIQ Plasma contenant un anti-VWF. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites En l’absence de standardisation, chaque laboratoire établit ses propres performances. - ELISA avec VWF plasmatique : les recherches positives ne sont pas interprétables chez les patients de groupe O, du fait de la présence d’anticorps anti-A et anti-B (interférence analytique avec les antigènes du groupe ABO présents sur le VWF d’origine plasmatique). - Tests de neutralisation : peu sensibles car ils mettent en évidence uniquement les anticorps de type neutralisants. Les tests de mélange utilisant le VWF:RCo ne détectent que les anticorps qui interfèrent avec la liaison à la GPIb. L’association de 2 techniques (VWF:CB et VWF:RCo) permet de sensibiliser la technique. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 133 Fiche 7.11 Agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes (PRP) Code NABM 1011 Signification biologique du paramètre Les plaquettes sanguines sont des cellules circulantes anucléées dont la fonction essentielle est d’assurer le colmatage des brèches vasculaires et l’arrêt du saignement. Une anomalie quantitative ou qualitative des plaquettes expose le patient à un risque de saignement. L’étude de l’agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes (PRP) permet une étude fonctionnelle des plaquettes sanguines in vitro. Cette fiche ne concerne pas l’utilisation de l’agrégation plaquettaire pour le diagnostic d’une thrombopénie induite par l’héparine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’agrégation plaquettaire est la conséquence de l’activation des plaquettes induite in vitro par différents agonistes et met en jeu différentes voies de signalisation qui varient en fonction du type et de la dose de l’agoniste utilisé. L’objectif de cet examen est de dépister une anomalie de réponse plaquettaire à un ou plusieurs agonistes pour confirmer ou non l’existence d’une dysfonction plaquettaire et orienter le diagnostic étiologique. Elle est indiquée devant un syndrome hémorragique inexpliqué afin de dépister une dysfonction Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement plaquettaire ou thrombopathie, d’origine constitutionnelle ou acquise. Elle est également indiquée dans certaines formes de maladie de Willebrand (type 2b) qui se manifestent par une affinité exagérée du facteur Willebrand pour son récepteur plaquettaire la GPIb, responsable d’une agrégation plaquettaire en réponse à de faibles doses de ristocétine. L’étude de la réponse aux agents antiplaquettaires (anti-P2Y12, aspirine), bien que non recommandée en routine, peut être utile dans certaines situations pour dépister une résistance au traitement ou un défaut d’observance. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’exploration plaquettaire n’est qu’exceptionnellement réalisée en urgence. Elle s’inscrit le plus souvent dans un contexte d’exploration spécialisée en bilan de première intention si le contexte clinique est en faveur d’une thrombopathie ou en bilan de deuxième intention devant un syndrome hémorragique inexpliqué pour lequel les causes les plus fréquentes de saignement ont été écartées (anomalie de la coagulation et maladie de Willebrand). Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105, 0,109 M (3,2 %) ou 0,129 M (3,8 %). Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué. Le sang doit être prélevé après une période de repos pour atténuer l’effet de l’exercice physique et à distance d’une prise de tabac (30 min) et d’une absorption de caféine (2 h). Le prélèvement à jeun est conseillé, mais reste possible après une collation très légère et dépourvue de matières grasses. Le prélèvement doit être effectué avec une aiguille de 21G sous stase veineuse minimale dans des tubes plastiques ou en verre siliconé après avoir éliminé les premiers mL de sang (tube de purge). Toute prise médicamenteuse doit être identifiée pour éviter les biais d’interprétation des résultats (en particulier anti-inflammatoires non stéroïdiens, antiplaquettaires, etc.). Selon l’indication de l’exploration plaquettaire et l’état clinique du patient, les médicaments connus pour inhiber les fonctions plaquettaires devront avoir été arrêtés 10 jours avant l’exploration. Le non-respect de ces conditions est acceptable si la recherche porte sur l’identification d’un défaut très sévère comme une maladie de Glanzmann. 134 Hémostase et coagulation Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement possible. L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire. La stabilité du sang total est au maximum de 3 h à température ambiante. Pas de conservation possible. Le test est réalisé en PRP préparé par centrifugation du sang citraté 10 min à 200 g entre + 18 et + 22 °C, sans frein, ou par sédimentation en cas de plaquettes géantes. La numération plaquettaire du PRP ne doit pas être ajustée par du plasma autologue pauvre en plaquettes jusqu’à 600 × 109/L. En cas de thrombopénie, les résultats seront interprétés avec prudence. Le principe du test est basé sur une mesure photométrique de l’éclaircissement du PRP secondaire au phénomène d’agrégation initié par un agoniste (adénosine diphosphate (ADP), acide arachidonique, épinéphrine, collagène, peptide d’activation libéré par la thrombine [TRAP], etc.). Le défaut peut concerner la réponse plaquettaire induite par un seul agoniste mais, dans la plupart des cas, l’orientation diagnostique devra intégrer et interpréter des défauts de réponse à plusieurs agonistes en raison de la mise en jeu de voies de signalisation communes à plusieurs agonistes et de l’existence de voies d’amplification (ADP, Thromboxane A2 [TXA2]) d’importance variable selon l’agoniste testé. Type de méthode Méthode essentiellement manuelle. Commercialisation récente d’une méthode automatisée. Type de mesure Mesure à la fois qualitative et quantitative. CIQ Pas de CIQ disponible. Les résultats sont interprétés au regard de valeurs de référence établies par les laboratoires pour le couple réactifs/appareil utilisé. EEQ Un guide d’interprétation est proposé par l’ECAT en coopération avec NASCOLA (www.ecat.nl). Valeurs de référence/ Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage maximal d’agrégation et en vélocité. Pour certains d’agonistes, le temps de latence est également à considérer. L’agrégation plaquettaire sur PRP relève d’une pratique spécialisée et doit être limitée à des centres « expérimentés ». À titre indicatif, la reproductibilité intra-série (n = 21) pour les 5 agonistes usuels et pour un couple réactif agoniste défini se situe entre 3,8 et 6,6 %. Des profils types d’agrégation plaquettaire ont été établis pour les défauts plaquettaires sévères (maladie de Glanzmann, maladie de Bernard et Soulier, déficit en kindline 3, déficit en CalDAG-GEFI, déficit en récepteurs d’activation en particulier à l’ADP, au collagène, au thromboxane A2). La persistance des anomalies dans le temps est un critère important à prendre en compte. Causes d’erreur, limites du test Les prélèvements très hémolysés ou lipémiques avec une numération plaquettaire insuffisante dans le PRP (< 150 × 109G/L excepté si la recherche porte sur des défauts très sévères) modifient l’interprétation des résultats. Les résultats doivent également être interprétés en fonction du traitement pris par le patient. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 135 Fiche 7.12 Quantification des glycoprotéines plaquettaires par cytométrie en flux (GPIb, GPIIbIIIa) et mise en évidence des marqueurs d’activation Code RIHN E099 Signification biologique du paramètre Les plaquettes sanguines sont des cellules circulantes anucléées dont la fonction essentielle est d’assurer le colmatage des brèches vasculaires et l’arrêt du saignement. Une anomalie quantitative ou qualitative des plaquettes expose à un risque de saignement. Certaines anomalies qualitatives correspondent à des déficits en protéines de surface ou intracellulaires ou à des défauts de signalisation dont le diagnostic bénéficie des performances de la cytométrie en flux (CMF). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La CMF permet l’analyse rapide d’une grande quantité de plaquettes dans un petit volume de sang total, de plasma riche en plaquettes ou de plaquettes lavées. Cette technique, basée généralement sur la reconnaissance d’un épitope spécifique par un anticorps couplé à un fluorochrome, est utilisée pour quantifier la molécule d’intérêt, à la surface ou à l’intérieur des plaquettes et peut également renseigner sur les fonctions plaquettaires. Dans ce cas, la mesure s’effectue avant et après stimulation des plaquettes et la mise en œuvre d’anticorps dirigés, le plus souvent, contre des épitopes de conformation qui n’apparaissent que lorsque la plaquette est activée, ou contre des protéines de signalisation phosphorylées. L’utilisation d’annexine V permet de mesurer l’exposition des phosphatidylsérines à la surface des plaquettes, marqueur indirect de leur activité procoagulante. L’utilisation de ligands fluorescents se fixant aux récepteurs activés est utile pour évaluer l’état d’activation des plaquettes. Le contenu des plaquettes en granules denses et leur capacité à sécréter ces granules sont estimés, après incubation des plaquettes avec de la mépacrine (normalement captée par les plaquettes et présentant une forte affinité pour l’ATP et l’ADP) et mesure de leur fluorescence à l’état basal et après stimulation. Ainsi la CMF est d’une aide appréciable pour le diagnostic de nombreuses pathologies plaquettaires dont les déficits en glycoprotéines de surface (GPIb : maladie de Bernard et Soulier ; GPIIbIIIa : thrombasthénie de Glanzmann ; GPVI : défaut de réponse au collagène) ou granulaires (absence de CD62P : syndrome des plaquettes grises ; absence de CD63, test à la mépacrine anormal : déficit en granules denses) ou un défaut de signalisation (profils anormaux après stimulation plaquettaire). La CMF est également utilisée pour mesurer l’état d’activation des plaquettes circulantes dans divers contextes (pathologies cardiovasculaires, infectieuses, auto-immunes, etc.) généralement au cours d’études cliniques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Ces analyses s’inscrivent le plus souvent dans une démarche diagnostique et un contexte d’exploration spécialisée. Elles sont exceptionnellement réalisées en urgence, par exemple dans un contexte hémorragique néonatal avec forte suspicion de maladie de Glanzmann. Elles sont rarement prescrites en première intention, devant un contexte clinique personnel et familial évocateur. Elles sont généralement réalisées en deuxième intention chez un patient pour lequel les causes les plus fréquentes de saignement (anomalie de la coagulation, maladie de Willebrand) ont été éliminées et lorsque les tests d’agrégation plaquettaire suggèrent une anomalie plaquettaire. 136 Hémostase et coagulation Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105 M, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]). EDTA possible si la stimulation des plaquettes n’est pas envisagée. Recommandations pour la qualité du prélèvement Sang prélevé après une période de repos et à distance d’une prise de tabac (30 min) et d’une absorption de caféine (2 h). Prélèvement à jeun conseillé mais restant possible après une collation très légère et dépourvue de matières grasses. Prélèvement effectué avec une aiguille de 21G sous stase veineuse minimale après avoir éliminé les premiers mL de sang. Identifier toute prise médicamenteuse pour éviter les biais d’interprétation des résultats (en particulier anti-inflammatoires non stéroïdiens, antiplaquettaires, etc.). Selon l’indication de l’exploration plaquettaire et l’état clinique du patient, les médicaments connus pour inhiber les fonctions plaquettaires doivent être stoppés 10 jours avant l’exploration. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement possible. Utilisation d’un pneumatique à valider par le laboratoire. Test le plus souvent réalisé rapidement après le prélèvement. Des solutions peuvent fixer le sang (avant et après stimulation) permettant l’envoi à un laboratoire référent. Test réalisé sur sang total ou plasma riche en plaquettes (PRP) préparé par centrifugation du sang 10 min à 200 g à température ambiante, sans frein, ou par sédimentation en cas de plaquettes géantes. Les plaquettes sont marquées par un ou plusieurs fluorochromes couplés à des anticorps, à d’autres ligands plaquettaires ou à des molécules captées par les plaquettes, puis analysées par CMF. Type de méthode Méthode manuelle. Type de mesure Mesure à la fois qualitative et quantitative. CIQ Contrôle d’alignement du cytomètre. Il n’existe pas d’échantillons sanguins stabilisés pour les plaquettes. EEQ Non. Valeurs de référence/ Performances du test Les résultats peuvent être exprimés en pourcentage de plaquettes marquées, en moyenne d’intensité de fluorescence ou en nombre de sites à l’aide de kits de quantification utilisant des billes de calibration. Le laboratoire doit vérifier ses valeurs de référence. Indispensable à de nombreux diagnostics de pathologies plaquettaires. Causes d’erreur, limites Test qui relève d’une pratique spécialisée et qui doit être limité à des centres expérimentés. La fiabilité des résultats est dépendante du préanalytique, du type d’échantillon, de la stimulation appliquée, de l’affinité des anticorps utilisés et de l’expertise de l’expérimentateur. Résultats à interpréter en fonction de l’anamnèse et du reste de l’exploration biologique. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 137 Fiche 7.13 Temps de lyse (du caillot) des euglobulines Code NABM 0175 Signification biologique du paramètre Le caillot des euglobulines correspond à la précipitation de protéines de la coagulation, notamment le fibrinogène, le plasminogène, le t-PA et l’u-PA. La précipitation des protéines à pH acide (pH = 5,9) élimine, au moins en partie, les inhibiteurs de la fibrinolyse (α 2 anti-plasmine, PAI, etc.) que l’on retrouve dans le surnageant. Cette absence d’inhibiteurs dans le caillot permet d’observer un temps de lyse sur une période relativement courte. Ainsi, le temps de dissolution du caillot de lyse des euglobulines est supérieur à 3 heures, chez un sujet indemne de toute pathologie de la fibrinolyse. La mesure du temps de lyse du caillot des euglobulines est également appelée « test de Von Kaulla ». Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le temps de lyse des euglobulines peut être considéré comme un test global de mesure de l’activité fibrinolytique d’un plasma. L’objectif de l’analyse Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement est donc de mettre en évidence une activité fibrinolytique élevée, notamment dans le contexte clinique de la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Cet examen est indiqué devant tout syndrome hémorragique dans lequel un excès de fibrinolyse est évoqué. Il n’est pas indiqué dans la surveillance des traitements fibrinolytiques. Il n’est pas indiqué, car non sensible, dans la surveillance des traitements inhibiteurs de la fibrinolyse. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le temps de lyse des euglobulines est un test simple et peu coûteux qui permet de mettre en évidence les états de fibrinolyse aigus. Le test conserve un certain intérêt dans la mesure où les méthodes d’exploration de la fibrinolyse sont peu développées, en dehors des techniques de type thromboélastogramme. La mesure du temps de lyse des euglobulines est non requise et, en pratique, inconstamment réalisée, dans le contexte d’une exploration de CIVD. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total (transport du prélèvement le plus rapidement possible) ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Réalisation immédiate. Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant la conservation du prélèvement. Principe méthodologique Les protéines plasmatiques d’un plasma citraté pauvre en plaquettes, dilué en eau distillée, sont précipitées en présence d’acide acétique glacé (0,016 %, pH 5). Les protéines précipitées sont dissoutes dans un tampon borate. La solution ainsi obtenue est calcifiée, ce qui déclenche la formation du caillot. La lyse est alors observée et le temps pour obtenir la lyse complète du caillot est mesuré. Différentes variantes de la méthode ont été décrites : obtention du caillot en présence de kaolin, adaptation de la technique en micropuits, méthode en plaque, ou encore lecture spectrophotométrique du caillot. Type de méthode Méthode manuelle. 138 Hémostase et coagulation Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Pas de CIQ commercialisé. Évaluation en parallèle d’un plasma normal recommandée. EEQ Pas d’EEQ commercialisé. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les performances de cet examen sont difficiles à appréhender. Le temps de lyse des euglobulines est dépendant de la concentration en fibrinogène du plasma. Par conséquent, le test n’est pas adapté en cas d’hypofibrinogénémie. En dehors de cette situation, un temps de lyse inférieur à 30 min témoigne d’un excès de fibrinolyse et évoque un risque hémorragique important. Bien que quantitatif (mesure chronométrique), le test est à interpréter de façon qualitative. Causes d’erreur, limites L’observation optique de la lyse est une source d’erreur et de variabilité. Le test n’est pas adapté en cas d’hypofibrinogénémie. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 139 Fiche 7.14 Dosage du facteur XIII (facteur de stabilisation de la fibrine) Code NABM 0173 Signification biologique du paramètre Le facteur XIII (FXIII) est la dernière enzyme à être activée dans la cascade de la coagulation. Il a comme principal rôle de stabiliser la fibrine. Il circule dans le plasma sous forme d’un hétérotétramère de haut poids moléculaire FXIII-A2B2 inactif, zymogène d’une transglutaminase. La sous-unité A, catalytique, est principalement synthétisée par la moelle osseuse mais aussi par les histiocytes tissulaires. La sous-unité B, produite par le foie, assure le transport et la protection de la sous-unité A dans le plasma. Lors de l’activation par la thrombine et le calcium, les sous-unités A et B se dissocient et la sous-unité A est clivée en forme active (A2*). Elle favorise la stabilisation du caillot de fibrine. Le FXIII joue également un rôle dans la cicatrisation des plaies, l’angiogenèse et le développement placentaire. Sa demi-vie est longue (≈ 9 jours). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : mise en évidence de déficits constitutionnels ou acquis exposant à un risque hémorragique. Les déficits constitutionnels en FXIII sont classés en 3 groupes : déficit en FXIII-A de type I (quantitatif) ou II (qualitatif) et déficit en FXIII-B. Le déficit sévère en FXIII (taux < 1 %) est très rare (1/1 à 2 000 000), de transmission autosomale récessive. Des taux de FXIII > 5-30 % peuvent être associés à des saignements Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement après chirurgie/traumatisme ou à d’autres manifestations. Exceptionnellement, il existe des déficits acquis en facteur XIII dont la symptomatologie hémorragique est variable. Indications : syndrome hémorragique inexpliqué en particulier retardé, saignements du nouveau-né (hémorragie intracérébrale ou du cordon ombilical et/ou hémorragie prolongée à la chute du cordon ombilical) ou défaut de cicatrisation. Le dosage est parfois réalisé lors de fausses couches spontanées à répétition. Enfin, il peut être prescrit en suivi chez un patient substitué par des concentrés de facteur XIII. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration À l’exception des hémorragies intracrâniennes de l’enfant où le dosage du FXIII est d’emblée indiqué, il s’agit d’un examen de seconde intention dans l’exploration d’un syndrome hémorragique, à effectuer après réalisation des tests d’hémostase standard, normaux en cas de déficit en FXIII, et après exclusion d’une maladie de Willebrand ou d’une anomalie fonctionnelle plaquettaire. Dans le cas des fausses couches à répétition, ce dosage pourra être réalisé dans le cadre d’un bilan étiologique de seconde intention après la recherche de SAPL (syndrome des antiphospholipides). Un déficit doit toujours être confirmé sur un second prélèvement. Le dosage antigénique est indiqué pour typer un déficit constitutionnel. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. 140 Hémostase et coagulation Mode de conservation Principe méthodologique Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du FXIII. Des données de la littérature indiquent une conservation du plasma congelé à une température <– 20 °C jusqu’à 3 mois, et ≤– 70 °C jusqu’à 18 mois. La centrifugation du sang total pour l’obtention du plasma doit se faire dans les 2 h suivant le prélèvement. Une mesure d’activité doit être réalisée en première intention. La technique fonctionnelle semi-quantitative de solubilité du caillot n’est plus recommandée car trop peu sensible. Les mesures d’activité font appel à des techniques photométriques basées sur l’étude de la libération de NH3 par le FXIIIa (mesure à 340 nm via une réaction dépendante de la consommation de NADH ou de NADPH proportionnelle à l’activité du FXIII) qui sont facilement automatisables, rapides bien que peu sensibles. La technique d’incorporation d’amine marquée a une meilleure sensibilité mais est peu robuste et difficile à mettre en œuvre. Lorsque l’activité est diminuée, la caractérisation du déficit est complétée par un dosage antigénique : antigène FXIII-A2B2 puis, si diminué, FXIII-A et FXIII-B. La recherche des anticorps anti-FXIII est mal standardisée et fait appel à des techniques de type Bethesda ou Nijmegen et des dosages fonctionnels, après chauffage du plasma à + 58 °C pendant 90 min. L’incubation secondaire doit être d’au moins 30 min à + 37 °C. Type de méthode Méthode automatisée. : photométrie, fluorimétrie, immunoturbidimétrie ou manuelle : ELISA. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Commerciaux. EEQ Oui (ECAT www.ecat.nl, UK NEQAS www.ukneqas.org.uk). Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Taux plasmatique dès la naissance et chez l’adulte > 70 %. Limite de quantification ≈ 7 % en technique photométrique. La technique d’incorporation d’amine est sensible au polymorphisme Val34Leu qui augmente les taux mesurés. Les techniques antigéniques doivent préciser s’il s’agit de dosages du FXIII sous forme tétramérique (FXIII-A2-B2), ou des sous-unités A ou B. Techniques photométriques : libération non spécifique de NH3 par décomposition de NAD (P) H indépendante du FXIIIa. Dans ce cas, il y a une possible surestimation pour les faibles taux (< 20 %), négligeable pour les valeurs normales. La correction de la valeur de l’activité FXIII s’effectue par la réalisation d’un blanc plasma : blocage complet de l’activité transglutaminase du FXIIIa par l’iodoacétamide 1 mmol/L. Interprétation selon le contexte clinique. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 141 Fiche 7.15 Plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1), activité (dosage chromogénique et antigénique) Code RIHN E096 Signification biologique du paramètre Le PAI-1 est un inhibiteur de la fibrinolyse présent dans le plasma et les plaquettes sanguines. Le PAI-1 circulant est, pour 90 %, contenu dans les granules alpha plaquettaires. Son action principale est de s’opposer à la dégradation du caillot de fibrine. Il est possible de quantifier l’activité et l’antigène du PAI-1. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription 1. Dépister les patients atteints de déficit sévère en PAI-1 : déficit très rare à transmission autosomique récessive, plus rarement dominante, responsable de saignements parfois sévères attribués à une augmentation de la fibrinolyse par défaut d’inhibition. Dans ce contexte le dosage de l’antigène est requis et montrera une absence complète de PAI-1 dans le plasma dépourvu en plaquettes, dans les plaquettes et dans le sérum. 2. Conforter un diagnostic de déficit en granules alpha plaquettaires : une réduction importante de la concentration du PAI-1 antigène dans les secréta plaquettaires ou dans le sérum alors que sa concentration plasmatique est normale est un élément en faveur du diagnostic du syndrome Nature du prélèvement des plaquettes grises. À l’opposé, un taux normal de PAI-1 dans le sérum exclut un déficit sévère en granules alpha. 3. Apprécier la sévérité du syndrome métabolique : les taux plasmatiques de PAI-1 sont étroitement associés à la présence d’un syndrome métabolique. La quantification de l’activité du PAI-1 dans le plasma permet d’apprécier l’intensité des dépôts ectopiques de graisse amenant à faire du PAI-1 un élément de suivi du syndrome métabolique. Dans ce contexte, le dosage de PAI-1 activité plasmatique se révèle plus informatif que le dosage de PAI-1 antigène qui peut être faussé par de mauvaises conditions préanalytiques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le dosage de PAI-1 s’inscrit toujours dans un bilan de deuxième intention après avoir exclu les autres causes de syndrome hémorragique constitutionnel. En diabétologie le dosage de PAI-1 activité s’inscrit dans un bilan de sévérité du syndrome métabolique en complément des autres critères clinicobiologiques. L’exploration du PAI-1 nécessite une évaluation de son activité et/ou de son antigène selon les indications. Pour le dosage de l’activité du PAI-1, il est recommandé d’utiliser un tube citrate acidifié de façon à bloquer ex vivo toute interaction entre le PAI-1 et son ligand, le tissue Plasminogen Activator (t-PA). Un prélèvement sur tube citrate est possible si la chaîne du froid est maintenue. Le dosage du PAI-1 antigène peut s’effectuer sur plasma ou sur sérum selon les indications. Le prélèvement du sérum ne requiert pas de conditions particulières. En revanche, le dosage du PAI-1 antigène sur plasma nécessite d’éviter toute contamination par le PAI-1 plaquettaire et donc de prélever sur tube CTAD pour limiter l’activation plaquettaire. L’utilisation d’un tube citrate (0,105 M, 0,109 M (3,2 %) ou 0,129 M (3,8 %)) est cependant possible si les conditions préanalytiques sont respectées. 142 Hémostase et coagulation Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Pour le dosage plasmatique du PAI-1 (activité ou antigène), le sang doit être prélevé après une période de repos de 20 min pour atténuer l’effet de l’exercice physique, à jeun, le matin entre 8 h et 10 h, en raison de l’existence d’une variation circadienne du PAI-1. Le dosage devra s’effectuer à distance d’un épisode thrombotique ou inflammatoire aigu et en dehors de la grossesse. La ponction veineuse doit être franche et le prélèvement doit s’effectuer avec une stase minimum. Il est conseillé d’ôter le garrot dès le prélèvement effectué et d’éliminer les premiers mL de sang. Si un dosage de PAI-1 activité est indiqué il est recommandé de maintenir la chaîne du froid (+ 4 °C) dès le prélèvement car l’activité du PAI-1 diminue à la chaleur. La préparation du plasma doit éviter toute contamination par les plaquettes, en particulier si un dosage du PAI-1 antigène est indiqué. Il est recommandé de centrifuger le tube de sang pendant 30 min à 2 500 g et de recueillir la partie supérieure du plasma pour limiter la contamination par la couche leucoplaquettaire. Acheminement du tube citraté dans la glace. Pas de contrainte pour le sérum. Congélation à – 20 °C (1 mois maximum), à – 80 °C (plusieurs années). La plupart des méthodes mesurant l’activité PAI-1 sont basées sur le principe général suivant : un volume d’activateur du plasminogène (t-PA) est incubé à température ambiante avec un volume de plasma qui contient l’inhibiteur à doser. S’ensuivent une acidification et une dilution pour détruire l’activité antiplasmine et stopper l’interaction entre le t-PA et le PAI-1. L’activité du t-PA résiduel est ensuite quantifiée sur du plasminogène apporté en excès. L’activité de la plasmine formée est alors évaluée sur un substrat spécifique. La lecture s’effectue par comparaison à une gamme de t-PA. Plus la quantité de plasmine formée est importante, plus la quantité de PAI-1 actif présente dans l’échantillon de départ est faible. Un essai immunofonctionnel est également disponible. Il consiste à déposer l’échantillon dans les puits d’une microplaque recouverts de t-PA. Le PAI-1 actif ayant lié le t-PA est ensuite révélé par un anticorps traceur anti-PAI-1. La lecture s’effectue par comparaison à une gamme établie à partir d’un plasma lyophilisé titré en PAI-1. Mesure du PAI-1 antigène par méthode ELISA. Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ CIQ industriels. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Performances du test Les résultats sont exprimés en ng/mL ou en UI/mL. Un individu sain non obèse en dehors de tout épisode inflammatoire et en l’absence de grossesse présente des taux plasmatiques très faibles de PAI-1. Ceci explique que la distribution des valeurs normales obtenues dans la population générale ne soit pas gaussienne. Il est conseillé à chaque laboratoire de définir ses valeurs normales chez des sujets sains non obèses en dehors de toute inflammation aiguë et en dehors de la grossesse. Les tests disponibles ont une bonne répétabilité et reproductibilité. Causes d’erreur, limites L’interprétation des dosages de PAI-1 antigène plasmatique doit avant tout exclure une contamination plaquettaire. Un dosage de PAI-1 dans le sérum doit s’interpréter en fonction du compte plaquettaire. Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 143 Fiche 7.16 Recherche et titrage d’un anticorps spécifique dirigé contre le facteur VIII ou le facteur IX Codes NABM 1018 et 1019 Signification biologique du paramètre Les anticorps anti-facteur VIII (FVIII) ou antifacteur IX (FIX), ou inhibiteurs spécifiques des FVIII ou FIX, sont le plus souvent des allo-anticorps apparaissant chez des patients présentant un déficit constitutionnel en FVIII (hémophilie A) ou FIX (hémophilie B) et traités par substitution en facteur manquant. Ces allo-anticorps représentent la principale complication du traitement de l’hémophilie. Il s’agit le plus souvent d’anticorps neutralisants qui annulent l’effet hémostatique des facteurs injectés. Les auto-anticorps, principalement anti-FVIII, sont peu fréquents, et peuvent apparaître au décours d’une pathologie dysimmunitaire, infectieuse ou néoplasique, au cours du post-partum, lors de la prise de certains médicaments (antibiotiques, sulfamides, phénytoïne, etc.), ou sans cause apparente. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche d’un anti-FVIII ou anti-FIX doit être réalisée régulièrement chez l’hémophile substitué, a fortiori si le patient présente des signes hémorragiques inhabituels ou persistants malgré une thérapeutique substitutive. Les auto-anticorps doivent être recherchés lors de syndrome hémorragique avec déficit acquis sévère en FVIII ou FIX. Si la recherche est positive, l’anticorps devra être titré. Ce titrage a un intérêt dans le diagnostic, la prise en charge et le suivi du traitement des patients qui développent ces anticorps. Le titre n’est cependant pas prédictif du risque hémorragique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche d’un anti-FVIII ou anti-FIX est toujours associée à un dosage de FVIII ou FIX. Les titrages doivent être réalisés dans un laboratoire ayant une activité en hémostase spécialisée. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Cf. recommandations pour la qualité du prélèvement. Principe dérivé de la méthode Bethesda/Nijmegen. Le plasma du malade utilisé pour la recherche ou le titrage ne doit pas contenir le facteur contre lequel l’inhibiteur recherché est dirigé. Si le taux du facteur concerné est > à 5 %, le plasma du malade doit être chauffé préalablement à + 58 °C pendant 30 min pour les anti-FVIII ou 90 min pour les anti-FIX. Pour la recherche, le plasma du malade est mélangé à volume égal avec un plasma témoin (contenant 100 % du facteur déficient chez le malade et dans un milieu tamponné). L’inhibition du facteur apporté par le plasma témoin dans le mélange est appréciée par la mesure du facteur résiduel après incubation à + 37 °C pendant 2 h (pour l’anti-FVIII) ou 10 min à 2 h (pour l’anti-FIX). La recherche est positive si le taux résiduel de facteur dans le mélange est < 66 %. Dans ce cas, le titre de l’anticorps doit être déterminé et exprimé en unités Bethesda définies par la quantité d’anticorps contenue dans un 1 mL de plasma neutralisant 50 % de l’activité d’un plasma normal. Pour le titrage, le taux résiduel de facteur est déterminé dans les mélanges en utilisant différentes dilutions du plasma du malade en tampon imidazole. 144 Hémostase et coagulation Type de méthode Méthode semi-automatisée. Type de mesure Mesure qualitative pour la recherche, quantitative pour le titrage. CIQ CIQ commerciaux disponibles. EEQ EEQ commerciaux disponibles. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Résultats du titrage exprimés en unités Bethesda par mL. Seuil de positivité : 0,6 UB/mL. Les performances du test peuvent varier selon les réactifs utilisés. Le choix du plasma témoin est essentiel pour éviter les variations de pH du mélange « plasma du malade + plasma du témoin » au cours de l’incubation (milieu tamponné). Causes d’erreur, limites Manque de standardisation interlaboratoires : préconiser le suivi dans le même laboratoire. Difficultés d’interprétation pour les anticorps présentant une cinétique d’inactivation inhabituelle. - Faux positif : présence d’un anticoagulant circulant de type lupique. - Faux négatif : 1) spécifique d’un facteur de la coagulation non neutralisant et accélérant la clairance plasmatique du facteur de la coagulation contre lequel il est dirigé. Réaliser dans ce cas une recherche par technique ELISA ; 2) recherche durant un traitement substitutif ou un traitement procoagulant par un agent bypassant (facteur VII activé ou concentré de complexe prothrombinique activé). Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique 145 Fiche 7.17 Recherche et titrage d’un anticorps spécifique d’un facteur de la coagulation (hors facteurs VIII et IX) Code RIHN E063 Signification biologique du paramètre Un anticorps spécifique d’un facteur de la coagulation est un inhibiteur acquis dirigé contre un facteur de la coagulation. Ces allo- ou autoanticorps peuvent être dirigés contre n’importe lequel des facteurs plasmatiques de la coagulation. Selon leur cible, ils peuvent être associés à des complications hémorragiques d’expression clinique variable, parfois sévères. Plus rarement, le patient reste asymptomatique et, exceptionnellement, il peut présenter un risque thrombotique. Les allo-anticorps apparaissent chez des patients présentant un déficit constitutionnel en un facteur de la coagulation et traités par des transfusions contenant le facteur manquant. Les auto-anticorps, peu fréquents, peuvent se manifester au décours d’une pathologie dysimmunitaire, infectieuse ou néoplasique, lors de la prise de certains médicaments (antibiotiques, sulfamides, phénytoïne, etc.), ou sans cause apparente. La plupart de ces anticorps inhibent l’activité coagulante du facteur contre lequel il est dirigé, et sont dits « neutralisants ». Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche d’anticorps spécifiques dirigés contre un facteur de la coagulation est indiquée Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation en cas de découverte d’un déficit isolé en un facteur de la coagulation chez un patient sans antécédent connu et après exclusion des autres causes de déficit acquis (début d’insuffisance hépatique, de coagulation intravasculaire disséminée, etc.) ou lorsqu’un patient avec un déficit constitutionnel en un facteur est traité par des transfusions contenant ce facteur. Dans ce cas, la recherche d’anticorps anti-facteur sera indiquée si le patient présente des signes hémorragiques inhabituels ou persistants malgré une thérapeutique substitutive. Si la recherche est positive, l’anticorps sera titré. Ce titrage a un intérêt dans le diagnostic, la prise en charge et le suivi du traitement. Le titre n’est cependant pas prédictif du risque hémorragique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche d’un anticorps spécifique d’un facteur de la coagulation est un examen de deuxième intention à réaliser en cas de déficit isolé en un facteur de la coagulation, après exclusion des autres causes de déficit et concertation clinicobiologique. Les titrages doivent être réalisés dans un laboratoire ayant une activité en hémostase spécialisée. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Cf. recommandations pour la qualité du prélèvement. 146 Hémostase et coagulation Principe méthodologique Principe dérivé de la méthode Bethesda/Nijmegen. Le plasma du malade ne doit pas contenir le facteur contre lequel l’inhibiteur recherché est dirigé. Chauffer préalablement le plasma à + 58 °C pendant 30 min (90 min pour les anti-XI) si le taux résiduel du facteur concerné est > à 5 % ou quelle que soit la concentration pour le fibrinogène. Pour la recherche, le plasma du malade est mélangé à volume égal avec un plasma témoin (contenant 100 % du facteur déficient chez le malade et dans un milieu tamponné). L’inhibition du facteur apporté par le plasma témoin dans le mélange est appréciée par la mesure du facteur résiduel après incubation à + 37 °C 10 min à 2 h. Si la recherche est positive, le titre de l’anticorps doit être déterminé et exprimé en unité Bethesda définie par la quantité d’anticorps contenue dans un 1 mL de plasma neutralisant 50 % de l’activité d’un plasma normal. Pour le titrage, le taux résiduel de facteur est déterminé dans les mélanges en utilisant différentes dilutions du plasma du malade en tampon imidazole. Type de méthode Méthode semi-automatisée. Type de mesure Mesure qualitative pour la recherche, quantitative pour le titrage. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Le seuil de positivité peut varier selon les conditions méthodologiques. Il est conseillé de tester en parallèle au moins un plasma frais congelé sans déficit sévère en facteur. 1) Manque de standardisation interlaboratoires : préconiser le suivi dans le même laboratoire. 2) Difficultés d’interprétation pour les anticorps présentant une cinétique d’inactivation inhabituelle. 3) Faux positif : présence d’un anticoagulant circulant de type lupique. Faux négatif : anticorps spécifique d’un facteur de la coagulation non neutralisant et accélérant la clairance plasmatique du facteur de la coagulation contre lequel il est dirigé (recherche par technique ELISA) ou recherche durant un traitement substitutif ou un traitement procoagulant par un agent bypassant (FVIIa ou concentré de complexe prothrombinique activé). Chapitre 7. Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique Bibliographie du chapitre 7 FICHE 7.1 – Dosage fonctionnel du facteur Willebrand par mesure de l’activité cofacteur de la ristocétine (ou autre méthode évaluant la liaison à la glycoprotéine Ib plaquettaire) Bodó I, Eikenboom J, Montgomery R, et al. von Willebrand factor Subcommittee of the Standardization and Scientific Committee of the International Society for Thrombosis and Haemostasis. Platelet-dependent von Willebrand factor activity. Nomenclature and methodology: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 2015;13:1345–50. 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Examens complémentaires pour l’exploration d’un syndrome hémorragique Hézard N, Simon G, Droullé A, et al. La cytométrie en fux dans un laboratoire d’hémostase. Revue francophone des laboratoires 2007;393:63–70. Garner SF, Furnell A, Kahan BC, et al. Platelet responses to agonists in a cohort of highly characterised platelet donors are consistent over time. Vox Sang 2017;112:18–24. Gresele P, Harrison P, Bury L, et al. Diagnosis of suspected inherited platelet function disorders: results of a worldwide survey. J Thromb Haemost 2014;12:1562–9. FICHE 7.13 – Temps de lyse (du caillot) des euglobulines Milstone JH. The euglobulin method for stimulating fibrinolytic activities. J Immunol 1941;48:109–16. Denninger MH. L’exploration biologique des coagulations intravasculaires disséminées (CIVD). Sang Thrombose Vaisseaux 2010;22:20–32. Iliich A, Bokarev I, Key NS. Global assays of fibrinolysis. Int J Lab Hem 2017;39:441–7. 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FICHE 7.16 – Recherche et titrage d’un anticorps spécifique dirigé contre le facteur VIII ou le facteur IX Verbruggen B, Dardikh M, Laros-van Gorkom B. Detecting and quantifying acquired functional inhibitors in hemostasis in Quality in: Kitchen S, Olson JD, Preston F. Laboratory Haemostasis and Thrombosis. (Eds) John Wiley & Sons, Ltd. 2013;12. Collins PW, Chalmers E, Hart D, et al. United Kingdom Haemophilia. Centre Doctors’ Organization. Diagnosis and management of acquired coagulation inhibitors: a guideline from UKHCDO. Br J Haematol 2013;162:758–73. FICHE 7.17 – Recherche et titrage d’un anticorps spécifique d’un facteur de la coagulation (hors facteurs VIII et IX) Verbruggen B, Dardikh M, Laros-van Gorkom B. Detecting and quantifying acquired functional inhibitors in hemostasis in Quality in: Kitchen S, Olson JD, Preston F. Laboratory Haemostasis and Thrombosis. (Eds) John Wiley & Sons, Ltd. 2013 ;12. Collins PW, Chalmers E, Hart D, et al. United Kingdom Haemophilia. Centre Doctors’ Organization. Diagnosis and management of acquired coagulation inhibitors: a guideline from UKHCDO. Br J Haematol 2013;162:758–73. Chapitre 8 Examens complémentaires pour l’exploration d’une consommation de facteurs de la coagulation Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 152 Hémostase et coagulation Fiche 8.1 Mesure quantitative des D-dimères Code NABM 10221 Signification biologique du paramètre Les D-dimères (DDi) sont des produits de dégradation spécifiques de la fibrine, c’est-à-dire des produits terminaux de la lyse du caillot. En effet, le motif DD apparaît lors de l’association de deux domaines D de monomères de fibrine, stabilisés (de façon covalente) par le facteur XIIIa. L’apparition de DDi résulte de l’activité protéolytique de la plasmine secondaire à l’activation de la coagulation. Les DDi s’élèvent de façon physiologique avec l’âge et pendant la grossesse. Ils s’élèvent également dans les périodes post-opératoires et dans certaines pathologies (inflammation, cancer, etc.). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La mesure quantitative des DDi est prescrite dans le diagnostic d’exclusion d’un épisode aigu de maladie thromboembolique veineuse (MTEV) en l’absence de traitement anticoagulant. Dans cette indication, l’analyse doit garantir une sensibilité et une valeur prédictive négative élevées, proches de 100 %. Le seuil retenu pour l’exclusion d’une MTEV est généralement de 0,5 mg/L (500 ng/mL), jusqu’à l’âge de 50 ans. Au-delà de 50 ans, il est recommandé d’ajuster Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation 1. Idem fiche 9.1. le seuil décisionnel à l’âge (âgeX10 pour établir un seuil diagnostique d’exclusion de l’embolie pulmonaire). D’autre part, la mesure des DDi peut être prescrite dans le diagnostic d’une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Dans cette situation, la positivité des DDi est souvent très élevée (CIVD aiguë) et s’intègre dans un tableau biologique complexe, évolutif dans le temps. Des scores cliniques et biologiques sont proposés, notamment par l’ISTH, qui incluent la positivité de la mesure des DDi (ou d’analyses de produits de dégradation de la fibrine). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans le contexte de l’exclusion de la MTEV : l’analyse des DDi est utile lorsque la probabilité clinique de MTEV (calculée selon un score de type Wells ou Genève) est faible ou intermédiaire, de façon à éviter le recours à des examens complémentaires. Dans le contexte de la CIVD, les DDi sont prescrits en association avec un panel d’analyses incluant, au minimum, TQ, fibrinogène et plaquettes. L’interprétation biologique doit intégrer l’ensemble de ces paramètres mais également leur évolution au cours du temps. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Les délais de stabilité et de réalisation de la recherche de DDi après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total, stabilité jusqu’à 24 h à température ambiante (acceptable entre + 4 et + 8 °C), en plasma congelé jusqu’à 24 mois < – 20 °C et 36 mois < – 70 °C. C hapitre 8. Examens complémentaires pour l’exploration d’une consommation de facteurs... Principe méthodologique 153 Les DDi sont dosés par des méthodes immunologiques utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques du domaine DD. Les méthodes diffèrent en fonction des anticorps et de la méthode de détection utilisée : enzymatique (ELISA), fluorescence (FIA, ELFA), luminescence (LIA), turbidimétrie. La technique de référence est la technique ELISA en microplaques. Selon la méthode de calibration, les signaux mesurés sont convertis en unités D-dimères ou en unités équivalentes fibrinogène (FEU) et exprimés en mg/L ou ng/mL (1 µg/mL de FEU = 0,5 µg/mL Unités DDi). Type de méthode Méthode automatisée ou automatisable. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Seuil de positivité proche de 500 ng/mL pouvant varier en fonction des réactifs. Pour l’exclusion d’une MTEV, les sensibilités et valeurs prédictives négatives doivent être proches de 100 %. Validation du seuil diagnostique par des études prospectives souhaitables. Dans un contexte de CIVD aiguë, les concentrations de DDi peuvent être très élevées. Une quantification n’est pas indispensable au diagnostic mais elle peut s’avérer utile dans le suivi de la coagulopathie. Causes d’erreur, limites Les mesures optiques peuvent être influencées par l’hémoglobine, la bilirubine, les lipides. Les méthodes immunologiques peuvent être influencées par la présence de facteur rhumatoïde ou d’anticorps hétérophiles. Outre les éléments identifiés dans la maîtrise des risques, il est indispensable d’évaluer les performances de la méthode dans des zones proches des valeurs seuils. Les renseignements cliniques et thérapeutiques (anticoagulants) sont indispensables à l’interprétation des résultats, tous les anticoagulants diminuant le taux de D-dimères. Les circonstances physiologiques ou pathologiques d’élévation des D-dimères doivent être connues du prescripteur. 154 Hémostase et coagulation Fiche 8.2 Détermination semi-quantitative des D-dimères ou des produits de dégradation de la fibrine (PDF) Code NABM 1021 Signification biologique du paramètre Les produits de dégradation de la fibrine (PDF) apparaissent sous l’action de la plasmine, lors du processus de fibrinolyse. Ces PDF constituent un mélange très hétérogène de molécules incluant potentiellement des produits de dégradation du fibrinogène. Les D-dimères (DDi) sont, au contraire, des produits de dégradation spécifiques de la fibrine. En effet, le motif DD qui les définit est constitué par l’association de deux domaines D de monomères de fibrine, stabilisés (de façon covalente) par le facteur XIIIa. L’apparition de DDi résulte de l’activité protéolytique de la plasmine secondaire à l’activation de la coagulation. Avec le développement d’anticorps monoclonaux spécifiques des DDi, les techniques de recherche de PDF sont devenues obsolètes. Par ailleurs, des méthodes quantitatives, automatisées et performantes, sont largement disponibles, ce qui limite l’intérêt des méthodes semi-quantitatives et des méthodes manuelles. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La détermination semi-quantitative des DDi ou des PDF peut être utilisée dans le diagnostic Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement d’une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD), lorsqu’une mesure quantitative des DDi n’est pas disponible. La CIVD est évoquée devant certains tableaux cliniques, la positivité des DDi ou des PDF s’intègre dans un tableau biologique complexe, évolutif dans le temps. Des scores cliniques et biologiques sont proposés, notamment par l’ISTH, qui incluent la positivité de la mesure des DDI ou des PDF. Une détermination semiquantitative des DDi ou des PDF est suffisante pour étayer le diagnostic de CIVD. En revanche, le suivi évolutif de CIVD sera affiné par une détermination quantitative des DDi. Il n’est pas recommandé d’utiliser une méthode non quantitative de détermination des D-dimères dans le diagnostic d’exclusion d’une maladie thromboembolique veineuse. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans un contexte de CIVD, la détermination semi-quantitative des DDi ou des PDF peut être prescrite en urgence lorsqu’une mesure quantitative des DDi n’est pas disponible. Cette prescription s’intègre dans un panel d’analyses incluant, au minimum, TQ, fibrinogène et plaquettes. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation des PDF après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total, stabilité jusqu’à 24 h à température ambiante (acceptable entre + 4 et + 8 °C), en plasma congelé jusqu’à 24 mois < – 20 °C et 36 mois < – 20 °C. C hapitre 8. Examens complémentaires pour l’exploration d’une consommation de facteurs... Principe méthodologique 155 Méthodes immunologiques utilisant l’agglutination de billes de latex, recouvertes d’anticorps monoclonaux dirigés contre le domaine DD. Ces méthodes sont rapides, unitaires, ne nécessitant aucun équipement lourd. Type de méthode Méthodes manuelles ou automatisables. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ CIQ disponibles. EEQ EEQ disponibles. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Méthodes peu sensibles, opérateur-dépendantes. Bien que les fiches-produits des industriels indiquent des performances acceptables dans le diagnostic d’exclusion de la MTEV, la détermination semi-quantitative des PDF/D-Dimères dans ce contexte n’est pas recommandée, dans la mesure où il existe des méthodes alternatives plus performantes. Dans un contexte de CIVD, la détection de PDF/DDimères peut être retenue dans le calcul d’un score biologique de CIVD. Causes d’erreur, limites Outre les éléments identifiés dans l’analyse de la maîtrise des risques, les méthodes manuelles et la lecture optique de l’agglutination sont peu adaptées aux exigences de l’accréditation et doivent faire l’objet d’études des variations inter-opérateurs. Les renseignements cliniques et thérapeutiques (anticoagulants) sont indispensables à l’interprétation des résultats. Les circonstances physiologiques ou pathologiques d’élévation des D-dimères, doivent être connues du prescripteur, ainsi que l’accessibilité aux tests quantitatifs. 156 Hémostase et coagulation Fiche 8.3 Monomères de fibrine : mesure quantitative sur automate Code LC E152 Signification biologique du paramètre Les monomères de fibrine se forment à partir du fibrinogène, après clivage des fibrinopeptides A et B par la thrombine. Ils ont une structure et une masse très proches de celles du fibrinogène. Ils ont la propriété de se polymériser pour constituer un réseau de fibrine. Ils ont aussi la capacité de se lier au fibrinogène, mais également aux produits de dégradation du fibrinogène et de la fibrine, sous la forme de complexes solubles. Les monomères de fibrine sont un reflet de la génération de thrombine et de la fibrinoformation. Ils sont différents des D-dimères qui apparaissent après stabilisation du réseau de fibrine par le FXIIIa et protéolyse par la plasmine. Bien que de signification biologique différente, monomères de fibrine et D-dimères sont des biomarqueurs de la génération de thrombine et de la fibrinoformation in vivo. Toutefois, les monomères de fibrine ne dépendent que de la coagulation tandis que les D-dimères dépendent de la coagulation et de la fibrinolyse/protéolyse plasmine-dépendante. Le volume de distribution des monomères de fibrine plasmatiques est proche du volume circulant plasmatique, tandis que celui des D-dimères, de masse plus faible, pouvant diffuser, est bien plus large, comprenant aussi le secteur extra-vasculaire. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription de fibrine ont été dosés dans de nombreuses situations (pro-) thrombotiques. Indications : circonstances cliniques induisant un état d’activation excessive de la coagulation et leur extrême, la coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Monomères de fibrine et D-dimères peuvent être quantifiés pour calculer le score de CIVD de l’ISTH. Les indications de prescription sont voisines de celles des D-dimères. Cependant, durant le choc septique, les monomères de fibrine, isolés ou intégrés au score de CIVD de l’ISTH, sont mieux associés au pronostic vital que les D-dimères. Les monomères de fibrine s’élèvent peu pendant la grossesse et ne s’élèvent pas lors du vieillissement, ce qui tranche avec le comportement des D-dimères. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Lors de l’exploration d’un état d’activation de la coagulation, les monomères de fibrine peuvent, selon les circonstances cliniques, mieux indiquer le pronostic vital que les D-dimères (choc septique en particulier). Ce marqueur apparaîtrait alors ici en première intention avant le dosage des D-dimères. Enfin, dans ces états, lorsque la discussion porte sur le rôle de la fibrinolyse sur les anomalies observées, monomères de fibrine et Ddimères ne sont pas impactés de façon similaire. Objectif : mettre en évidence un excès de génération de thrombine in vivo. Les monomères Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. C hapitre 8. Examens complémentaires pour l’exploration d’une consommation de facteurs... Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement. L’industriel indique une stabilité de 8 h du plasma à température ambiante et de 1 mois à – 20 °C. Le dosage peut se faire sur plasma congelé à – 70 °C. Principe méthodologique Les tests non immunologiques identifiant les complexes solubles (gélification par l’éthanol, sulfate de protamine, test de Largo utilisant une méthode d’agglutination) ne sont plus réalisés. Les monomères de fibrine sont mis en évidence par des anticorps monoclonaux spécifiques par ELISA ou agglutination de particules sensibilisées. Ces anticorps doivent être précisément caractérisés. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ CIQ disponibles. EEQ Pas d’EEQ commercialisé. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Résultats exprimés en µg/mL. Bonnes performances pour les méthodes automatisées, qui doivent être appréciées pour les valeurs basses et élevées. Dans un contexte d’indications assez larges allant du dépistage d’un état thrombotique à un diagnostic de CIVD, il faut définir le domaine de mesure de la technique qui doit être étendu (5 à 150 µg/mL). Le seuil de détection doit être précisé. En l’absence d’EEQ, cet examen doit être considéré comme en phase d’évaluation. Les méthodes immunoturbidimétriques peuvent entraîner une surestimation en présence de facteur rhumatoïde et une sous-estimation lors de fortes concentrations. 157 158 Hémostase et coagulation Bibliographie du chapitre 8 FICHE 8.1 – Mesure quantitative des D-dimères Di Nisio M, Squizzato A, Rutjes AW, et al. Diagnostic accuracy of D-dimer test for exclusion of venous thromboembolism: a systematic review. J Thromb Haemost 2007;5:296–304. Righini M, Perrier A, De Moerloose P, et al. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis : 20 years later. J Thromb Haemost 2008;6:1059–71. Toh CH, Hoots WK. SSC on Disseminated Intravascular Coagulation of the ISTH. The scoring system of the Scientific and Standardisation Committee on Disseminated Intravascular Coagulation of the International Society on Thrombosis and Haemostasis: a 5-year overview. J Thromb Haemost 2007;5:604–6. FICHE 8.2 – Détermination semi-quantitative des D-dimères ou des produits de dégradation de la fibrine (PDF) Di Nisio M, Squizzato A, Rutjes AW, et al. Diagnostic accuracy of D-dimer test for exclusion of venous thromboembolism: a systematic review. J Thromb Haemost 2007;5:296–304. Righini M, Perrier A, De Moerloose P, et al. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis: 20 years later. J Thromb Haemost 2008;6:1059–71. Toh CH, Hoots WK. SSC on Disseminated Intravascular Coagulation of the ISTH. The scoring system of the Scientific and Standardisation Committee on Disseminated Intravascular Coagulation of the International Society on Thrombosis and Haemostasis: a 5-year overview. J Thromb Haemost 2007;5:604–6. FICHE 8.3 – Monomères de fibrine : mesure quantitative sur automate Hamano A, Tanaka S, Takeda Y, et al. A novel monoclonal antibody to fibrin monomer and soluble fibrin for the detection of soluble fibrin in plasma. Clin Chim Acta 2002;318:25–32. Wada H, Sakuragawa N. Are fibrin-related markers useful for the diagnosis of thrombosis? Semin Thromb Haemost 2008;34:33–8. Grossman KB, Arya R, Peixoto AB, et al. Maternal and pregnancy characteristics affect plasma fibrin monomer complexes and D-dimer reference ranges for venous thromboembolism in pregnancy. Am J Obst Gynecol 2016;215:466e1–8e. Chapitre 9 Diagnostic d’exclusion de maladie thromboembolique veineuse Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 160 Hémostase et coagulation Fiche 9.1 Mesure quantitative des D-dimères Code NABM 10221 Signification biologique du paramètre Les D-dimères (DDi) sont des produits de dégradation spécifiques de la fibrine, c’est-à-dire des produits terminaux de la lyse du caillot. En effet, le motif DD apparaît lors de l’association de deux domaines D de monomères de fibrine, stabilisés (de façon covalente) par le facteur XIIIa. L’apparition de DDi résulte de l’activité protéolytique de la plasmine secondaire à l’activation de la coagulation. Les DDi s’élèvent de façon physiologique avec l’âge et pendant la grossesse. Ils s’élèvent également dans les périodes post-opératoires et dans certaines pathologies (inflammation, cancer, etc.). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La mesure quantitative des DDi est prescrite dans le diagnostic d’exclusion d’un épisode aigu de maladie thromboembolique veineuse (MTEV) en l’absence de traitement anticoagulant. Dans cette indication, l’analyse doit garantir une sensibilité et une valeur prédictive négative élevées, proches de 100 %. Le seuil retenu pour l’exclusion d’une MTEV est généralement de 0,5 mg/L (500 ng/mL) jusqu’à l’âge de 50 ans. Au-delà de 50 ans, il est recommandé d’ajuster le Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement seuil décisionnel à l’âge (âge × 10) pour établir un seuil diagnostique d’exclusion de l’embolie pulmonaire. D’autre part, la mesure des DDi peut être prescrite dans le diagnostic d’une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD). Dans cette situation, la positivité des DDi est souvent très élevée (CIVD aiguë), et s’intègre dans un tableau biologique complexe, évolutif dans le temps. Des scores cliniques et biologiques sont proposés, notamment par l’ISTH, qui incluent la positivité de la mesure des DDi (ou d’analyses de produits de dégradation de la fibrine). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans le contexte de l’exclusion de la MTEV : l’analyse des DDi est utile lorsque la probabilité clinique de MTEV (calculée selon un score de type Wells ou Genève) est faible ou intermédiaire, de façon à éviter le recours à des examens complémentaires. Dans le contexte de la CIVD, les DDi sont prescrits en association avec un panel d’analyses incluant, au minimum, TQ, fibrinogène et plaquettes. L’interprétation biologique doit intégrer l’ensemble de ces paramètres mais également leur évolution au cours du temps. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de la recherche de DDi après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total, stabilité jusqu’à 24 h à température ambiante (acceptable entre + 4 et + 8 °C), en plasma congelé jusqu’à 24 mois < – 20 °C et 36 mois < – 70 °C. 1. Idem fiche 8.1. Chapitre 9. Diagnostic d’exclusion de maladie thromboembolique veineuse Principe méthodologique Les DDi sont dosés par des méthodes immunologiques utilisant des anticorps monoclonaux spécifiques du domaine DD. Les méthodes diffèrent en fonction des anticorps et de la méthode de détection utilisée : enzymatique (ELISA), fluorescence (FIA, ELFA), luminescence (LIA), turbidimétrie. La technique de référence est la technique ELISA en microplaques. Selon la méthode de calibration, les signaux mesurés sont convertis en unités D-dimères ou en unités équivalentes fibrinogène (FEU) et exprimés en mg/L ou ng/mL (1 µg/mL de FEU = 0,5 µg/mL Unités DDi). Type de méthode Méthode automatisée ou automatisable. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Seuil de positivité proche de 500 ng/mL pouvant varier en fonction des réactifs. Pour l’exclusion d’une MTEV, les sensibilités et valeurs prédictives négatives doivent être proches de 100 %. Validation du seuil diagnostique par des études prospectives souhaitables. Dans un contexte de CIVD aiguë, les concentrations de DDi peuvent être très élevées. Une quantification n’est pas indispensable au diagnostic mais elle peut s’avérer utile dans le suivi de la coagulopathie. Causes d’erreur, limites Les mesures optiques peuvent être influencées par l’hémoglobine, la bilirubine, les lipides. Les méthodes immunologiques peuvent être influencées par la présence de facteur rhumatoïde ou d’anticorps hétérophiles. Outre les éléments identifiés dans la maîtrise des risques, il est indispensable d’évaluer les performances de la méthode dans des zones proches des valeurs seuils. Les renseignements cliniques et thérapeutiques (anticoagulants) sont indispensables à l’interprétation des résultats, tous les anticoagulants diminuant le taux de D-dimères. Les circonstances physiologiques ou pathologiques d’élévation des D-dimères doivent être connues du prescripteur. 161 162 Hémostase et coagulation Bibliographie du chapitre 9 FICHE 9.1 – Mesure quantitative des D-dimères Di Nisio M, Squizzato A, Rutjes AW, et al. Diagnostic accuracy of D-dimer test for exclusion of venous thromboembolism : a systematic review. J Thromb Haemost 2007;5:296–304. Righini M, Perrier A, De Moerloose P, et al. D-Dimer for venous thromboembolism diagnosis : 20 years later. J Thromb Haemost 2008;6:1059–71. Toh CH, Hoots WK. SSC on Disseminated Intravascular Coagulation of the ISTH. The scoring system of the Scientific and Standardisation Committee on Disseminated Intravascular Coagulation of the International Society on Thrombosis and Haemostasis : a 5-year overview. J Thromb Haemost 2007;5:604–6. Chapitre 10 Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 164 Hémostase et coagulation Synopsis V Recherche de facteurs biologiques de risque de maladie thromboembolique veineuse Figure 10.1. Recherche de facteurs biologiques de risque de maladie thromboembolique veineuse. *TV site inhabituel : thrombose veineuse profonde du membre supérieur, splanchnique, cérébrale, rétinienne, pelvienne, etc. (recherche de la mutation V617F de JAK2, CALR, MPL et recherche de clone HPN). Circonstances déclenchantes majeures (transitoire ou non) : immobilisation plâtrée, fracture d’un membre inférieur, chirurgie sous anesthésie générale ≥ 30 minutes, alitement aigu > 3 jours dans les 3 mois précédents, cancer actif dans les deux ans précédents, césarienne. Circonstances déclenchantes non-majeures : grossesse ou post-partum, contraception œstroprogestative ou traitement hormonal substitutif de la ménopause dans l’année précédant la MTEV, voyage ≥ 6 heures. FBR héréditaire : activité AT, PC, PS, F5 Leiden G1691A, F2 G20210A. FBR acquis : anticoagulant lupique, Ac anticardiolipines, Ac anti-β2GP1. - FBR : facteurs biologiques de risque - TV : thrombose veineuse - TVP : thrombose veineuse profonde C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 165 Fiche 10.1 Dosage fonctionnel de l’antithrombine par la mesure de l’activité cofacteur de l’héparine Code NABM 0189 Signification biologique du paramètre L’antithrombine (AT) est l’inhibiteur physiologique principal des facteurs activés de la cascade de la coagulation (thrombine (IIa), Xa, IXa et XIa). Elle est synthétisée par le foie, sa masse moléculaire est de 58 KDa, sa demi-vie plasmatique d’environ 65 h. Elle a deux sites fonctionnels essentiels : le site actif d’inhibition des protéases (RS) et un site de liaison à l’héparine (HBS). L’héparine est un catalyseur de la réaction d’inhibition. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : mise en évidence de déficits exposant à un risque de maladie thromboembolique veineuse (MTEV). Les déficits acquis peuvent être liés à une diminution de synthèse (insuffisance hépatocellulaire), une consommation (thromboses étendues et CIVD), une perte de la protéine non compensée (syndrome néphrotique) ou peuvent être la conséquence de certains traitements (asparaginase, héparine non fractionnée à posologies curatives). Les déficits constitutionnels (prévalence des déficits hétérozygotes entre 1/2 000 et 1/5 000 dans la population générale et 1 à 2 % chez les sujets atteints de maladie thromboembolique veineuse) Nature du prélèvement sont en grande majorité quantitatifs (type I), mais aussi qualitatifs, conséquences de mutations qui affectent l’inhibition des protéases (type IIRS), la liaison à l’héparine (type IIHBS), ou la stabilité de la protéine (type IIPE). Ils sont facteurs de risque d’évènements thromboemboliques veineux (risque différent en fonction des mutations impliquées). Il existe des mutations à effet fort et d’autres à effet faible y compris au sein des déficits de type IIHBS, longtemps considérés comme globalement peu thrombogènes. Indications : recherche de facteurs génétiques de risque de thrombose veineuse, exploration d’une résistance biologique à l’héparinothérapie, suivi de la réponse aux concentrés d’AT, surveillance d’un traitement à l’asparaginase. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La mesure de l’activité cofacteur de l’héparine est l’examen de première intention pour dépister un déficit en AT car elle est sensible à tous les types de déficits. Le typage plasmatique d’une anomalie constitutionnelle comporte de plus la mesure de l’activité progressive de l’AT et la mesure de l’antigène. Le génotypage est nécessaire dans certains cas pour déterminer le degré de risque thromboembolique. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Recommandations pour la qualité du prélèvement Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de l’AT. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité à température ambiante d’au moins 48 h en sang total et 24 h en plasma citraté, et d’au moins 2 ans en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Principe méthodologique Méthode colorimétrique mesurant l’activité amidolytique résiduelle de la thrombine bovine ou du FXa sur un substrat chromogénique spécifique, en présence d’héparine. 166 Hémostase et coagulation Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la naissance 63 % (écart-type : 12), taux de l’adulte atteint vers l’âge de 1 an : 80-120 %. La sensibilité vis-à-vis de certains variants diffère en fonction des réactifs (Alhenc-Gelas 2009). Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. Interférence possible avec l’hémolyse, l’ictère et la lactescence. Ne pas réaliser en présence d’anticoagulants oraux directs (anti-Xa ou anti-IIa) selon la méthode : risque de surestimation des taux d’AT. Réalisation de l’examen possible sous héparine ou antivitamine K (AVK). C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 167 Fiche 10.2 Dosage immunologique de l’antithrombine Code NABM 0188 Signification biologique du paramètre L’antithrombine (AT) est l’inhibiteur physiologique principal des facteurs activés de la cascade de la coagulation (thrombine (IIa), Xa, IXa et XIa). Elle est synthétisée par le foie, sa masse moléculaire est de 58 KDa, sa demi-vie d’environ 65 h. Elle a deux sites fonctionnels essentiels, le site actif d’inhibition des protéases (RS) et un site de liaison à l’héparine (HBS). L’héparine est un catalyseur de la réaction d’inhibition. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectif : typage des déficits constitutionnels en AT. Les déficits constitutionnels (prévalence des déficits hétérozygotes entre 1/2 000 et 1/5 000 dans la population générale et 1 à 2 % chez les sujets atteints de maladie thromboembolique veineuse) sont en grande majorité quantitatifs (type I), mais aussi qualitatifs, conséquences de mutations qui affectent l’inhibition des protéases (type IIRS), la liaison à l’héparine (type IIHBS), ou la stabilité de la protéine (type IIPE). Ils Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement sont facteurs de risque d’évènements thromboemboliques veineux (risque différent en fonction des mutations impliquées). Il existe des mutations à effet fort et d’autres à effet faible y compris au sein des déficits de type IIHBS, longtemps considérés comme globalement peu thrombogènes. Indication : cet examen qui mesure la concentration plasmatique d’antithrombine est indiqué en complément de la mesure de l’activité cofacteur de l’héparine lorsqu’un déficit constitutionnel en AT est suspecté. Le typage plasmatique d’une anomalie constitutionnelle comporte également la mesure de l’activité progressive de l’AT. Le génotypage est nécessaire dans certains cas pour déterminer le degré de risque thromboembolique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen à réaliser en deuxième intention, après le dosage fonctionnel par mesure de l’activité cofacteur de l’héparine, dans le cadre du typage plasmatique d’un déficit constitutionnel. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de l’AT. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité à température ambiante d’au moins 48 h en sang total et 24 h en plasma citraté, et d’au moins 2 ans en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Principe méthodologique Méthode immunologique (turbidimétrie principalement). Type de méthode Méthode automatisée ou manuelle. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. 168 Hémostase et coagulation Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la naissance 63 % (écart-type : 12), taux de l’adulte atteint vers l’âge de 1 an : 80-120 %. Ce test ne détecte pas les déficits qualitatifs. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. Causes d’erreur, limites Pour les techniques immunoturbidimétriques : - possible surestimation en cas de plasma trouble (lipémique) ; - interférences possibles du facteur rhumatoïde si > 800 UI/mL. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 169 Fiche 10.3 Dosage fonctionnel de la protéine C par méthode de coagulation Code NABM 0191 Signification biologique du paramètre La protéine C (PC) est une protéine vitamine K dépendante qui, après activation par le complexe thrombine/thrombomoduline et aidée par son cofacteur la protéine S (PS), dégrade les FVa et FVIIIa de la coagulation. Elle est synthétisée par le foie, sa masse moléculaire est de 62 KDa, sa demi-vie plasmatique est de 6 à 8 h. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : mise en évidence de déficits exposant à un risque de maladie thromboembolique veineuse (MTEV) ou exceptionnellement à un risque de purpura fulminans néonatal (déficit sévère homozygote). Les déficits constitutionnels sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes de 2 à 4 pour 1 000 dans la population générale et 3 % chez les sujets atteints de MTEV), en grande majorité quantitatifs (type I), mais aussi qualitatifs, conséquences de mutations qui affectent le site protéasique (IIAM) ou des régions d’interactions avec ses partenaires PS, FVa, FVIIIa, phospholipides (IIAC). La littérature ne permet pas de donner des informations sur les degrés de risque associés aux différents types de déficits. Une origine acquise du déficit doit toujours être éliminée dans le cadre d’un bilan de thrombophilie. Les déficits Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation acquis sont liés à une diminution de synthèse (insuffisance hépatocellulaire), à la production de facteurs non fonctionnels (hypovitaminose K et traitements par antivitamine K (AVK)), à une consommation (thromboses étendues et CIVD) ou à une perte de la protéine non compensée (syndrome néphrotique). Il existe de rares cas d’auto-anticorps anti-protéine C. Indication : recherche de facteurs génétiques de risque de thrombose veineuse, exploration d’un purpura fulminans néonatal, dans de rares cas surveillance des traitements par concentrés de protéine C. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Cet examen, qui permet d’évaluer l’activation de la PC (in vitro, le Protac remplace le complexe thrombine/thrombomoduline) et l’activité protéasique de la PCa, est le seul examen sensible à tous les types de déficits constitutionnels. C’est donc la méthode à utiliser en première intention dans le cadre de la recherche d’anomalies génétiques responsables de thromboses. Le typage plasmatique d’un déficit constitutionnel comporte de plus le dosage immunologique et la mesure de l’activité amidolytique de la PC. Le génotypage est nécessaire au diagnostic dans certains cas. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PC. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité de la PC d’au moins 48 h en sang total conservé à température ambiante et d’au moins 2 ans en plasma congelé à une température ≤ – 20 °C (pas de donnée pour le plasma non congelé). 170 Hémostase et coagulation Nature du prélèvement Principe méthodologique Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Méthode chronométrique mesurant le degré d’allongement d’un test global de coagulation induit par la PC du plasma du patient après activation par le Protac dans un système comportant du plasma commercial déplété en PC. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la naissance 35 % (écart-type : 9), taux de l’adulte atteint à 15 ans : 70-140 %. Compte tenu de l’hétérogénéité du phénotype plasmatique chez les sujets porteurs d’un déficit constitutionnel, un résultat normal ne permet pas d’exclure la présence d’une mutation délétère avec 100 % de certitude. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. Ne pas réaliser cet examen sous anticoagulants oraux directs ou AVK. Interférence possible (en fonction des coffrets) avec certains anticoagulants lupiques (risque de surestimation), des taux de FVIII très élevés, le FV Leiden (risque de sous-estimation), les héparinémies très élevées. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 171 Fiche 10.4 Dosage fonctionnel de la protéine C par mesure de l’activité amidolytique Code NABM 0191 Signification biologique du paramètre La protéine C (PC) est une protéine vitamine K dépendante qui, après activation par le complexe thrombine/thrombomoduline et aidée par son cofacteur la protéine S (PS), dégrade les FVa et FVIIIa de la coagulation. Elle est synthétisée par le foie, sa masse moléculaire est de 62 KDa, sa demi-vie plasmatique est de 6 à 8 h. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : typage des déficits constitutionnels. Les déficits constitutionnels en PC sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes de 2 à 4 pour 1 000 dans la population générale et 3 % chez les sujets atteints de maladie thromboembolique veineuse), en grande majorité quantitatifs (type I), mais aussi qualitatifs conséquences de mutations qui affectent le site protéasique (IIAM) Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement ou des régions d’interactions avec ses partenaires PS, FVa, FVIIIa, phospholipides (IIAC). La littérature ne permet pas de donner des informations sur les degrés de risque associés aux différents types de déficit. Indication : la mesure de l’activité amidolytique évalue la fonctionnalité du site protéasique de la PC. De ce fait, son utilisation en première intention n’est pas recommandée car elle ne permet pas de dépister tous les types de déficits qualitatifs. Sa réalisation fait partie du typage plasmatique des déficits constitutionnels. Le génotypage est nécessaire au diagnostic dans certains cas. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen, à réaliser en deuxième intention, après le dosage fonctionnel de la PC par test de coagulation dans le cadre du typage d’un déficit. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PC. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité de la PC d’au moins 48 h en sang total conservé à température ambiante et d’au moins 2 ans en plasma congelé à une température ≤ – 20 °C (pas de donnée pour le plasma non congelé). Principe méthodologique Méthode chromogénique : activation de la PC (in vitro, le Protac remplace le complexe thrombine/ thrombomoduline) puis mesure de sa capacité à cliver un substrat chromogène spécifique. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. 172 Hémostase et coagulation Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la naissance 35 % (écart-type : 9), taux de l’adulte atteint à 15 ans : 70-140 %. Ce test ne détecte pas les déficits qualitatifs de type IIAC. De plus, compte tenu de l’hétérogénéité du phénotype plasmatique chez les sujets porteurs d’un déficit constitutionnel quel qu’en soit le type, un résultat normal ne permet pas d’exclure la présence d’une mutation délétère avec 100 % de certitude. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. Interférence possible avec les plasmas ictériques, hémolysés ou lactescents. Dépistage du déficit constitutionnel non recommandé sous AVK (difficulté d’interprétation). Pas d’interférence des traitements anticoagulants. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 173 Fiche 10.5 Dosage immunologique de la protéine C Code NABM 1027 Signification biologique du paramètre La protéine C (PC) est une protéine vitamine K dépendante qui, après activation par le complexe thrombine/thrombomoduline et aidée par son cofacteur la protéine S (PS), dégrade les FVa et FVIIIa de la coagulation et ainsi inhibe la génération de thrombine. Elle est synthétisée par le foie, sa masse moléculaire est de 62 KDa, sa demi-vie plasmatique est de 6 à 8 h. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : typage des déficits constitutionnels. Les déficits constitutionnels en PC sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes de 2 à 4 pour 1 000 dans la population générale et 3 % chez les sujets atteints de maladie thromboembolique veineuse), en grande majorité quantitatifs (type I), mais aussi qualitatifs conséquences de Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement mutations qui affectent le site protéasique (IIAM) ou des régions d’interactions avec ses partenaires PS, FVa, FVIIIa, phospholipides (IIAC). La littérature ne permet pas de donner des informations sur les degrés de risque associés aux différents types de déficits. Indication : cet examen, qui mesure la concentration plasmatique de la protéine C, est prescrit pour déterminer le caractère quantitatif ou qualitatif d’un déficit en protéine C. Sa réalisation fait partie du typage des déficits constitutionnels. Le génotypage est nécessaire au diagnostic dans certains cas. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen à réaliser en deuxième intention, après le dosage fonctionnel de la PC par test de coagulation dans le cadre du typage d’un déficit. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PC. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité de la PC d’au moins 48 h en sang total conservé à température ambiante et d’au moins 2 ans en plasma congelé à une température ≤ – 20 °C (pas de donnée pour le plasma non congelé). Principe méthodologique Méthode immunologique type ELISA ou ELFA. Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Contrôles commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Les résultats sont exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique moyen à la naissance 35 % (écart-type : 9), taux de l’adulte atteint à 15 ans : 70-140 %. Ce test ne détecte pas les déficits qualitatifs. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. Pas d’interférence des traitements anticoagulants. Recherche de déficit constitutionnel par dosage plasmatique non recommandé sous AVK (difficulté d’interprétation). 174 Hémostase et coagulation Fiche 10.6 Dosage fonctionnel de la protéine S Code NABM 0190 Signification biologique du paramètre La protéine S (PS) est une protéine vitamine K dépendante qui circule dans le plasma, liée à la C4bBP pour 60 % environ. La fraction libre régule la coagulation par son effet cofacteur de la protéine C activée qui dégrade les FVa et FVIIIa et ainsi inhibe la génération de thrombine. Elle est synthétisée en partie par le foie, sa demi-vie plasmatique est de 42 h. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : mise en évidence de déficits exposant à un risque de maladie thromboembolique veineuse (MTEV) ou exceptionnellement à un risque de purpura fulminans néonatal (déficit sévère homozygote). Les déficits constitutionnels sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes estimée entre 1/1 000 et 1/3 000 dans la population générale et 2 % chez les sujets atteints de MTEV), en grande majorité quantitatifs, mais aussi qualitatifs. Le degré de risque thrombotique est fonction des mutations sous-jacentes et du taux de protéine S active circulante. Une origine acquise du déficit doit toujours être éliminée dans le cadre d’un bilan de thrombophilie. Les déficits Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement acquis sont liés à une diminution de synthèse (insuffisance hépatocellulaire), à la production de facteurs non fonctionnels (hypovitaminose K et traitements par antivitamine K (AVK)), à une consommation (thromboses étendues et CIVD), une perte de la protéine non compensée (syndrome néphrotique). La protéine S diminue également au cours des traitements estrogéniques par voie orale et précocement au cours de la grossesse. Il existe de rares cas d’auto-anticorps anti-protéine S. Indication : recherche de facteurs génétiques de risque de thrombose veineuse, exploration d’un purpura fulminans néonatal. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Cet examen qui mesure l’activité cofacteur de la PCa de la PS doit être utilisé en première intention pour dépister un déficit en PS car il est sensible à tous les types de déficits. Le typage d’un déficit constitutionnel comporte de plus le dosage immunologique de la PS libre. Le dosage de la PS totale n’est pas recommandé car il n’apporte pas d’information susceptible d’influencer la prise en charge thérapeutique du patient. Le génotypage est nécessaire dans certains cas. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dypiridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PS. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité d’au moins 1 an en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Aucune donnée concernant la stabilité dans les prélèvements non congelés, que ce soit sur sang total ou sur plasma, n’est rapportée. Principe méthodologique Méthode chronométrique mesurant le degré d’allongement d’un test global de coagulation induit par la PS du plasma du patient dans un système comportant du plasma déficient en PS et de la PCa. Type de méthode Méthode automatisée. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 175 Résultats exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance compris entre 12 et 60 %, taux de l’adulte atteint à 6 mois : homme : 60-140 %, femme âgée de moins de 50 ans : 50-140 %, femme âgée de plus de 55 ans : 55-140 %. La mesure d’activité est sensible à tous les types de déficits en protéine S. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. Ne pas réaliser cet examen sous anticoagulants oraux directs ni sous AVK. Interférences possibles (en fonction des coffrets) avec certains anticoagulants lupiques (surestimation), des taux de FVIII très élevés, le FV Leiden (sous-estimation), les héparinémies très élevées. 176 Hémostase et coagulation Fiche 10.7 Dosage immunologique de la protéine S libre Code NABM 1025 Signification biologique du paramètre La protéine S (PS) est une protéine vitamine K dépendante qui circule dans le plasma, liée à la C4bBP pour 60 % environ. La fraction libre régule la coagulation par son effet cofacteur de la protéine C activée qui dégrade les FVa et FVIIIa et ainsi inhibe la génération de thrombine. Elle est synthétisée en partie par le foie, sa demi-vie plasmatique est de 42 h. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectif : typage des déficits constitutionnels. Les déficits constitutionnels sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes estimée entre 1/1 000 et 1/3 000 dans la population générale et 2 % chez les sujets atteints de maladie thromboembolique Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement veineuse), en grande majorité quantitatifs, mais aussi qualitatifs. Le degré de risque thrombotique est fonction des mutations sous-jacentes et du taux de protéine S active circulante. Indication : cet examen qui mesure la concentration plasmatique de la forme libre de la PS est prescrit dans le cadre du typage d’un déficit constitutionnel en protéine S. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen à réaliser en deuxième intention, après le dosage fonctionnel de la PS dans le cadre du typage d’un déficit constitutionnel. Le dosage de la PS totale n’est pas recommandé car il n’apporte pas d’information susceptible d’influencer la prise en charge thérapeutique du patient. Le génotypage est nécessaire dans certains cas. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PS. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité d’au moins 48 h en sang total conservé à température ambiante et au moins 1 an en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Aucune donnée concernant la stabilité dans les plasmas non congelés n’est rapportée. Principe méthodologique Méthode immunologique : ELISA ou immunoturbidimétrie faisant intervenir soit un anticorps spécifique de la PS libre soit des billes recouvertes de C4bBP, puis un anticorps anti-PS. Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluations interlaboratoires possibles (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Résultats exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance compris entre 12 et 60 %, taux de l’adulte atteint à 6 mois : homme : 60-140 %, femme âgée de moins de 50 ans : 50-140 %, femme âgée de plus de 55 ans : 55-140 %. Ce test ne détecte pas les déficits qualitatifs. Possibilité de mauvaise reconnaissance de la protéine si une anomalie moléculaire affecte l’épitope de la PS reconnu par l’anticorps (NB : les patients ont une activité normale ou subnormale). Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. La présence extrêmement rare d’anticorps anti-souris chez certains sujets peut conduire à des résultats erronés. Dépistage du déficit constitutionnel non recommandé chez les patients sous AVK (difficulté d’interprétation). C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique 177 Fiche 10.8 Dosage immunologique de la protéine S totale Code NABM 1026 Signification biologique du paramètre La protéine S (PS) est une protéine vitamine K dépendante qui circule dans le plasma, liée à la C4bBP pour 60 % environ. La fraction libre régule la coagulation par son effet cofacteur de la protéine C activée vis-à-vis de la dégradation des FVa et FVIIIa. Elle est synthétisée en partie par le foie, sa demi-vie plasmatique est de 42 h. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectif : typage des déficits constitutionnels. Les déficits constitutionnels sont rares (prévalence des déficits hétérozygotes estimée entre 1/1 000 et 1/3 000 dans la population générale et 2 % chez les sujets atteints de maladie thromboembolique Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement veineuse), en grande majorité quantitatifs, mais aussi qualitatifs. Le degré de risque thrombotique est fonction des mutations sous-jacentes et du taux de protéine S active circulante. Indication : évaluation de la PS totale (fraction libre + liée) dans le cadre du typage d’un déficit constitutionnel en protéine S. Dans l’état actuel des connaissances, l’activité de la PS est portée par sa fraction libre dans le plasma et l’évaluation de la PS totale n’apporte pas d’information susceptible d’influencer la prise en charge thérapeutique du patient. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le dosage systématique de la PS totale n’est pas à recommander. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PS. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indique une stabilité de la PS totale d’au moins 8 h en sang total conservé à température ambiante et d’au moins 1 an en plasma congelé à température ≤ – 20 °C. Aucune donnée concernant la stabilité dans les plasmas non congelés n’est rapportée. Principe méthodologique Méthode immunologique. Type de méthode Méthode manuelle ou automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Résultats exprimés en pourcentage (1 UI/mL = 100 %). Taux plasmatique à la naissance compris entre 12 et 60 %, taux de l’adulte atteint à 6 mois : homme : 60-140 %, femme âgée de moins de 50 ans : 50-140 %, femme âgée de plus de 55 ans : 55-140 %. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation de cet examen. La présence extrêmement rare d’anticorps anti-souris chez certains sujets peut conduire à des résultats erronés. 178 Hémostase et coagulation Fiche 10.9 Recherche et identification d’un anticoagulant de type lupique (ou antiphospholipide par une technique de coagulation, anciennement « antiprothrombinase ») Code NABM 1020 Signification biologique du paramètre La détection d’un anticoagulant circulant de type lupique ou lupus anticoagulant (LA) signe la présence d’anticorps antiphospholipides (aPL) capables d’induire la prolongation de tests de coagulation in vitro. Il s’agit, avec la recherche d’anticorps anti-β2 -GPI (aβ2GPI) et anticardiolipine (aCL) par techniques immunologiques, d’un des trois critères biologiques du syndrome des antiphospholipides (SAPL) associant, à la présence persistante à au moins 12 semaines d’intervalle d’au moins un de ses critères biologiques, la survenue de manifestations thrombotiques artérielles et/ou veineuses, et/ou des complications obstétricales sans qu’il y ait plus de 5 ans entre les manifestations cliniques et la détection des marqueurs biologiques. La présence d’un LA n’est pas spécifique du SAPL et peut apparaître au cours d’infections (présence transitoire le plus souvent), de cancers et d’hémopathies lymphoïdes (notamment celles s’accompagnant d’un pic monoclonal d’immunoglobulines M qui peut avoir une activité LA), de maladies auto-immunes (autres que le lupus érythémateux systémique fréquemment associé au SAPL), et de certains traitements (bêtabloquants notamment). Malgré la prolongation des tests de coagulation in vitro, la présence d’un LA ne s’accompagne pas d’un risque hémorragique, sauf lorsque le LA est associé à une hypo-prothrombinémie sévère due à des anticorps anti-facteur II. La présence d’un LA est le marqueur biologique le mieux corrélé au risque de manifestations cliniques Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement dans le SAPL. Les patients les plus à risque sont ceux avec triple positivité des marqueurs biologiques (LA + , aβ2GPI + , aCL + ). La prescription d’une recherche de LA devra s’accompagner de celle d’une recherche d’aCL et d’aβ2GPI. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : mettre en évidence la présence d’anticorps antiphospholipides capables d’induire la prolongation de tests de coagulation in vitro si le contexte clinique le justifie. Indications 1. Niveau élevé : évènement veineux thromboembolique (EVTE) inexpliqué (idiopathique) ou thrombose artérielle chez un patient jeune (< 50 ans), thromboses récidivantes, thrombose de site inhabituel, pertes fœtales tardives, toute thrombose ou complication obstétricale chez des patients avec maladie auto-immune. 2. Niveau moyen : bilan de pathologie autoimmune, fausses couches précoces répétées, EVTE non idiopathique sujet jeune. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche d’un LA associée à celle des aCL et aβ2GPI est une prescription de première intention du bilan de thrombophilie. La conclusion doit intégrer le profil aPL complet et signaler la nécessité du contrôle à 12 semaines, en cas de positivité. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Double centrifugation indispensable, dans le but d’éliminer le maximum de plaquettes résiduelles du plasma (< 107/mL), qui apportent des phospholipides et réduisent la sensibilité des tests (faux négatifs). Renseigner obligatoirement la notion de traitement anticoagulant : héparines, AVK, AOD et effectuer sur tout échantillon TP, TCA, fibrinogène, éventuellement un temps de thrombine, activité anti-Xa. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour cet examen. Le plasma doit être congelé à une température < à – 70 °C et décongelé avant l’analyse au bain-marie, 5 min à + 37 °C. Quatre étapes : 1) recherche d’un allongement d’un test de coagulation de dépistage, temps de venin de vipère Russell dilué (dRVVT) et/ou temps de céphaline avec activateur (TCA) avec réactif sensible au LA ; 2) mise en évidence de la présence d’un inhibiteur (test sur mélange) avec calcul de l’index d’anticoagulant circulant ; 3) confirmation de la dépendance en phospholipides (PL) (raccourcissement des tests de dépistage après ajout de PL) ; 4) exclusion d’une anomalie de la coagulation associée si TCA allongé (diagnostic différentiel : hémophilie A acquise). Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Variable en fonction de la sensibilité des réactifs. Ne pas réaliser en présence de traitements anti-Xa ou anti-IIa directs (AOD) ni chez les patients traités par HNF : risque de faux positifs. Pour les patients sous HBPM, prélever juste avant l’injection (résiduel). Pour les patients sous AVK avec INR ≥ 1,5, tests réalisés sur mélange avec risque de faux négatifs par dilution de l’anticorps. Faux négatifs : grossesse, inflammation (facteur VIII élevé). Faux positifs : inflammation (fibrinogène, CRP élevée). 179 180 Hémostase et coagulation Fiche 10.10 Recherche des polymorphismes F5 G1691A (facteur V Leiden) et F2 G20210A du gène la prothrombine Codes NABM 1029 et 1 030 groupés code NABM 1031 Signification biologique du paramètre Le polymorphisme Arg506Gln (F5 R506Q) dû à la transition G1691A dans le gène du facteur V (F5) est responsable du FV Leiden. La transition F2 G20210A est située en position 3’ non traduite du gène de la prothrombine. Le F5 Leiden est à l’origine d’une résistance à la protéine C activée alors que la transition G20210A est associée à une augmentation modérée du taux plasmatique de la prothrombine. La prévalence du F5 Leiden est de 3 à 5 % en Europe avec un gradient nord/ sud et est associée à une augmentation du risque relatif de maladie thromboembolique de 3 à 8 à l’état hétérozygote et de 80 à l’état homozygote. La prévalence de la transition G20210A est de 2 à 4 % en Europe avec une augmentation du risque relatif de 3 à l’état hétérozygote. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Ces deux variants sont des facteurs de risque de thrombose veineuse dont la recherche fait partie du bilan de thrombophilie constitutionnelle. Il Nature du prélèvement Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique s’agit de marqueurs de génétique constitutionnelle qui doivent être prescrits dans le cadre d’une consultation de thrombophilie et qui nécessitent le recueil du consentement éclairé et signé du patient. La prescription de ces bilans est encadrée, tenant compte notamment de l’âge du patient au premier évènement thromboembolique, de son sexe et du caractère provoqué ou non de chaque épisode (cf. recommandations nationales Pernod G.). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche de ces deux polymorphismes doit être réalisée en première ligne du bilan de thrombophilie en complément du dosage de l’activité de l’antithombine, des protéines C et S et de la recherche d’anticorps antiphospholipides, en plus de l’hémogramme. La recherche du F5 Leiden doit se substituer en première intention à la recherche d’une résistance à la protéine C activée souvent sensible aux interférences et traitements anticoagulants, sauf cas particuliers (patients greffés). Sang total EDTA ou tout échantillon permettant une extraction d’ADN génomique. Aucune. Acheminement du prélèvement dans les 48 h. Température ambiante ou + 4 °C. Les techniques de génotypage sont nombreuses et commerciales (souvent marquage CE-IVD, validation de méthode en portée A pour le Cofrac) ou « maison » (validation de méthode selon le COFRAC en portée B). Il s’agit souvent de techniques de PCR (réaction d’amplification de l’ADN) couplées à une détection sur gel d’agarose ou sur support solide (microplaque ou billes) avec une révélation colorée ou fluorescente. Les plus utilisées utilisent le FRET, le reverse Dot-Blot, l’amplification spécifique d’allèle, la PCR en temps réel de type TaqMan© ou la RFLP. Ces analyses sont réalisées selon les directives du décret n°2008-321 du 04/04/2008 et de l’arrêté du 27/05/2013 relatifs à « l’examen des caractéristiques génétiques d’une personne à des fins médicales ». Les biologistes réalisant ces analyses de génétique constitutionnelle sont agréés par l’agence de la Biomédecine et les locaux dédiés sont autorisés par l’ARS. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique Type de méthode Méthode automatisée mais parfois manuelle. Type de mesure Mesure qualitative : absence ou présence de la mutation à l’état hétérozygote ou homozygote. CIQ Des contrôles homozygote sain, hétérozygote et homozygote muté doivent être intégrés à chaque série analytique. EEQ Oui (RFB-ECAT) (www.ecat.nl). Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Sensibilité et spécificité proche de 100 % pour les deux mutations. Il s’agit d’un diagnostic de quasi-certitude quant à la présence ou à l’absence de ces mutations. Les causes d’erreur sont rares et pourraient théoriquement être dues à des polymorphismes de type SNP présents sous le site des amorces ou des sondes de révélation et empêchant leur fixation, par exemple le variant C20209T du gène de la prothrombine mais qui est très rare. Chez les greffés de cellules souches hématopoïétiques, l’ADN ne doit pas être extrait des leucocytes. 181 182 Hémostase et coagulation Bibliographie du chapitre 10 FICHE 10.1 – Dosage fonctionnel de l’antithrombine par la mesure de l’activité cofacteur de l’héparine Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Hugon-Rodin J, et al. GFHT study group on Genetic Thrombophilia. Thrombotic risk according to SERPINC1 genotype in a large cohort of subjects with antithrombin inherited deficiency. Thromb Haemost 2017;117:1040–51. FICHE 10.2 – Dosage immunologique de l’antithrombine Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Hugon-Rodin J, et al. GFHT study group on Genetic Thrombophilia. Thrombotic risk according to SERPINC1 genotype in a large cohort of subjects with antithrombin inherited deficiency. Thromb Haemost 2017;117:1040–51. FICHE 10.3 – Dosage fonctionnel de la protéine C par méthode de coagulation Allaart CF, Poort SR, Rosendaal FR, et al. Increased risk of venous thrombosis in carriers of hereditary protein C deficiency defect. Lancet 1993;341:134–8. Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. FICHE 10.4 – Dosage fonctionnel de la protéine C par mesure de l’activité amidolytique Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. FICHE 10.5 – Dosage immunologique de la protéine C Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21: 12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. FICHE 10.6 – Dosage fonctionnel de la protéine S Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009; 21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Horellou MH, et al. GEHT genetic thrombophilia group. PROS1 genotype phenotype relationships in a large cohort of adults with suspicion of inherited quantitative protein S deficiency. Thromb Haemost 2016;115:570–9. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. FICHE 10.7 – Dosage immunologique de la protéine S libre Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Horellou MH, et al. GEHT genetic thrombophilia group. PROS1 genotype phenotype relationships in a large cohort of adults with suspicion of inherited quantitative protein S deficiency. Thromb Haemost 2016;115:570–9. C hapitre 10. Exploration des facteurs de risque biologiques de maladie thromboembolique FICHE 10.8 – Dosage immunologique de la protéine S totale Alhenc-Gelas M, Aillaud MF, Delahousse B. La recherche des facteurs biologiques de risque établis de maladie thromboembolique veineuse : état des connaissances et conséquence pour la pratique en biologie clinique. Sang Thrombose Vaisseaux 2009;21:12–39. Mauge L, Alhenc Gelas M. Stabilité pré-analytique des paramètres de la coagulation : revue des données disponibles. Ann Biol Clin 2014;72:141–5. Alhenc-Gelas M, Plu-Bureau G, Horellou MH, et al. GEHT genetic thrombophilia group. PROS1 genotype phenotype relationships in a large cohort of adults with suspicion of inherited quantitative protein S deficiency. Thromb Haemost 2016;115:570–9. Alhenc-Gelas M, Darnige L. Thrombophilie : exploration biologique. EMC Biologie médicale 2016;1–10. FICHE 10.9 – Recherche et identification d’un anticoagulant de type lupique (ou antiphospholipide par une technique de coagulation, anciennement « antiprothrombinase ») Pengo V, Tripodi A, Reber G, et al. Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. Subcommittee on lupus anticoagulant/Antiphospholipid Antibody 183 of the Scientific and Standardisation Committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis. J Thromb Haemost 2009;7: 1737–40. Darnige L. Anticoagulant circulant de type lupique (lupus anticoagulant). EMC Biologie médicale 2015;. 0(0) :1-7 [Article 90-20-0007-A]. FICHE 10.10 – Recherche des polymorphismes F5 G1691A (facteur V Leiden) et F2 G20210A du gène la prothrombine Bertina RM, Koeleman BP, Koster T, et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994;369:64–7. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, et al. A common genetic variation in the 3’-untranslated region of the prothrombin gene is associated with elevated plasma prothrombin levels and an increase in venous thrombosis. Blood 1996;88. 3698-3670. Pernod G, Biron-Andreani C, Morange PE, et al. French group on haemostasis and thrombosis ; French Society of vascular medicine. Recommendations on testing for thrombophilia in venous thromboembolic disease : a French consensus guideline. J Mal Vasc 2009;34:156–203. Chapitre 11 Suivi biologique des traitements antithrombotiques Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 186 Hémostase et coagulation Fiche 11.1 Temps de Quick (INR) en cas de traitement par antivitamine K Code NABM 0127 Signification biologique du paramètre Le temps de Quick (TQ) est un temps de coagulation, mesuré à + 37 °C, d’un plasma citraté pauvre en plaquettes (PPP), après addition de thromboplastine calcique. C’est un test semi-global de la coagulation qui permet d’explorer les déficits en 3 des 4 facteurs Vitamine K-dépendants (facteurs II, VII et X). Il est exprimé en INR (International Normalized Ratio) chez un patient traité par anti-vitamine K (AVK) pour la surveillance du traitement anticoagulant. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : adaptation des doses et suivi du traitement par AVK. Ce sont des inhibiteurs de la vitamine K époxyde réductase impliquée dans le cycle de régénération de la forme réduite de la vitamine K, indispensable à la maturation posttraductionnelle hépatique des facteurs II, VII, IX et X. Ils induisent la synthèse de zymogènes pas ou peu fonctionnels appelés protéines induites par les AVK ou PIVKA (Protein Induced by Vitamin K), d’où leur effet anticoagulant. Ce sont des dérivés, soit coumariniques (acénocoumarol ou warfarine), soit de l’indanedione (fluindione, plus de 80 % des prescriptions d’AVK en France). Leurs principaux inconvénients sont leur marge thérapeutique étroite, leur large variabilité dose-réponse interet intra-individuelle nécessitant une surveillance biologique par l’INR pour l’adaptation des doses. Le résultat du TQ est obligatoirement rendu en INR en cas de traitement par AVK. Indications : suivi biologique des traitements par AVK, y compris en cas de surdosage en AVK ou d’arrêt récent. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le TQ (INR) est le seul test de première intention pour la surveillance du traitement par AVK. Les posologies et les INR doivent être consignées dans un carnet de suivi de traitement par AVK (ANSM). À l’instauration du traitement, l’utilisation d’algorithmes posologiques est recommandée pour atteindre plus rapidement l’INR cible. En cas de surdosage asymptomatique, de toute situation à risque hémorragique ou d’accidents hémorragiques chez des patients traités par AVK, des recommandations basées sur les valeurs de l’INR sont proposées par la HAS. Des appareils d’automesure de l’INR à partir d’un prélèvement capillaire sont remboursés en France chez les enfants de moins de 18 ans et chez les adultes porteurs de valves mécaniques après éducation thérapeutique. Un contrôle des automesures par un INR au laboratoire d’analyses biomédicales doit être réalisé en début de traitement puis tous les 6 mois. Les deux prélèvements doivent être réalisés dans un délai inférieur à 3 h. Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Recommandations pour la qualité du prélèvement Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Renseigner le nom de l’AVK, la posologie et la date de tout arrêt éventuel du traitement. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C. Les délais de stabilité et de réalisation de l’INR après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017. En sang total et plasma : recommandé à température ambiante jusqu’à 24 h, acceptable jusqu’à 4 h à température réfrigérée ou jusqu’à 2 h entre + 25 °C et + 30 °C. Principe méthodologique Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 187 Le résultat est exprimé en INR, égal au rapport TQ patient/TQ témoin élevé à la puissance ISI (index de sensibilité international de la thromboplastine). Les réactifs à ISI proches de 1,0 sont actuellement recommandés pour améliorer la standardisation de l’INR. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation, interlaboratoires possible (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances L’INR chez l’adulte sain non traité est inférieur à 1,2-1,3 selon la nature et le lot de thromboplastine. L’ANSM précise que, à l’exception de certaines situations spécifiques (valvulopathies et prothèses de valve cardiaque mécaniques notamment), un INR compris entre 2,0 et 3,0 est recherché chez les patients sous AVK, avec une valeur cible de 2,5. Normes maximales acceptables (95e percentiles) recommandées pour les coefficients de variation de reproductibilité de l’INR (GFHT 2015) : INR < 2 ; CV < 7,2% / INR > 2 ; CV < 8,5%. Causes d’erreur, limites du test Les causes d’erreur les plus fréquentes concernent la qualité du prélèvement sanguin. Le TQ/INR est sensible à des concentrations d’héparine non fractionnée > 1,0 UI/mL et de bas poids moléculaire > 1,5 UI anti-Xa/mL. En cas d’hématocrite élevé > 55 %, l’INR est surestimé, un prélèvement sur tube adapté est nécessaire. L’INR ne permet pas d’évaluer l’effet des anticoagulants oraux directs (AOD). Des interférences en cas de fibrinogène élevé ou d’anticoagulant lupique fort sont également observées avec certains réactifs. 188 Hémostase et coagulation Fiche 11.2 Activité anti-Xa des héparines et apparentés : héparine non fractionnée (HNF), héparines de bas poids moléculaire (HBPM), fondaparinux, danaparoïde Code NABM 0186 Signification biologique du paramètre La mesure de l’activité anti-Xa plasmatique permet d’évaluer la concentration des chaînes d’héparine (ou apparenté) circulant dans le plasma ayant une activité inhibitrice vis-à-vis du facteur Xa (FXa) (apporté comme réactif) en présence d’antithrombine (AT). L’activité anti-Xa évalue ainsi spécifiquement l’activité biologique des chaînes d’héparine porteuses du pentasaccharide se liant à l’AT et potentialisant son action inhibitrice. La cinétique de l’activité anti-Xa des héparines et apparentés dépend notamment de leur poids moléculaire moyen et de la proportion relative des chaînes courtes et longues d’héparine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription – Activité anti-Xa de l’héparine non fractionnée (HNF) (improprement appelée « héparinémie »)/du danaparoïde à dose « curative » Objectifs : le suivi de l’HNF à dose curative est indispensable du fait de la grande variabilité interet intra-individuelle de la réponse au traitement. Après administration d’une dose initiale d’HNF (ou danaparoïde) avec ou sans bolus, l’objectif est d’ajuster les posologies de manière à se situer dans une zone thérapeutique, définie en fonction de l’indication, en respectant les délais entre le prélèvement et l’administration lorsque celle-ci est discontinue. Les posologies sont augmentées en cas de sous-dosage, diminuées en cas de surdosage. Patients concernés : tous. Fréquence du suivi : au moins quotidienne. – Activité anti-Xa des HBPM à dose « curative » Objectifs : la mesure de l’activité anti-Xa des HBPM/fondaparinux permet de dépister un surdosage et/ou une accumulation chez les patients à risque (cf. infra). Le prélèvement doit être fait au pic d’activité pour permettre une interprétation des seuils de surdosage, qui sont propres à chaque HBPM (cf. infra). Les adaptations éventuelles de doses n’ont pas été validées lors d’essais cliniques, qui ont été réalisés sans suivi de l’activité anti-Xa. Patients concernés : • insuffisants rénaux (clairance < 60 mL/min évaluée par Cockcroft), particulièrement ceux âgés > 75 ans ; • poids < 40 kg ou > 120 kg ; • résistance clinique au traitement (par exemple : patients cancéreux). Fréquence du suivi : au début du traitement (après la 3e injection pour les schémas à 2 injections/24 h, deuxième injection pour les schémas à 1 injection/24 h), puis au bout de quelques jours (rythme de la surveillance à adapter selon les résultats, l’évolution de la fonction rénale chez les patients insuffisants cardiaques ou en réanimation, la durée du traitement). Le suivi de l’activité anti-Xa des HBPM est inutile dans les autres cas du fait de la bonne prédictibilité de leur effet, sauf situation particulière. – Heures de prélèvement : (hors situation particulière : cf. infra). HNF/danaparoïde : →perfusion IV : > 4 h après l’instauration du traitement, ou > 2 h après un changement posologique, à n’importe quel moment ; →voie SC : à mi-chemin entre 2 injections (6 h après l’injection si schéma à 2 injections/24 h, 4 h après l’injection si schéma à 3 injections/24 h). HBPM : au pic d’activité, soit 3 à 4 h après l’injection pour les schémas à 2 injections/24 h, 4 à 6 h pour les schémas à 1 injection/24 h. Fondaparinux : au pic d’activité, soit 2 à 3 h après l’injection. – Situations particulières : avant un geste invasif à haut risque hémorragique pour s’assurer de l’absence d’activité anti-Xa détectable ; lors d’une hémorragie pour s’assurer de l’absence de surdosage. Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques – À dose préventive, le suivi de l’activité anti-Xa des traitements hépariniques n’a pas d’indication. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration HNF : l’intérêt de l’activité anti-Xa par rapport au TCA pour le suivi de l’HNF est de n’être influencée ni par les variations des protéines inflammatoires (facteur VIII, fibrinogène, CRP, etc.) ni par des déficits acquis en facteurs. Zone thérapeutique de l’HNF : 0,3 à 0,7 UI/ mL (0,3 à 0,6 UI/mL dans les syndromes coronariens aigus). Spécialité HBPM/fondaparinux : l’activité anti-Xa mesurée à l’aide calibrations dédiées est le seul test utilisable pour évaluer les concentrations de ces médicaments, mais n’est pas directement corrélée à l’activité antithrombotique. Les résumés et caractéristiques du produit (RCP) indiquent des valeurs moyennes mesurées chez des sujets traités par chaque HBPM, qui ne sont pas des zones thérapeutiques. Il n’est pas défini à ce jour à partir de quel seuil une diminution de posologie peut être envisagée ; en revanche, il ne faut pas augmenter la posologie si la valeur est inférieure à ces moyennes. Posologie Activité anti-Xa au pic m ± ET Seuil de surdosage Schéma d’HBPM à 2 injections par jour – prélèvement 3-4 h après l’injection enoxaparine 100 UI/kg/12 h 1,20 ± 0,17 UI/mL ND dalteparine 100-120 UI/kg/12 h 0,6 ± 0,25 UI/mL 1,0 nadroparine 85 UI/kg/12 h 1,0 ± 0,2 UI/mL ND Schéma d’HBPM à une injection par jour – prélèvement 4-6 h après l’injection tinzaparine 175 UI/kg/24 h 0,87 ± 0,15 UI/mL 1,5 nadroparine 171 UI/kg/24 h 1,34 ± 0,15 UI/mL 1,8 fondaparinux (une injection par jour) – prélèvement 2-3 h après l’injection fondaparinux 7,5 mg/24 h 1,40 ± 0,40 µg/mL ND Danaparoïde : cf. RCP. Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]) ou CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dypiridamole). Recommandations pour la qualité du prélèvement Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Respecter le délai entre l’heure d’injection et celle du prélèvement. Renseigner obligatoirement le médicament, sa posologie par unité de temps, les heures d’administration et de prélèvement. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Les délais de stabilité et de réalisation de la mesure de l’anti-Xa après le prélèvement doivent respecter les recommandations pré-analytiques du GFHT 2017 : - en sang total sur tube citraté : jusqu’à 2 heures, à température ambiante ; - en plasma sur tube citraté : jusqu’à 4 h si centrifugation dans l’heure, plasma décanté ou non, conservation à température réfrigérée (+ 2 à + 8 °C) ou ambiante ; - en sang total ou plasma sur tube CTAD : jusqu’à 6 h à température ambiante. Principe méthodologique Activité anti-Xa amidolytique : méthode de cinétique enzymatique en un ou deux temps, avec ajout d’un excès connu de FXa (réactif) et de substrat chromogène spécifique du FXa. Le FXa non inhibé par l’anticoagulant hydrolyse le substrat, libérant de la paranitroaniline de façon inversement proportionnelle à la concentration de l’anticoagulant. Les résultats sont obtenus à partir d’une droite de calibration établie à l’aide de plasmas titrés en HNF/HBPM, fondaparinux, ou danaparoïde suivant le médicament. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. 189 190 Hémostase et coagulation CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation interlaboratoires possible (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Résultats exprimés en UI/mL. Coefficient de variation intralaboratoire de la plupart des méthodes automatisées < 10 %. La variabilité interlaboratoire est plus élevée (CV > 20 %) liée à l’hétérogénéité des réactifs (présence d’antithrombine ou de sulfate de dextran). Causes d’erreur, limites Prélèvement réalisé du côté du bras perfusé, contamination par de l’héparine au moment du prélèvement, concentrations résiduelles d’AOD anti-Xa (y compris < 30 ng/mL), prélèvement ictérique, hémolysé, déficit sévère en AT avec certaines méthodes. Le sulfate de dextran présent dans certains réactifs peut entraîner une surestimation de l’activité anti-Xa dans certains contextes notamment après neutralisation par le sulfate de protamine. Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 191 Fiche 11.3 Activité anti-Xa des anticoagulants oraux (hors héparine ou dérivés) rivaroxaban, apixaban, edoxaban Signification biologique du paramètre La mesure de l’activité anti-Xa des anticoagulants oraux directs (AOD) permet la quantification de la concentration plasmatique des AOD anti-Xa (xabans) : rivaroxaban, apixaban et edoxaban. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La mesure de la concentration des xabans est réalisée dans certaines situations critiques : accident hémorragique ou thromboembolique, nécessité d’un acte invasif urgent, thrombolyse d’un infarctus cérébral, aggravation brutale de la fonction rénale ou hépatique pouvant exposer à un surdosage. Elle Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement ne doit pas être utilisée en dehors de ces situations d’urgence ni pour l’adaptation des doses. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test de première intention dans les situations listées ci-dessus. En cas d’accident hémorragique, d’acte invasif urgent, d’intention de thrombolyse d’un infarctus cérébral, une prise en charge spécifique basée sur la concentration est proposée (GFHT, GIHP, SFNV). À noter que les xabans peuvent interférer avec les tests de coagulation de façon différente selon le xaban et les réactifs de laboratoire. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour cet examen. Stabilité en sang total : au moins 4 h, température ambiante. Stabilité en plasma : au moins 8 h, température ambiante. Congélation à – 20 °C : stabilité au moins 30 jours. Principe méthodologique Activité anti-Xa amidolytique : méthode en un ou deux temps, avec ajout d’une quantité connue de facteur Xa et de substrat spécifique du facteur Xa. Le facteur Xa non inhibé par l’anticoagulant hydrolyse le substrat. La libération de paranitroaniline est inversement proportionnelle à la concentration de l’anticoagulant. Les résultats exprimés en concentrations dites pondérales (en ng/mL) sont obtenus à partir d’une droite de calibration établie à l’aide de plasmas titrés surchargés en rivaroxaban, apixaban ou edoxaban, suivant le médicament pris par le patient. Il n’existe pas d’AOD anti-Xa universel de référence pour la calibration. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances Le domaine de linéarité est compris entre ∼20 ng/mL et 500 ng/mL. 192 Hémostase et coagulation Causes d’erreur, limites À interpréter selon le contexte clinique. L’interprétation est rendue difficile du fait d’une importante variabilité inter-individuelle des concentrations attendues. Pour information, les valeurs (5e95e percentiles) retrouvées chez les patients traités pour FA sont comprises au pic (2 à 3 h après la prise) entre 184 et 343 ng/mL (rivaroxaban 20 mg) ; 91 et 321 ng/mL (apixaban 5 mg × 2) ; 120 et 250 ng/mL (edoxaban 60 mg) ; et en résiduel (juste avant la prise suivante, soit 12 h pour apixaban et 24 h pour rivaroxaban et edoxaban), entre 12 et 137 ng/mL (rivaroxaban 20 mg) ; 41 et 230 ng/ mL (apixaban 5 mg × 2) ; 10 et 40 ng/mL (edoxaban 60 mg). Du fait de la variation des concentrations au cours du temps, le résultat doit être interprété en fonction du délai entre la dernière prise et le prélèvement. L’exposition du patient au médicament est plus fidèlement représentée par la valeur mesurée en résiduel. Actuellement, il n’existe pas de seuil de surdosage associé à un risque accru de saignement pour les xabans. Ainsi, une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation des dosages. Tout autre anticoagulant à activité anti-Xa, notamment lors de relais par les dérivés hépariniques, peut interférer et faussement majorer la concentration mesurée de xabans. Des trousses de dosage spécifiques des AOD, sans interférences avec les dérivés hépariniques sont disponibles. Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 193 Fiche 11.4 Activité anti-IIa des anticoagulants oraux (hors héparine ou dérivés) dabigatran Signification biologique du paramètre La mesure de l’activité anti-IIa permet la quantification plasmatique de la concentration de dabigatran, anticoagulant oral direct. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La mesure de la concentration du dabigatran est réalisée dans certaines situations critiques : accident hémorragique ou thromboembolique, nécessité d’un acte invasif urgent, thrombolyse d’un infarctus cérébral avec ou sans réversion par l’antidote (l’idarucizumab), aggravation brutale de la fonction rénale pouvant exposer à un Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement surdosage. Elle ne doit pas être utilisée en dehors de ces situations ou pour l’adaptation des doses. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Test de première intention dans les situations listées ci-dessus. En cas d’accident hémorragique, d’acte invasif urgent, de thrombolyse d’un infarctus cérébral, une prise en charge spécifique basée sur la concentration et la disponibilité ou non de l’antidote, l’idarucizumab, est proposée (GFHT, GIHP, SFNV). À noter que le dabigatran peut interférer avec les tests de coagulation de façon différente selon les réactifs de laboratoire. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour cet examen. Stabilité en sang total : au moins 4 h, température ambiante. Stabilité en plasma : au moins 8 h, température ambiante. Congélation à – 20 °C, stabilité : au moins 30 jours. Principe méthodologique Méthode de coagulation : temps de thrombine dilué. L’échantillon plasmatique à tester est dilué avec un pool de plasma. La coagulation est initiée par ajout de thrombine humaine. Le temps de coagulation est fonction de la concentration de dabigatran dans le plasma à tester. Activité anti-IIa amidolytique, test à l’écarine : le principe repose sur le clivage de la prothrombine par l’écarine. Les produits de clivage générés, principalement la meizothrombine, clivent un substrat chromogène libérant de la paranitroaniline. Ce clivage est inhibé par le dabigatran et la quantité de paranitroaniline mesurée est inversement proportionnelle à la concentration de dabigatran. Les résultats exprimés en concentrations dites pondérales (en ng/mL) sont obtenus à partir d’une droite de calibration établie à l’aide de plasmas titrés surchargés en dabigatran. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. EEQ Oui. Performances du test Le domaine de linéarité est compris entre ∼15 ng/mL et ∼500 ng/mL. 194 Hémostase et coagulation Causes d’erreur, limites du test L’interprétation est rendue difficile du fait d’une importante variabilité inter-individuelle des concentrations attendues. Une expertise en hémostase est nécessaire pour l’interprétation des dosages. Une concentration supérieure à 200 ng/mL est associée à un risque accru de saignement lorsque la mesure est effectuée en résiduel chez un patient traité pour fibrillation atriale. Pour information, les valeurs (25e-75e percentiles) retrouvées chez les patients traités par dabigatran 150 mg × 2 pour FA, sont comprises entre 117-275 ng/mL au pic et entre 61 et 143 ng/mL en résiduel. À interpréter selon le contexte clinique. Tout autre anticoagulant à activité anti-IIa directe peut interférer et faussement majorer la concentration mesurée de dabigatran avec les 2 types de tests. Seul le « temps de thrombine dilué » est sensible à la présence d’héparine non fractionnée qui peut majorer la concentration mesurée dabigatran. Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 195 Fiche 11.5 Mesure du temps de thrombine Code RIHN E201 Signification biologique du paramètre Le temps de thrombine (TT), est un test global d’exploration de la fibrinoformation. Le TT ne figure plus à la nomenclature des actes de biologie médicale. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le TT n’est préconisé ni dans la prise en charge de l’évaluation préopératoire du risque hémorragique, ni pour l’exploration d’une CIVD, ni pour le suivi des traitements hépariniques. Pour les anomalies rares du fibrinogène, le TT peut être substitué par le dosage fonctionnel du fibrinogène (méthode de Clauss). Le TT est d’une extrême sensibilité au dabigatran, inhibiteur direct de la thrombine, mais aussi à la présence d’autres composants naturels ou chimiques, exerçant une activité anti-IIa, parmi lesquels l’héparine non fractionnée. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Chez un patient traité par dabigatran, en situation d’urgence (accident hémorragique, nécessité d’un acte invasif urgent, thrombolyse d’un infarctus cérébral) et en l’absence de test de dosage spécifique, un TT peut être réalisé. Un TT dans les valeurs de référence (ratio temps du malade/ temps du témoin < 1,20 le plus souvent), correspond à une concentration très faible à nulle de dabigatran. En revanche, le TT est inutilisable pour la quantification du dabigatran. Le TT peut aussi s’inscrire dans une démarche préanalytique d’assurance-qualité du prélèvement d’hémostase pour vérifier l’absence de traces d’héparine ou de dabigatran dans le prélèvement ou lorsque la nature de l’anticoagulant que reçoit le patient n’est pas connue. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du TT. La synthèse de la littérature de Mauge et al. (2014) indiquait une stabilité en plasma frais de 7 jours et en plasma congelé inférieure à 10 mois. Principe méthodologique Le TT, test chronométrique, est un temps de coagulation à + 37 °C d’un plasma citraté, en présence de thrombine calcique. La formation du caillot est détectée par des méthodes électromécaniques ou optiques. Le résultat est exprimé en secondes rapportées au temps d’un plasma témoin. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Au moins deux niveaux. Commerciaux. Évaluation interlaboratoires possible (CIL). EEQ EEQ commerciaux de différents niveaux. Valeurs de référence/Interprétation et performances En fonction des fournisseurs, les concentrations de thrombine varient. Ainsi, compte tenu de l’absence de standardisation de ce test, chaque laboratoire doit établir ses propres valeurs de référence. Au-delà de 120 sec., le TT manque de précision. 196 Hémostase et coagulation Causes d’erreur, limites - L’allongement du TT est peu spécifique et peut survenir dans différents contextes clinico-biologiques : hypofibrinogénémies, dysfribinogénémies, protéines monoclonales, produits de dégradation du fibrinogène ou de la fibrine (du fait de leur activité antithrombine) au cours de fibrinolyse aiguë ou de coagulopathie de consommation, patients ayant reçu des solutés de remplissage. - Le TT est très sensible à la présence de traces d’héparine dans le prélèvement (contamination ou traitement reçu par le patient). Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 197 Fiche 11.6 Thrombopénies induites par l’héparine (TIH) : Recherche d’anticorps anti-facteur 4 plaquettaire (FP4) par technique immunologique Code NABM 1024 Signification biologique du paramètre Les traitements par héparine peuvent induire la synthèse d’anticorps dits héparine-dépendants généralement dirigés contre le facteur 4 plaquettaire associé à l’héparine (anti-HFP4) responsables d’une thrombopénie induite par l’héparine (TIH). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche d’anticorps anti-HFP4 ne doit être prescrite que lors d’une suspicion de TIH reposant sur un faisceau d’arguments : • diminution de 30 à 50 % de la numération plaquettaire sous héparine dans un délai de 5 à 21 jours après le début du traitement (délai plus précoce possible si exposition à l’héparine dans les 100 jours antérieurs) ; • thrombose veineuse ou artérielle (nouvelle ou extension d’un processus thrombotique initial), nécrose cutanée au site d’injection sous-cutané de l’héparine, réaction systémique après injection intraveineuse d’héparine. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Un score de probabilité pré-test (score des 4 T’s) aide à guider la prescription de ces analyses qui seront réalisées essentiellement en cas de score intermédiaire ou élevé (≥ 4), mais il manque de sensibilité dans certains contextes, comme en réanimation ou après chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle où la persistance de la thrombopénie postopératoire ou une nouvelle chute des plaquettes sont les critères les plus fiables. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de première intention lors d’une suspicion de TIH. Compte tenu de son manque de spécificité, avant de conclure à un diagnostic de TIH, un test immunologique positif doit être complété par un test fonctionnel pour vérifier le pouvoir pathogène des anticorps anti-HFP4. Si la suspicion clinique est forte et la recherche d’anticorps antiHFP4 est négative, les tests fonctionnels peuvent mettre en évidence des anticorps héparine-dépendants dirigés contre une autre cible. Sang prélevé sur tube sec ou sur citrate de sodium (0,105 M, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]). Pas de recommandations spécifiques. Température ambiante si transport rapide, sinon réfrigéré ou congelé. Mode de conservation Pas de recommandations spécifiques du GFHT. Plasma ou sérum réfrigéré pendant 7 jours, congelé au-delà. Principe méthodologique - Tests ELISA, IgG ou IgG/A/M et cibles antigéniques variables : FP4/héparine - FP4/polyvinylsulfonate (PVS) - héparine + lysat plaquettaire. - Test en chimiluminescence (CLIA), IgG ou IgG/A/M, cible FP4/PVS. - Méthode compétitive d’agglutination de particules de latex (PaGIA®), Ig G/A/M, cible FP4/PVS (test unitaire). - Agglutination de particules de latex/filtration sur gel, IgG/A/M, cible FP4/Héparine. - Immunochromatographie sur membrane (STIC), Ig G, cible Ag FP4/polynanion (test unitaire). 198 Hémostase et coagulation Type de méthode - Type de mesure Mesure semi-quantitative pour ELISA et chimiluminescence, qualitative pour les autres. Méthode compétitive d’agglutination de particules de latex : automate ACLTop®. Test en chimiluminescence : automate AcuStar®. Agglutination de particules de latex/filtration sur gel : centrifugeuse spécifique. Tests ELISA : lecteur spectrophotométrique de microplaque. CIQ Fournis dans chaque trousse. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Excellente sensibilité (Ss) au prix d’une moins bonne spécificité (Sp) : ELISA IgG : Ss : 98,3, Sp : 85,4 %. ELISA IgG/A/M : Ss 96,7 % Sp 86,8 % ; CLIA IgG : Ss : 98,8, Sp 94,6 %. CLIA IgG/A/M : Ss : 98,9, Sp 85,6 % ; PaGIA : Ss 96,5 %, Sp 93,7 %. STIC : Ss 98,4 %, Sp 90,3 %. Dans un contexte de chirurgie cardiaque, la Sp est médiocre : 30 à 50 % des patients développent des anticorps anti-FP4, associés à une TIH dans 1 à 3 % des cas. Les anticorps pathogènes étant d’isotype IgG, l’utilisation de trousses IgG spécifiques est recommandée. Lors de la réalisation d’un test ELISA, la probabilité clinique de la TIH est fortement corrélée à l’absorbance mesurée et les résultats doivent être exprimés en mentionnant l’absorbance et le seuil de positivité. Les tests unitaires rapides présentent parfois une difficulté d’interprétation. Tout test douteux doit être considéré comme positif afin de garantir leur bonne valeur prédictive négative et un test semi-quantitatif doit être réalisé. Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 199 Fiche 11.7 Thrombopénies induites par l’héparine (TIH) : tests fonctionnels pour la mise en évidence des anticorps héparine-dépendants Code NABM 1011 par méthode d’agrégation Signification biologique du paramètre Les traitements par héparine peuvent induire la synthèse d’anticorps dits héparine-dépendants généralement dirigés contre le facteur 4 plaquettaire associé à l’héparine (anti-HFP4) responsables d’une thrombopénie induite par l’héparine (TIH). Ces anticorps peuvent être détectés par un test fonctionnel qui met en évidence in vitro une activation et/ou une agrégation plaquettaire en présence d’héparine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche de ces anticorps ne doit être prescrite que lors d’une suspicion de TIH reposant sur un faisceau d’arguments : • diminution de 30 à 50 % de la numération plaquettaire (NP) sous héparine dans un délai de 5 à 21 jours après le début du traitement (délai plus précoce possible si exposition à l’héparine dans les 100 jours antérieurs) ; • thrombose veineuse ou artérielle (nouvelle ou extension d’un processus thrombotique initial), nécrose cutanée au site d’injection sous-cutané de l’héparine, réaction systémique après injection intraveineuse d’héparine. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Ces tests doivent être prescrits après discussion clinico-biologique. Un score de probabilité aide à guider la prescription de ces analyses qui sont réalisées essentiellement en cas de score intermédiaire ou élevé (≥ 4), mais il manque de sensibilité dans certains contextes comme en réanimation ou après chirurgie cardiaque avec circulation extracorporelle où la persistance de la thrombopénie postopératoire ou une nouvelle chute des plaquettes sont les critères les plus fiables. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche d’une activation ou d’une agrégation plaquettaire doit être réalisée pour confirmer le pouvoir pathogène des anti-HFP4 mis en évidence par un test immunologique. Elle est généralement réalisée en deuxième intention après un test immunologique positif mais peut aussi venir en première ligne en fonction du contexte. Si la suspicion clinique est forte et la recherche d’antiHFP4 négative, les tests fonctionnels peuvent mettre en évidence des anticorps héparine-dépendants dirigés contre une autre cible. Sang prélevé sur tube sec ou sur citrate de sodium (0,105 M, 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]). Attention à NE PAS PRÉLEVER sur tubes CTAD (qui contiennent un inhibiteur de l’activation plaquettaire) qui pourraient rendre le test faussement négatif. Prélever avant la mise sous Orgaran qui peut négativer les tests fonctionnels. Température ambiante si transport rapide, sinon réfrigéré ou congelé. Pas de recommandations spécifiques du GFHT. Plasma ou sérum du jour, congelé au-delà. 200 Hémostase et coagulation Principe méthodologique Les plaquettes-témoin, lavées pour le test de libération de sérotonine radiomarquée (SRA) ou non lavées pour le test d’agrégation plaquettaire (TAP) ou pour la cytométrie en flux (CMF), sont incubées avec le plasma du patient et une faible concentration d’héparine (0,5 UI ou 1 UI/mL). Lorsque des anticorps anti-HFP4 pathogènes sont présents dans le plasma, les plaquettes sont activées. Le signal d’activation est mesuré en fluorescence (CMF), par la libération de SRA ou par le pourcentage d’agrégation plaquettaire (TAP ou HIPA). Les seuils de positivité sont définis par le laboratoire. Cette activation/agrégation ne doit pas être observée en présence d’une forte concentration d’héparine (10 UI ou 100 UI) et/ou lorsque les plaquettes ont préalablement été incubées avec un anticorps monoclonal IV.3 qui bloque l’accès au Récepteur Fc γ RII. SRA avec agrément pour utilisation de la radioactivité. Type de méthode Méthode manuelle. Type de mesure Mesure qualitative. CIQ Non. Utiliser comme CIQ le plasma d’un patient ayant un test fonctionnel positif. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites TAP : sensibilité > 80 % avec une spécificité > à 90 %. SRA et CF. : sensibilité > 90 %. Spécificité > 95 %. Faux négatifs : 1) défaut de sensibilité des plaquettes-témoin aux anticorps de TIH ; 2) présence d’héparine ou d’Orgaran® dans le plasma qui peut inhiber l’activation/agrégation plaquettaire induite par les anticorps de TIH ; 3) en TAP et CMF si immunoglobulines présentes dans le plasma riche en plaquettes du témoin ; 4) pour les techniques en plaquettes lavées : trop faible quantité de FP4. Faux positifs : si présence de thrombine dans le plasma patient. Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 201 Fiche 11.8 Exploration biologique de la pharmacodynamie des médicaments antiplaquettaires. Test d’agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes (PRP) Code RIHN E054 Signification biologique du paramètre Les traitements antiplaquettaires par aspirine et anti P2Y12 : thiénopyridines (clopidogrel, prasugrel) et anti-P2Y12 directs (ticagrelor, etc.) sont largement utilisés, notamment chez les patients avec syndrome coronaire aigu et/ou bénéficiant d’une angioplastie coronaire, mais également en neurologie interventionnelle (clopidogrel). De nombreuses études ont montré une variabilité interindividuelle de la réponse biologique au clopidogrel, de cause génétique et non génétique, avec environ 30 % des patients présentant un niveau d’inhibition plaquettaire insuffisant. Des interactions médicamenteuses diminuant son effet existent également. La réponse aux anti-P2Y12 directs (ticagrelor) est en revanche plus prévisible. Une inhibition significative de la voie P2Y12 permet de réduire la survenue de complications thrombotiques notamment en phase aiguë des syndromes coronariens aigus (SCA). À l’inverse, une inhibition plaquettaire excessive est à éviter afin de limiter le risque hémorragique. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif du test d’agrégamétrie est d’analyser la réponse à un anti-P2Y12 et/ou à l’aspirine. Cette analyse ne doit pas s’appliquer à la surveillance systématique d’un traitement antiplaquettaire mais seulement à certains cas rares, notamment pour évaluer : • la réponse biologique en cas de résistance clinique (thrombose de stent ou récidive) ; • l’observance d’un patient ; • la récupération des fonctions plaquettaires après arrêt du (des) traitement(s) avant une procédure invasive ; • la neutralisation de l’antiplaquettaire au décours d’un syndrome hémorragique. Cette fiche concerne spécifiquement le test d’agrégamétrie qui peut être complété pour les anti-P2Y12 par le test VASP par cytométrie en flux ou ELISA sur sang total (cf. fiche 11.9 « Test VASP par cytométrie en flux ou ELISA »). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’étude de la réponse à un anti-P2Y12 et/ou à l’aspirine est un examen de première ou seconde intention selon le contexte. Nature du prélèvement Sang total prélevé sur citrate de sodium (0,105 ou 0,109 M ou 0,129 M). Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué. Recommandations pour la qualité du prélèvement Le sang doit être prélevé après une période de repos pour atténuer l’effet de l’exercice physique et à distance d’une prise de tabac (30 min) et d’une absorption de caféine (2 h). Le prélèvement à jeun est conseillé mais reste possible après une collation très légère et dépourvue de matières grasses. Le prélèvement doit être effectué avec une aiguille de 21G sous stase veineuse minimale dans des tubes en plastique ou en verre siliconé après avoir éliminé les premiers mL de sang (tube de purge). Tous les médicaments doivent être signalés pour éviter les biais d’interprétation des résultats (en particulier anti-inflammatoires non stéroïdiens, inhibiteurs de pompes à protons, etc.). Un traitement de 5 jours minimum pour les thiénopyridines est nécessaire avant les tests d’exploration. Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, le plus rapidement possible. L’utilisation d’un pneumatique doit être validée par le laboratoire. 202 Hémostase et coagulation Mode de conservation La stabilité du sang total est au maximum de 3 h à température ambiante. Pas de conservation possible. Principe méthodologique Le test est réalisé en plasma riche en plaquettes (PRP) préparé par centrifugation du sang citraté 10 min à 200 g entre + 18 et + 22 °C, sans frein, ou par sédimentation en cas de plaquettes géantes. La numération plaquettaire du PRP ne doit pas être ajustée par du plasma autologue pauvre en plaquettes jusqu’à 600 G/L. En cas de thrombopénie, les résultats seront interprétés avec prudence. Le principe du test est basé sur une mesure photométrique de l’éclaircissement du PRP secondaire au phénomène d’agrégation initié par l’acide arachidonique (aspirine) ou l’adénosine diphosphate, ADP (anti-P2Y12). Type de méthode Méthode essentiellement manuelle. Type de mesure Mesure à la fois qualitative et quantitative. CIQ Pas de CIQ disponible. Les résultats sont interprétés au regard de valeurs de référence établies par les laboratoires pour le couple réactifs/appareil utilisé. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performancesdu test Causes d’erreur, limites du test Les résultats sont exprimés en pourcentage maximal d’agrégation (parfois en vélocité, en agrégation résiduelle, en aire sous la courbe). L’agrégation plaquettaire sur PRP relève d’une pratique spécialisée et doit être limitée à des centres expérimentés. À titre indicatif la reproductibilité intra-série (n = 21) pour les agonistes usuels et pour un couple réactif agoniste défini se situe entre 3,8 et 6,6 %. Une bonne réponse à un traitement par thiénopyridines se traduit par une agrégation à l’ADP 5, 10 ou 20 µM en PRP < 50 % (à établir pour chaque agrégomètre). Une bonne réponse à un traitement par l’aspirine se traduit par une agrégation à l’acide arachidonique < 20 %. Les prélèvements très hémolysés, lipémiques ou avec une numération plaquettaire insuffisante dans le PRP (< 150 G/L) modifient l’interprétation des résultats. Les résultats doivent également être interprétés en fonction du traitement pris par le patient et des maladies associées (diabète, hypertension, AOMI, etc.). Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques 203 Fiche 11.9 Test VASP par cytométrie en flux ou ELISA pour l’exploration biologique de la pharmacodynamie des médicaments antiplaquettaires anti-P2Y12 Code RIHN E140 Signification biologique du paramètre Les traitements antiplaquettaires anti-P2Y12 par thiénopyridines (clopidogrel, prasugrel) et antiP2Y12 directs (ticagrelor, etc.) sont largement utilisés, notamment chez les patients avec syndrome coronaire aigu et/ou bénéficiant d’une angioplastie coronaire, ainsi qu’en neurologie interventionnelle (clopidogrel et ticagrelor). De nombreuses études ont montré une variabilité interindividuelle de la réponse biologique au clopidogrel, de cause génétique et non génétique (≈ 30 % des patients présentent un niveau d’inhibition plaquettaire insuffisant). Des interactions médicamenteuses diminuant son effet existent également. La réponse aux anti-P2Y12 directs (ticagrelor) est en revanche plus prévisible. Une inhibition significative de la voie P2Y12 permet de réduire la survenue de complications thrombotiques notamment en phase aiguë des syndromes coronariens aigus (SCA). À l’inverse, une inhibition plaquettaire excessive peut être associée à un risque hémorragique. Le principe du test repose sur la mesure de la phosphorylation de la VASP (Vasodilatator Stimulated Phosphoprotein), protéine intra-plaquettaire spécifique de la signalisation liée au récepteur P2Y12. Le degré de phosphorylation de la VASP est corrélé à l’efficacité du traitement par les anti- P2Y12. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif du test VASP est d’analyser la réponse à un anti-P2Y12. Cette analyse ne doit pas s’appliquer à la surveillance systématique d’un traitement anti-P2Y12, mais elle est indiquée dans certains cas rares, notamment pour évaluer : • la réponse biologique en cas de résistance clinique (thrombose de stent ou récidive) ; • l’observance d’un patient ; • la récupération des fonctions plaquettaires après arrêt du (des) traitement(s) avant une procédure invasive ; • la neutralisation de l’anti-P2Y12 au décours d’un syndrome hémorragique. Cette fiche concerne spécifiquement le test de phosphorylation de VASP par cytométrie en flux ou ELISA réalisé sur sang total. Pour les tests en agrégométrie, voir fiche 11.8 : « Exploration biologique de la pharmacodynamie des médicaments antiplaquettaires ». Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche de résistance aux traitements antiplaquettaires anti-P2Y12 est à réaliser en fonction du contexte clinique. Nature du prélèvement Sang total sur tube citrate de sodium à 0,105, 0,109 M (3,2 %) ou 0,129 M (3,8 %). Prélèvement sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) contre-indiqué. Recommandations pour la qualité du prélèvement Les conditions de prélèvement sont clairement définies par l’ISTH. Une durée de traitement minimum aux thiénopyridines (minimum de 5 jours) doit être respectée avant d’effectuer ce test pour une évaluation de réponse pertinente en traitement chronique. En phase aiguë d’un SCA, le test peut être réalisé 12 heures après la dose de charge. Contraintes d’acheminement Transport du prélèvement à température ambiante entre + 15 °C et + 25 °C, en minimisant les chocs (ne pas utiliser de système pneumatique). Mode de conservation À réaliser dans les 48 heures qui suivent le prélèvement. 204 Hémostase et coagulation Principe méthodologique Test VASP réalisé par cytométrie en flux ou par ELISA, sur sang total dans les deux cas. Après perméabilisation cellulaire, la VASP phosphorylée est marquée avec un anticorps spécifique par marquage indirect. Deux conditions sont testées en présence de PGE1 seul ou de PGE1 + ADP. Il est conseillé de confronter les résultats à ceux d’un test d’agrégométrie (technique de référence). Type de méthode Méthode manuelle, lecture semi-automatique (cytométrie en flux, ELISA). À ce jour un seul fournisseur existe : Biocytex-Stago. Type de mesure Mesure quantitative. Les résultats sont exprimés en Index de réactivité plaquettaire (IRP) en ( %). CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Valeurs de référence à établir par le laboratoire. Les performances varient selon la sensibilité et les réglages du cytomètre. Une bonne réponse à un traitement par anti-P2Y12 se traduit par un IRP* < 50 % et a été déterminée après dose de charge en phase aiguë du SCA. Aucun seuil n’a été déterminé dans les autres pathologies. Une valeur < à 20 % expose à un risque hémorragique (3,4). Absence d’interférence avec l’aspirine et les anti-GPIIbIIIa. Causes d’erreur, limites du test Les plaquettes sont sensibles à de nombreux facteurs pouvant induire un biais à cette technique s’ils ne sont pas maîtrisés (ex : qualité du prélèvement, choc physique ou thermique, etc.). Chapitre 11. Suivi biologique des traitements antithrombotiques Bibliographie du chapitre 11 FICHE 11.1 – temps de Quick (INR) en cas de traitement par antivitamine K. Synthèse des recommandations professionnelles HAS. « Prise en charge des surdosages en antivitamines K, des situations à risque hémorragique et des accidents hémorragiques chez les patients traités par antivitamines K en ville et en milieu hospitalier ». Avril 2008. www.has-sante.fr. Rapport ANSM. « Les anticoagulants en France en 2014: état des lieux, synthèse et surveillance ». Avril 2014. FICHE 11.2 – Activité anti-Xa des héparines et apparentés: héparine non fractionnée (HNF), héparines de bas poids moléculaire (HBPM), fondaparinux, danaparoïde. Gouin-Thibault I, Lecompte T, Sie P, et al. Anticoagulants usuels: maniement et gestion des complications. EMC Traité de Médecine Akos 2013;2–0495. Mouton C, Calderon J, Janvier G, et al. Dextran sulfate included in factor Xa assay reagent overestimates heparin activity in patients after heparin reversal by protamine. Thromb Res 2003;111:273–9. European Medicine Agency. www.ema.europa.eu. FICHE 11.3 – Activité anti-Xa des anticoagulants oraux (hors héparine ou dérivés) rivaroxaban, apixaban, edoxaban. GFHT: http://site.geht.org. GIHP: http://gihp.org. https://www.societe-francaise-neurovasculaire.fr. FICHE 11.4 – Activité anti-IIa des anticoagulants oraux (hors héparine ou dérivés) dabigatran. http://site.geht.org. http://gihp.org. https://www.societe-francaise-neurovasculaire.fr. FICHE 11.5 – Mesure du temps de thrombine. HAS. Biologie des anomalies de l’hémostase. Tome II: temps de thrombine et correction du temps de thrombine. Juillet 2011. Dabigatran etexilate et examens de biologie médicale. Groupe français d’hémostase et thrombose (GFHT): www.gfht.org. FICHE 11.6 – Recherche d’anticorps anti-facteur 4 plaquettaire (FP4) par technique immunologique. Warkentin TE, Greinacher A, Gruel Y, et al. Scientific and standardization committee of the international society on thrombosis and haemostasis. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia: a conceptual framework and implications for diagnosis. J Thromb Haemost 2011;9:2498–500. Nagler M, Bachmann LM, ten Cate H, et al. Diagnostic value of immunoassays for heparin-induced thrombocytopenia: a systematic review and metaanalysis. Blood 2016;127:546–57. Husseinzadeh HD, Gimotty PA, Pishko AM, et al. Diagnostic accuracy of IgG-specific versus polyspecific enzyme-linked immunoassays in hepa- 205 rin-induced thrombocytopenia: a systematic review and meta-analysis. J Thromb Haemost 2017;15:1203–12. Vayne C, Guery EA, Gruel Y, et al. Données actualisées sur les thrombopénies induites par l’héparine. Revue francophone des laboratoires 2017;494:41–53. FICHE 11.7 – Tests fonctionnels pour la mise en évidence des anticorps héparine-dépendants. Minet V, Dogné JF, Mullier F. Thrombocytopenia: A Review. Molecules 2017;22:617. Warkentin TE, Greinacher A, Gruel Y, et al. Scientific and standardization committee of the international society on thrombosis and haemostasis. Laboratory testing for heparin-induced thrombocytopenia: a conceptual framework and implications for diagnosis. J Thromb Haemost 2011;9:2498–500. FICHE 11.8 – Exploration biologique de la pharmacodynamie des médicaments antiplaquettaires. Test d’agrégation plaquettaire en plasma riche en plaquettes (PRP). Vickers MV, Thompson SG. Sources of variability in dose response platelet aggregometry. Thromb Haemost 1985;53:219–20. Harrison P. Platelet function analysis. Blood Rev 2005;19:111–23. Rapport HAS d’évaluation technologique, tome III. Test photométrique d’agrégation plaquettaire. 2011. Cattaneo M, Cerletti C, Harrison P, et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: A Consensus of the Working Party from the Platelet Physiology Subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost 2013;11:1183–9. Payrastre B, Alessi MC, Sie P. Physiopathologie des thrombopathies constitutionnelles. Hématologie 2014;20:20–35. Bonello L, Tantry US, Marcucci R, et al. Working Group on High On-Treatment Platelet Reactivity. Consensus and future directions on the definition of high on-treatment platelet reactivity to adenosine diphosphate. J Am Coll Cardiol 2010;56:919–33. FICHE 11.9 – Test VASP par cytométrie en flux ou ELISA pour l’exploration biologique de la pharmacodynamie des médicaments antiplaquettaires anti-P2Y12. Cattaneo M, Cerletti C, Harrison P, et al. Recommendations for the standardization of light transmission aggregometry: a consensus of the working party from the platelet physiology subcommittee of SSC/ISTH. J Thromb Haemost 2013;11:1183–9. Bonello L, Paganelli F, Arpin-Bornet M, et al. Vasodilatorstimulated phosphoprotein phosphorylation analysis prior to percutaneous coronary intervention for exclusion of postprocedural major adverse cardiovascular events. J Thromb Haemost 2007;5:1630–6. 206 Hémostase et coagulation Bonello L, Tantry US, Marcucci R, et al. Working Group on High On-Treatment Platelet Reactivity. Consensus and future directions on the definition of high on-treatment platelet reactivity to adenosine diphosphate. J Am Coll Cardiol 2010;56:919–33. Jeong YH, Bliden KP, Tantry US, et al. High on-treatment platelet reactivity assessed by various platelet function tests: is the consensus-defined cut-off of VASP-P platelet reactivity index too low ? J Thromb Haemost 2012;10:487–9. Chapitre 12 Autres contextes clinico-biologiques Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 208 Hémostase et coagulation Fiche 12.1 Mesure de l’activité de la protéase du facteur Willebrand (ADAMTS 13) Code LC E048 Signification biologique du paramètre ADAMTS13 (A Disintegrin And Metalloprotease with ThromboSpondin type 1 repeats, member 13) est une métalloprotéase qui clive spécifiquement le facteur Willebrand (VWF) au niveau de la liaison peptidique Tyr1605-Met1606 (domaine A2 du VWF). Cette protéase réduit ainsi la taille des multimères du VWF et régule ses fonctions hémostatiques. ADAMTS13 est synthétisée par les cellules Ito du foie, les cellules endothéliales et les mégacaryocytes. Sa concentration plasmatique est de l’ordre de 1 µg/mL et sa demi-vie comprise entre 2 et 3 jours. En pathologie, un déficit sévère de l’activité d’ADAMTS13 (< 10 %) est associé au purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT). Le PTT est une microangiopathie thrombotique (MAT) et donc définie à ce titre par l’association d’une anémie hémolytique mécanique, d’une thrombopénie sévère de consommation et d’une ischémie multiviscérale qui sont à l’origine des signes cliniques observés chez les patients. L’absence d’activité d’ADAMTS13 aboutit à l’accumulation de VWF très hautement multimérisé qui favorise la formation spontanée de thrombi plaquettaires dans la microcirculation, responsables de la MAT. Il s’agit d’une maladie rare dont la prévalence annuelle en France est estimée à 13 cas par million d’habitants. Sur le plan physiopathologique, on distingue 3 formes de PTT : • le PTT acquis auto-immun dû à la présence d’auto-anticorps anti-ADAMTS13 (75 % des cas) ; • le PTT acquis via des mécanismes non déterminés (22 % des cas) ; • le déficit congénital en ADAMTS13 résultant de mutations du gène ADAMTS13 (syndrome d’Upshaw-Schulman [USS], ∼ 3 % des cas). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : dans un contexte de diagnostic différentiel des MAT, cet examen a pour objectif de mettre en évidence ou non un déficit fonctionnel sévère de l’activité d’ADAMTS13 (< 10 %). Dans un contexte de suivi de PTT, cet examen a pour objectif de détecter une diminution de l’activité d’ADAMTS13 au cours de la période de rémission clinique. Principales indications : 1) diagnostic positif de PTT dans un contexte de MAT (argument biologique confirmant le diagnostic clinique) ; 2) diagnostic d’exclusion d’un PTT dans un contexte de suspicion de syndrome hémolytique et urémique atypique (argument biologique confortant l’utilisation d’eculizumab) ; 3) suivi d’un PTT acquis connu (détection d’une rechute biologique précédant une rechute clinique). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans le bilan de MAT, la mesure de l’activité d’ADAMTS13 est un examen de première intention. En cas d’activité effondrée (< 10 %), la recherche d’IgG anti-ADAMTS13 doit être effectuée en seconde intention. La mesure antigénique d’ADAMTS13 n’est pas à retenir pour le diagnostic biologique : cet examen est réservé à quelques rares cas pour la caractérisation de certains patients atteints d’USS, ou à des fins de recherche clinique. Chapitre 12. Autres contextes clinico-biologiques Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]) ou sur tube sec. Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Recommandations pour la qualité du prélèvement L’EDTA inhibe l’activité d’ADAMTS13 : les prélèvements sur EDTA sont formellement contreindiqués. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Sang total, plasma citraté ou sérum congelés selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Pas de recommandation spécifique. Le principe repose sur la dégradation d’un substrat exogène (VWF) par ADAMTS13 du plasma testé et la mise en évidence des produits de dégradation. Les techniques varient par la nature du substrat et par la méthode de mise en évidence des produits de dégradation du VWF. - Méthodes utilisant le VWF entier : mesure des produits de protéolyse par des méthodes électrophorétiques (multimères ou fragments) ou immunologiques (liaison au collagène, VWF:Ag). - Méthodes utilisant des fragments peptidiques du VWF contenant le site de clivage : mesure des produits de protéolyse par des méthodes fluorimétriques (FRETS-VWF73) (méthode de référence), spectrométrie de masse (SELDI-TOF) ou immunologiques (ELISA). Type de méthode Les méthodes actuellement disponibles sont manuelles. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Pas de CIQ spécifique disponible, excepté ceux des trousses commerciales ELISA. EEQ Oui. Standard international depuis 2015 et ECAT (www.ecat.nl). Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 209 Il est recommandé de titrer le plasma destiné à l’étalonnage et d’exprimer les résultats en UI/mL (1 UI/mL = 100 % d’activité). Les méthodes commerciales peuvent présenter des discordances aux valeurs seuils de diagnostic par rapport la méthode de référence (environ 10 % des cas). Fluorimétrie : hémolyse ou bilirubinémie importantes, prélèvements autofluorescents. Méthodes utilisant le VWF entier : risque d’interférence avec le VWF endogène si le taux de VWF:Ag plasmatique/sérique est > 300 %. 210 Hémostase et coagulation Fiche 12.2 Recherche et titrage d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéase du facteur Willebrand (anti-ADAMTS 13) Code LC E049 Signification biologique du paramètre Les anticorps anti-ADAMTS13 sont des autoanticorps de nature polyclonale. Ils peuvent être « neutralisants » (c’est-à-dire inhibiteurs) et inhiber l’activité d’ADAMTS13, ou « non neutralisants » et accélérer la clairance d’ADAMTS13 en formant des complexes immuns. La plupart du temps, ces deux mécanismes coexistent. Ces anticorps sont à l’origine de l’effondrement de l’activité de la métalloprotéase ADAMTS13, protéase spécifique du facteur Willebrand (VWF). L’absence d’activité d’ADAMTS13 aboutit à l’accumulation de VWF très hautement multimérisé, ce qui favorise la formation spontanée de thrombi plaquettaires dans la microcirculation et l’apparition d’une microangiopathie thrombotique (MAT) appelée purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT). Les auto-anticorps anti-ADAMTS13 peuvent être recherchés et titrés par des méthodes immunologiques ou grâce à des tests fonctionnels. auto-immune d’un déficit sévère de l’activité d’ADAMTS13 chez un patient atteint de PTT. Indications : 1) diagnostic du caractère acquis auto-immun d’un PTT ; 2) suivi d’un PTT acquis auto-immun (si l’activité d’ADAMTS13 demeure < 10 %) ; 3) suivi d’un PTT héréditaire (détection d’une allo-immunisation post-transfusionnelle après échanges plasmatiques). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Examen de seconde intention dans un contexte d’exploration de PTT. Cet examen est à réaliser si et seulement si l’activité d’ADAMTS13 est < 10 % ou durant le suivi d’un PTT tant que l’activité d’ADAMTS13 est < 10 %. Le titrage des IgG anti-ADAMTS13 est à privilégier par rapport aux tests fonctionnels car ces derniers sont moins sensibles notamment pour la détection des anticorps « non neutralisants ». Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Objectifs : la mise en évidence d’auto-anticorps anti-ADAMTS13 permet d’affirmer l’étiologie Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]) ou sur tube sec. Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. À part le citrate de sodium, tous les autres anticoagulants sont contre-indiqués. En revanche, le prélèvement sur tube sec est possible. Sang total, plasma citraté ou sérum congelés selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Pas de recommandation spécifique. Principe méthodologique Chapitre 12. Autres contextes clinico-biologiques 211 Méthodes de type ELISA : plusieurs méthodes (western blot ou Elisa) dédiées à la détection et/ ou au titrage des auto-anticorps anti-ADAMTS13 (IgG, IgM et IgA) ont été développées. Seules les méthodes permettant de titrer les IgG anti-ADAMTS13 ont été adaptées en trousses commerciales de recherche clinique. Ces méthodes utilisent des plaques recouvertes d’un ADAMTS13 recombinant et la révélation, des anti-IgG humaines couplées à la peroxydase. Tests de mélange pour les tests fonctionnels : mélange de plasma témoin et de plasma testé préchauffé à + 56 °C afin de dissocier d’éventuels complexes immuns. L’activité ADAMTS13 résiduelle est mise en évidence selon différentes méthodes (cf. Mesure de l’activité d’ADAMTS13) avec les limites inhérentes à ces dernières. Les tests de mélange sont des méthodes semi-quantitatives et peu sensibles. Il n’existe pas de consensus quant à l’expression des résultats. Type de méthode Méthode manuelle ou automatisable (ELISA) pour le titrage des IgG anti-ADAMTS13. Manuelle (tests de mélange) pour la détection d’un inhibiteur circulant anti-ADAMTS13. Type de mesure Mesure quantitative (ELISA) ou semi-quantitative (tests de mélange). CIQ Pas de CIQ spécifique, excepté ceux des trousses commerciales ELISA. EEQ Oui, ECAT (www.ecat.nl). Valeurs de référence/Interprétation et performances du test ELISA : la limite principale de l’examen dépend du seuil de positivité. Avec les trousses commerciales, celle définie par le fabricant est comprise entre 10 U/mL et 15 U/mL. Ce seuil est probablement sous-estimé. Il est recommandé que chaque laboratoire définisse son seuil à l’aide d’une population de volontaires sains. Causes d’erreur, limites L’administration d’immunoglobulines chez le patient peut constituer une interférence (faux positif). De plus, la recherche d’IgG anti-ADAMTS13 est négative à la phase inaugurale chez environ 20 % des PTT acquis. Cela est vraisemblablement dû à plusieurs facteurs : 1) une limite de sensibilité du test pour la détection des IgG anti-ADAMTS13 non libres (c’est-à-dire liées à ADAMTS13 au sein de complexes immuns circulants) ; 2) l’absence d’IgG anti-ADAMTS13 circulantes chez certains patients PTT dont tous les complexes immuns ont subi une clairance par le système macrophagique ; 3) le caractère non auto-immun de certains PTT acquis (défaut de synthèse, dégradation ou inhibition catalytique d’ADAMTS13). 212 Hémostase et coagulation Fiche 12.3 Dosage de l’activité amidolytique du plasminogène (PLG) Code RIHN E100 Signification biologique du paramètre Le plasminogène est le précurseur inactif de la plasmine, enzyme clé du système fibrinolytique vasculaire et extravasculaire. Le plasminogène est une glycoprotéine d’environ 92 kDa de la famille des sérines protéases synthétisée principalement par le foie. Il circule dans le plasma sous deux formes : l’une native, majoritaire, le Glu-plasminogène (demi-vie : 2-3 jours), l’autre étant le Lysplasminogène qui a subi une protéolyse partielle (demi-vie : 20 h). Sous l’influence de l’activateur tissulaire du plasminogène (t-PA) ou de l’urokinase (u-PA), le plasminogène est converti en plasmine. Son rôle principal consiste à lyser la fibrine insoluble pour permettre la formation de produits de dégradation de la fibrine solubles. La plasmine est ensuite rapidement neutralisée par l’alpha-2 antiplasmine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La principale indication du dosage de l’activité du plasminogène est la conjonctivite ligneuse. Il s’agit de la principale manifestation clinique associée au déficit congénital en plasminogène avec une incidence < 106. Elle correspond à un défaut de la fibrinolyse extravasculaire, avec formation Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement récurrente de pseudo-membranes fibrineuses au niveau des muqueuses oculaires pouvant conduire à la cécité. Plus rarement, il a été rapporté une atteinte des muqueuses utérine, digestive ou respiratoire. Dans de rares cas, ces dépôts fibrineux surviennent au niveau du système nerveux central à l’origine d’hydrocéphalie occlusive chez le nouveau-né et nécessitent la recherche d’un déficit en plasminogène. La prévalence des thromboses veineuses profondes associées à un déficit en plasminogène étant identique à celle de la population générale, le dosage de l’activité du plasminogène n’est pas indiqué dans le cadre d’un bilan de thrombophilie. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le dosage de l’activité du plasminogène est un examen de première intention en cas de conjonctivite ligneuse. Un déficit doit toujours être confirmé sur un second prélèvement. Une diminution de l’activité du plasminogène devra être complétée par un dosage antigénique du plasminogène. Il existe deux types de déficits : l’hypoplasminogénémie (type 1) avec antigène et dosage fonctionnel abaissés et la dysplasminogénémie (type 2) avec taux antigénique normal et taux fonctionnel inférieur à 60 %. Sang prélevé sur citrate de sodium (recommandé 0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ; acceptable 0,129 M [3,8 %]). Le dosage sur tube CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole) est également possible. Suivre les recommandations pré-analytiques du GFHT 2015/2017. Contraintes d’acheminement Sang total ou plasma citraté congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure du plasminogène. Il est habituellement admis une stabilité : 1) en sang total inférieure à 4 h à température ambiante ; 2) en plasma pauvre en plaquettes congelé 1 mois à – 20 °C et 6 mois à – 80 °C. La centrifugation du sang total pour obtenir du plasma doit se faire dans les 2 h suivant le prélèvement. Principe méthodologique Chapitre 12. Autres contextes clinico-biologiques Le dosage de l’activité du plasminogène est réalisé par méthode amidolytique. De la streptokinase en excès est ajoutée au plasma dilué permettant la formation d’un complexe plasminogènestreptokinase avec une activité « plasmine-like ». Cette quantité de complexes, proportionnelle à la quantité de plasminogène initiale, est évaluée par son action sur un substrat chromogène. Dans ces conditions, la réaction est insensible aux inhibiteurs plasmatiques du plasminogène. Type de méthode Méthode automatisée. Type de mesure Mesure quantitative. CIQ Oui commerciaux, au moins 2 niveaux. EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 213 Résultats exprimés en pourcentage. L’activité du plasminogène est diminuée de 50 % chez le nouveau-né à terme et atteint des valeurs adultes à l’âge de 6 mois (valeurs de référence : 80-120 %). Chez les patients atteints de conjonctivite ligneuse associée à un déficit constitutionnel en plasminogène, l’activité est en général < 40 %. L’activité du plasminogène peut être augmentée en cas de grossesse, de syndrome inflammatoire ou infectieux. Les résultats doivent être interprétés en fonction de l’âge et du contexte inflammatoire ou infectieux. 214 Hémostase et coagulation Fiche 12.4 Recherche d’un auto-anticorps dirigé contre la protéine S Code RIHN E106 Signification biologique du paramètre Les auto-anticorps dirigés contre la protéine S (PS) peuvent être responsables d’un déficit acquis en PS. Quand ce déficit est sévère, des accidents thrombotiques graves ou un purpura fulminans post-infectieux se manifestant par des lésions ecchymotiques, voire nécrotiques, peuvent survenir. Ces manifestations gravissimes, souvent accompagnées d’une coagulation intravascu­ laire disséminée, surviennent principalement au décours d’un épisode infectieux, le plus souvent une varicelle. Un diagnostic précoce est indispensable pour permettre une prise en charge adaptée. Ils peuvent parfois être rencontrés au cours de maladies auto-immunes. Ces anticorps, lorsqu’ils inhibent l’activité anticoagulante de la PS, sont dits neutralisants. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche d’auto-anticorps dirigés contre la protéine S est indispensable lors de la mise en évidence d’un déficit sévère en protéine S diagnostiqué dans un contexte d’accident thrombotique grave ou de purpura fulminans post-infectieux pour débuter rapidement un traitement adapté. La mise en évidence d’une décroissance progressive des anticorps anti-PS est nécessaire pour s’assurer de l’efficacité du traitement. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche d’auto-anticorps anti-PS est un examen de deuxième intention à réaliser en cas de déficit isolé sévère en PS dans un contexte clinique n’évoquant pas un déficit constitutionnel. Cette recherche s’effectue dans un laboratoire spécialisé. Nature du prélèvement Sang prélevé sur citrate de sodium (0,105 ou 0,109 M [3,2 %] ou 0,129 M [3,8 %]), CTAD (citrate, théophylline, adénosine, dipyridamole), EDTA ou tube sec. Recommandations pour la qualité du prélèvement Pas de recommandations spécifiques disponibles ; le même prélèvement étant le plus souvent utilisé pour le dosage de la PS, suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour ce dosage. Contraintes d’acheminement Sang total, plasma ou sérum congelé selon le délai d’acheminement. Suivre les recommandations du GFHT 2015/2017 pour les conditions de transport. Mode de conservation Le GFHT n’a pas, à ce jour, émis de recommandations concernant les conditions de conservation du prélèvement pour la mesure de la PS. Certaines trousses indiquent que le plasma doit être utilisé dans les 8 heures suivant sa préparation ou être congelé à une température au moins – 20 °C pendant 6 mois maximum. Principe méthodologique Utilisation d’une plaque ELISA sensibilisée par de la PS humaine puis stabilisée. L’échantillon à tester est déposé dans le puits. Les auto-anticorps anti-PS, lorsqu’ils sont présents se fixent sur la PS immobilisée. Après lavage, les anticorps fixés sont révélés par un immunoconjugué spécifique des IgG humaine ou des IgM humaines. La coloration qui se développe est proportionnelle à la quantité d’auto-anticorps anti-PS présente dans le milieu. Type de méthode Méthode manuelle de type ELISA. Trousses commerciales disponibles. Type de mesure Mesure quantitative : titre en unités arbitraires UA/mL obtenues grâce à une courbe d’étalonnage. CIQ Non. EEQ Chapitre 12. Autres contextes clinico-biologiques Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances Les seuils de positivité sont indiqués par le fabricant. Les kits ELISA disponibles sur le marché n’ont pas de marquage CE. Causes d’erreur, limites Un lavage insuffisant peut se traduire par un bruit de fond élevé et une valeur trop forte du contrôle négatif. Comme pour tout auto-anticorps, la présence d’un état inflammatoire ou infectieux, d’immuncomplexes circulants, de gammapathie, de pathologies auto-immunes, peuvent entraîner une réactivité aspécifique faible. 215 216 Hémostase et coagulation Bibliographie du chapitre 12 FICHE 12.1 – Mesure de l’activité de la protéase du facteur Willebrand (ADAMTS 13). Veyradier A, Wolf M, Stepanian A, et al. ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur Von Willebrand. EMC Biologie médicale 2011;. 90-200003-A. Mariotte E, Azoulay E, Galicier L, et al. French Reference Center for Thrombotic Microangiopathies. Epidemiology and pathophysiology of adulthoodonset thrombotic microangiopathy with severe ADAMTS13 deficiency (thrombotic thrombocytopenic purpura) : a cross-sectional analysis of the French national registry for thrombotic microangiopathy. Lancet Haematol 2016;3:e237–245. Hubbard AR, Heath AB, Kremer Hovinga JA. Subcommittee on von Willebrand Factor. Establishment of the WHO 1st International Standard ADAMTS13, plasma (12/252) : communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost 2015;13:1151–3. Thouzeau S, Capdenat S, Stépanian A, et al. Évaluation of a commercial assay for ADAMTS13 activity measurement. Thromb Haemost 2013;110:852–3. Joly B, Stepanian A, Hajage D, et al. Évaluation of a chromogenic commercial assay using VWF-73 peptide for ADAMTS13 activity measurement. Thromb Res 2014;134:1074–780. FICHE 12.2 – Recherche et titrage d’un anticorps spécifique dirigé contre la protéase du facteur Willebrand (anti-ADAMTS 13). Veyradier A, Wolf M, Stepanian A, et al. ADAMTS13, la protéase spécifique de clivage du facteur Von Willebrand. EMC Biologie médicale 2011;. 90-200003-A. Mariotte E, Azoulay E, Galicier L, et al. French Reference Center for Thrombotic Microangiopathies. Epidemiology and pathophysiology of adulthoodonset thrombotic microangiopathy with severe ADAMTS13 deficiency (thrombotic thrombocytopenic purpura) : a cross-sectional analysis of the French national registry for thrombotic microangiopathy. Lancet Haematol 2016;3:e237–245. Ferrari S, Mudde GC, Rieger M, et al. IgG subclass distribution of anti-ADAMTS13 antibodies in patients with acquired thrombotic thrombocytopenic purpura. J Thromb Haemost 2009;7:1703–10. FICHE 12.3 – Dosage de l’activité amidolytique du plasminogène (PLG). Cesarman-Maus G, Hajjar KA. Molecular mechanisms of fibrinolysis. Br J Haematol 2005;129:307–21. Hilali MM, Gilliver BE. Physiological activation of plasminogen in full term newborn infants. J Clin Pathol 1984;37:1264–7. FICHE 12.4 – Recherche d’un auto-anticorps dirigé contre la protéine S. Hurtaud-Roux MF, Lasne D, Baudouin V, et al. Autoanticorps dirigés contre la protéine S : référentiels hémostase/Société française d’hématologie. Hématologie 2012;18:233–8. Larakeb AS, Evrard S, Louillet F, et al. Acute renal cortical necrosis due to acquired antiprotein S antibodies. Pediatr Nephrol 2009;24:207–9. Boccara O, Lesage F, Regnault V, et al. Nonbacterial purpura fulminans and severe autoimmune acquired protein S deficiency associated with human herpesvirus-6 active replication. Br J Dermatol 2009;161:181–3. Chapitre 13 Annexes Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 218 Hémostase et coagulation Fiche 13.1 Tableau de synthèse des recommandations pré-analytiques (mise à jour mai 2017) Paramètres Tube Recommandé Acceptable Non conforme Tube sous « vide », stérile. Tube citrate : PET étanche, polypropylène Tube CTAD : PET ou verre siliconé. Verre siliconé. Autres. Volume résiduel d’air > 20 % (pour la surveillance des traitements par héparine non fractionnée). Volume d’air résiduel ≤ 20 %. Respect strict des dates de péremption. Anticoagulant pH plasma anticoagulé Hématocrite Calibre de l’aiguille Matériel de prélèvement Citrate 3,2 %. CTAD : dont citrate 3,2 %. Le GEHT recommande une concentration de citrate unique pour un LBM compte tenu des possibles variations des valeurs de référence des tests globaux en particulier (TQ/TCA). Citrate 3,8 %. 7,3 à 7,45 0,20 (20 %) à 0,55 (55 %). 19 à 22 gauge. Polymère inerte, matériel stérile, apyrogène. Utilisation d’unités à ailettes (épicrâniennes) autorisée en particulier en cas de veines difficiles, en pédiatrie, gériatrie, oncologie, etc. Autres. < 7,3 ou > 7,45 1/ Si > 0,55 (55 %) : le GEHT recommande au minimum une information aux prescripteurs. La correction du volume de citrate au niveau du tube est laissée à l’appréciation de chaque LBM. > 0,55 (55 %) : résultat rendu sans information au prescripteur. 2/ Si < 0,20 (20 %) en accord avec les recommandations documentées du CLSI (5e édition), un ajustement du volume de citrate est possible (appréciation LBM). Cependant les examens d’hémostase peuvent être réalisés sans correction du volume d’anticoagulant. < 0,20 (20 %) : pas d’ajustement recommandé du volume de citrate, résultat rendu sans information au prescripteur. 23 gauge : veines difficiles, pédiatrie, gériatrie, oncologie, etc. > 25 gauge. Chapitre 13. Annexes Paramètres Garrot Site de ponction Place du tube Remplissage Homogéinisation du tube après le prélèvement Transport sang total Recommandé Acceptable Non conforme < 1 min. Peu serré. Entre 1 à 3 min. > 3 min. Trop serré. Veineux. Artériel. Prélèvement sur cathéter : après rejet d’un volume de sang qui tient compte de l’espace mort que représente le cathéter (environ 5 à 10 mL). Autres. 2e tube après un tube de « purge » (neutre sans additif) ou un tube sec (sans activateur de l’hémostase) ou après des hémocultures. 1er tube, si ponction veineuse franche et si le bilan ne comporte que des tests courants de coagulation (TQ en particulier) non affectés par l’activation endothéliale. Après tube sec avec activateur ou anticoagulant autre que citrate. Lors des prélèvements avec une aiguille épicrânienne, le tube de purge est recommandé. En cas de prélèvement avec aiguille épicrânienne, à défaut d’un tube de purge, il est recommandé de s’assurer obligatoirement du volume de remplissage acceptable (volume mort de la tubulure < 10 % du volume final du tube). ≥ 90 %. ≥ 80 %. Dès la fin du remplissage du tube, par retournements lents et complets. Non réfrigéré. + 15 à + 25 °C. 219 < 80 %. Homogénéisation du tube par retournements non réalisée ou décalée par rapport à la fin du prélèvement. Agitation vigoureuse. Pour les températures intermédiaires, le GEHT n’émet pas de recommandations, mais préconise d’associer lors de la maîtrise des risques la température ET la durée du transport. Réfrigéré (+ 2 à + 8 °C) Glace. >+ 37 °C. Le GEHT recommande de minimiser les chocs et les vibrations pour éviter de dénaturer les protéines et limiter l’activation plaquettaire (CLSI 5e édition). Le transport par pneumatique fait l’objet de recommandations spécifiques pour la qualification, basées sur la longueur, la vitesse moyenne, les accélérations et décélérations, les forces appliquées à l’échantillon, la température… L’argumentaire est disponible ici : http://site.geht.org/wp-content/uploads/2016/12/ Reco_Transport_pneumatique.pdf Conservation et délai avant l’examen À la date du 01/07/2018, données disponibles pour les examens suivants : TP, TCA, fibrinogène, D dimères, activités anti-Xa HNF et anti-Xa HBPM. En cours de révision pour les autres examens. 220 Hémostase et coagulation Paramètres Recommandé Acceptable Non conforme Centrifugation Conditions standard L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf 1 500 à 2 000 g ET au moins 15 min < 1 500 g ET 15 min. ou 2 000 à 2 500 g ET au moins 10 min. < 2 000 g ET 10 min. Centrifugation rapide (Limitée aux TQ, TCA, fibrinogène et Ddimères) L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf > ou = 3 000 g ET au moins 5 min < 3 000 g ET 5 min. ou > ou = 4440g ET au moins 2 min. < 4 440 g ET 2 min. Double centrifugation L’objectif est d’obtenir un taux de plaquettes résiduelles dans le plasma < 10 G/L L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf Deux centrifugations standard successives (avec décantation entre les 2 centrifugations). Centrifugation standard unique (sous réserve de vérification de l’obtention d’un plasma avec un nombre résiduel de plaquettes < 10 G/L). Filtration ou centrifugation rapide (en première et/ou deuxième centrifugation). Température L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf Centrifugeuse à température contrôlée = + 15 à + 25 °C. Si fonctionnement ponctuel, les centrifugeuses sans système de refroidissement peuvent être utilisées (sous réserve que la température reste <+ 25 °C au cours de l’utilisation). <+ 15 °C ou >+ 25 °C. Rotor L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf Rotor à godets mobiles. Rotor angulaire à angle fixe (sous réserve de vérifier l’absence de contamination du plasma par les cellules sanguines). Frein L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf Frein désactivé. Frein (puissance minimum). Contrôles des centrifugeuses L’argumentaire est disponible ici : http://site. geht.org/wp-content/ uploads/2016/12/centrifugation.pdf Au moins une fois par an. Critères de contrôle des plasmas : plaquettes < 10 G/L sur au moins 6 échantillons consécutifs analyses. Frein (puissance maximum). < une fois par an. Moins de 6 échantillons consécutifs analyses. Paramètres Congélation Chapitre 13. Annexes Recommandé Acceptable 221 Non conforme Rapide à au moins – 70 °C. Rapide à au moins – 20 °C. Autres. Au moins – 70 °C. Tube non mouillable avec bouchon à vis. Capacité adaptée au volume du plasma. Au moins – 20 °C (< 15 jours). < – 20 °C. Conservation des échantillons congelés À la date du 01/07/2018, données disponibles pour les examens suivants : TP, TCA, fibrinogène, D dimères, activités anti-Xa HNF et anti-Xa HBPM. En cours de révision pour les autres examens. Transport d’échantillon congelé Carboglace. Il est recommandé de s’assurer de la conformité du transport et du matériel à la réception. Décongélation Rapide à + 37 °C au bain-marie avec une immersion complète de l’aliquote et un temps de décongélation adapté au volume de plasma de l’aliquote. Glace ou accumulateur de froid (plaque eutectique). Il est recommandé de s’assurer de la conformité du transport et du matériel à la réception. Température ambiante, fraîche ou réfrigérée. Température ambiante. Étuve, Micro-ondes. >+ 39 °C. 222 Hémostase et coagulation Fiche 13.2 Stabilité des paramètres d’hémostase générale et délais de réalisation des analyses. Sang total et plasma frais Mise à jour mai 2017 Les délais en sang total correspondent au délai à partir du prélèvement. Les délais des plasmas correspondent à des échantillons centrifugés dans les deux heures suivant le prélèvement. Conservation en tube primaire bouché. • T°C ambiante : + 15- + 25 °C (d’après la Pharmacopée européenne). Paramètre • T°C réfrigérée : + 2- + 8 °C (d’après la Pharmacopée européenne). • Entre + 8 et + 15 °C : Absence de données. En l’absence de données suffisantes, le GFHT ne se prononce pas sur la conformité de conditions de conservation non mentionnées dans le tableau. Lien vers Recommandations texte long GFHT délai de réalisation : http://site.geht.org/actu/ recommandations-preana-2017/ SANG TOTAL et PLASMA FRAIS Recommandé Acceptable Non conforme TP/INR (demande seule en attente des recommandations pour les dosages des facteurs de la voie exogène) Sang total et plasma : jusqu’à 24 h à T°C ambiante. Sang total et plasma : - jusqu’à 4 h à T°C réfrigérée ; - jusqu’à 2 h à T°C comprise entre + 25 °C et + 30 °C. Sang total et plasma : - au-delà de 24 h à T°C ambiante ; - au-delà de 4 h à T°C réfrigérée ; - au-delà de 2 h à T°C comprise entre + 25 °C et + 30 °C ; - T°C > + 30 °C ; - conservation sur glace. Fibrinogène Sang total et plasma : jusqu’à 24 h, à T°C ambiante. Sang total : jusqu’à 24 h, entre + 4 °C et + 30 °C. Plasma: jusqu’à 24 h, entre + 4 °C et + 25 °C. Sang total et plasma : - au-delà de 24 h, quelle que soit la T°C de conservation ; - conservation sur glace. D-dimères Sang total : jusqu’à 24 h à T°C ambiante. Plasma : données bibliographiques insuffisantes, se référer aux fiches produits fournisseurs. Sang total : jusqu’à 24 h à T°C entre + 4 °C et + 8 °C. Sang total : - au-delà de 24 h quelle que soit la température de conservation ; - < + 4 °C ou > + 25 °C ; - conservation sur glace. Chapitre 13. Annexes Paramètre SANG TOTAL et PLASMA FRAIS Recommandé TCA sans HNF Acceptable Sang total (si dosage des facteurs de la voie endogène) : jusqu’à 4 h à T°C ambiante. Sang total (sans dosage des facteurs de la voie endogène) : jusqu’à 6 h, à T°C ambiante. Plasma (si dosage des facteurs de la voie endogène) : jusqu’à 4 h à T°C ambiante, si centrifugation dans les 2 heures. Plasma (sans dosage des facteurs de la voie endogène) : jusqu’à 8 h à T°C ambiante, si centrifugation dans les 2 heures. TCA avec HNF et/ou Activité anti-Xa HNF 223 Sang total sur tube citraté : jusqu’à 2 heures après le prélèvement, à T°C ambiante. Non conforme Sang total : - au-delà de 4 h à T°C ambiante si dosage des facteurs de la voie endogène ; - au-delà de 6 h à T°C ambiante sans dosage des facteurs de la voie endogène ; - conservation sur glace ou à température réfrigérée. Plasma (sans dosage des facteurs de la voie endogène) : jusqu’à 8 h à T°C réfrigérée. Plasma : - au-delà de 4 h à T°C ambiante si dosage des facteurs de la voie endogène ; - au-delà de 8 h à T°C ambiante ou réfrigérée sans dosage des facteurs de la voie endogène. Tube citraté : Sang total : > 2 h après le prélèvement si échantillon conservé à T°C ambiante. Plasma sur tube citraté : jusqu’à 4 h après le prélèvement, si centrifugation dans l’heure, plasma décanté ou non, conservation à T°C refrigérée ou ambiante (données insuffisantes si la centrifugation n’est pas réalisée dans l’heure suivant le prélèvement). Sang total ou plasma sur tube CTAD : jusqu’à 6 h après le prélèvement, à T°C ambiante. Activité anti-Xa HBPM Sang total ou plasma sur tube CTAD : > 6 h après le prélèvement, à T°C ambiante. Sang total et plasma : jusqu’à 6 h à T°C ambiante (données insuffisantes au-delà de 6 h). TP : Taux de prothrombine. INR : International normalized ratio. TCA : Temps de céphaline avec activateur. HNF : Héparine non fractionnée. HBPM : Héparine de bas poids moléculaire. CTAD : Citrate théophylline adénosine dipyridamole. 224 Hémostase et coagulation Fiche 13.3 Stabilité des paramètres d’hémostase générale et délais de réalisation des analyses. Plasma décanté et congelé En l’absence de données suffisantes, le GFHT ne se prononce pas sur la conformité de conditions de conservation non mentionnées dans le tableau. Paramètre Lien vers Recommandations texte long GFHT délai de réalisation : http://site.geht.org/actu/ recommandations-preana-2017/. PLASMA DÉCANTÉ et CONGELÉ Recommandé Acceptable Non conforme Pas de données ou données insuffisantes Décantation dans les 4 h après le prélèvement : - jusqu’à 4 semaines à T°C ≤ – 20 °C ; - jusqu’à 3 ans à T°C ≤ – 70 °C. Conservation à une T°C > – 20 °C. Conservation au-delà de 4 semaines à – 20 °C ≤ T°C < – 70 °C. Au-delà de 3 ans à T°C < – 70 °C. TP INR (demande TP seule en attente des recommandations pour les dosages des facteurs de la voie exogène) Pas de congélation. Fibrinogène Jusqu’à 24 mois à T°C ≤ – 20 °C et/ou ≤ – 70 °C. Conservation à une T°C > – 20 °C. Au-delà de 24 mois à T°C < – 20 °C et/ ou < – 70 °C. D-dimères Jusqu’à 24 mois à T°C ≤– 20 °C. Jusqu’à 36 mois à T°C ≤ – 70 °C. Conservation à une T°C > – 20 °C. Au-delà de 24 mois à des T°C comprises entre – 20 °C < T°C < – 70 °C. Au-delà de 36 mois à T°C < – 70 °C. TCA sans HNF Pas de congélation. Conservation à une T°C > – 20 °C. Conservation au-delà de 12 mois à – 20 °C ≤ T°C < – 70 °C. Au-delà de 2 ans à T°C < à – 70 °C. Décantation dans les 4 h après le prélèvement : - jusqu’à 12 mois à T°C ≤ – 20 °C ; - jusqu’à 2 ans à T°C ≤ - 70 °C. Chapitre 13. Annexes Paramètre 225 PLASMA DÉCANTÉ et CONGELÉ Recommandé Acceptable Non conforme Pas de données ou données insuffisantes TCA avec HNF Pas de congélation. Centrifugation dans l’heure qui suit le prélèvement du tube citraté et décantation dans les 4 h après le prélèvement. Jusqu’à 2 semaines à T°C ≤ – 20 °C. Conservation à une T°C > – 20 °C. Au-delà de 2 semaines à T°C < – 20 °C. Conservation du plasma congelé à partir des tubes CTAD. Activité anti-Xa HNF Pas de congélation. Centrifugation dans l’heure qui suit le prélèvement du tube citrate. Jusqu’à 1 semaine à T°C ≤ à – 70 °C. Conservation à une T°C > – 20 °C. Au-delà d’une semaine à T°C < – 70 °C. Conservation du plasma congelé à partir des tubes CTAD. Activité anti-Xa HBPM Pas de congélation. Plasma décanté et congelé dans les 4 h après le prélèvement : - jusqu’à 24 h à T°C ≤ - 20 °C ; - jusqu’à 1 semaine à T°C ≤ – 70 °C. Conservation à une T°C > – 20 °C. Au-delà de 24 h à des T°C inférieure à – 20 °C. Au-delà d’une semaine à T°C < – 70 °C. TP : Taux de prothrombine. INR : International normalized ratio. TCA : Temps de céphaline avec activateur. HNF : Héparine non fractionnée. HBPM : Héparine de bas poids moléculaire. CTAD : Citrate théophylline adénosine dipyridamole. Chapitre 14 Groupes sanguins érythrocytaires Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Fiche 14.1 Le groupage sanguin ABO-RH1 (RhD) Code NABM 1140 Signification biologique du paramètre Le polymorphisme érythrocytaire est immunogène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la grossesse et pour certains groupes, à la transplantation incompatible. • Une transfusion incompatible peut aboutir, a minima, à une inefficacité transfusionnelle, au pire au décès du patient. Ainsi, les anticorps des différents systèmes dictent les règles de compatibilité transfusionnelle qui ont pour objectif d’éviter un conflit et/ou de prévenir une allo-immunisation. Parmi les différents systèmes de groupes sanguins, deux sont considérés comme majeurs. Le premier est le système ABO dont les anticorps, naturels et réguliers, représentent un danger dès la première transfusion incompatible qui peut aboutir à une hémolyse intravasculaire aiguë. Le second est système Rhésus (RH) et notamment l’antigène D (RH1) qui est le plus immunogène des antigènes de groupes sanguins et dont les anticorps, immuns et irréguliers, peuvent aboutir à une hémolyse intratissulaire massive. • Les anticorps de groupes sanguins s’opposent aussi à une grossesse incompatible. Si les anticorps du système ABO peuvent être responsables d’une maladie hémolytique néonatale souvent modérée, les anticorps anti-D peuvent être responsables de maladie hémolytique fœtale et néonatale sévères avec parfois mort in utero. • Du fait d’une distribution extra-érythroïde (expression endothéliale), les antigènes du système ABO s’opposent également à la transplantation incompatible qui peut aboutir à un rejet aigu. • Enfin, si l’incompatibilité ABO ne s’oppose pas à la greffe de cellules souches hématopoïétiques, elle peut être responsable d’évènements immunohémolytiques au moment de l’infusion du greffon ou dans les suites immédiates, qui imposent une prise en charge adaptée. On conçoit donc l’intérêt de connaître de façon indissociable le groupe ABO-RH1 d’un patient dans ces diverses situations. Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est de connaître le résultat du groupe ABO-RH1 d’un patient afin d’assurer la sécurité immuno-hémolytique des transfusions, greffes et transplantations et un suivi immunohématologique de la grossesse. • En contexte transfusionnel, la disponibilité d’un groupe ABO-RH1 valide du receveur est obligatoire. Elle permet d’assurer les règles de compatibilité lors de la sélection des concentrés de globules rouges et de plaquettes ainsi que du plasma. Il est toujours associé au phénotype RH (RH2, RH3, RH4, RH5) et KEL1. • En contexte obstétrical, la connaissance du groupe RH1 (RhD) de la mère permet, chez les femmes RhD négatif (RH:-1) de mettre en œuvre un calendrier de suivi adéquat de la grossesse et, lorsque le RH1 (RhD) de l’enfant (fœtus et nouveau-né) est connu, d’indiquer une immunoprophylaxie anti-D ou de diagnostiquer une maladie hémolytique fœtale et/ou néonatale par anti-D. La détermination du groupe RH1 (RhD) du fœtus se fait par génotypage fœtal à partir de l’ADN circulant dans le plasma maternel. La connaissance du groupe ABO de la mère et du nouveau-né permet de diagnostiquer une maladie hémolytique néo natale par incompatibilité fœtomaternelle ABO. • En contexte de transplantation d’organe, la connaissance du groupe ABO-RH1 du receveur et du greffon permet de sélectionner le greffon adéquat et, dans les transplantations rénales incompatibles majeures, de poser l’indication d’un titrage des anticorps ABO afin d’envisager une éventuelle stratégie de réduction de ces anticorps. • En contexte de greffe de cellules souches hématopoïétiques, la connaissance du groupe ABORH1 du receveur et du greffon permet d’évaluer les risques hémolytiques en cas d’incompatibilité ABO majeure ou mineure. Chapitre 14. Groupes sanguins érythrocytaires • Enfin, en cas de recherche d’agglutinines irrégulières (RAI) positive, le groupe ABO-RH1 contribue à la validation d’un anti-RH1. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans toutes ces situations, le groupage ABORH1 demeure une analyse de première intention qui est incontournable et non substituable. Sang total sur EDTA. Test à réaliser si possible à distance d’un épisode transfusionnel (3 mois). Compte tenu de la criticité de l’analyse et des risques liés à l’identitovigilance, un groupe ABO-RH1 valide est obtenu après deux déterminations sur deux prélèvements réellement différents. Compte tenu de l’immaturité des antigènes et des anticorps, un groupe ABO de nouveau-né ne peut être validé avant l’âge de 6 mois. Température ambiante. Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). La détection des groupes sanguins repose sur des méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque). Une réalisation de groupage ABO repose sur 2 épreuves qui doivent être cohérentes entre elles : une épreuve globulaire en testant les hématies avec des anticorps monoclonaux (anti-A, anti-B et anti-A,B) et une épreuve plasmatique en testant le plasma vis-à-vis d’hématies test A1 et B. Une réalisation de groupage RH1 consiste à tester les hématies vis-à-vis d’un anti-D monoclonal et du réactif témoin correspondant qui doit donner une réaction négative. Une détermination à partir d’un prélèvement repose sur une réalisation si elle est automatisée et deux réalisations par deux opérateurs si elle est manuelle. Un résultat valide repose sur deux déterminations à partir de deux prélèvements différents. Méthodes manuelles et automatisées. Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test 231 Il n’y a pas de valeur de référence pour ces caractéristiques inhérentes à l’individu. La qualité du résultat dépend de celle des hématies et anticorps utilisés. Le principal risque lors de la détermination de groupes sanguins est une inversion de patients. L’identito-vigilance est majeure et renforcée par la nécessité de réaliser deux épreuves différentes. La présence d’anticorps anti-érythrocytaires peut fausser les résultats (auto- ou allo-immunisation). 232 Immuno hématologie Fiche 14.2 Le phénotypage RH-KEL1 (Rh-K) Code NABM 1145 Signification biologique du paramètre Le polymorphisme érythrocytaire est immunogène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la grossesse et, pour certains groupes, à la transplantation incompatible. À côté des antigènes du système ABO et de l’antigène RH1 du système RH, d’autres antigènes peuvent être la cible d’anticorps impliqués dans des réactions transfusionnelles ou des incompatibilités fœtomaternelles plus ou moins sévères. Parmi eux, on considère ceux qui sont explorés par le phénotype RH-KEL1 qui regroupe les antigènes RH2 (C), RH3 (E), RH4 (c) et RH5 (e) du système RH et l’antigène KEL1 (K) du système KEL. Les anticorps correspondants, qui peuvent apparaître à la suite d’une stimulation interhumaine (transfusion ou grossesse), sont dits immuns et irréguliers. La connaissance du phénotype RH-KEL1 des patients permet de sélectionner les produits sanguins adéquats en vue de prévenir une alloimmunisation ou un conflit et contribue à valider la spécificité d’un anticorps lors de l’étape d’identification d’une recherche d’agglutinines irrégulières (RAI). On conçoit donc l’intérêt de connaître le phénotype RH-KEL1 d’un patient dans ces diverses situations. d’assurer la sécurité immuno-hémolytique des transfusions et un suivi immunohématologique de la grossesse. Cette analyse est utile dans différents cas de figure. • En contexte transfusionnel, le phénotype RHKEL1 est obligatoire chez tout receveur afin d’avoir un résultat fiable avant toute transfusion et d’assurer les règles de compatibilité lors de la sélection des concentrés de globules rouges en vue d’éviter un conflit si l’anticorps est présent ou de prévenir une allo-immunisation chez certains patients pour préserver un avenir obstétrical chez la femme avant la ménopause ou un avenir transfusionnel chez le polytransfusé potentiel (hémopathies, hémoglobinopathies). • En contexte obstétrical, la réalisation du phénotype RH-KEL1 est obligatoire. Outre sa contribution au diagnostic d’une éventuelle maladie hémolytique fœtale ou néonatale impliquant les anticorps correspondants, il permettra d’anticiper la sélection des produits sanguins pour la mère ou l’enfant si nécessaire. • Enfin en cas de RAI positive, le phénotype RHKEL1 est obligatoire et contribue à la validation d’anticorps dirigés contre les différents antigènes qu’il regroupe. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’objectif de l’analyse est de connaître le résultat du phénotype RH-KEL1 d’un patient afin Dans toutes ces situations, le phénotype RHKEL1 demeure une analyse de première intention qui est incontournable et non substituable. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Sang total sur EDTA. À réaliser si possible à distance d’un épisode transfusionnel (3 mois). Compte tenu de la criticité de l’analyse et des risques liés à l’identitovigilance, un phénotype RH-KEL1 valide est obtenu après deux déterminations sur deux prélèvements réellement différents. Température ambiante. Chapitre 14. Groupes sanguins érythrocytaires Nature du prélèvement Sang total sur EDTA. Mode de conservation Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). Principe méthodologique Type de méthode Type de test Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque). Une réalisation de phénotype RH-KEL1 consiste à tester les hématies vis-à-vis d’anti-RH2, -RH3, -RH4, -RH5, -KEL1 monoclonaux et du réactif témoin correspondant qui doit donner une réaction négative. Une détermination à partir d’un prélèvement repose sur une réalisation si elle est automatisée et deux réalisations par deux opérateurs si elle est manuelle. Un résultat valide repose sur deux déterminations à partir de deux prélèvements différents. Méthodes manuelles et automatisées. Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test 233 Il n’y a pas de valeur de référence pour ces caractéristiques inhérentes à l’individu. La qualité du résultat dépend de celle des hématies et anticorps utilisés. Le principal risque lors de la détermination de groupes sanguins est une inversion de patients. L’identito-vigilance est majeure et renforcée par la nécessité de réaliser deux épreuves différentes. La présence d’anticorps anti-érythrocytaires peut fausser les résultats (auto- ou allo-immunisation). 234 Immuno hématologie Fiche 14.3 Le phénotypage étendu Code NABM 1146 Signification biologique du paramètre Le polymorphisme érythrocytaire est immunogène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la grossesse et, pour certains groupes, à la transplantation incompatible. À côté des antigènes explorés par le groupage ABO-RH1 et le phénotype RH-KEL1, d’autres antigènes peuvent être la cible d’anticorps impliqués dans des réactions transfusionnelles ou des incompatibilités fœtomaternelles plus ou moins sévères. Parmi eux, on considère ceux qui sont explorés par le phénotype étendu qui regroupe les antigènes autres que ceux explorés par le groupage ABO-RH1 et RHKEL1, et notamment les antigènes communs des systèmes Duffy (FY) (Fya (FY1), Fyb (FY2)), Kidd (JK) (Jka (JK1), Jkb (JK2)) et MNS (M (MNS1), N (MNS2), S (MNS3) et s (MNS4)). Les anticorps correspondants qui peuvent apparaître à la suite d’une stimulation interhumaine (transfusion ou grossesse) sont dits immuns et irréguliers. La connaissance du phénotype étendu des patients permettra de sélectionner les produits sanguins adéquats en vue de prévenir une alloimmunisation ou un conflit et contribuera à valider la spécificité d’un anticorps lors de l’étape d’identification d’une recherche d’agglutinines irrégulières (RAI). On conçoit donc l’intérêt de connaître le phénotype étendu d’un patient dans ces diverses situations. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription la sécurité immuno-hémolytique des transfusions et un suivi immunohématologique de la grossesse. Cette analyse est utile : • en contexte transfusionnel, la réalisation d’un phénotype étendu est indiquée chez tout receveur polytransfusé potentiel (hémopathies, hémoglobinopathies) afin d’avoir un résultat fiable avant toute transfusion et chez tout receveur présentant un anticorps dirigé contre un ou plusieurs antigènes autres que ceux explorés par le groupage ABO-RH1 et le phénotype RH-KEL1. L’objectif est d’assurer les règles de compatibilité lors de la sélection des concentrés de globules rouges en vue d’éviter un conflit si l’anticorps est présent ou de prévenir une allo-immunisation supplémentaire vis-à-vis d’autres antigènes ; • en contexte obstétrical, la réalisation du phénotype étendu, outre sa contribution au diagnostic d’une éventuelle maladie hémolytique fœtale ou néonatale impliquant les anticorps correspondants, permet d’anticiper la sélection des produits sanguins pour la mère ou l’enfant si nécessaire ; • enfin en cas de RAI positive, le phénotype étendu contribue à la validation d’anticorps dirigés contre les différents antigènes qu’il regroupe. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans toutes ces situations, le phénotype étendu demeure une analyse de première intention qui est incontournable et non substituable. L’objectif de l’analyse est de connaître le résultat du phénotype étendu d’un patient afin d’assurer Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Sang total sur EDTA. Examen à réaliser si possible à distance d’un épisode transfusionnel (3 mois). Compte tenu de la criticité de l’analyse et des risques liés à l’identitovigilance, un phénotype étendu valide est obtenu après deux déterminations sur deux prélèvements réellement différents. Température ambiante. Chapitre 14. Groupes sanguins érythrocytaires Nature du prélèvement Sang total sur EDTA. Mode de conservation Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). Principe méthodologique Type de méthode Type de test Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque). Une réalisation de phénotype étendu consiste à tester les hématies vis-à-vis d’anti-FY1, -FY2, -JK1, -JK2, -MNS3 et MNS4 et du réactif témoin correspondant qui doit donner une réaction négative. Une détermination à partir d’un prélèvement repose sur une réalisation si elle est automatisée et deux réalisations par deux opérateurs si elle est manuelle. Un résultat valide repose sur deux déterminations à partir de deux prélèvements différents. Méthodes manuelles et automatisées. Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Il n’y a pas de valeur de référence pour ces caractéristiques inhérentes à l’individu. La qualité du résultat dépend de celle des hématies et anticorps utilisés. Le principal risque lors de la détermination de groupes sanguins est une inversion de patients. L’identito-vigilance est majeure et renforcée par la nécessité de réaliser deux épreuves différentes. La présence d’anticorps anti-érythrocytaires peut fausser les résultats (auto- ou allo-immunisation). 235 236 Immuno hématologie Fiche 14.4 Groupes sanguins en biologie moléculaire Code RIHN E201 Signification biologique du paramètre Le polymorphisme érythrocytaire est immunogène. À ce titre, il s’oppose à la transfusion, à la grossesse et, pour certains polymorphismes, à la transplantation incompatible. L’ensemble des antigènes de groupes sanguins (GS) peut être la cible d’anticorps impliqués dans des réactions transfusionnelles ou des incompatibilités fœto-maternelles plus ou moins sévères. Un grand nombre de GS peuvent être explorés par les techniques sérologiques avec l’utilisation d’anticorps spécifiquement dirigés contre les antigènes de GS, permettant d’obtenir un phénotype. La détermination du phénotype des patients permet de sélectionner les produits sanguins adéquats en vue de prévenir une allo-immunisation ou un conflit et contribue à valider la spécificité d’un anticorps lors de l’étape d’identification d’une agglutinine irrégulière (RAI). Cependant pour certains GS, pour lesquels les situations d’alloimmunisation sont plus rares, il n’existe pas de réactifs commerciaux. La connaissance des bases moléculaires du polymorphisme de la plupart des GS permet d’obtenir un génotype dont on peut déduire le phénotype. De plus, pour certains GS, et notamment le système RH, il existe des variants pouvant être à l’origine de situations d’incompatibilité. Deux catégories majeures de variants sont décrites et caractérisées sur le plan moléculaire : • les antigènes partiels dépourvus de certains épitopes immunogènes : les porteurs exposés à l’antigène complet via la transfusion ou la grossesse peuvent produire un allo-anticorps contre les épitopes non exprimés ; • les antigènes affaiblis, caractérisés par une diminution de la réactivité sérologique, mais sans risque d’immunisation pour le porteur. Les techniques sérologiques d’agglutination ne sont pas suffisamment discriminantes pour caractériser ces variants, le recours à la biologie moléculaire est indispensable. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est de déduire le phénotype du génotype dans les situations où les techniques sérologiques ne sont pas réalisables ou insuffisamment sensibles. Comme pour les techniques sérologiques de détermination des GS, la biologie moléculaire a pour but d’assurer la sécurité immunohémolytique des transfusions et un suivi immunohématologique de la grossesse. Ces analyses sont réalisées chaque fois qu’il est nécessaire de déterminer un groupe sanguin (cf. fiches 14.1, 14.2 et 14.3) : • en contexte transfusionnel récent (< 3 mois) : le phénotype ne peut pas être réalisé par sérologie du fait de la présence concomitante de globules rouges autologues et transfusés. Les produits transfusés étant déplétés en leucocytes, le prélèvement réalisé chez un individu transfusé ne contient que ses propres leucocytes, et donc uniquement son ADN ; • dans le cas d’un test indirect à l’antiglobuline positif de type IgG : la plupart des réactifs sérologiques sont des IgG. Si les globules rouges d’un individu sont saturés par des auto-anticorps, notamment au cours des anémies hémolytiques auto-immunes, la détermination du phénotype par sérologie donne des faux positifs ; • en l’absence de réactifs commerciaux : pour certains groupes sanguins rares ou pour des groupes sanguins générant peu fréquemment des alloanticorps, il n’y a pas de réactifs commerciaux. La biologie moléculaire est alors utilisée lorsque les bases moléculaires sont connues ; • pour la caractérisation des antigènes variants/ partiels pour lesquels le risque et les conséquences de l’allo-immunisation sont majeurs et une prévention possible : – en contexte obstétrical face à un affaiblissement d’expression d’un antigène RH, dont on ne peut déterminer s’il s’agit d’un antigène Chapitre 14. Groupes sanguins érythrocytaires partiel (qui peut aussi avoir une expression affaiblie). Une porteuse d’un antigène RH1 partiel (D partiel) est prise en charge sur le plan immuno-hématologique comme une femme RH:-1 (D négatif), – chez les patients drépanocytaires présentant souvent des antigènes RH partiels avec des conséquences d’allo-immunisation sévères, – lorsqu’un individu produit un anticorps visà-vis d’un antigène qu’il exprime, sans que les Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test techniques sérologiques d’absorption ne permettent de conclure à son caractère autologue. La mise en évidence d’un antigène partiel est en faveur d’un allo-anticorps. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le génotype est une analyse de première intention incontournable et non substituable, mais seulement dans les cas mentionnés ci-dessus. Sang total sur EDTA. Sang hépariné contre-indiqué (inhibiteur de PCR). Quantité minimale de globules blancs afin de disposer d’assez d’ADN. Température ambiante. Réfrigération pendant 1 mois (tests de robustesse à effectuer). Méthodes de biologie moléculaire où le phénotype est déduit du génotype : - technologies de PCR en temps réel par sondes d’hydrolyse avec discrimination allélique en point final ; - technologies de PCR multiplex : élongation des polymorphismes (e-map) ou PCR-SSO (Luminex). Séquençage après amplification par PCR de fragments d’ADN génomique ou d’ARN. Méthodes manuelles et automatisées. Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test 237 Il n’y a pas de valeur de référence pour ces caractéristiques inhérentes à l’individu. La qualité du résultat dépend de celle des hématies et anticorps utilisés. Le principal risque lors de la détermination de groupes sanguins est une inversion de patients. L’identito-vigilance est majeure mais moins prégnante dans ces tests réalisés dans des conditions spécifiques et pour des patients particuliers. 238 Immuno hématologie Bibliographie du chapitre 14 FICHE 14.1 – Le groupage sanguin ABO-RH1 (RhD) Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375 texte n° 80. Clavier B. Le groupage sanguin en question : actualité et perspectives. Revue française des Laboratoires 2012;42:43–8. Avis n° 2013.0041/AC/SEAP du 10 avril 2013 du collège de la HAS relatif au projet de référentiel proposé par la CNAM des travailleurs salariés le 22 février 2013 et portant sur le groupe sanguin et la recherche d’anticorps anti-érythrocytaires. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. FICHE 14.2 – Le phénotypage RH-KEL1 (Rh-K) Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375 texte n° 80. Clavier B. Le groupage sanguin en question : actualité et perspectives. Revue française des Laboratoires 2012;42:43–8. Avis n° 2013.0041/AC/SEAP du 10 avril 2013 du collège de la HAS relatif au projet de référentiel proposé par la CNAM des travailleurs salariés le 22 février 2013 et portant sur le groupe sanguin et la recherche d’anticorps anti-érythrocytaires. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. FICHE 14.3 – Le phénotypage étendu Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375 texte n° 80. Avis n° 2013.0041/AC/SEAP du 10 avril 2013 du collège de la HAS relatif au projet de référentiel proposé par la CNAM des travailleurs salariés le 22 février 2013 et portant sur le groupe sanguin et la recherche d’anticorps anti-érythrocytaires. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. FICHE 14.4 – Groupes sanguins en biologie moléculaire Yip SP. Sequence variation at the human ABO locus. Ann Hum Genet 2002;66:1–27. Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375 texte n° 80. Prager M. Molecular genetic blood group typing by the use of PCR-SSP technique. Transfusion 2007; 47(1 Suppl):54S–9S. Chapitre 15 Anticorps anti-érythrocytaires Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 240 Immunohématologie Fiche 15.1 Recherche d’agglutinines irrégulières (RAI) Codes NABM 1141, 1131, 1149, 1150 Signification biologique du paramètre La détection des anticorps anti-érythrocytaires est un élément majeur de la sécurité immunohémolytique des transfusions et du suivi de grossesse. En contexte transfusionnel, les anticorps présents dictent les règles de sélection des concentrés de globules rouges (CGR) afin d’éviter un conflit. En contexte obstétrical, les anticorps présents dictent les modalités de suivi de la femme enceinte et l’évaluation de leur pouvoir hémolytique pour le fœtus et le nouveau-né. Deux analyses permettent de détecter ces anticorps : • les anticorps du système ABO sont détectés par le biais du groupage ABO ; • les anticorps autres que ABO sont détectés par la recherche d’agglutinines irrégulières (RAI). La RAI a pour objectif de dépister et d’identifier les anticorps dirigés contres les antigènes autres que ABO en testant le sérum ou le plasma du patient vis-à-vis d’hématies humaines non poolées et spécifiquement sélectionnées sur leur phénotype. Elle comporte deux étapes, le dépistage et l’identification. Si le dépistage est positif, l’identification est obligatoire. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est d’assurer la sécurité immuno-hémolytique des transfusions et un suivi immunohématologique de la grossesse. • En contexte transfusionnel, compte tenu de l’évanescence des anticorps, la réglementation et les recommandations actuelles prévoient de disposer avant chaque transfusion du résultat d’une RAI réalisée sur un échantillon de moins de 72 h. Dans certains cas, une extension à 21 jours peut être acceptée, sur prescription et sous réserve d’une absence de risque d’alloimmunisation (transfusion ou accouchement) dans les 6 mois précédents. Par ailleurs, l’hémovigilance impose de détecter une allo-immunisation post-transfusionnelle par la pratique d’une RAI entre 1 mois et 3 mois après une transfusion. Enfin, il faut rappeler l’importance, pour la sélection des CGR, de la prise en compte des anticorps connus même s’ils ne sont plus détectés par la RAI le jour de la transfusion (« un anticorps un jour, un anticorps toujours »). • En contexte obstétrical, la réalisation d’une RAI est obligatoire et a un triple objectif : – dépister (à 4 reprises chez la femme RH:-1 et à 2 reprises chez la femme RH1) et suivre une allo-immunisation susceptible d’engendrer une maladie hémolytique fœtale/néonatale, – identifier, chez les femmes RhD négatif, celles qui doivent bénéficier d’une immunoprophylaxie (femmes RH:-1, non immunisée vis-à-vis de RH1, porteuse d’un enfant RH1), – disposer d’un résultat de RAI au moment de l’accouchement afin d’anticiper la sélection des CGR si nécessaire pour la mère ou l’enfant. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans toutes ces situations, la RAI demeure une analyse de première intention qui est incontournable et non substituable. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires Plasma ou sérum (tube EDTA ou tube sec). Prélèvement inférieur ou égal à 3 jours. Extension possible à 21 jours en absence d’allo-immunisation dans les 6 mois précédents. Chez le fœtus, RAI sur prélèvement maternel de moins de 3 jours. Chez nouveau-né avant 4 mois, RAI sur prélèvement maternel réalisé entre 72 h avant l’accouchement et 4 mois après. Chez le nouveau-né après 4 mois, idem adulte. Température ambiante. Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). Principes méthodologiques Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque). La technique est un test indirect à l’antiglobuline polyvalente ou anti-IgG dont la sensibilité permet la détection, au minimum, d’un anti-RH1 < 20 ng/mL. Le recours aux enzymes protéolytiques peut être utile en cas de mélange d’anticorps, voire obligatoire en cas d’exploration d’une réaction transfusionnelle immunohémolytique. Type de méthode Méthodes manuelles et automatisées. Type de test Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Ces anticorps sont normalement absents. Certains anticorps irréguliers dirigés contre des groupes rares sont plus difficiles à mettre en évidence. 241 242 Immunohématologie Fiche 15.2 Dosage pondéral des agglutinines irrégulières (RAI) dans le cadre du suivi de grossesse Code NABM 1150 Signification biologique du paramètre Les conséquences de la rencontre in vivo entre antigènes érythrocytaires et anticorps sont variables et dépendent de nombreux paramètres liés aux antigènes, aux anticorps et à la réactivité du système phagocytaire (ou réticulo-endothélial) qui est propre à l’individu. Ainsi, l’évaluation de sa signification clinique d’un anticorps identifié chez un patient ou un donneur est un élément fondamental. L’un des éléments d’appréciation du risque hémolytique d’un anticorps est son taux qui peut être estimé de façon semi-quantitative par le titrage ou par le dosage pondéral. En contexte d’incompatibilité fœto-maternelle, le dosage pondéral permet d’exprimer la concentration en µg/mL ou U.CHP/mL (Centre national de référence en hémobiologie périnatale, CNRHP) ou UI/mL d’anticorps de nature IgG, en particulier les anticorps du système RH. Cette technique ne dépend pas de l’affinité de l’anticorps qui est évaluée par le titrage. L’association titrage et dosage pondéral permet une évaluation complémentaire du risque hémolytique fœtal d’un d’anticorps. L’atteinte de seuils dangereux impose de rechercher une souffrance fœtale pouvant, en fonction Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation de l’âge de la grossesse, indiquer une transfusion in utero ou un accouchement prématuré avec une prise en charge transfusionnelle du nouveau-né. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le dosage pondéral d’un anticorps anti-érythrocytaire chez une femme enceinte est un élément fondamental d’appréciation du risque immunohémolytique fœtal et de la surveillance de l’alloimmunisation au cours de la grossesse. Il concerne les anticorps du système RH et notamment les anticorps de spécificité anti-RH1 (anti-D), antiRH2 (anti-C) et anti-RH4 (anti-c). Ces alloanticorps susceptibles d’entraîner une maladie hémolytique fœtale et/ou néonatale doivent être dosés dès que leur titre atteint un seuil critique, et ce dès la 12e semaine d’aménorrhée. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit d’une analyse de deuxième intention. Elle doit être mise en œuvre lorsque le titrage atteint un seuil dit critique (par exemple 16 pour l’antiRH1 ou 4 pour l’anti-RH4). Elle doit être répétée au même rythme que le titrage de ces anticorps. Plasma ou sérum, tube EDTA ou tube sec. Prélèvement inférieur ou égal à 3 jours Prélèvement précédent (n-1) congelé à – 20 °C. Température ambiante. Réfrigération à + 4 °C pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). Principes méthodologiques Type de méthode Type de test Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires En vue d’une comparaison de résultats dans le suivi, les dosages pondéraux pour une femme enceinte donnée doivent tous être réalisés dans le même laboratoire. Il s’agit d’une technique d’agglutination automatisée qui est basée sur un dosage comparatif par rapport à un standard international anti-RH1 et de ses dilutions de concentration connue. Deux variantes techniques sont mises en œuvre : - la variante « 2 temps » où l’ensemble des sous-classes d’IgG anti-RH est dosé ; - la variante « 1 temps » dans laquelle les anticorps anti-RH de sous-classe IgG3 sont détruits par un contact direct avec des enzymes. Elle permet l’évaluation des anticorps de haute affinité dont la concentration apparente est souvent supérieure à celle obtenue dans la technique « 2 temps ». Le seuil dangereux est de 0,7 µg/mL pour les anti-RH1 et 3 µg/mL pour les anti-RH4. Méthode automatique. Mesure semi-quantitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). Tout dosage est effectué en parallèle : - d’un redosage de l’échantillon précédent conservé congelé à – 20 °C ; - d’un standard anti-RH1 et de ses dilutions dont les concentrations sont connues. EEQ Non. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test 243 Ces anticorps sont normalement absents. Les redosages pour le suivi de l’évolution des taux d’anticorps imposent des prélèvements permettant de stocker suffisamment d’échantillons. 244 Immunohématologie Fiche 15.3 Épreuve directe de compatibilité au laboratoire Code NABM 1152 Signification biologique du paramètre La détection des anticorps anti-érythrocytaires est un élément majeur de la sécurité immuno-hémolytique des transfusions. Les anticorps présents dictent les règles de sélection des concentrés de globules rouges (CGR) afin d’éviter un conflit, en évitant d’apporter les antigènes correspondant aux anticorps détectés chez le patient. Dans certaines situations, il convient de s’assurer que le CGR sélectionné est bien compatible avec le sérum/plasma du receveur par la pratique d’une épreuve de compatibilité au laboratoire. C’est une véritable RAI « personnalisée » où le panel de la RAI est remplacé par les hématies de la poche sélectionnée. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est d’assurer la sécurité immuno-hémolytique des transfusions. Elle est réalisée dans deux situations. • Chez un patient allo-immunisé avec une RAI positive ou avec simplement avec un anticorps connu dans son historique. Dans ces conditions, il convient de sélectionner un CGR dépourvu de l’antigène correspondant à l’anticorps, suivi d’une validation de cette sélection par la réalisation d’une épreuve de compatibilité au laboratoire en testant, Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principes méthodologiques Type de méthode dans les mêmes conditions techniques que la RAI, l’hématie de la poche vis-à-vis du sérum/plasma du receveur. L’obtention d’une réaction négative permet de déclarer l’unité « compatible » avec la mention de qualification « CGR compatibilisé ». Il convient de rappeler que cette analyse n’est pas indiquée en absence d’allo-immunisation. • Chez le patient drépanocytaire, même en absence d’allo-immunisation « apparente ». En effet, ces patients sont dans la majorité des cas originaires d’Afrique subsaharienne. Souvent, pour des raisons de compatibilité, des unités issues de donneurs de même origine sont nécessaires. Or la distribution préférentielle africaine de certains antigènes de groupes sanguins (RH10, RH20, Jsa, etc.) expose ces patients à une alloimmunisation qui n’est pas détectable par la RAI de routine, ces antigènes étant absents des panels utilisés. Aussi, afin de rattraper cette situation d’incompatibilité si nocive pour le drépanocytaire, une épreuve de compatibilité est réalisée même si la RAI est apparemment négative. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans toutes ces situations, l’épreuve de compatibilité demeure une analyse de première intention qui est incontournable et non substituable. Plasma ou sérum (tube EDTA ou tube sec). Prélèvement inférieur ou égal à 3 jours avec les mêmes exigences que pour la RAI. Température ambiante. Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). L’épreuve de compatibilité repose sur les mêmes méthodes que la RAI. Méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque). La technique est un test indirect à l’antiglobuline polyvalente ou anti-IgG dont la sensibilité permet la détection, au minimum, d’un anti-RH1 < 20 ng/mL. Méthodes manuelles et automatisées. Type de test Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Ces anticorps sont normalement absents. L’identification de certaines spécificités peut être délicate. La présence d’allo- ou d’auto-anticorps peut gêner le test (voir test d’adsorption). 245 246 Immunohématologie Fiche 15.4 Test direct à l’antiglobuline (TDA) Codes NABM 1153 et 1154 Signification biologique du paramètre La survenue d’un syndrome hémolytique impose de préciser les modalités de destruction des hématies. On définit classiquement des causes corpusculaires (anomalie de la membrane, des enzymes ou de l’hémoglobine) et extra corpusculaires (immunologiques, toxiques et mécaniques). La définition d’une cause immunologique ou non immunologique peut représenter une autre approche de l’exploration étiologique centrée sur la réalisation d’un test direct à l’antiglobuline en cas de présence de stigmates d’hémolyse. La positivité de ce test, en attestant la sensibilisation in vivo des hématies par des anticorps et/ou du complément, confirme l’origine immunologique d’une hémolyse. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de ce test est de détecter une sensibilisation in vivo des hématies par un anticorps et/ou le stigmate de son passage par la présence d’une fraction du complément (C3d). Il doit être indiqué devant tout syndrome hémolytique afin Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principes méthodologiques de préciser la cause (immunologique ou non) de l’hémolyse. Il permet ainsi de mettre en évidence une sensibilisation in vivo des hématies : • par un auto-anticorps lié à une anémie hémolytique auto-immune (AHAI) ; • par un allo-anticorps lié à une incompatibilité transfusionnelle ou une maladie hémolytique du nouveau-né par incompatibilité fœto-maternelle ; • par un hétéro anticorps au cours d’une anémie hémolytique médicamenteuse. • On parle aussi de « test de Coombs ». Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration En cas de survenue d’une hémolyse dans toutes ces situations pathologiques, le test direct à l’antiglobuline demeure une analyse de première intention qui est incontournable et non substituable. Si le TDA détecte la sensibilisation in vivo des hématies, il ne donne pas le nom de la spécificité de l’anticorps. C’est l’élution directe qui, pratiquée secondairement, permettra de définir l’anticorps coupable du conflit in vivo. Sang total sur EDTA. NA. Température ambiante. Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). Méthode immunologique qui repose sur l’utilisation d’antiglobulines humaines reconnaissant des marqueurs isotypiques humains d’immunoglobulines ou de fractions du complément. La fixation de l’antiglobuline sur ces marqueurs est révélée par une agglutination des hématies du patient sur support filtration ou en tube. On utilise classiquement de façon simultanée et séparée une anti-IgG et une anti-C3d complétées par un réactif témoin qui doit être négatif. Plus rarement, une anti-IgA est utilisée. Pour ce qui est des IgM, la détection de C3d atteste de son passage. Une image de double population est possible en contexte d’incident transfusionnel. Type de méthode Type de test Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires Méthodes manuelle et automatisée. Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Ce test est normalement négatif. Causes d’erreur, limites du test L’identification de certaines spécificités peut être délicate. La présence d’allo- ou d’auto-anticorps peut gêner le test (voir test d’adsorption). 247 248 Immunohématologie Fiche 15.5 Titrage des agglutinines froides Signification biologique du paramètre Les anémies hémolytiques auto-immunes (AHAI) sont réparties en AHAI « chaudes » et en AHAI « froides ». Dans les AHAI « froides », le test direct à l’antiglobuline (TDA) est classiquement de type complément exclusif, révélant l’implication d’une IgM fixant le complément. Les auto-anticorps froids réagissent plus fortement à + 4 °C qu’à des températures plus élevées. Dans les AHAI à auto-anticorps froids, c’est-à-dire présentant une réactivité supérieure aux basses températures vis-à-vis des hématies tests (+ 4 °C, + 22 °C, comparativement à + 37 °C), le titrage a un intérêt clinique. En effet, il permet de différencier les anticorps « froids » sans signification pathologique des anticorps pathologiques dont le titre dépasse 1/64 à + 4 °C, avec des titres souvent beaucoup plus élevés et une amplitude thermique importante (réactivité présente aussi à + 37 °C). La spécificité de l’agglu- Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique tinine froide peut aussi être explorée (anti-I ou anti-i), mais cette information n’a pas d’impact clinique. Le titrage des agglutinines froides est donc une analyse de l’exploration d’une hémolyse immunologique. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif du titrage des agglutinines froides est le diagnostic et le suivi d’une anémie hémolytique à auto-anticorps froids. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le titrage des agglutinines froides est une épreuve de seconde intention après réalisation du TDA (positif de type complément ou négatif) dans un contexte de survenue d’une hémolyse hors contexte transfusionnel et obstétrical. Prélèvement de 2 tubes secs de 7 mL de sang et de 1 tube de 7 mL sur EDTA. Le prélèvement doit être placé pendant 2 heures à + 37 °C dès son arrivée au laboratoire et décanté immédiatement à la sortie de l’étuve. Température ambiante. 48 heures. Le titrage est réalisé sur des hématies traitées à la papaïne et/ou natives. La technique classique décrite ici est celle réalisée en micotubes de verre avec lecture de l’agglutination sous microscope. Il s’agit de la technique de référence. Des techniques en gel filtration, plus simples de réalisation, ont aussi été validées. Une dilution géométrique de raison 2 du sérum est réalisée dans 10 tubes en verre, sous un volume de 0,5 mL. Une série de titrages est réalisée à + 4 °C et une autre à + 37 °C, en déposant 1 goutte d’hématies sélectionnées dans chaque tube. Les hématies sont de 3 catégories : des globules rouges d’adultes (exprimant l’antigène I), des globules rouges de nouveau-nés (exprimant uniquement l’antigène i), les propres globules rouges du patient (provenant du tube EDTA). Après 2 heures à + 4 °C et à + 37 °C, une goutte de chaque tube est déposée entre lame et lamelle et lue au microscope pour rechercher l’agglutination. Le résultat du titrage est rendu à + 4 °C et à + 37 °C. Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Ce test est normalement négatif. Causes d’erreur, limites du test L’identification de certaines spécificités peut être délicate. La présence d’allo- ou d’auto-anticorps peut gêner le test (voir test d’adsorption). 249 250 Immunohématologie Fiche 15.6 Épreuve d’adsorption d’anticorps anti-érythrocytaires Code NABM 1156 Signification biologique du paramètre Les anticorps anti-érythrocytaires peuvent être des auto-anticorps ou des allo-anticorps. Les auto-anticorps sont produits au cours des anémies hémolytiques auto-immunes. Ils peuvent aussi être présents sans pour autant induire une pathologie. Ils sont fréquemment dirigés contre des antigènes de fréquence élevée du globule rouge (système RH, Bande 3, Glycophorine A) de telle sorte que, lors de la recherche d’agglutinines irrégulières (RAI), ils réagissent avec toutes les hématies-tests. Les allo-anticorps anti-érythrocytaires sont produits au décours d’une transfusion phéno-incompatible ou pendant la grossesse. Leur détection est un élément majeur de la sécurité immuno-hémolytique des transfusions et du suivi de grossesses. En contexte transfusionnel, les anticorps présents dictent les règles de sélection des concentrés de globules rouges (CGR) afin d’éviter un conflit. En contexte obstétrical, les anticorps présents dictent les modalités de suivi de la femme enceinte et l’évaluation de leur pouvoir hémolytique pour le fœtus et le nouveau-né. En présence d’auto-anticorps, les allo-anticorps sont difficilement identifiables à la RAI car ils sont masqués par la réactivité des auto-anticorps. De plus, dans certains cas, il n’est pas toujours possible de déterminer à la RAI si un anticorps est un allo-anticorps (d’intérêt transfusionnel ou obstétrical) ou un auto-anticorps dont l’impact dans ces situations est plus faible. L’épreuve d’absorption permet d’identifier les allo-anticorps masqués par un auto-anticorps, et Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement de différencier un auto-anticorps d’un allo-anticorps. Enfin, lorsqu’il existe un mélange d’allo-anticorps, la RAI est difficilement interprétable et des adsorptions différentielles des différents anticorps sont une aide à l’identification du mélange. Deux épreuves peuvent être réalisées dans ce contexte : l’allo-adsorption et l’auto-adsorption. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est d’assurer la sécurité immuno-hémolytique des transfusions en identifiant un ou des allo-anticorps et en différenciant les allo-anticorps des auto-anticorps. Une autoadsorption est réalisée pour : • confirmer le caractère autologue de réactions spécifiques ou non spécifiques retrouvées à la RAI, avec un témoin de RAI (plasma contre les propres hématies du patient) positif ou négatif ; • détecter des allo-anticorps après adsorption d’auto-anticorps. Une allo-adsorption est réalisée pour permettre la détection d’allo-anticorps après adsorption : • d’auto-anticorps ; • d’allo-anticorps agglutinant la majorité ou la totalité des hématies : mélange ou anticorps reconnaissant un antigène de fréquence élevée. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Les épreuves d’adsorption sont des analyses de seconde intention réalisées au décours d’une RAI. Elles relèvent de la décision du biologiste. Recueil de 2 à 3 tubes de 7 mL sur EDTA ou tube sec traité. Traitement dans la semaine suivant le prélèvement. Température ambiante. Mode de conservation Principe méthodologique Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires Réfrigération pendant 7 jours (tests de robustesse à effectuer). La détection des anticorps repose sur des méthodes immunologiques où la réaction antigène-anticorps peut être révélée par agglutination (support filtration, microplaque ou tube) ou par immunoadhérence (support microplaque). La méthode consiste en 2 étapes : - adsorption du sérum ; - RAI réalisée sur le sérum ou le plasma adsorbé pour identifier les anticorps d’intérêt (cf. fiche 15.1). Pour l’allo-adsorption, des hématies adsorbantes, sélectionnées en fonction de leur phénotype érythrocytaire, sont incubées avec le sérum ou le plasma à tester. L’adsorbat est ensuite recueilli après centrifugation du milieu réactionnel. Ce cycle est réalisé plusieurs fois. Pour l’auto-adsorption, le principe est le même, mais les hématies adsorbantes sont les propres hématies du patient. Dans tous les cas, pour une meilleure efficience de l’adsorption, les hématies peuvent être prétraitées par des enzymes protéolytiques. Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure qualitative. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Ce test est normalement négatif. Test manuel « maison » dépendant des conditions de réalisation et nécessitant une grande expertise. 251 252 Immunohématologie Fiche 15.7 Épreuve d’élution d’anticorps à partir de globules rouges Code NABM 1155 Signification biologique du paramètre La survenue d’un syndrome hémolytique impose de préciser les modalités de destruction des hématies. On définit classiquement des causes corpusculaires (anomalie de la membrane, des enzymes ou de l’hémoglobine) et extra corpusculaires (immunologiques, toxiques et mécaniques). Le test direct à l’antiglobuline permet de confirmer l’origine immunologique d’une anémie hémolytique, mais dans certaines circonstances, il est nécessaire d’identifier la spécificité des anticorps ayant sensibilisé les hématies. L’épreuve d’élution permet de « décrocher » ces anticorps des hématies et ensuite de les identifier par une recherche d’agglutinines irrégulières (RAI). Enfin, les limites de sensibilité du test direct à l’antiglobuline (TDA, test de Coombs) ne permettent pas toujours de confirmer la sensibilisation. L’épreuve d’élution, en concentrant les éventuels anticorps sensibilisants, peut permettre de confirmer que les hématies ont été sensibilisées in vivo par des anticorps. Nature du prélèvement Tube de 7 mL de sang sur EDTA. Recommandations pour la qualité du prélèvement Traitement dans les 72 heures. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de ce test est d’isoler et d’identifier des anticorps responsables d’une sensibilisation in vivo des hématies. Les champs d’applications sont les suivants : • TDA positif chez un nouveau-né ; • notion de syndrome hémolytique en contexte transfusionnel ou non, quelque soit le résultat du TDA ; • notion d’incident transfusionnel ou d’inefficacité transfusionnelle ; • TDA positif avec antécédent transfusionnel de moins de 3 mois. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration L’épreuve d’élution est une épreuve de seconde intention après réalisation du TDA, qu’il soit positif ou négatif, dans un contexte de survenue d’une hémolyse. Elle est réalisée sur décision du biologiste. Température ambiante. Pendant 3 jours à température ambiante. La technique la plus utilisée est la technique d’élution à l’acide (digitonine acide). Des trousses commerciales existent à cet effet. Lorsque les anticorps fixés sont susceptibles d’être des anti-A ou anti-B de type IgG dans le cadre d’une incompatibilité fœto-maternelle, une technique d’élution par choc osmolaire par congélation-décongélation brutale peut être utilisée, mais elle est peu efficace pour les autres types d’anticorps. Dans tous les cas l’éluat, récupéré par centrifugation du milieu réactionnel, est testé en technique de RAI (cf. fiche 15.1) vis-à-vis des hématies O du panel, exprimant tous les antigènes de groupes sanguins d’intérêt, mais aussi vis-à-vis d’hématies A et B. Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure qualitative. Chapitre 15. Anticorps anti-érythrocytaires CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Ce test est normalement négatif. Les limites sont représentées par la quantité parfois faible d’anticorps élués ou une élution défectueuse. 253 254 Immunohématologie Bibliographie du chapitre 15 FICHE 15.1 – Recherche d’Agglutinines Irrégulières (RAI). Décret no 92-143 du 14 février 1992 relatif aux examens obligatoires prénuptial, pré et postnatal. JORF n° 40 du 16 février 1992 page 2505. Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. sfar.org/referentiels/2011. Hémovigilance : Décret n( 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n( 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. HAS. Synthèse des recommandations professionnelles. Suivi et orientation des femmes enceintes en fonction des situations à risque identifiées. Mise à jour mai 2016. FICHE 15.2 – Dosage pondéral des agglutinines irrégulières (RAI) dans le cadre du suivi de grossesse. Décret no 92-143 du 14 février 1992 relatif aux examens obligatoires prénuptial, pré et postnatal. JORF n° 40 du 16 février 1992 page 2505. GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. Huguet-Jacquot S, Toly-Ndour C, Cortey A, et al. Diagnostic et suivi biologiques des allo-immunisations anti-érythrocytaires chez la femme enceinte. Revue française des Laboratoires 2015;470:73–80. Brossard Y, Parnet-Mathieu F, Larsen M. Incompatibilités fœto-maternelles érythrocytaires in : Lefrère JJ, Rouger P (Eds.), Transfusion sanguine : une approche sécuritaire, vol. 1, John Libbey Eurotext. 2000 :290-318. HAS. Synthèse des recommandations professionnelles. Suivi et orientation des femmes enceintes en fonction des situations à risque identifiées. Mise à jour mai 2016. FICHE 15.3 – Épreuve directe de compatibilité au laboratoire. Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. Décision du 20 octobre 2010 fixant la liste et les caractéristiques des produits sanguins labiles. JORF n° 0276 du 28 novembre 2010 page 21143, texte n° 12. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. HAS. Synthèse des recommandations professionnelles. Suivi et orientation des femmes enceintes en fonction des situations à risque identifiées. Mise à jour mai 2016. FICHE 15.4 – Test Direct à l’Antiglobuline (TDA). Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. Parker V, Tormey CA. The direct antiglobulin test : indications, interpretation, and pitfalls. Arch Pathol Lab Med 2017;141:305–10. FICHE 15.5 – Titrage des agglutinines froides. GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. Berentsen S, Randen U, Tjønnfjord GE. Cold agglutininmediated autoimmune hemolytic anemia. Hematol Oncol Clin North Am 2015;29:455–71. FICHE 15.6 – Épreuve d’adsorption d’anticorps anti-érythrocytaires. GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. Hémovigilance : Décret n° 2014-1042 du 12 septembre 2014 relatif au sang humain. JORF n° 0213 du 14 septembre 2014 page 15115, texte n° 6. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusion de globules rouges homologues : produits, indications alternatives. 2014. Ekema EM. Separation of multiple antibodies by adsorption with allogeneic red blood cells. Immunohematology 2017;33:155–8. FICHE 15.7 – Épreuve d’élution d’anticorps à partir de globules rouges. Johnston MF, Belota MK. Determination of need for elution studies for positive direct antiglobulin tests in pretransfusion testing. Am J Clin Pathol 1988;90:58–62. Greco VA, Byrne KM, Procter JL, et al. Detection of antibodies in acid eluates with the gel microcolumn assay. Transfusion 2002;42:698–701. Chapitre 16 Autres anticorps anti-éléments figurés du sang Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 256 Immunohématologie Fiche 16.1 Recherche d’anticorps dirigés contre la membrane des polynucléaires neutrophiles Code NABM 0161 Signification biologique du paramètre Les anticorps dirigés contre la membrane des polynucléaires neutrophiles peuvent être soit : • des auto-anticorps dirigés contre les glycoprotéines de la membrane du polynucléaire neutrophile (essentiellement CD16/FcγRIIIb et CD177/NB1), ou plus spécifiquement contre les antigènes HNA (Human Neutrophil Antigens) exprimés par ces glycoprotéines (essentiellement HNA-1a/NA1 et HNA-1b/NA2, qui sont des polymorphismes de FcγRIIIb) ; • des allo-anticorps dirigés contre les antigènes des groupes granulocytaires HNA. Cinq systèmes sont décrits à ce jour : HNA-1 (antigènes HNA1a/NA1, HNA-1b/NA2, HNA-1c/SH et HNA-1d) ; HNA-2 ; HNA-3 (antigènes HNA-3a et HNA-3b) ; HNA-4 (antigènes HNA-4a et HNA-4b) ; HNA-5 (antigènes HNA-5a et HNA-5b) ; • des iso-anticorps (rares) anti-CD16 chez les sujets déficitaires en FcγRIIIb. Les allo-anticorps ne sont désormais présents que chez des donneuses allo-immunisées pendant la grossesse, en raison de la transfusion de produits déleucocytés et de l’exclusion du don des patients ayant un passé transfusionnel. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Un premier objectif de l’analyse est de rechercher et identifier des auto-anticorps dirigés contre la membrane des polynucléaires neutrophiles dans l’exploration des neutropénies de l’adulte et de l’enfant où une cause auto-immune est suspectée (voir ci-dessus les anticorps les plus souvent impliqués). Un second objectif est de détecter et identifier des allo-anticorps anti-HNA, dans les cas de : • suspicion de neutropénie néonatale par alloimmunisation fœto-maternelle. Les anticorps anti-HNA sont à rechercher chez la mère, en parallèle des typages HNA comparatifs de la mère et du nouveau-né. Il s’agit le plus souvent d’anti HNA-1 (anti-HNA-1a/NA1, anti-HNA-1b/ NA2, plus rarement anti-HNA-1c/SH ou antiHNA-1d), voire d’anti-HNA-2 ; • réactions transfusionnelles de type TRALI (Transfusion Related Acute Lung Injury). Les anticorps anti-HNA sont à rechercher chez le patient, mais surtout chez les donneuses éventuellement impliquées. L’anticorps antigranuleux le plus souvent retrouvé est un anti-HNA-3a, mais on observe aussi des antiHNA-3b, anti-HNA-1 et anti-HNA-2 ; • réactions post-transfusionnelles de type frissonhyperthermie ; • neutropénie inexpliquée post greffe de cellules souches hématopoïétiques. Toute mise en évidence d’anti-HNA doit être confrontée au type HNA des sujets (patient ou donneur) et au typage HNA de la cible. Il s’agit du nouveau-né en cas de neutropénie néonatale, du patient en cas d’anti-HNA identifié chez une donneuse impliquée dans un TRALI classique, exceptionnellement de la donneuse si on suspecte un TRALI inversé avec anti-HNA identifié chez le patient. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration • Dans l’exploration de suspicion de TRALI, la recherche d’anticorps anti-HLA de classe I et de classe II chez le receveur, et surtout chez la/les donneuses potentiellement impliquée(s), est l’examen de première intention. La recherche d’anti-HNA est réalisée dans un deuxième temps, systématiquement selon les dernières recommandations. À noter que les porteuses d’anti-HNA ont aussi souvent une immunisation anti-HLA. • Dans l’exploration d’une neutropénie néonatale (recherche d’allo-anticorps) ou d’une neutropénie de l’adulte et de l’enfant (recherche Chapitre 16. Autres anticorps anti-éléments figurés du sang d’auto-anticorps), la place de ces examens est fonction de l’ensemble du dossier clinico-biologique. Dans les suspicions de neutropénie d’ori- Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement gine auto-immune, l’absence d’auto-anticorps identifié n’exclut pas le diagnostic. Sérum du patient (tube sec) pour la recherche d’anticorps antigranuleux circulants. À noter : la recherche d’anticorps fixés sur les polynucléaires neutrophiles (test direct prélevé sur EDTA) est exceptionnellement réalisée et tend à être abandonnée, car souvent non interprétable et non contributive en raison de la fragilité des cellules, de l’absence de spécificité (pas d’identification possible) et des faux positifs. Prélèvement primaire sur tube sec inférieur ou égal à 4 jours. Contraintes d’acheminement Tubes primaires acheminés dans les 4 jours à température ambiante ou sérum décanté après prélèvement, congelé et acheminé congelé. Mode de conservation Robustesse à tester. Par précaution et en raison des contraintes techniques dépendant quotidiennement des donneurs de cellules granuleuses fraîches, de phénotype HNA défini, pour constituer les panels, les sérums sont décantés, aliquotés et congelés, pour éviter les cycles de congélation/décongélation. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Il faut réaliser trois techniques « maison » qui sont essentielles, complémentaires et ne se remplacent pas mutuellement. Elles testent le sérum du patient vis-à-vis de panels de cellules granuleuses fraîches hétérozygotes et homozygotes dans les systèmes HNA connus. Ces techniques sont longues, en particulier en raison des contraintes de constitution des panels. - Deux techniques respectivement d’immunofluorescence (Granulocyte Immunofluorescence Test GIFT) et d’agglutination (Granulocyte Agglutination Test, GAT) sont nécessaires pour le dépistage d’anticorps anti-granuleux (auto et allo-anticorps circulants), mais peuvent aussi aider à l’identification, voire être la seule technique d’identification pour certains anticorps purement granuloagglutinants, comme certains anti-HNA-3 retrouvés dans les TRALI. - La technique d’immobilisation (Monoclonal Antibody-Specific Immobilization of Granulocyte Antigens, MAIGA), est essentielle pour l’identification des auto-anticorps circulants anti-glycoprotéines (anti-CD16 et anti-CD177) et des auto- et allo-anticorps anti HNA. À noter qu’il n’y a pas de MAIGA disponible pour l’identification d’anti-HNA-3. Il s’agit de la capture de la glycoprotéine granulocytaire à l’aide d’anticorps monoclonaux correspondants et de la mise en évidence de la fixation d’anticorps humains sur cette glycoprotéine par une technique immuno enzymatique. Une technique Luminex® a été développée récemment. Elle présente l’avantage d’être rapide et sensible. Cependant, les comparaisons avec les techniques usuelles montrent d’une part que certains auto-anticorps et certains anticorps granuloagglutinants ne sont pas identifiés en Luminex®, et d’autre part que l’on peut noter certains faux positifs aberrants. Cette technique ne peut pas remplacer les techniques classiques manuelles mais peut être d’un apport complémentaire intéressant, et sa place reste encore à définir. Méthode manuelle. Mesures qualitatives (GIFT, GAT) ou qualitatives à données quantifiables (MAIGA, Luminex®). CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA). CIQ négatifs et positifs « maison » pour les techniques de GIFT, GAT et MAIGA. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites 257 Ces anticorps sont normalement absents. La GIFT est une technique sensible, mais non spécifique. Elle peut être réalisée en cytométrie en flux ou en lecture en microscopie de fluorescence. La GAT est une technique non spécifique, qui ne met en évidence que les anticorps de type granuloagglutinants. La lecture s’effectue en microscopie inversée. Le MAIGA est une technique moins sensible, mais spécifique. Il n’existe aucune trousse commerciale pour ces techniques de GIFT, GAT ou MAIGA. Faux positifs et faux négatifs justifiant l’utilisation de plusieurs techniques. 258 Immunohématologie Fiche 16.2 Recherche d’anticorps dirigés contre les plaquettes Codes NABM 0162 et 0163 Signification biologique du paramètre Les anticorps anti-plaquettes peuvent être soit : • des auto-anticorps fixés in vivo sur les plaquettes ou circulants. Dans ce cas, il s’agit d’anticorps dirigés spécifiquement contre les glycoprotéines de la membrane plaquettaire, essentiellement GpIIbIIIa, mais aussi GpIbIX et + GpIaIIa ; • des allo-anticorps circulants. Il s’agit alors d’anticorps dirigés spécifiquement contre un/des antigènes de groupe plaquettaires (Human Platelet Antigens, HPA), qui sont des polymorphismes des mêmes glycoprotéines et de la molécule CD109. Les systèmes HPA sont des systèmes bialléliques avec un allèle « a » de haute fréquence et un allèle « b » de basse fréquence. Un sujet est HPA-aa, ou ab, ou bb, et peut s’immuniser contre l’antigène qui lui est étranger lors d’une transfusion, d’une grossesse ou d’une greffe. Vingtneuf systèmes HPA ont été décrits à ce jour. Seuls HPA-1, HPA-3, HPA-5, et éventuellement HPA-2 et HPA-15 sont d’intérêt transfusionnel ; • des iso-anticorps (rares), comme les anti-GpIIbIIIa circulants dans le contexte particulier de la maladie de Glanzmann, ou les anti-CD36 (GpIV) dans le cadre de sujets de phénotype plaquettaire déficitaire en CD36. Ces patients peuvent s’isoimmuniser après transfusion ou grossesse. Plusieurs techniques sont à ce jour disponibles, mais la technique de référence (gold standard) est le MAIPA (Monoclonal Antibody-specific Immobilization of Platelet Antigens). Le MAIPA met en évidence les anticorps fixés (MAIPA direct) ou circulants (MAIPA indirect), en dépistage sur les plaquettes de panels hétérozygotes et en identification sur les plaquettes de panel homozygotes. Le MAIPA est le seul test conçu à la fois pour la recherche des auto- et des allo-anticorps anti-plaquettes, mais aussi des anticorps privés (en cross-match entre sérum maternel et plaquettes paternelles). Il est également adaptable à la recherche spécifique d’anti-HPA-15, contrairement à toutes les autres techniques. Parmi ces dernières, on peut citer : la cytométrie en flux de dépistage des anticorps fixés sur les plaquettes (sensible mais non spécifique), les kits ELISA (plus rapides que le MAIPA, mais ne répondant pas à tous les besoins), la technologie Luminex® (plus rapide que le MAIPA) conçue pour l’identification des allo-antiHPA d’intérêt transfusionnel uniquement. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est : • de détecter et identifier des allo-anticorps antiplaquettes circulants dans le cadre de thrombopénies fœtales/néonatales par allo-immunisation materno-fœtale, d’état réfractaire aux transfusions plaquettaires, de réaction post-transfusionnelle de type fièvre et frissons, de thrombopénie prolongée post greffe de cellules souches hématopoïétiques ou de suspicion de purpura post-transfusionnel. Tout allo-antiHPA identifié devra être confronté au typage HPA du patient. La fiabilité de l’identification des allo-antiHPA est primordiale, à la fois pour adapter la prise en charge transfusionnelle plaquettaire, mais aussi, dans le cas des alloimmunisations fœto-maternelles, pour assurer la prise en charge anténatale spécifique et adaptée des grossesses suivantes ; • de rechercher des auto-anticorps anti-plaquettes spécifiques, fixés et circulants, lors de l’exploration d’une thrombopénie de l’adulte ou de l’enfant. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans l’exploration d’une thrombopénie fœtale/ néonatale (chez un nouveau-né par ailleurs cliniquement sain) ou d’une suspicion de purpura posttransfusionnel, la recherche d’allo-antiHPA est une analyse incontournable, de première intention, et non substituable. On recherchera en particulier un allo-antiHPA-1a, mais de nombreuses spécificités peuvent être en cause. Dans l’exploration des Chapitre 16. Autres anticorps anti-éléments figurés du sang thrombopénies néonatales, la recherche d’antiHPA est réalisée chez la mère de l’enfant. Dans l’exploration d’un état réfractaire ou de réactions post-transfusionnelles (RPT), la recherche d’anti-HLA est l’analyse de première intention. La recherche d’allo-antiHPA est indiquée en cas de négativité de la recherche des anti-HLA ou de la persistance de mauvais rendements transfusionnels ou de RPT malgré l’attribution de plaquettes HLA compatibles. Dans certains cas, la recherche d’anti-HPA peut être réalisée d’emblée, en parallèle de celle de première intention des anti-HLA, à l’initiative du biologiste, en fonction des circonstances cliniques et biologiques. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement 259 Dans l’exploration d’une thrombopénie de l’adulte ou de l’enfant, la recherche d’auto-anticorps n’est ni nécessaire ni suffisante pour le diagnostic de purpura thrombopénique immunologique (PTI), qui repose sur un faisceau d’arguments cliniques et biologiques. Cette recherche est utile en cas de difficulté DIAGNOSTIQUE et quand elle met en évidence une spécificité reconnue antiglycoprotéine plaquettaire. Un résultat négatif n’exclut pas le diagnostic. Dans ce contexte, la recherche des auto-anticorps fixés (test direct) est généralement plus contributive que celle des auto-anticorps circulants (en l’absence de transfusions plaquettaires dans les 3 jours précédents ou de taux effondré < 10 G/L). En pratique, il est habituel de rechercher les deux. Test direct : Plaquettes du patient, isolées à partir de prélèvement sur tube EDTA. Test indirect : Plasma ou sérum du patient (tube EDTA ou tube sec). Attention aux conditions pré-analytiques spécifiques requises pour la technique utilisée. Test direct : Prélèvement inférieur ou égal à 48 heures. Test indirect : Prélèvement inférieur ou égal à 4 jours. Tubes primaires acheminés à température ambiante. Mode de conservation Attention : voir les conditions préanalytiques spécifiques des techniques utilisées, précisées par le fournisseur, ainsi que les tests de robustesse à effectuer localement. Les tests directs doivent être réalisés aussi rapidement que possible après avoir isolé les plaquettes. Pour les tests indirects : - MAIPA : réfrigération pendant 14 jours possible après avoir décanté les sérums et/ou plasma, puis congélation ; - ELISA et Luminex® : réfrigération 48 h possible après avoir décanté puis congélation, ou congélation d’emblée des sérums (tests de robustesse à effectuer). Principes méthodologiques 1) MAIPA (technique de référence) : capture d’un antigène plaquettaire à l’aide d’anticorps monoclonaux de souris dirigés contre la glycoprotéine plaquettaire qui en est le support, et mise en évidence de la fixation d’anticorps humains sur cet antigène par une technique immuno-enzymatique. 2) ELISA : glycoprotéines purifiées, fixées dans les puits dans lesquels on ajoute le sérum à tester. La présence d’un anticorps sera mise en évidence par une technique immunoenzymatique. 3) Luminex® : glycoprotéines purifiées, de typage HPA connu, fixées sur des billes fluorescentes mises en présence du sérum à tester, puis d’une anti-immunoglobuline humaine couplée à la phycoérythrine (PE). La mise en évidence de la fixation d’un anticorps sur la bille et son identification sont possibles grâce à deux faisceaux laser : l’un identifiant la bille, l’autre la positivité de la bille après excitation de la PE. 260 Immunohématologie Type de méthode Type de test Méthode manuelle, automatisable. Mesure qualitative à données quantifiables. CIQ Respect de l’arrêté du 26 avril 2002 (GBEA) CIQ négatif et positif fournis dans les trousses. EEQ Oui. Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites Ces anticorps sont normalement absents. Faux positifs et faux négatifs justifiant l’utilisation de plusieurs techniques. Chapitre 16. Autres anticorps anti-éléments figurés du sang Bibliographie du chapitre 16 FICHE 16.1 – Recherche d’anticorps dirigés contre la membrane des polynucléaires neutrophiles Tazzari PL, Rondelli D, Re F, et al. Antibodies reactive with neutrophils following allogeneic haematopoietic stem cell transplantation. Eur J Haematol 1999;62:57–62. Stroncek D. Neutrophil alloantigens. Transfus Med Rev 2002;16:67–75. Curtis BR, Reno C, Aster RH. Neonatal alloimmune neutropenia attributed to maternal immunoglobulin G antibodies against the neutrophil alloantigen HNA-1c (SH): a report of five cases. Transfusion 2005;45:1308–13. Stroncek DF. Neutrophil-specific antigen HNA-2a, NB1 glycoprotein, and CD177. Curr Opin Hematol 2007;14:688–93. Riera NE, Rosso Saltó M, Galán V, et al. Anti-polymorphonuclear neutrophil antibodies in patients with leukopenia or neutropenia. Int J Lab Hematol 2010;32:e96–105. Storch EK, Hillyer CD, Shaz BH. Spotlight on pathogenesis of TRALI: HNA-3a (CTL2) antibodies. Blood 2014;124:1868–72. Heinzl MW, Schönbacher M, Dauber EM, et al. Detection of granulocyte-reactive antibodies: a comparison of different methods. Vox Sang 2015;108:287–93. 261 FICHE 16.2 – Recherche d’anticorps dirigés contre les plaquettes GBEA : Arrêté du 26 avril 2002 modifiant l’arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JORF n° 104 du 4 mai 2002 page 8375, texte n° 80. HAS. Protocole national de diagnostic et de soins (PNDS). Purpura thrombopénique immunologique de l’enfant et de l’adulte. Mai 2017. HAS. Recommandation de bonne pratique. Transfusions de plaquettes. Octobre 2015. Rapports bi-annuels des Workshops d’Immunologie Plaquettaire de l’International Society of Blood. Transfusion (publiés dans Vox Sanguinis). Beardsley DS, Ertem M. Platelet autoantibodies in immune thrombocytopenic purpura. Transfus Sci 1998;19:237–44. Rozman P. Platelet antigens. The role of human platelet alloantigens (HPA) in blood transfusion and transplantation. Transpl Immunol 2002;10:165–81. Tomer A. Autoimmune thrombocytopenia: determination of platelet-specific autoantibodies by flow cytometry. Pediatr Blood Cancer 2006;47:697–700. Chapitre 17 Cytogénétique hématologique Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 266 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 17.1 Caryotype onco-hématologique Code NABM 0906 Signification biologique du paramètre Le caryotype consiste en l’étude des chromosomes d’une cellule ou d’un clone cellulaire. Dans les hémopathies malignes, le caryotype peut être normal ou anormal. Les anomalies chromosomiques, lorsqu’elles existent, correspondent à des pertes (délétion, monosomie, nullosomie), des gains (duplication, trisomie, etc.) ou des déplacements (translocations, insertions entre plusieurs chromosomes, inversions intra chromosomiques, etc.) de matériel génétique. Les anomalies ne sont pas réparties au hasard. Des chromosomes ou des bandes chromosomiques sont concernés de façon récurrente, voire spécifique d’une hémopathie. Il existe une relation entre génotype et phénotype : une anomalie chromosomique affecte un ou plusieurs gènes importants qui modifient le comportement cellulaire et conditionnent la réponse au traitement. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le caryotype onco-hématologique a pour objectif la détection d’anomalies chromosomiques dans les cellules malignes. Ce sont des anomalies acquises Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement (n’existant que dans les cellules tumorales) et clonales (les mêmes anomalies sont retrouvées dans toutes les cellules malignes issues d’une seule cellule mutée). Quelle que soit la maladie en cause (leucémies aiguës ou chroniques, syndromes lymphoprolifératifs, néoplasies myéloprolifératives, syndromes myélodysplasiques, lymphomes, etc.), l’établissement du caryotype joue un rôle majeur dans la prise en charge des patients par sa valeur diagnostique et/ou pronostique, permettant de choisir l’option thérapeutique la plus adaptée. Par ailleurs, l’existence d’un marqueur chromosomique peut être exploitée pour le suivi de la maladie du patient. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le caryotype est pratiqué au moment du diagnostic de l’hémopathie, avant tout traitement. Il est important que toutes les analyses nécessaires à la prise en charge d’une hémopathie maligne (morphologiques, immunophénotypiques, cytogénétiques, moléculaires) soient réalisées lors du même prélèvement et avant le début du traitement. Un caryotype peut également être réalisé lors du suivi du patient. Aspiration médullaire, prélèvement sanguin, biopsie ganglionnaire ou tissulaire (rate, peau, etc.), liquide d’épanchement. L’étude cytogénétique de type caryotype n’est possible que sur des échantillons vivants et aseptiques. Les prélèvements doivent être introduits dans un flacon stérile contenant un milieu de culture simple, de l’héparine et un antibiotique, mais en aucun cas un fixateur. Le prélèvement sanguin ou médullaire doit être réalisé sur tube héparine lithium. Le transport doit être aussi rapide que possible (24 h maximum), à température ambiante. Mode de conservation Chapitre 17. Cytogénétique hématologique 267 Le culot cellulaire obtenu à l’issue de la culture est conservé à – 20 °C et peut être utilisé jusqu’à épuisement. Principe méthodologique Les chromosomes ne sont visibles que dans des cellules en division. Les prélèvements à étudier doivent donc contenir des cellules en cycle. Au laboratoire de cytogénétique, ces prélèvements sont préparés pour une culture brève dont la durée sera adaptée à la pathologie suspectée, suivie d’un blocage des cellules en métaphase (le plus souvent au moyen de colchicine), moment du cycle où les chromosomes sont condensés et facilement identifiables. L’application d’une solution hypotonique permet d’obtenir un gonflement des cellules et de disperser les chromosomes. Les cellules sont ensuite fixées et peuvent être conservées à – 20 °C à ce stade. L’analyse est faite en général sur 20 métaphases obtenues après étalement du culot cellulaire sur lames. Une dénaturation permet ensuite de faire apparaître les bandes chromosomiques spécifiques de chaque paire de chromosomes et de les classer. La formule chromosomique est donnée suivant des règles établies par une nomenclature internationale régulièrement révisée et doit comporter l’analyse d’au moins 20 mitoses. Type de méthode La technique nécessaire à l’obtention des cellules en métaphase est le plus souvent manuelle. Les mitoses repérées au microscope (par un opérateur ou un robot chercheur de métaphases) sont capturées à l’aide de logiciels analyseurs d’images qui permettent un classement semi-automatique. Type de test Mesure qualitative et moyennement quantitative. CIQ Maison. EEQ Oui. Performances du test Causes d’erreur, limites du test Le caryotype permet une analyse globale du génome, avec comme limite la résolution de cette technique (environ 5-10 mégabases). Il permet de détecter les anomalies cellule par cellule, avec une hiérarchisation des anomalies clonales et sous-clonales. Des faux négatifs sont possibles si : - seules des métaphases de cellules normales ont été obtenues ; - le clone cellulaire anormal est très minoritaire ; - la qualité des chromosomes est médiocre. Échec du caryotype possible, en particulier si prélèvement pauvre, coagulé ou contaminé. 268 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 17.2 Hybridation sur chromosomes métaphasiques et/ou interphasiques Codes NABM 0903, 0904 ou 0905 Signification biologique du paramètre L’hybridation in situ fluorescente (Fluorescence In Situ Hybridization ou FISH) est réalisée avec des sondes spécifiques marquées par des fluorochromes et permet de détecter des anomalies génomiques sur des chromosomes métaphasiques et/ou des noyaux interphasiques. C’est une technique complémentaire au caryotype (cf. fiche 17.1, indispensable dans la prise en charge de nombreuses hémopathies. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription En complément du caryotype, la FISH permet soit de détecter des anomalies cryptiques (non visibles), de préciser des anomalies ou de confirmer l’implication d’un gène dans une anomalie. Elle peut aussi permettre une meilleure quantification des cellules portant l’anomalie, Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation en augmentant le nombre de cellules analysées lorsque l’évaluation porte sur les signaux de noyaux interphasiques. Enfin, elle peut permettre de rechercher une anomalie de façon spécifique en cas d’échec du caryotype, puisqu’elle peut être réalisée sur cellules ne se divisant pas (noyaux interphasiques). Il est également possible de réaliser de la FISH sur des appositions ou des coupes anatomopathologiques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration En fonction du type d’hémopathie, des arbres stratégiques ont été mis en place par le groupe francophone de cytogénétique hématologique (GFCH), concernant en particulier le choix de(s) (la) sonde(s) à réaliser, au diagnostic et/ou dans le suivi des hémopathies Aspiration médullaire, prélèvement sanguin, liquide d’épanchement, biopsie médullaire, biopsie ou apposition ganglionnaire, splénique ou de masse tumorale. Lorsque la FISH est réalisée sur chromosomes, les conditions sont les mêmes que pour l’étude cytogénétique de type caryotype et elle n’est possible que sur des échantillons vivants et aseptiques. Les prélèvements doivent être introduits dans un flacon stérile contenant un milieu de culture simple, de l’héparine et un antibiotique, mais en aucun cas un fixateur. Le prélèvement sanguin ou médullaire doit être réalisé sur tube héparine lithium. Pour la FISH interphasique, un étalement sur lame est suffisant, frottis ou cytocentrifugat de bonne qualité. Les coupes anatomopathologiques doivent être les plus fines possible. Le transport doit être aussi rapide que possible (24 h maximum), à température ambiante. Le culot cellulaire obtenu à l’issue de la culture est conservé à – 20 °C et peut être utilisé jusqu’à épuisement. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Chapitre 17. Cytogénétique hématologique Chaque sonde spécifique d’un chromosome entier, d’une région chromosomique ou d’un locus, s’hybride sur une séquence de l’ADN analysé. Ceci est réalisé par dénaturation thermique (séparation des 2 brins de l’ADN), puis renaturation. Cette technique repose sur la complémentarité des bases de l’ADN : la sonde ne se fixe que si la séquence ciblée est présente. La sonde est couplée à un fluorochrome et la préparation est lue au microscope à fluorescence à la fin de la technique. Le signal fluorescent peut alors être présent sur le chromosome attendu, présent sur un autre chromosome, scindé, ou absent. Il est classique d’utiliser deux sondes couplées à des fluorochromes différents (le plus souvent émettant respectivement en vert et en rouge). Les sondes caractéristiques des fusions chromosomiques résultant de translocations donnent des signaux séparés sur les chromosomes normaux et des signaux proches sur le site de la translocation. À l’inverse, les sondes dites breakapart donnent des signaux proches sur le chromosome normal au niveau de point de cassure potentiel et des signaux séparés en cas de translocation. Méthode manuelle et semi-automatisée (dénaturation-renaturation), lecture des signaux par un opérateur ou par un chercheur de métaphases. Mesure qualitative et quantitative. CIQ Maison. EEQ Oui. Performances du test Causes d’erreur, limites du test 269 Technique plus sensible que le caryotype, avec un seuil de résolution de 100 à 300 kb, la FISH peut détecter des translocations, des pertes ou des gains de matériel chromosomique. Elle permet également de détecter ces anomalies cellule par cellule plutôt que dans l’ensemble de l’ADN. Elle peut être réalisée sur cellules non cultivées et sur tissus. La FISH est une technique ciblée d’analyse du génome dans laquelle « on ne trouve que ce que l’on cherche ». En fonction de la localisation de la sonde, certains remaniements peuvent ne pas être détectés. Il faut donc connaître de façon précise la construction de la sonde. Sur noyaux interphasiques de cellules en suspension, le seuil de positivité pour détecter des anomalies varie de 1 à 5 % en fonction des sondes. Sur coupes anatomopathologiques, la superposition des couches de cellules rend la lecture difficile et délicate. 270 Oncologie moléculaire hématologique Bibliographie du chapitre 17 FICHE 17.1 – Caryotype onco-hématologique Nguyen-Khac F, Daudignon A, Eclache V, et al. Cytogenetics in the management of hematologic malignancies: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:509–10. FICHE 17.2 – Hybridation sur chromosomes métaphasiques et/ou interphasiques Nguyen-Khac F, Daudignon A, Eclache V, et al. Cytogenetics in the management of hematologic malignancies: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:509–10. Roche-Lestienne C, Boudry-Labis E, Mozziconacci MJ. Cytogenetics in the management of “chronic myeloid leukemia”: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique HématologiqueGroupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:511–5. Bilhou-Nabéra C, Bidet A, Eclache V, et al. Cytogenetics in the management of Philadelphia-negative myeloproliferative neoplasms: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:517–23. Eclache V, Lafage-Pochitaloff M, Lefebvre C, et al. Cytogenetic place in managing myelodysplastic syndromes: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:525–34. Luquet I, Bidet A, Cuccuini W, et al. Cytogenetics in the management of acute myeloid leukemia: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:535–46. Baranger L, Cuccuini W, Lefebvre C, et al. Cytogenetics in the management of children and adult acute lymphoblastic leukemia (ALL): an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:547–60. Nguyen-Khac F, Borie C, Callet-Bauchu E, et al. Cytogenetics in the management of chronic lymphocytic leukemia: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:561–7. Lefebvre C, Callet-Bauchu E, Chapiro E, et al. Cytogenetics in the management of lymphomas and lymphoproliferative disorders in adults and children: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:568–87. Daudignon A, Quilichini B, Ameye G, et al. Cytogenetics in the management of multiple myeloma: an update by the Groupe Francophone de Cytogénétique Hématologique (GFCH). Ann Biol Clin 2016;74:588–95. Chapitre 18 Exploration des proliférations myéloïdes Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 272 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.1 Recherche et quantification des transcrits BCR-ABL1 Code LC N407 Signification biologique du paramètre Les transcrits BCR-ABL1 sont produits par le gène BCR-ABL1. Dans le contexte d’un syndrome myéloprolifératif (SMP, ou néoplasme myéloprolifératif NMP), ils constituent le marqueur moléculaire diagnostique de la leucémie myéloïde chronique (LMC). Ce marqueur n’est cependant pas spécifique de la LMC puisqu’il est aussi exprimé dans un sous-groupe de leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL). La protéine codée par les transcrits BCR-ABL1 est la cible des agents thérapeutiques de la classe des inhibiteurs d’ABL1. La détection des transcrits BCRABL1 ouvre donc la possibilité de l’utilisation des inhibiteurs d’ABL1 à des fins thérapeutiques. De plus, la quantification régulière des transcrits BCR-ABL1 tout au long du traitement permet de vérifier la qualité de la réponse de chaque patient et d’identifier ceux pour lesquels une adaptation thérapeutique est nécessaire. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche des transcrits BCR-ABL1 doit être entreprise devant toute suspicion de LMC pour confirmer l’hypothèse diagnostique, devant toute suspicion de NMP pour exclure le diagnostic de LMC, et pour toute LAL de la lignée B. L’objectif est de justifier l’utilisation des inhibiteurs Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA, voire moelle. Recommandations pour la qualité du prélèvement Ne pas congeler le prélèvement. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode d’ABL1 dans la stratégie thérapeutique, soit en monothérapie (LMC) soit en association avec une polychimiothérapie intensive (LAL). Dans le contexte de la LMC, la quantification des transcrits BCR-ABL1 doit être prescrite sur une base trimestrielle, de l’initiation du traitement jusqu’à l’obtention de la réponse moléculaire majeure (RMM). Une fois la RMM obtenue et confirmée, la quantification des transcrits BCRABL1 peut se faire sur un rythme semestriel. L’objectif est d’identifier les patients pour lesquels un ajustement thérapeutique est nécessaire. À plus long terme, la quantification des transcrits BCR-ABL1 est indispensable pour justifier une suspension du traitement. En situation d’arrêt de traitement la quantification des transcrits BCR-ABL1 permet de diagnostiquer la rechute moléculaire qui nécessite la reprise du traitement. Dans le contexte des LAL BCR-ABL1 positives, la quantification des transcrits BCR-ABL1 doit être adaptée au protocole de traitement qui a été choisi. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche des transcrits BCR-ABL1 doit se faire en première intention devant toute suspicion de LMC, devant toute suspicion de NMP, devant toute LAL de la lignée B. Acheminement au laboratoire à une température comprise entre + 15 et + 30 °C dans un délai inférieur ou égal à 24 h. Conservation des prélèvements à une température comprise entre + 15 et + 30 °C dans un délai inférieur ou égal à 24 h. Recherche des transcrits BCR-ABL1. Transcription inverse des ARN en ADNc suivi d’une amplification par PCR avec électrophorèse des fragments amplifiés. Quantification des transcrits BCR-ABL1. Transcription inverse des ARN en ADNc suivie par une amplification par PCR en temps réel. Méthode manuelle, automatisable. Type de test Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes Test qualitatif pour la recherche et quantitatif pour la quantification des transcrits BCR-ABL1. CIQ « Maisons » ou commerciaux. EEQ Disponibles auprès du GBMHM (Groupe de biologie moléculaire des hémopathies malignes), à la fois pour la recherche et la quantification des transcrits BCR-ABL1. Valeurs de référence/Interprétation et performances Recherche des transcrits BCR-ABL1. Identification des transcrits BCR-ABL1, y compris les transcrits atypiques, et typage de l’isoforme exprimée. Quantification des transcrits BCR-ABL1. Détermination des niveaux d’expression des transcrits BCR-ABL1, normalisés sur l’expression d’un gène contrôle (ABL1, GUSB ou BCR). Dans le contexte de la LMC, le niveau d’expression doit en outre être standardisé sur l’échelle internationale. Cela n’est applicable que pour les LMC exprimant les transcrits e14a2 ou e13a2. Causes d’erreur, limites du test Recherche des transcrits BCR-ABL1 : dégradation des ARN, présence d’un inhibiteur, expression d’une isoforme non amplifiable par la méthode mise en œuvre. Quantification des transcrits BCR-ABL1 : dégradation des ARN, présence d’un inhibiteur, isoforme non déterminée avant traitement. 273 274 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.2 Recherche des mutations du domaine tyrosine kinase de BCR-ABL1 Code RIHN N421 Signification biologique du paramètre Les mutations du domaine tyrosine kinase de BCRABL1 sont des évènements génétiques somatiques acquis par les cellules tumorales et susceptibles d’induire une résistance aux agents thérapeutiques de la classe des inhibiteurs d’ABL1. En situation de résistance ou de réponse suboptimale au traitement, l’identification d’une mutation doit conduire à la révision du traitement. Les spectres des mutations de résistance aux différents inhibiteurs d’ABL1 étant différents, le type de la mutation identifiée est un des éléments fondamentaux qui permettent de guider de façon rationnelle l’adaptation du traitement. La détection d’une mutation est aussi le signe d’une instabilité génétique associée à un risque accru de progression de la maladie. tyrosine kinase de BCR-ABL1 a pour objectif de caractériser la résistance et de proposer un traitement alternatif efficace. L’examen doit être entrepris en situation d’échec ou de réponse suboptimale au traitement, comme défini par l’European Leukemia Net (ELN). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche des mutations du domaine tyrosine kinase de BCR-ABL1 doit se faire en première intention : • en situation d’échec ou de réponse suboptimale au traitement ; • devant une augmentation du niveau d’expression des transcrits BCR-ABL1 d’un ½ Log10, soit 3,3 fois. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Dans le contexte du traitement par un inhibiteur d’ABL1, la recherche des mutations du domaine Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Sang sur tube EDTA, voire moelle osseuse. Ne pas congeler le prélèvement. Acheminement au laboratoire à une température comprise entre + 15 et + 30 °C dans un délai inférieur ou égal à 24 h. Conservation des prélèvements à une température comprise entre + 15 et + 30 °C dans un délai inférieur ou égal à 24 h. La recherche de mutation du domaine kinase de BCR-ABL1 comporte extraction d’ARN et la préparation par transcription inverse d’ADN complémentaires (ADNc). Après amplification par PCR, une capture du domaine tyrosine kinase est réalisée et les amplicons sont séquencés. Les séquences obtenues sont comparées à une séquence de référence. Méthode manuelle, automatisable. Mesure qualitative pour les méthodes de séquençage de type Sanger. Mesure quantitative pour les méthodes de séquençage en parallèle en phase solide. Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes CIQ Oui, maison. EEQ Pas d’EEQ disponible actuellement. Valeurs de référence/Interprétation et performances Sensibilité de détection de 15-20 % pour les méthodes de séquençage type Sanger. Sensibilité de détection de 1 à 5 % pour les méthodes de séquençage en parallèle en phase solide. Il est possible d’identifier des mutations composites. Causes d’erreur, limites du test Causes d’erreur : mutations induites par les enzymes utilisées pour la transcription inverse et l’amplification par PCR. Limite du test : le niveau d’expression des transcrits BCR-ABL1 doit être supérieur à 0,1 %. Une qualité insuffisante des ARN extraits peut aussi minimiser les résultats. 275 276 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.3 Recherche/Quantification de la mutation JAK2V617F Code LC N417 Signification biologique du paramètre JAK2 est une tyrosine-kinase impliquée dans la transduction du signal de récepteurs aux cytokines, en particulier celui de l’érythropoïétine (EPO-R), de la thrombopoïétine (TPO-R ou MPL) et du facteur de croissance des granulocytes (G-CSF-R ou CSF3R). La mutation NM_004972.3 (JAK2 :c.1849G > T; p.Val617Phe) ou JAK2V617F est la plus fréquemment retrouvée dans les néoplasies myéloprolifératives. Elle entraîne une perte de la régulation négative physiologiquement jouée par le domaine JH2 (pseudo-kinase) sur le domaine JH1 (domaine kinase) avec pour conséquence une hypersensibilité et même une indépendance des progéniteurs hématopoïétiques par rapport à leurs facteurs de croissance. la mutation renforce le diagnostic de Néoplasie myéloproliférative. Cette recherche est également pleinement justifiée en cas de thrombose splanchnique (thrombose porte, syndrome de Budd-Chiarri), y compris si l’hémogramme est normal. L’indication est bien plus discutée dans d’autres situations thrombotiques inhabituelles (thrombose veineuse cérébrale, thrombose d’un site inhabituel, récidives thrombotiques sans étiologie) en l’absence d’anomalies de l’hémogramme. La quantification de la mutation peut orienter le diagnostic (homozygotie indiquée par un taux > 50 % classiquement limitée aux polyglobulies de Vaquez et myélofibroses) et aider au suivi des NMP (augmentation si passage en myélofibrose, diminution en réponse au traitement). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche de la mutation JAK2V617F est un élément majeur du diagnostic des néoplasies myéloprolifératives (NPM) : en situation de polyglobulie, la présence de cette mutation est un argument fort en faveur de la maladie de Vaquez (ou Polycythemia Vera), surtout si son taux est > 5 %. En présence d’une thrombocytose ou d’une suspicion de myélofibrose (érythromyélémie, splénomégalie, anémie, dacryocytose, etc.), la découverte de Dans un bilan de polyglobulie, la recherche/ quantification de JAK2V617F a toute sa place en première intention en dehors de situations cliniques évidentes (insuffisance respiratoire avec hypoxie, shunt cardiaque droit/gauche, etc.), souvent en association avec le dosage d’érythropoïétine. En cas de thrombocytose, la recherche peut être engagée après avoir éliminé les causes réactionnelles les plus fréquentes (syndromes inflammatoires chroniques, carences martiales, asplénie). Nature du prélèvement Sang sur tube EDTA. Recommandations pour la qualité du prélèvement Une détermination précise de la charge allélique, en particulier en cas de suivi, est préférentiellement réalisée sur polynucléaires purifiés. Prévoir suffisamment de sang (minimum 10 mL). Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h), surtout si nécessité de purifier les polynucléaires. Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Possibilité de travailler sur sang total congelé. Principe méthodologique Plusieurs techniques sont disponibles, le plus souvent PCR quantitative avec discrimination allélique basée sur l’utilisation de compétition de sondes ou d’amorces spécifiques. Type de méthode Méthode manuelle, automatisable. Type de test Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes Mesure quantitative ou qualitative selon la technique utilisée. Une mesure quantitative est préférable. CIQ Maison et commercial. EEQ Disponible au sein du GBMHM. Valeurs de référence/ Performances du test Causes d’erreur, limites du test La détection d’une mutation JAK2V617F est une marque de clonalité fournissant un argument fort en faveur du diagnostic de NMP. Il faut interpréter avec prudence les faibles charges alléliques (< 2 %) qui peuvent être de simples marqueurs d’hématopoïèse clonale liée à l’âge (CHIP : Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential). Les faibles charges alléliques doivent être interprétées avec prudence, surtout en situation de polyglobulie ou de thrombose sans autre stigmate de néoplasie myéloproliférative. Exceptionnellement, une mutation additionnelle proche peut négativer la recherche (interférence avec l’hybridation des amorces). Il faut alors avoir recours à une technique alternative. 277 278 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.4 Recherche de mutation de l’exon 12 de JAK2 Code RIHN N455 (forfait) Signification biologique du paramètre JAK2 est une tyrosine-kinase impliquée dans la transduction du signal de récepteurs aux cytokines, en particulier celui de l’érythropoïétine (EPO-R), de la thrombopoïétine (TPO-R ou MPL) et du facteur de croissance des granulocytes (G-CSF-R ou CSF3R). Les mutations de l’exon 12 de JAK2 sont retrouvées dans de rares polyglobulies de Vaquez. Elles activent fortement l’activité kinase. Il s’agit de mutations diverses (insertions, délétions, substitutions, combinaisons de ces éléments) siégeant au niveau d’une séquence limitée de l’exon 12. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche de mutations de l’exon 12 permet de poser le diagnostic de maladie de Vaquez en Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique l’absence de la mutation JAK2V617F. On ne la trouve pas dans les autres néoplasies myéloprolifératives (NMP). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans un bilan de polyglobulie, la recherche de mutations de l’exon 12 de JAK2 est réservée aux cas où la mutation JAK2V617F n’est pas retrouvée (ou parfois retrouvée à un taux inhabituellement bas) et souvent après avoir éliminé les causes simples de polyglobulie secondaire ou de fausse polyglobulie. Un taux bas d’érythropoïétines en l’absence de mutation JAK2V617F est une bonne indication à la recherche de mutations de l’exon 12. Sang sur tube EDTA, voire moelle osseuse. Devant la difficulté de détecter des clones peu importants, ce qui est fréquent, il est préférable de travailler sur polynucléaires purifiés (au moins 10 mL de sang). Température ambiante, transport rapide (sous 24 h) surtout si nécessité de purifier les polynucléaires. Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Plusieurs techniques sont disponibles. Le séquençage de Sanger a une limite de détection suboptimale (10-20 %). Les techniques HRM (High Resolution Melting) permettent une détection relativement sensible mais nécessitent un séquençage de confirmation. Les techniques NGS sont très intéressantes dans cette indication. Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure qualitative. CIQ Maison. EEQ Non. Valeurs de référence/Performances du test La recherche de mutation de l’exon 12 de JAK2 permet de poser le diagnostic de maladie de Vaquez chez les quelques patients (2-3 %) ne présentant pas de mutation JAK2V617F. Causes d’erreur, limites du test Les petits clones sont parfois difficiles à détecter, il faut s’assurer d’utiliser une technique sensible et ne pas hésiter à répéter l’examen en cas de doute. Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes 279 Fiche 18.5 Recherche de mutations de CALR Code RIHN N455 (forfait) Signification biologique du paramètre Le gène de la calréticuline (CALR) est muté chez environ un quart à un tiers des patients présentant des néoplasies myéloprolifératives (NMP) à prédominance mégacaryocytaire (thrombocytémie essentielle, myélofibrose primitive). Il code pour une protéine résidente du réticulum endoplasmique assurant le contrôle de qualité des glycoprotéines et jouant un rôle dans l’homéostasie calcique. Les formes mutées de calréticuline interagissent spécifiquement avec les récepteurs MPL de la thrombopoïétine, entraînant leur activation en l’absence de cytokine. Les mutations de CALR siègent au niveau du dernier exon (exon 9) et entraînent systématiquement un décalage du cadre de lecture. Celui-ci est responsable du changement de la séquence protéique qui, d’acide, devient basique et donne naissance à un peptide soluble. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription En présence d’une thrombocytose ou d’une suspicion de myélofibrose, la mise en évidence Nature du prélèvement d’une mutation de CALR est un argument fort en faveur du diagnostic de NMP. Elle permet en outre une catégorisation pronostique : dans une thrombocytémie essentielle, les mutations CALR sont associées à un moindre risque thrombotique et dans les myélofibroses, elles sont associées à une meilleure survie globale. Il faut toutefois nuancer ces propos qui semblent dépendre du type de mutation. Contrairement aux mutations JAK2V617F, les mutations de CALR ne sont pas retrouvées de façon significative en cas de thrombose si l’hémogramme est normal. Place éventuelle dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Le plus souvent mutuellement exclusive des autres mutations de prolifération (JAK2, MPL), la recherche de mutations de CALR est souvent réalisée en seconde intention après celle de mutation JAK2V617F en cas de suspicion de thrombocytémie essentielle ou de myélofibrose. Rarement, ces mutations peuvent être associées, surtout en cas de faible charge allélique. Sang sur tube EDTA, voire moelle osseuse. Recommandations pour la qualité du prélèvement Le plus souvent réalisé sur l’échantillon d’ADN extrait pour la recherche de mutation JAK2V617F faite en première ligne. Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h) surtout si nécessité de purifier les polynucléaires. Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Température ambiante jusqu’à séparation cellulaire. Possibilité de travailler sur sang total congelé. Plusieurs techniques disponibles, mettant souvent à profit le fait qu’il y a systématiquement un changement de taille de l’exon 9 (analyse de fragment, HRM). Le séquençage Sanger est envisageable car les charges alléliques sont quasi exclusivement supérieures à 10 %. Le séquençage NGS est possible avec parfois des difficultés bio-informatiques d’alignement dans cette région hautement répétitive. Méthode manuelle, automatisable. Test principalement qualitatif, quantification possible. CIQ Maison. EEQ Prévu au sein du GBMHM. Performances du test Causes d’erreur, limites du test Marque de clonalité fournissant un argument fort en faveur du diagnostic de NMP. Classification pronostique. De rares variants génétiques constitutionnels entraînent des variations du nombre de répétitions de l’exon 9. Ces délétions de bases par multiples de trois ne doivent pas être confondues avec des mutations pathogènes. 280 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.6 Recherche de mutations de MPL Code RIHN N455 (forfait) Signification biologique du paramètre MPL est le gène codant pour le récepteur de la thrombopoïétine. Il est muté chez un faible pourcentage de patients présentant des néoplasies myéloprolifératives (NMP) à prédominance mégacaryocytaire (thrombocytémie essentielle : environ 5 %, myélofibrose primitive : jusqu’à 10 %). Les mutations de MPL se situent principalement au niveau de l’exon 10 et plus particulièrement au niveau du tryptophane en position 515. Ce résidu, proche de la zone transmembranaire, assure le maintien au repos du dimère de récepteurs en l’absence de ligand. Sa substitution pour un grand nombre d’autres acides aminés entraîne une activation du récepteur en l’absence de thrombopoïétine. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription En présence d’une thrombocytose ou d’une suspicion de myélofibrose, la mise en évidence Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Le plus souvent mutuellement exclusive des autres mutations de prolifération (JAK2, CALR), la recherche de mutations de MPL est plutôt réalisée en troisième intention après la recherche de mutations JAK2V617F et de l’exon 9 de CALR, en cas de suspicion de Thrombocytémie Essentielle ou de myélofibrose. Rarement, ces mutations peuvent être associées, surtout en cas de faible charge allélique JAK2V617F. La recherche de cette mutation est le plus souvent réalisée sur l’échantillon d’ADN extrait pour la recherche de mutation JAK2V617F réalisée en première ligne. Température ambiante, transport rapide (sous 24 h) surtout si nécessité de purifier les polynucléaires. Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Plusieurs techniques sont disponibles, explorant tout l’exon 10 de MPL (HRM1, séquençage) ou uniquement la position W515, voire uniquement les deux substitutions les plus fréquentes (PCR spécifiques d’allèles). Le séquençage par NGS est volontiers utilisé. Méthode manuelle, automatisable. Mesure qualitative, certaines techniques sont quantitatives. Maison. EEQ Non. Causes d’erreur, limites du test Place éventuelle dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Sang sur tube EDTA, voire moelle osseuse. CIQ Valeurs de référence/ Performances du test d’une mutation de MPL est un argument fort en faveur du diagnostic de NMP. Il y a une possible classification pronostique, sous réserve du faible nombre de patients rapportés dans les séries : les mutations de MPL confèrent un risque thrombotique proche de celui observé chez les patients présentant une mutation JAK2V617F et un risque fibrotique qui serait plus important qu’avec les autres mutations. La mise en évidence d’une mutation de MPL est une marque de clonalité fournissant un argument fort en faveur du diagnostic de néoplasie myéloproliférative. Classification pronostique. Selon la technique utilisée, certaines mutations peuvent ne pas être détectées, soit par manque de sensibilité (petits clones fréquents), soit qu’il s’agisse d’une mutation plus rare non explorée (mutation S505, autres mutations complexes, etc.). 1. HRM: High Resolution Melting. Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes 281 Fiche 18.7 Recherche de mutations de CSF3R et SETBP1 Code RIHN N455 (forfait) Signification biologique du paramètre CSF3R est le gène qui code pour le récepteur du G-CSF. Des mutations activatrices ont été retrouvées, principalement dans les néoplasies myéloprolifératives (NPM) rares ou atypiques (leucémie neutrophile chronique, LNC, et leucémie myéloïde chronique atypique, LMCa). Il existe deux zones importantes de mutation : une dans le domaine extracellulaire, proche du domaine transmembranaire, dont les mutations activent la voie JAK-Stat, l’autre au niveau intracellulaire où des délétions suppriment des régions de régulation négative. SETBP1 est un partenaire de SET, un inhibiteur de la phosphatase suppresseur de tumeur PP2A. Les mutations de l’exon 4 (domaine SKI) de SETBP1 inhibent la dégradation de la protéine, permettant donc sa surexpression qui inhibe PP2A mais aussi d’autres cibles comme RUNX1. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription ment) dans les LNC (surtout CSF3R) et les LMCa. Tous deux sont des marqueurs de clonalité parfois fort utiles. Les mutations de CSF3R constituent un critère majeur de diagnostic des LNC. Les mutations de SETBP1 semblent associées à un pronostic défavorable dans les LMCa mais aussi dans les Leucémies myélomonocytaires chroniques (LMMC). Les mutations de CSF3R pourraient conférer une sensibilité élective aux inhibiteurs de JAK2. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Ces recherches sont volontiers pratiquées lors du bilan de NMP inhabituel, à la recherche d’un marqueur de clonalité en l’absence d’anomalie cytogénétique ou pour en préciser le type et le pronostic. Elles sont fréquemment associées à des explorations plus larges par technique de Next Generation Sequencing (NGS). Les mutations de ces deux gènes, volontiers associées, se retrouvent principalement (mais pas exclusiveNature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Sang sur tube EDTA, voire moelle osseuse. L’examen est souvent réalisé sur l’échantillon d’ADN extrait pour la recherche de mutation JAK2V617F faite en première ligne. Température ambiante, transport rapide. Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Le séquençage est nécessaire, soit par technique de Sanger avec sa limite de sensibilité (1020 %), soit souvent par NGS (Next Generation Sequencing). Méthode manuelle, automatisable. Mesure qualitative. CIQ Maison. EEQ Non, sauf si panel myéloïde du GBMHM. Valeurs de référence/Performances du test Marque de clonalité fournissant un argument fort en faveur du diagnostic de néoplasie myéloproliférative. Argument en faveur du diagnostic de LNC pour CSF3R. Classification pronostique. Causes d’erreur, limites du test Qualité de l’ADN, envahissement tumoral. 282 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.8 Forfait syndromes myélodysplasiques (SMD) Code RIHN N456 (forfait) Signification biologique du paramètre Les syndromes myélodysplasiques (SMD) sont des hémopathies myéloïdes hétérogènes du sujet âgé dont le diagnostic repose sur l’examen morphologique des cellules médullaires. La physiopathologie des SMD est associée à la présence de nombreuses mutations somatiques. Ces mutations affectent des gènes impliqués dans différents processus cellulaires dont la régulation épigénétique, l’épissage des ARN, la prolifération et la différentiation. Grâce aux nouvelles technologies de séquençage ciblant les principaux gènes d’intérêt, il est admis désormais que 90 % des patients sont porteurs d’au moins une mutation et en moyenne entre 2 et 3 mutations sont retrouvées par patient, en association avec les anomalies cytogénétiques observées dans 50 % des cas. Au niveau international, la classification des hémopathies mise à jour par l’OMS en 2016 a introduit la présence de mutations somatiques afin de mieux définir l’entité des SMD avec sidéroblastes en couronne (SMD-RS). À terme, les résultats de la recherche de mutations somatiques dans les SMD seront incorporés lors de la prochaine révision du score pronostic international (IPSS-R2). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription En lien avec de nombreuses publications, la recherche de mutations somatiques dans le cadre des SMD se révèle importante pour : • aider dans certains cas à poser le diagnostic (en cas de dysplasie d’interprétation délicate et dans Nature du prélèvement le cadre de l’abaissement du seuil de sidéroblastes en couronne à 5 % s’il existe une mutation de SF3B1 pour les SMD-RS selon la classification OMS 2016) ; • affiner le pronostic des patients selon le statut mutationnel du gène TP53 et/ou le nombre cumulé de mutations ; • envisager des pistes thérapeutiques (si présence de mutation dans les gènes IDH1, IDH2, SF3B1, SRSF2, U2AF1, DNMT3A, etc.) ; • utiliser ces données en tant que marqueurs théranostiques. Ce dernier point est en lien avec les traitements par agents stimulant l’érythropoïèse, par hypométhylants ou par greffe allogénique de cellules souches hématopoïétiques en association avec les autres marqueurs déjà établis. La recherche de mutations somatiques dans les SMD s’envisage sous la forme d’un forfait englobant les principaux gènes décrits (recommandations GBMHM). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Chez tout patient bénéficiant d’un projet thérapeutique, la recherche des mutations somatiques dans les SMD doit se faire au stade du diagnostic en première intention et doit s’envisager en deuxième intention en cas d’évolution de la maladie ou de perte de réponse au traitement mis en place. Tous ces résultats doivent faire l’objet de réunions de concertation pluridisciplinaires afin d’aider à la prise en charge des patients. Moelle sur tube EDTA ou milieu Hank’s hépariné/culot de cytogénétique. Recommandations pour la qualité du prélèvement Le plus souvent réalisé sur l’échantillon d’ADN extrait du matériel médullaire ayant permis de poser le diagnostic cytologique/cytogénétique. Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 48 h). Mode de conservation Température ambiante jusqu’à séparation cellulaire. Possibilité de travailler sur moelle congelée après séparation des cellules mononucléées sur gradient de ficoll. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes Plusieurs techniques sont disponibles, le séquençage de nouvelle génération (NGS) est à privilégier de par sa capacité à étudier de nombreux gènes simultanément avec une sensibilité importante. Le séquençage Sanger ou l’analyse de fragments peut se révéler utile pour certains gènes d’interprétation délicate en NGS (ASXL1, CEBPa, etc.). Méthode manuelle, non automatisable. Mesure quantitative pour le NGS, qualitative pour les autres techniques. CIQ Maison/En cours de réflexion au sein du GBMHM (groupe de biologie moléculaire des hémopathies malignes). EEQ Disponible au sein du GBMHM (NGS myéloïde). Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test 283 Méthodes sensibles et spécifiques à visée diagnostique, pronostique et théranostique améliorant la prise en charge des patients. Des processus bio-informatiques adaptés et la connaissance des bases de données des variants décrits (ClinVar, UCSC, etc.) sont nécessaires pour l’interprétation correcte du caractère somatique des mutations. Toute suspicion d’une anomalie constitutionnelle devra faire l’objet d’une consultation de génétique auprès d’un spécialiste. 2. IPSS : International Prognostic Scoring System. 284 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.9 Recherche de la mutation de NPM1 Code RIHN N459 (forfait) Signification biologique du paramètre NPM1 est une protéine chaperonne multifonctionnelle faisant la navette entre le noyau et le cytoplasme. En situation physiologique, sa localisation est essentiellement nucléolaire. Elle joue un rôle dans la stabilité du génome, la biogénèse des ribosomes et régule des gènes suppresseurs de tumeurs. Les mutations de NPM1 dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) sont localisées sur l’exon 12 et consistent en une insertion de 4 bases, décalant le cadre de lecture, et aboutissant à une protéine modifiée d’expression cytoplasmique prépondérante. Ces mutations sont présentes dans 30 % des LAM et plus particulièrement dans le sous-groupe à caryotype normal. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription • un facteur pronostique majeur dans les LAM de groupe cytogénétique intermédiaire (classification ELN 2017) permettant de classer les patients dans le groupe favorable si elle est associée à une absence de mutation de FLT3-ITD ou à une mutation FLT3-ITD de ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage < 0,5 ; • une cible de quantification de la maladie résiduelle (MRD). Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans le bilan d’une LAM de cytogénétique intermédiaire, la recherche d’une mutation de NPM1 est indispensable pour la stratification thérapeutique et est réalisée en première intention. Si elle est positive, elle peut également servir de cible pour la quantification de la MRD. La recherche de la mutation NPM1 permet d’identifier : Nature du prélèvement Moelle sur EDTA. Si blastose périphérique, sang EDTA ou sang citrate CPT. Recommandations pour la qualité du prélèvement Il est nécessaire d’utiliser un prélèvement le plus blastique possible (> 20 %). La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes. Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tubesCPT, centrifuger avant envoi. Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de cellules mononucléées de sang ou de moelle osseuse. Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Plusieurs techniques disponibles, le plus souvent PCR fluorescente avec analyse de fragments et séquençage Sanger ou séquençage de nouvelle génération (NGS, Next Generation Sequencing). Méthode manuelle, partiellement automatisable. Mesure qualitative pour la détection, quantitative pour la MRD. CIQ Contrôles interlaboratoires. EEQ Envisagé (GBMHM). Valeurs de référence/ Performances du test Causes d’erreur, limites du test Méthode sensible et spécifique. Il y a peu de faux négatifs car il existe une très bonne corrélation entre la blastose et le clone portant la mutation NPM1. On observe peu de variation lors des rechutes. Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes 285 Fiche 18.10 Recherche des mutations de FLT3 : FLT3-ITD et FLT3 TKD Code RIHN N459 (forfait) Signification biologique du paramètre FLT3 est un récepteur tyrosine kinase normalement exprimé à la surface des cellules progénitrices de l’hématopoïèse. Il est activé par la liaison de son ligand, la cytokine FLT3LG ; il s’en suit une dimérisation du récepteur à l’origine d’une activité tyrosine kinase entraînant une activation de voies de signalisation en aval, responsables de la survie, de la prolifération et de la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitifs. Des mutations somatiques responsables d’une activation constitutive de FLT3 (sans liaison nécessaire du ligand) ont été identifiées dans deux domaines fonctionnels du récepteur : • le domaine juxta membranaire de FLT3, mutation qui consiste en une duplication interne en tandem (FLT3-ITD), en phase de lecture (multiple de 3 bases), de taille et de localisation variables entre les exons 14 et 15 ; • le domaine tyrosine kinase de FLT3, mutation non-sens dans l’exon 20 de FLT3 TKD ou mutations des codons D835 et I836. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription La recherche de la mutation FLT3-ITD est un facteur pronostique majeur dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) de groupe cytogénétique intermédiaire, permettant de classer les patients dans le groupe ELN défavorable en cas de ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage > 0,5 (European LeukemiaNet [ELN] 2017). La recherche de la mutation FLT3-ITD et TKD est indiquée pour mettre en place un traitement par un inhibiteur ciblant l’activité tyrosine kinase de FLT3. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Dans le bilan de LAM de cytogénétique intermédiaire, la recherche de mutation FLT3-ITD est indispensable pour la stratification thérapeutique (indication d’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques) en première ligne. Moelle sur EDTA, si blastique. Sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT. Prélèvement le plus blastique possible (> 20 %). La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes. Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT, centrifuger avant envoi. Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de sang ou de moelle avec plus de 20 % de blastes. Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Plusieurs techniques sont disponibles, le plus souvent PCR fluorescente avec analyse de fragments permettant l’établissement d’un ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage. La mutation FLT3-TKD peut être recherchée par technique HRM (High Resolution Melting), séquençage Sanger ou séquençage de nouvelle génération. Méthode manuelle, partiellement automatisée. Mesure qualitative et quantitative avec calcul du ratio pour FLT3-ITD. Mesure qualitative pour la recherche de mutation FLT3-TKD. CIQ Dilution de la lignée FLT3-ITD mutée. Échanges interlaboratoires. EEQ Oui, ponctuel (GBMHM). Performances du test Causes d’erreur, limites du test Marqueur pronostique et théranostique pour les traitements par un inhibiteur ciblé anti FLT3. Fréquence de sous-clones multiples très faiblement mutés pour FLT3-ITD. 286 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 18.11 Mutation de CEBPa Code RIHN N459 (forfait) Signification biologique du paramètre La protéine CEBPα (qui existe sous deux isoformes, p30 et p42) est un facteur de transcription impliqué dans l’hématopoïèse des granuleux et des monocytes. Les mutations de CEBPα sont le plus souvent acquises, somatiques. On en observe deux types : les mutations C terminales affectant la liaison à l’ADN et l’homo ou l’hétérodimérisation de la protéine et les mutations N terminales produisant une protéine tronquée favorisant l’expression de l’isoforme le plus court de la protéine, p30, qui inhibe la transactivation de l’isoforme p42 par un effet dominant négatif. L’augmentation du ratio p30/p42 bloque l’induction du récepteur au G-CSF. Les doubles mutations du gène CEBPα sont présentes dans environ 4 % des leucémies aiguës myéloïdes (LAM) de patients de moins de 65 ans. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Les mutations bi-alléliques de CEBPα sont un facteur de bon pronostic dans les LAM de groupe Nature du prélèvement cytogénétique intermédiaire permettant de classer les patients dans le groupe clinique favorable si elles sont associées à une absence de mutation de FLT3-ITD ou à une mutation FLT3-ITD de ratio FLT3-ITD/FLT3 sauvage < 0,5 (classification ELN 2017). Ces patients ne seront pas éligibles, dans un premier temps, à un traitement intensif du type allogreffe de cellules souches hématopoïétiques. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Les mutations FLT3-ITD et FLT3-TKD doivent être recherchées systématiquement en cas d’indication de traitement par inhibiteur de Flt3. De plus, dans le bilan de LAM de cytogénétique intermédiaire, la recherche de mutation CEBPa est indispensable pour la stratification thérapeutique du patient. Elle peut être réalisée dans un deuxième temps après la recherche de mutation de FLT3-ITD et de NPM1 (qui sont plus fréquentes). Moelle sur EDTA, sang si blastique – sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT. Recommandations pour la qualité du prélèvement Utiliser le prélèvement le plus blastique possible. Du fait de la sensibilité de la technique utilisée (séquençage Sanger), un pourcentage de blastes supérieur à 20 % est nécessaire pour la validation du résultat. La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes. Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT, centrifuger avant envoi. Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de sang ou de moelle avec plus de 20 % de blastes. Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Seule la technique de séquençage Sanger est utilisée pour mettre en évidence les mutations de CEBPα (insertion/délétion, parfois de grande taille, mutation ponctuelle, duplication, etc.). Le séquençage de nouvelle génération n’est pas, pour le moment, adapté au séquençage de ce gène du fait de sa structure (richesse en bases GC) et de la taille des insertions/délétions. Méthode manuelle, partiellement automatisée ou totalement automatisable. Mesure qualitative. CIQ Échanges interlaboratoires. EEQ Oui, en cours GBMHM. Valeurs de référence/ Performances du test Causes d’erreur, limites du test Difficultés d’interprétation de certaines mutations (substitution) dont le caractère pathogénique n’est pas certain (nombreux polymorphismes). Préconiser des contrôles sur sang après rémission ou sur prélèvement de matériel biologique constitutionnel. Pourcentage de blastes insuffisant (< 20 %). Chapitre 18. Exploration des proliférations myéloïdes 287 Fiche 18.12 Mutations de RUNX1, TP53, ASXL1, IDH1 et IDH2 Code RIHN N459 (forfait) Signification biologique du paramètre Recherche de mutations de mauvais pronostic clinique dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) : • RUNX1 (AML1), facteur de transcription nécessaire à l’hématopoïèse tardive ; • ASXL1, protéine nucléaire impliquée dans la régulation épigénétique de l’expression de gènes et participant au remodelage de la chromatine ; • TP53, facteur de transcription nucléaire impliqué dans l’arrêt du cycle cellulaire et la mort cellulaire par apoptose pour permettre de pallier à d’éventuels dommages de l’ADN. TP53 a un rôle dans le maintien de la stabilité du génome. Recherche de mutations à visée théranostique dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) : IDH1 et IDH2 (isocitrate déshydrogénase), enzymes impliquées dans le cycle de Krebs dont les mutations entraînent l’augmentation de production d’un oncométabolite le 2 hydroglutarate (2 HG). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Une mutation des gènes RUNX1, ASXL1 ou TP53 est un facteur de mauvais pronostic qui entraîne le reclassement du patient de groupe intermédiaire en groupe de mauvais pronostic en cas de caryotype de risque intermédiaire. Les mutations de RUNX1 et ASXL1 sont fréquemment associées. La plupart des LAM avec mutation de TP53 sont déjà classées dans le groupe de mauvais pronostic du fait de la coexistence d’anomalies cytogénétiques de mauvais pronostic (caryotype complexe ou monosomique). La recherche de mutations des gènes IDH1/2 est à visée théranostique car il existe des médicaments inhibiteurs d’IDH1 et IDH2 et la mise en évidence de ces mutations peut changer la stratégie thérapeutique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Ces recherches sont réalisées pour les patients présentant une LAM du groupe cytogénétique intermédiaire n’ayant pas de mutation FLT3ITD/sauvage > 0,5, ce qui les classe dans le groupe de mauvais pronostic. La recherche des mutations des gènes IDH1/2 est effectuée en seconde intention en cas de LAM en rechute ou réfractaire, mais devrait rapidement être effectuée au diagnostic (années 2020). Nature du prélèvement Moelle sur EDTA, si blastique, sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT. Recommandations pour la qualité du prélèvement Prélèvement le plus blastique possible (> 20 %). La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes. Contraintes d’acheminement Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT, centrifuger avant envoi. Possibilité d’envoi d’ADN issu d’un échantillon de cellules mononucléées de sang ou de moelle osseuse. Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Séquençage Sanger et/ou séquençage de nouvelle génération (NGS). Méthode automatisée partiellement. Mesure qualitative. CIQ Échanges interlaboratoires. EEQ Oui GBMHM pour le NGS myéloïde. Valeurs de référence/ Performances du test Causes d’erreur, limites du test Pourcentage de blastes insuffisant, couverture incomplète du gène. 288 Oncologie moléculaire hématologique Bibliographie du chapitre 18 FICHE 18.1 – Recherche et quantification des transcrits BCR-ABL1 Arber D, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. 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Clinical effects of driver somatic mutations on the outcomes of patients with myelodysplastic syndromes treated with allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. J Clin Oncol 2016;34:3627–37. FICHE 18.11 – Mutation de CEBPa FICHE 18.9 – Recherche de la Mutation de NPM1 FICHE 18.12 – Mutations de RUNX1, TP53, ASXL1, IDH1 et IDH2 Falini B, Mecucci C, Tiacci E, et al. GIMEMA Acute Leukemia. Working Party. Cytoplasmic nucleophosmin in acute myelogenous leukemia with a normal karyotype. N Engl J Med 2005;352:254–66. Döhner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017;129:424–47. FICHE 18.10 – Recherche des mutations de FLT3: FLT3-ITD et FLT3 TKD Nakao M, Yokota S, Iwai T, et al. Internal tandem duplication of the flt3 gene found in acute myeloid leukemia. Leukemia 1996;10:1911–8. Yamamoto Y, Kiyoi H, Nakano Y, et al. Activating mutation of D835 within the activation loop of FLT3 in human hematologic malignancies. Blood 2001;97:2434–9. Döhner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017;129:424–47. Pabst T, Mueller BU, Zhang P, et al. Dominant-negative mutations of CEBPA, encoding CCAAT/enhancer binding protein-alpha (C/EBPalpha), in acute myeloid leukemia. Nat Genet 2001;27:263–70. Döhner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017;129:424–47. Metzeler KH, Herold T, Rothenberg-Thurley M, et al. Spectrum and prognostic relevance of driver gene mutations in acute myeloid leukemia. Blood 2016;128:686–98. Paschka P, Schlenk RF, Gaidzik VI, et al. ASXL1 mutations in younger adult patients with acute myeloid leukemia: a study by the German-Austrian Acute Myeloid Leukemia. Study Group. Haematologica 2015;100: 324–30. Terada K, Yamaguchi H, Ueki T, et al. Full-length mutation search of the TP53 gene in acute myeloid leukemia has increased significance as a prognostic factor. Ann Hematol 2018;97:51–61. Stein EM, DiNardo CD, Pollyea DA, et al. Enasidenib in mutant IDH2 relapsed or refractory acute myeloid leukemia. Blood 2017;130:722–31. Döhner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017;129:424–47. Chapitre 19 Exploration des proliférations lymphoïdes Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 292 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 19.1 Recherche de clonalité B par PCR multiplex Codes LC N400 et N420 Signification biologique du paramètre La région variable des immunoglobulines (Ig) est dotée d’une extrême diversité. Celle-ci résulte de processus de recombinaisons génétiques complexes survenant pendant l’ontogenèse des lymphocytes B qui aboutissent à la juxtaposition des différents gènes (V, éventuellement D et J) qui codent pour ces régions variables. Dans une population lymphoïde B clonale, toutes les cellules ont les mêmes réarrangements des gènes de chaînes lourdes (IGH) et légères kappa (IGK) ou lambda (IGL), alors qu’une population réactionnelle est composée de cellules portant un ensemble de réarrangements distincts. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’étude moléculaire de clonalité lymphoïde B est d’analyser les profils des réarrangements des gènes des Ig (en particulier la zone Nature du prélèvement de leur juxtaposition) et de déterminer s’ils ont une allure clonale (taille unique) ou non (tailles multiples). L’étude de clonalité moléculaire est indiquée : • devant une prolifération lymphoïde suspecte sur une biopsie tissulaire ou des cellules en suspension (en particulier en l’absence de monotypie franche des chaînes légères à l’immunophénotypage, ou en l’absence d’immunophénotypage) ; • pour comparer et affirmer la nature clonale identique (ou non) en cas de localisations multiples ou de récidive d’une hémopathie connue. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit le plus souvent d’une technique de deuxième intention à mettre en œuvre en cas de doute sur un prélèvement après un examen anatomo-pathologique, cytologique et/ou immunophénotypique. Biopsie tissulaire fraîche, congelée ou fixée et incluse en paraffine. Sang, moelle, ou tout autre liquide biologique. Recommandations pour la Prélèvement sur EDTA (l’héparine peut interférer avec l’amplification). qualité du prélèvement L’ADN extrait de fragment en paraffine peut parfois être de moins bonne qualité, car trop fragmenté. Contraintes d’acheminement Température ambiante (sauf biopsie congelée) sous 48 h. Mode de conservation Température ambiante (sauf biopsie congelée) jusqu’à extraction de l’ADN. Principe méthodologique Type de méthode Type de test La méthode est basée sur l’amplification génique des régions variables des gènes des Ig par la technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) à l’aide d’amorces multiples (multiplex). Les produits d’amplification sont ensuite analysés par électrophorèse (le plus souvent capillaire). La cible de choix est le locus IGH, qui doit être complétée dans certains cas (résultat faussement négatif en raison de mutations somatiques dans les IGH) par celui des loci IGK et des IGL. Méthode manuelle, éventuellement automatisable. Mesure essentiellement qualitative, bien qu’une appréciation grossièrement quantitative (clone majoritaire ou minoritaire) puisse être obtenue. CIQ Maison et commercial. EEQ EEQ national (GBMHM) et européen (EuroClonality). Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Test spécifique mais devant être interprété en fonction d’autres données biologiques (résultats anatomo-pathologiques, cytologiques, immuno-phénotypiques). Il faut distinguer la polyclonalité, associée aux populations B physiologiques, l’oligoclonalité témoignant d’une réponse immunitaire restreinte à quelques clones et la clonalité vraie se traduisant par un pic unique. - La présence d’un clone lymphoïde B, surtout minoritaire, n’est pas toujours synonyme de population tumorale maligne. - La technique a une sensibilité d’environ 5 % et n’est donc pas adaptée au suivi de la maladie résiduelle (qui nécessite une autre méthodologie). Chapitre 19. Exploration des proliférations lymphoïdes 293 Fiche 19.2 Recherche de clonalité T par PCR multiplex Codes LC N404 et N420 Signification biologique du paramètre La région variable des récepteurs à l’antigène des lymphocytes T (TCR) est dotée d’une extrême diversité. Celle-ci résulte de processus de recombinaison génétique complexes survenant pendant l’ontogenèse des lymphocytes et aboutissant à la juxtaposition des différents gènes (V, éventuellement D et J) qui codent pour ces régions variables. Dans une population lymphoïde T clonale, toutes les cellules ont les mêmes réarrangements des gènes des TCR, alors qu’une population réactionnelle est composée de cellules portant un ensemble de réarrangements distincts. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’étude moléculaire de clonalité lymphoïde T est d’analyser les profils des réarrangements des gènes des TCR (en particulier la zone de leur juxtaposition) et de déterminer s’ils ont une allure clonale (taille unique) ou non (tailles multiples). L’étude de clonalité moléculaire est indiquée : • devant une prolifération lymphoïde suspecte sur une biopsie tissulaire ou sur des cellules en suspension (en particulier en cas d’anomalies cytologiques et/ou à l’immunophénotypage) ; • pour comparer et affirmer la nature clonale identique (ou non) en cas de localisations multiples ou de récidive d’une prolifération T connue. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Il s’agit le plus souvent d’une technique de deuxième intention à mettre en œuvre en cas de doute sur un prélèvement après un examen anatomo-pathologique, cytologique et/ou immunophénotypique. Nature du prélèvement Biopsie tissulaire fraîche, congelée ou fixée et incluse en paraffine. Sang ou moelle sur EDTA, ou tout autre liquide biologique. Recommandations pour la qualité du prélèvement Prélèvement sur EDTA (l’héparine peut interférer avec l’amplification). L’ADN extrait de tissus conservés en paraffine peut parfois être de moins bonne qualité, trop fragmenté. Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Type de méthode Type de test Pas de délai pour les biopsies congelées ou fixées, 48 heures pour sang ou moelle. Température ambiante (sauf biopsie congelée, carboglace) jusqu’à extraction de l’ADN. La méthode est basée sur l’amplification génique des régions variables des TCR par la technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) à l’aide d’amorces multiples (multiplex). Les produits d’amplification sont ensuite analysés par électrophorèse (le plus souvent capillaire). La cible de choix est le TCR gamma car il est réarrangé dans tous les lymphocytes T matures et un grand nombre de proliférations T immatures1, qu’ils soient de type alpha-bêta ou gamma-delta. On peut compléter le bilan par l’analyse des gènes du TCR bêta s’il persiste un doute, ou exceptionnellement du TCR delta pour confirmer le caractère gamma-delta d’une prolifération T. Méthode manuelle, éventuellement automatisable en partie. Mesure essentiellement qualitative, bien qu’une appréciation grossièrement quantitative (clone majoritaire ou minoritaire) puisse être obtenue. CIQ Maison et commercial. EEQ EEQ national (GBMHM) et européen (EuroClonality). 294 Oncologie moléculaire hématologique Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Test spécifique mais devant toujours être interprété en fonction du contexte clinique et des autres résultats biologiques, en particulier anatomopathologiques, cytologiques, immunophénotypiques. Il faut distinguer la polyclonalité, associée aux populations T physiologiques, l’oligoclonalité témoignant d’une réponse immunitaire restreinte à quelques clones et la clonalité vraie se traduisant par un pic unique. - Clonalité n’est pas toujours synonyme de malignité. Ceci est particulièrement vrai en cas de clones T plus ou moins minoritaires qui peuvent se voir dans de nombreuses situations s’accompagnant d’un déséquilibre du répertoire immunitaire : infections (chroniques surtout), auto-immunité, greffe de moelle, immunodépression, vieillissement. - La technique a une sensibilité d’environ 5 % et n’est donc pas adaptée au suivi de la maladie résiduelle qui nécessite une autre méthodologie. 1. Le locus gamma est le premier à être réarrangé lors de la lymphopoïèse T et les réarrangements abortifs persistent dans le génome des lymphocytes T à TCR alpha-bêta. Chapitre 19. Exploration des proliférations lymphoïdes 295 Fiche 19.3 Statut mutationnel du locus de la chaîne lourde des immunoglobulines Code RIHN N420 Signification biologique du paramètre Les lymphocytes B subissent une phase de différenciation complémentaire dans les organes lymphoïdes secondaires caractérisée en particulier par la maturation d’affinité de leur récepteur à l’antigène (B-Cell Receptor, BCR). Celle-ci est liée à l’introduction de mutations somatiques dans les gènes codant pour les régions variables des immunoglobulines, et à la sélection des mutants ayant une affinité accrue pour leur cible antigénique. Pour des raisons encore mal élucidées, le taux de ces mutations somatiques dans les régions variables des gènes de chaînes lourdes des immunoglobulines (IGHV) constitue un facteur pronostique majeur des leucémies lymphoïdes chroniques (LLC). Un taux de mutation inférieur à 2 % (ou autrement dit une identité avec la séquence germinale d’origine de plus de 98 %) est un facteur de mauvais pronostic, l’inverse étant vrai pour un taux de mutations supérieur à 2 %. De plus, des séquences de BCR quasi identiques (qualifiées de stéréotypiques) ont été décrites chez des patients différents, certaines d’entre elles ayant une valeur pronostique indépendante de leur statut mutationnel IGHV. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’analyse consiste à réaliser la séquence des gènes IGHV des cellules tumorales afin de déterminer leur pourcentage d’identité par rapport aux séquences dites germinales dont elles dérivent. Elles sont alors classées en « non mutées » ou « mutées » selon que ce pourcentage est supérieur ou inférieur au seuil de 98 %. Le statut mutationnel IGHV est un facteur à visée pronostique puissant, mais qui tend à devenir également un facteur théranostique pour guider l’attitude thérapeutique. À noter que contrairement à de nombreux autres paramètres biologiques (génétiques notamment), le statut mutationnel IGHV est inchangé au cours de l’évolution de la maladie, et peut donc être réalisé à n’importe quel moment de la prise en charge du patient. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Cet examen a une place dans le bilan pronostique de la maladie, et est désormais à prendre en compte pour guider le choix thérapeutique. Sang (sur EDTA) essentiellement. Rarement moelle osseuse ou biopsie ganglionnaire (fraîche, congelée ou fixée et incluse en paraffine). Il est parfois nécessaire de réaliser l’analyse à partir de l’ARN, ce qui nécessite un délai de transport de moins de 48 h. Température ambiante, transport rapide (sous 48 h). Mode de conservation Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire et extraction de l’ADN. Possibilité de travailler sur cellules congelées. Principe méthodologique La méthode comporte plusieurs étapes : 1) amplification génique des réarrangements clonaux des gènes d’immunoglobulines par la technique de Polymerase Chain Reaction (PCR) (voir chapitre 19) ; 2) séquençage des produits de PCR par technique conventionnelle (Sanger) ou de nouvelle génération (NGS) ; 3) comparaison de la séquence obtenue avec la séquence germinale la plus proche à l’aide d’outils bio-informatiques spécifiques. 296 Oncologie moléculaire hématologique Type de méthode Type de test Méthode manuelle, pouvant être partiellement automatisable. Mesure qualitative. CIQ Maison et commercial. EEQ EEQ européen (ERIC : European Research Initiative on CLL). Valeurs de référence/Performances du test Test spécifique de la LLC, aucune valeur n’a été démontrée à ce jour pour les autres hémopathies lymphoïdes. Causes d’erreur, limites du test L’amplification des gènes IGHV peut parfois s’avérer impossible à partir de l’ADN (en raison de mutations somatiques) et nécessiter le recours à l’ARN. En outre, le statut mutationnel peut être impossible à déterminer dans de rares situations : absence d’obtention d’un réarrangement productif, présence de 2 réarrangements ayant des statuts mutationnels discordants (l’un muté, l’autre non muté). Chapitre 19. Exploration des proliférations lymphoïdes 297 Fiche 19.4 Étude du profil mutationnel des hémopathies lymphoïdes par séquençage haut débit Code RIHN N452 (forfait) Signification biologique du paramètre Les hémopathies lymphoïdes (B et T) sont un groupe hétérogène d’hémopathies, dont la nosologie intègre des données cliniques, morphologiques, phénotypiques, cytogénétiques et moléculaires. L’avènement des technologies de séquençage du génome à haut débit a permis de mettre en évidence des mutations récurrentes dans certaines entités, dont la détection peut avoir un impact pour le diagnostic positif, la stratification pronostique ou la décision thérapeutique (théranostique). Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif de l’analyse est de rechercher des mutations ponctuelles/insertions/délétions concernant un panel de gènes ayant un impact dans la prise en charge diagnostique, pronostique et/ou théranostique des hémopathies lymphoïdes. Un travail commun du GBMHM (Groupe de biologie moléculaire des hémopathies malignes) et du LYSA (LYmphoma Study Association) a permis de proposer un panel de gènes d’intérêt pour les hémopathies lymphoïdes B ou T, publié en 2018. Il n’y a pas actuellement de consensus sur les indications de l’analyse moléculaire des hémopathies lymphoïdes. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration En première ligne, il semble raisonnable d’avoir recours au séquençage d’un lymphome en cas de diagnostic difficile, ou bien pour préciser le pronostic (par exemple en déterminant le score m7 FLIPI [Follicular Lymphoma International Prognostic Index] dans le lymphome folliculaire), ou encore à visée théranostique (par exemple, recherche de mutations de TP53 dans la leucémie lymphoïde chronique [LLC], qui sera alors traitée par un inhibiteur de la voie du BCR). En situation de rechute ou de maladie réfractaire, l’analyse du profil mutationnel peut permettre de favoriser l’inclusion dans un essai clinique de thérapie ciblée. Nature du prélèvement De préférence ADN extrait de biopsie envahie congelée ou fixée et incluse en paraffine, en sachant que la qualité de la technique est alors altérée. Recommandations pour la qualité du prélèvement La qualité de l’ADN est optimale à partir de matériel congelé, ou de prélèvement sanguin ou médullaire si ces tissus sont envahis. Contraintes d’acheminement Il est souhaitable que les biopsies parviennent à l’état frais au laboratoire d’anatomo-pathologie, qui réalisera alors la congélation d’un fragment. Mode de conservation Une fois congelés, les prélèvements peuvent être conservés à – 80 °C pendant plusieurs années. Principe méthodologique Type de méthode Type de test CIQ - Enrichissement de l’ADN tumoral par la constitution d’une librairie représentant le panel de gènes d’intérêt (différentes stratégies existent : capture, amplicons, etc.). - Séquençage des librairies. - Analyse bio-informatique. Méthode manuelle, automatisable. Mesure qualitative avec données quantitatives (fréquence d’allèles variants). Maisons ou commerciaux. 298 Oncologie moléculaire hématologique EEQ Organisés par le GBMHM. Performances du test Les performances sont largement dépendantes de facteurs pré-analytiques : degré d’envahissement tumoral, qualité de l’ADN. Les pipelines d’analyse bio-informatique sont très importants pour l’identification de polymorphismes et de mutations pathologiques. Causes d’erreur, limites du test - Difficultés d’interprétation de certains variants : est-ce une mutation somatique ou un polymorphisme rare ? Ce variant a-t-il une signification biologique claire ? - Hétérogénéité tumorale. Chapitre 19. Exploration des proliférations lymphoïdes Bibliographie du chapitre 19 FICHE 19.1 – Recherche de clonalité B par PCR multiplex van Dongen JJ, Langerak AW, Brüggemann M, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003;17:2257–317. Evans P, Pott Ch, Groenen PJ, et al. Significantly improved PCR-based clonality testing in B-cell malignancies by use of multiple immunoglobulin gene targets. Report of the BIOMED-2 Concerted Action BHM4-CT98-3936. Leukemia 2007;21:207–14. Langerak AW, Groenen PJ, Brüggemann M, et al. EuroClonality/BIOMED-2 guidelines for interpretation and reporting of Ig/TCR clonality testing in suspected lymphoproliferations. Leukemia 2012;26:2159–71. FICHE 19.2 – Recherche de clonalité T par PCR multiplex van Dongen JJ, Langerak AW, Brüggemann M, et al. Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia 2003;17:2257–317. Brüggemann M, White H, Gaulard P, et al. Powerful strategy for polymerase chain reaction-based clonality assessment in T-cell malignancies Report of the BIOMED-2 Concerted Action BHM4 CT98-3936. Leukemia 2007;21:215–21. 299 Langerak AW, Groenen PJ, Brüggemann M, et al. EuroClonality/BIOMED-2 guidelines for interpretation and reporting of Ig/TCR clonality testing in suspected lymphoproliferations. Leukemia 2012;26: 2159–71. FICHE 19.3 – Statut mutationnel du locus de la chaîne lourde des immunoglobulines (forfaitisé avec les leucémies lymphoïdes chroniques) Sutton LA, Hadzidimitriou A, Baliakas P, et al. European Research Initiative on CLL (ERIC). Immunoglobulin genes in chronic lymphocytic leukemia: key to understanding the disease and improving risk stratification. Haematologica 2017;102:968–71. Rosenquist R, Ghia P, Hadzidimitriou A, et al. Immunoglobulin gene sequence analysis in chronic lymphocytic leukemia: updated ERIC recommendations. Leukemia 2017;31:1477–81. Stamatopoulos K, Agathangelidis A, Rosenquist R, et al. Antigen receptor stereotypy in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2017;31:282–91. FICHE 19.4 – Étude du profil mutationnel des hémopathies lymphoïdes par séquençage haut débit Rosenquist R, Rosenwald A, Du MQ, et al. European Research Initiative on CLL (ERIC) and the European Association for Haematopathology (EAHP). Clinical impact of recurrently mutated genes on lymphoma diagnostics: state-of-the-art and beyond. Haematologica 2016;101:1002–9. Sujobert P, Le Bris Y, de Leval L, et al. Définition d’un panel minimal de gènes pour la prise en charge des hémopathies lymphoïdes matures. Hématologie 2018;24:27–59. Chapitre 20 Maladie résiduelle moléculaire Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 302 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 20.1 Recherche et quantification d’une cible unique d’oncogénétique somatique lors du diagnostic ou du suivi d’une leucémie aiguë myéloblastique (ou maladie résiduelle des LAM) Code RIHN N451 Signification biologique du paramètre La recherche de la maladie résiduelle dans les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) se réalise en général par la quantification d’une cible spécifique de la maladie : • un transcrit de fusion (PML-RARα pour les leucémies promyélocytaires, CBFβ-MYH11 pour les LAM avec inversion du 16 ou t(16;16), RUNX1-RUNX1T1 pour les LAM avec t(8;21), pour les plus fréquentes. De nombreux autres transcrits peuvent également être suivis ; • une mutation somatique comme la mutation de NPM1 ; • une hyperexpression de WT1, mais cette cible est moins spécifique de la pathologie, du fait de son expression faible dans les progéniteurs hématopoïétiques normaux. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription • Suivre la décroissance de la maladie résiduelle (MRD), facteur pronostique de la pathologie en particulier dans les LAM de type CBFβ-MYH11 et RUNX1-RUNX1T1 ou NPM1 positives. Une MRD supérieure au seuil optimal défini permet de reclasser le patient dans un groupe bénéficiant Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique d’un renforcement du traitement de consolidation (allogreffe de cellules souches hématopoïétiques). • Détecter précocement une rechute, ce qui permet d’anticiper un traitement. • Suivre les patients allogreffés, ce qui permet, en fonction du résultat du chimérisme correspondant, de proposer des traitements immunomodulateurs. Le suivi par WT1 est particulièrement intéressant en post allogreffe car son expression sanguine est plus faible dans ce contexte que chez des sujets normaux. La sensibilité de WT1 reste cependant inférieure à une cible spécifique comme NPM1 muté ou un transcrit de fusion. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Suivi précoce des LAM permettant une réorientation thérapeutique (changement du pronostic de la leucémie). Selon les cibles, des suivis précoces peuvent être indiqués dans la moelle et des suivis tardifs dans le sang. Un suivi sur les deux tissus (sang et moelle) doit être réalisé avant de changer de type de prélèvement pour une interprétation correcte des points de suivi. Moelle sur EDTA, sang sur EDTA ou sang sur citrate CPT. La réalisation d’une séparation des cellules mononucléées permet l’enrichissement du prélèvement en blastes. Température ambiante, transport rapide (sous 24 h). Si le prélèvement a été réalisé sur tube CPT, centrifuger avant envoi. Possibilité d’envoi d’ADNc issu d’un échantillon de cellules mononucléées de sang ou de moelle (cDNA correspondant à 1 µg équivalent ARN). Température ambiante jusqu’à la séparation cellulaire. Ces recherches sont réalisées par PCR quantitative avec des amorces spécifiques de l’anomalie recherchée. L’utilisation de la PCR digitale est en développement. Type de méthode Type de test Chapitre 20. Maladie résiduelle moléculaire Méthode manuelle partiellement automatisable. Mesure quantitative. CIQ Contrôles interlaboratoires. EEQ Envisagé pour certaines cibles (GBMHM). Valeurs de référence/ Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Bonne performance avec standardisation grâce à des gammes de plasmides de calibration. Quantité insuffisante de cellules, d’ARN. Dégradation de l’ARN. 303 304 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 20.2 Quantification d’une cible d’immunogénétique (Ig/TCR) lors du suivi d’une leucémie lymphoblastique ou d’un syndrome lymphoprolifératif (ou maladie résiduelle) Code RIHN N450 Signification biologique du paramètre La quantification de la maladie résiduelle (Minimal Residual Disease, MRD) est un biomarqueur puissant d’évaluation de la réponse au traitement dans les hémopathies malignes. La cinétique de disparition du clone lors des phases précoces a souvent une valeur pronostique. Elle reflète la sensibilité de l’hémopathie au traitement et la réponse de l’individu. Elle est complémentaire des marqueurs d’oncogénétique des cellules tumorales. Les remaniements clonaux des gènes codant pour les récepteurs à l’antigène des lymphocytes B et T, IG et TR, sont des marqueurs spécifiques des clones présents dans la majorité de cancers lymphoïdes, et sont des cibles idéales pour la quantification de la MRD des leucémies aiguës lymphoblastiques (LAL), du myélome multiple (MM) et de certains lymphomes, comme le lymphome du manteau1. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription L’objectif est de réaliser une amplification clonespécifique de la région CDR32 des remaniements IG/TR par Polymerase Chain Reaction (PCR) Quantitative (Q-PCR). La sensibilité, entre 10-4 et 10-5, est déterminée par la quantité d’ADN analysé. La prescription est souvent dictée par le protocole thérapeutique dans lequel est inclus le patient, surtout pour les LAL. Les points précoces permettent l’évaluation du pronostic et la stratification du traitement. Les points tardifs peuvent permettre un traitement préemptif, si la cinétique d’augmentation de la MRD est compatible avec une intervention thérapeutique. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Analyse de première intention pour le suivi des LAL (adulte et enfant). Examen restreint aux patients inclus dans des protocoles thérapeutiques pour les hémopathies lymphoïdes matures. 1. Lymphome à cellules du manteau (LCM) ou Mantle Cell Lymphoma (MCL). 2. CDR3 : 3e Complementarity Determining Region. Les CDR sont les boucles peptidiques assurant la reconnaissance spécifique d’un épitope particulier dans les domaines variables des immunoglobulines, codées par le réarrangement des gènes IGH et des chaînes légères d’immunoglobulines. Nature du prélèvement Chapitre 20. Maladie résiduelle moléculaire Moelle ou sang sur tube EDTA. Recommandations pour la qualité du prélèvement Ne pas prélever sur héparine (inhibition de l’amplification). Le prélèvement du diagnostic doit être infiltré par au moins 1 % de cellules pathologiques. Pour les lymphomes, une biopsie fixée au formol et incluse en paraffine1 peut être utilisée si de l’ADN de qualité appropriée est obtenu. Le tissu congelé est cependant préférable. Pour les prélèvements de suivi, il est nécessaire de disposer de 1 à 10 millions de cellules (15 mL de sang ou 1 à 2 mL de moelle osseuse, éviter l’hémodilution). Contraintes d’acheminement Sang ou moelle frais (sous 48 h) préférable. Il est possible de séparer les cellules mononucléées sur gradient de ficoll, et de les conserver en vapeur d’azote liquide ou à – 80 °C avant de les acheminer en carboglace. Mode de conservation Principe méthodologique 305 Température ambiante jusqu’à séparation cellulaire. Un séquençage des IG/TR est effectué au diagnostic, par technique de Sanger ou NGS-amplicon. Une PCR clone-spécifique est dessinée utilisant une amorce dirigée contre le CDR3. La quantification aux points de suivi est réalisée par Q-PCR en comparaison à l’ADN du patient au diagnostic. Des alternatives sont en cours d’évaluation : PCR digitale en gouttelette (ou digital droplet PCR – ddPCR), surtout pour les lymphomes, et le NGS amplicon, surtout pour les MM. Il est nécessaire de disposer d’une gamme de quantification pour la Q-PCR et d’un étalon interne pour le NGS. Type de méthode Méthode manuelle. Type de test Mesure quantitative. CIQ Maison. EEQ Euro-MRD au sein de l’ESLHO2 pour la Q-PCR, la ddPCR et le NGS (détection des cibles). Valeurs de référence/ Interprétation et performances Il s’agit d’une mesure quantitative de la réponse au traitement. La sensibilité est déterminée par la quantité d’ADN analysé, la spécificité et la performance de l’amorce allèle spécifique (l’AJO/ASO ou anti-junctional allele-specific oligonucleotide) et se situe habituellement entre 10-4 et 10-5. Causes d’erreur, limites du test Inhibiteur d’ADN. Hémopathie non-informative car absence de remaniement clonal identifiable par PCR et séquençage au diagnostic (absence de prélèvement envahie, LAL très immature ou MM/ lymphome ayant subi trop de mutations somatiques des IGH, séquence CDR3 inappropriée, etc.). 1. Formalin Fixed Paraffin Embedded (FFPE). 2. ESLHO : European Scientific Foundation of Hemato-Oncology. 306 Oncologie moléculaire hématologique Bibliographie du chapitre 20 FICHE 20.1 – Recherche et quantification d’une cible unique d’oncogénétique somatique lors du diagnostic ou du suivi d’une leucémie aiguë myéloblastique (ou maladie résiduelle des LAM) Jourdan E, Boissel N, Chevret S, et al. French AML Intergroup. Prospective evaluation of gene mutations and minimal residual disease in patients with core binding factor acute myeloid leukemia. Blood 2013;121:2213–23. Willekens C, Blanchet O, Renneville A, et al. French AML Intergroup. Prospective long-term minimal residual disease monitoring using RQ-PCR in RUNX1RUNX1T1-positive acute myeloid leukemia : results of the French CBF-2006 trial. Haematologica 2016;101:328–35. Döhner H, Estey E, Grimwade D, et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood 2017;129:424–47. Schuurhuis GJ, Heuser M, Freeman S, et al. Minimal/ measurable residual disease in AML: consensus document from ELN MRD Working Party. Blood 2018;131:1275–91. FICHE 20.2 – Quantification d’une cible d’immunogénétique (Ig/TCR) lors du suivi d’une leucémie lymphoblastique ou d’un syndrome lymphoprolifératif (ou maladie résiduelle) van Dongen JJ, van der Velden VH, Brüggemann M, et al. Minimal residual disease diagnostics in acute lymphoblastic leukemia: need for sensitive, fast, and standardized technologies. Blood 2015;125:3996–4009. Kumar S, Paiva B, Anderson KC, et al. International Myeloma Working Group consensus criteria for response and minimal residual disease assessment in multiple myeloma. Lancet Oncol 2016;17:e328–46. Ladetto M, Buske C, Hutchings M, et al. ESMO Lymphoma Consensus Conference Panel Members. ESMO consensus conference on malignant lymphoma: general perspectives and recommendations for prognostic tools in mature B-cell lymphomas and chronic lymphocytic leukaemia. Ann Oncol 2016;27:2149–60. Chapitre 21 Autres techniques moléculaires Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. 308 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 21.1 Séquençage haut débit (NGS) Codes RIHN N452, N453, N454 Signification biologique du paramètre Le NGS (Next Generation Sequencing) permet le séquençage en parallèle de milliers de fragments d’ADN. Il peut être utilisé à travers différentes approches : le séquençage du génome entier, de l’exome correspondant au séquençage de toutes les régions codantes du génome, du transcriptome pour étude de l’ARN, du méthylome pour l’analyse épigénétique et enfin le séquençage ciblé de gènes d’intérêt. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Le séquençage du génome à l’aide des technologies de NGS permet de caractériser les mutations et polymorphismes d’un seul nucléotide (SNP : Single Nucleotide Polymorphism), les insertions et les délétions (indels) de quelques bases, l’analyse de la variabilité du nombre de copies (CNV : Copy Number Variation) permettant d’analyser les aberrations chromosomiques telles que l’aneuploïdie. L’application la plus classique du NGS est le séquençage d’un panel de gènes ou de certaines de leurs régions d’intérêt spécifiques, le but étant de se focaliser sur des régions codantes spécifiques. Des mutations sont présentes dans de nombreuses pathologies, notamment dans la plupart des cancers et dans certains syndromes, ce qui justifie leur recherche et leur identification. C’est également le cas en génétique pré-implantatoire. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation La majorité des cancers résulte d’évènements mutationnels somatiques ou germinaux. Au cours des dernières années, de nombreuses études NGS ont été menées pour fournir un profil moléculaire complet des cancers, pour identifier de nouvelles altérations génétiques conduisant à l’oncogenèse, pour étudier l’hétérogénéité, la complexité et l’évolution tumorale. Ces efforts ont fourni des résultats significatifs pour de nombreuses hémopathies malignes tels les leucémies aiguës (LA), les syndromes myélodysplasiques (SMD), les néoplasies myeloprolifératives (NMP) et les syndromes lymphoprolifératifs (SLP)/lymphomes. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration Les recherches de mutations par NGS doivent être effectuées en première intention lorsque leur détection peut revêtir un intérêt : • diagnostic : pour les patients atteints de SMD, LAM, SLP, NMP, les mutations détectées par NGS peuvent permettre d’établir une meilleure classification pronostique et donc une meilleure prise en charge thérapeutique ; • théranostique lorsqu’elle peut être visée par une thérapie ciblée. On peut citer les mutations de BCR-ABL dans la leucémie myéloïde chronique (LMC) ou les LA lymphoblastiques (LAL) PH1 + , ou encore les mutations de la voie BTK (Bruton Tyrosine Kinase) dans les SLP. Sang ou moelle sur tube EDTA. Culots cytogénétiques. Coupes de tissu (ganglion le plus souvent) congelées, voire paraffinées. Les coupes de tissu congelé sont à privilégier par rapport aux coupes paraffinées qui génèrent des fragments plus courts d’ADN autour de 100 à 200 paires de bases. Moins de 24 h. Entre + 15 et + 30 °C, ou congelé à – 80 °C après extraction. Principe méthodologique Type de méthode Type de test Chapitre 21. Autres techniques moléculaires Les principales technologies utilisées permettent d’obtenir des fragments courts. Étapes communes aux différentes technologies : - +/- fragmentation de l’ADN ; - préparation d’une librairie avec des adaptateurs ; - amplification clonale par émulsion ou bridge PCR ; - séquençage par pyroséquençage ou fluorescence ; - analyse bio-informatique des données générées. Méthode manuelle, +/- automatisable. Mesure quantitative indiquant la fréquence d’allèles variants. CIQ Maisons ou commerciaux. EEQ Par le GBMHN. Performances du test Causes d’erreur, limites du test Plus rapide et moins onéreux que la méthode Sanger. Permet également d’augmenter la sensibilité de détection des mutations jusqu’à 1 %. Matériel de mauvaise qualité, hétérogénéité tumorale. Présence d’homopolymères pour les techniques par pyroséquençage. Erreur de séquençage pour les techniques par fluorescence. Caractérisation pathologique parfois délicate de variants peu ou pas décrits. 309 310 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 21.2 Chimérisme moléculaire Codes RIHN G179, G180, G225 Signification biologique du paramètre L’objectif d’une allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (Allo-SCT)1 est de remplacer le tissu hématopoïétique du receveur, que l’on espère avoir éliminé par la procédure de conditionnement (chimiothérapie, irradiation corporelle totale), par un nouveau tissu hématopoïétique issu des cellules souches transplantées du donneur. Le greffon peut être de la moelle osseuse ou des cellules souches périphériques CD34+ mobilisées avant d’effectuer une cytaphérèse. Il peut aussi d’agir de sang de cordon. Les donneurs sont des membres de la famille du receveur ou des donneurs volontaires non apparentés inscrits sur un fichier international. La recherche du chimérisme consiste à rechercher les proportions de cellules du donneur et du receveur dans le sang, la moelle, ou des sous-populations cellulaires (lymphocytes T CD3+, cellules médullaires CD34+) du receveur. Cet examen permet d’évaluer le degré de reconstitution hématopoïétique (prise du greffon), son maintien dans le temps, mais également de suspecter un rejet de la greffe (disparition du greffon) ou la survenue d’une rechute qui concerne toujours (sauf cas exceptionnels) des cellules du receveur. Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement Mode de conservation Principe méthodologique Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cet examen est prescrit dans les suites d’Allo-SCT réalisée : • pour consolider le traitement d’une hémopathie maligne : leucémie aiguë lymphoblastique ou myéloblastique, néoplasie myéloproliférative (myélofibrose), myélodysplasie, certains lymphomes agressifs ; • en cas d’aplasie médullaire. La décision d’Allo-SCT relève d’une réunion de concertation pluridisciplinaire (RCP). Les points de suivi des patients sont bien codifiés. En fonction des résultats de la mesure du chimérisme, certains patients pourront bénéficier d’une injection de lymphocytes du donneur2 pour consolider la prise du greffon. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration C’est un examen normalement codifié quant aux points de suivi. Une recherche spécifique peut être prescrite en cas d’anomalies de la NFS ou de manifestations cliniques suggérant une perte du greffon. Sang périphérique ou moelle osseuse. Prélèvement sur EDTA. Aucune. Température ambiante ou réfrigération à + 4 °C. Lorsque le donneur est identifié et sélectionné, un échantillon de sang est adressé au laboratoire pour identifier les marqueurs moléculaires permettant de différencier son ADN de celui du receveur. Les marqueurs les plus simples sont ceux liés aux chromosomes sexuels. Toute une série d’autres marqueurs polymorphiques a été caractérisée et est testée dans un panel d’amplification. Les polymorphismes les plus discriminants, un spécifique du donneur et un spécifique du receveur, sont repérés. Ils font l’objet, pour chaque couple donneur/receveur et à chaque point de mesure, après extraction de l’ADN des cellules du receveur, d’une amplification en PCR quantitative en temps réel. Un gène de ménage, tel que l’albumine, est amplifié en parallèle afin d’évaluer les proportions relatives de cellules du donneur et du receveur. Les résultats sont rendus en pourcentages. Plus récemment, des techniques reposant sur l’amplification de petits motifs répétitifs en tandem (short tandem repeats) ou sur le séquençage haut débit (NGS) ont été développées. Type de méthode Type de test 1. 2. Chapitre 21. Autres techniques moléculaires 311 Méthode manuelle, semi-automatisée pour le NGS. Mesure quantitative. CIQ Non. EEQ Non. Valeurs de référence/Interprétation et performances De manière générale, une recherche de chimérisme identifiant au moins 98 % de cellules du donneur est le signe d’une reconstitution complète : prise de greffon. Il faut noter que cette évaluation sur du sang total n’est pas forcément retrouvée lorsque des sous-populations spécifiques (triées préalablement à l’extraction d’ADN) sont testées, comme les lymphocytes T ou les cellules souches. La signification de ces discordances fait encore l’objet de recherches. Causes d’erreur, limites du test Mauvaise qualité de l’ADN, mauvaise amplification du gène de ménage, tri cellulaire peu performant. Allo-SCT: Allogeneic Stem Cell Transplantation. DLI : Donor Lymphocyte Infusion. 312 Oncologie moléculaire hématologique Fiche 21.3 Recherche des transcrits de fusion dans les leucémies aiguës Signification biologique du paramètre Les leucémies aiguës lymphoblastiques ou myéloïdes présentent fréquemment des réarrangements chromosomiques récurrents (translocations ou délétions) résultant en gènes de fusion ayant une activité oncogénique. Ces réarrangements définissent souvent des entités de leucémie, certaines étant intégrées à la classification internationale des hémopathies (WHO 2016) et pouvant avoir un impact sur le traitement. De nombreuses données de la littérature associent des anomalies moléculaires spécifiques au pronostic de la leucémie, permettant de guider la prise en charge thérapeutique la plus adaptée. Certaines anomalies moléculaires peuvent aussi constituer des cibles thérapeutiques. Les réarrangements chromosomiques peuvent être détectés en cytogénétique (caryotype et/ ou FISH) et les gènes de fusion correspondants peuvent également être mis en évidence en biologie moléculaire. Ce sont alors généralement les transcrits de fusion produits qui sont recherchés, par RT-PCR à partir de l’ARN extrait des cellules. Les transcrits de fusion peuvent être également mesurés de façon quantitative et ainsi constituer un marqueur pour le suivi de maladie résiduelle. Objectifs de l’analyse et principales indications de prescription Cette analyse vise à caractériser la leucémie d’un patient donné. Cette caractérisation permet : Nature du prélèvement Recommandations pour la qualité du prélèvement Contraintes d’acheminement • d’identifier les types de leucémies éligibles à une thérapeutique spécifique (transcrit PMLRARA de la LAM3, LAL-B avec transcrit BCRABL1 notamment) ; • d’affiner le pronostic de la maladie et d’appliquer des critères de stratification thérapeutique ; • d’identifier des marqueurs de maladie résiduelle qui serviront à évaluer la réponse au traitement. Place dans la hiérarchie d’un bilan d’exploration La recherche des transcrits de fusion des leucémies aiguës par RT-PCR est un examen de seconde intention au diagnostic, orienté par l’analyse cytologique (LAL ou LAM, présence d’anomalies morphologiques évocatrices) et la cytométrie en flux (LAL B ou T). Ces analyses complètent et confirment les examens de cytogénétique. Les anomalies devant être systématiquement recherchées sont notamment : • PML-RARA associé à la t(15 ;17) dans la LAM3 (LA promyélocytaire) ; • CBFB-MYH11 associé à l’inv(16) dans les LAM avec éosinophiles anormaux • AML1-ETO associé à la t(8 ;21) dans les LAM ; • BCR-ABL1 associé à la t(9 ;22) dans les LAL-B. Moelle, sang, LCR ou tissus divers (en cas d’envahissement extra-médullaire). Les prélèvements de sang et de moelle doivent être réalisés sur anticoagulant EDTA. Les tissus doivent être frais, non fixés, ou congelés à – 180 °C. Les prélèvements frais doivent être acheminés à température ambiante. Les ARN étant des molécules instables, un acheminement rapide des prélèvements est recommandé (moins de 48 h entre le prélèvement et la congélation). Si ce délai ne peut être respecté, le prélèvement doit être traité pour isoler les cellules mononucléées (Ficoll) et les congeler à – 80 °C, pour un acheminement différé en carboglace. Chapitre 21. Autres techniques moléculaires Mode de conservation Température ambiante (< 24 heures) ou congélation à – 80 °C des cellules mononucléées (culot sec, DMSO ou réactif dédié à la conservation des ARN). Tissus : congélation à – 180 °C. Principe méthodologique La détection de ces anomalies est basée sur l’amplification des transcrits de fusion, par utilisation d’amorces spécifiques se situant de part et d’autre de la fusion sur les deux gènes impliqués. L’utilisation de nouvelles techniques de type RT-MLPA permet de détecter simultanément un grand nombre de transcrits de fusion. Type de méthode Type de test Méthode généralement manuelle. Mesure qualitative (RT-PCR en point final) ou quantitative (RT-PCR quantitative en temps réel). CIQ CIQ maison, souvent des lignées cellulaires. EEQ Il n’existe pas actuellement d’EEQ pour la plupart des cibles analysées, sauf BCR-ABL1. Valeurs de référence/Interprétation et performances Causes d’erreur, limites du test Ces anomalies sont par définition absentes des cellules normales. Méthodes sensibles et spécifiques à visée diagnostique, pronostique, théranostique et pour l’évaluation de la réponse au traitement (maladie résiduelle). Dégradation des ARN. Possibilité de contaminations. Les techniques de RT-PCR, par principe, ne détectent que les transcrits de fusion correspondant aux amorces choisies. La recherche de réarrangements impliquant des partenaires variables (cas de MLL) ou des points de cassures variables ne peut être exhaustive par RT-PCR. Les techniques de RT-MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) multiplexant un grand nombre de sondes permettent de rechercher simultanément de nombreux transcrits de fusion. Seule la technique de RNA-seq permet de rechercher tous les transcrits de fusion possible sans connaissance préalable du transcrit présent. 313 314 Oncologie moléculaire hématologique Bibliographie du chapitre 21 FICHE 21.1 – Séquençage haut débit (NGS) Vogelstein B, Papadopoulos N, Velculescu VE, et al. Cancer genome landscapes. Science 2013;339: 1546–58. Koboldt D, Steinberg KM, Larson DE, et al. The nextgeneration sequencing revolution and its impact on genomics. Cell 2013;155:27–38. FICHE 21.2 – Chimérisme moléculaire Alizadeh M, Bernard M, Danic B, et al. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002;99:4618–25. Kim J, Hwang IS, Kim HS, et al. Bone marrow chimerism detection using next generation sequencing based on single nucleotide polymorphisms following liver transplantation : comparison with short tandem repeat-PCR. Ann Lab Med 2016;36:82–4. FICHE 21.3 – Recherche des transcrits de fusion dans les leucémies aiguës Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood 2016;127:2391–405. Ruminy P, Marchand V, Buchbinder N, et al. Multiplexed targeted sequencing of recurrent fusion genes in acute leukaemia. Leukemia 2016;30:757–60. Index A Absorption, 250 ACC lupique, 87 Activité amidolytique, 171 Agglutinines froides, 248 Agglutinines irrégulières (RAI), 240 Agrégation (plaquettaire), 121 Allo-anticorps –– anti-érythrocytaires, 250 –– anti-plaquettes, 258 –– anti-polynucléaires neutrophiles/anti HNA, 256 Amylose, 99 Anémie, 4 –– arégénérative, 42 –– auto-immune, 23 –– corpusculaire, 53 –– hémolytique, 53 –– macrocytaire, 4 –– microcytaire, 4 –– régénérative, 53 Annexine V, 135 Anticoagulants circulants, 86 Anticoagulants oraux directs, 85 Anticorps –– anti-plaquettes, 197 –– FP4, 197 Anticorps monoclonaux, 28 Anti-IIa, 193 –– dabigatran, 193 –– idarucizumab (antidote), 193 Antiphospholipides, 84 Antithrombine, 165 Antivitamine K, 84 Anti-Xa, 188, 191 –– apixaban, 191 –– danaparoïde, 188 –– edoxaban, 191 –– fondaparinux, 188 –– rivaroxaban, 191 Aplasie médullaire, 11 Apoptose, 35 Asparaginase, 165 Guide des analyses en hématologie © 2018 Elsevier Masson SAS. Tous droits réservés. ASXL1 (mutation), 287 Auto-anticorps –– ADAMTS13, 208 –– anti-facteurs de la coagulation, 93 –– protéine S, 214 Auto-anticorps anti-érythrocytaires, 240 B BCR-ABL1 –– mutations, 274 –– transcrits, 272 Bilirubine, 51 Biologie moléculaire, 21 Butyrate estérase, 19 C Caillot, 91 Calréticuline (mutation), 279 Carence, 55, 60 Carence martiale, 60 Caryotype, 17, 266 CD (Cluster of differentiation), 28 CD34, 30 CEBPa (mutation), 286 Cellules souches périphériques, 30 Chimérisme moléculaire, 310 Chirurgie cardiaque, 197 Clonalité B, 292 Clonalité T, 293 Coagulation, 84, 109 –– voie extrinsèque, 84 Coagulation intravasculaire disséminée, 17 Coagulopathie, 84 Coefficient de saturation de la transferrine, 60 Collagène, 121 Contexte obstétrical, 240 CSF3R et SETBP1 (mutations), 281 Cycle cellulaire, 35 Cytochimie, 19 Cytométrie en flux, 15, 28 Cytopénie, 4 Cytosquelette, 51 D D-Dimères, 152 316 Index Dopage, 7 Drépanocytes, drépanocytose, 42 E Ektacytométrie, 49 Électrophorèse, 54 Elliptocytes, elliptocytose, 42 Élution d'anticorps, 252 Éosine maléimide, 49 Épreuve directe de compatibilité, 244 Érythropoïèse, 62 Érythropoïétine, 6 Euglobulines, 137 F Facteur tissulaire, 84 Facteurs (de la coagulation) –– Facteur V Leiden, 180 –– I (fibrinogène), 84 –– II (prothrombine), 84 –– IX (facteur antihémophilique B), 103 –– V (proaccélérine), 95 –– VII (proconvertine), 84 –– VIII (facteur antihémophilique A), 101 –– X (facteur Stuart), 84 –– XI (facteur Rosenthal), 86 –– XII (facteur Hageman), 107 –– XIII (facteur de stabilisation de la fibrine), 139 Falciformation, 44 Fer, 62 Ferritine, 60 Ferroportine, 66 Fibrine, 91 Fibrinogène, 84 Fibrinolyse, 91 FISH, 268 FLT3 (mutations), 284 Formule, 13 Fransferrine, 62 Frottis sanguin, 13 G Ganglion, 15 Glanzmann (thrombasthénie de), 119 Globules blancs, 4 Glycoprotéine Ib plaquettaire, 126 Grossesse/obstétrique/contexte obstétrical/ accouchement, 6, 230, 240 Groupes sanguin –– biologie moléculaire, 236 Groupes sanguins, 230 –– ABO, 230 –– RH, 230 –– Rh-K, 232 Guthrie (test de), 78 H Haptoglobine, 51, 65 Heinz (corps de), 45 Hématies, 4 Hématies cibles, 42 Hématocrite, 6 Hémochromatoses, 60 Hémoglobine, 4, 47 –– fœtale, HbF, 47 –– HbA, 70 –– HbC, 70 –– HbE, 71 –– HbS, 44 Hémoglobinose C, 49 Hémoglobinurie paroxystique nocturne, 31 Hémogramme, 4 Hémojuveline, 66 Hémolyse, 31 Hémopathies lymphoïdes, 297 Hémopathies malignes, 21 Hémophagocytose, 19 Hémophilie, 143 Hémorragie/maladie hémorragique, 91 Hémostase, 109 Héparine de bas poids moléculaire, 188 Héparine non fractionnée, 86 Hepcidine, 62 Hypovitaminose, 95 I IDH (mutations), 287 Immunophénotypage, 21 Indice d'anticoagulant circulant, 87 Inflammation, 64 INR, 84 Isopropanol, 73 J JAK2, 6 –– mutation exon 12, 278 –– mutation JAK2V617F, 276 K Kininogène, 86 Kleihauer (test de), 47 L Lavage broncho-alvéolaire, 15 Leucémie, 4, 15 Leucémie aiguë, 302 Leucémie lymphoïde chronique, 295 Leucémie myéloïde chronique, 272 Leucocytes, 4 Leucocytose, 4 Leucopénie, 4 Liquide biologique, 15 Liquide céphalo-rachidien, 15 Lupus (ACC lupique), 86, 102, 178 Lymphocytes, 4 Lymphome, 15 M MAIPA, 258 Maladie de Vaquez, 4, 6, 55, 276 Maladie résiduelle moléculaire –– des LAL, 304 –– des LAM, 302 –– des syndromes lymphoprolifératifs, 304 Maladie thromboembolique, 87 Médicaments antiplaquettaires, 201 Mégacaryocyte, 11 Minkowski-Chauffard, 49 Monocytes, 4 MPL (mutation), 280 Myélofibrose, 276 Myélogramme, 17 Myéloperoxydase, 19 N Néoplasie myéloproliféative (syndrome myéloprolifératif), 272 Néoplasie myéloproliférative, 4 NPM1 (mutation), 13, 284 O Oxymétrie, 76 P Paludisme, 42 Panel, 28 Perls, 19 Plaquettes, 4, 9 –– géantes, 9 –– grises, 9 –– Volume Plaquettaire Moyen, 4 Plasmine, 154 Plasminogen activator inhibitor-1, 141 Plasminogène, 212 Ploïdie, 35 PML, 13 Polycythemia Vera, 4, 6, 276 Polyglobulie, 4 Polymorphisme érythrocytaire, 234 Polynucléaires, 4 Prékallikréine, 86 Produits de dégradation de la fibrine, 154 Protéine C, 93 Protéine S, 95 Prothrombinase, 95 Prothrombine, 84 –– polymorphismes, 180 Index 317 Purpura fulminans, 169 Purpura thrombopénique idiopathique, 11 Purpura thrombopénique immunologique, 259 Purpura thrombotique thrombocytopénique, 210 R Récepteur soluble de la transferrine, 64 Résistance globulaire, 49 Réticulocyte, 8 Rhésus, 47 Ristocétine, 115 RUNX1 (mutation), 287 S Schizocytes, 42 Séquençage haut débit/NGS, 308 Sidéroblaste, 19 Sphérocytes, 42 Sphérocytes, sphérocytose, 42, 45, 51 Statut mutationnel des gènes des immunoglobulines, 282, 295 Stomatocytes, stomatoytose, 42 Surcharge, 60 Syndrome d'activation macrophagique (SAM), 60 Syndrome de Bernard Soulier, 9 Syndrome des antiphospholipides, 178 Syndrome hémolytique, 42, 246, 252 Syndrome hémorragique, 84 Syndrome lymphoprolifératif, 28 Syndrome myélodysplasique, 19, 282 Syndrome MYH9, 9 Syndromes myélodysplasiques (SMD), 55, 282 T Taux de prothrombine (temps de Quick), 84 Temps d'occlusion plaquettaire, 119 Temps de céphaline avec activateur, 84 Temps de Quick, 84 Temps de thrombine, 195 Test de Coombs, 31 Test direct à l'antiglobuline, 246 Thalassémie, 45 Thrombocyte, 9 Thrombocytémie essentielle, 11 Thrombocytose, 4 Thromboélastogramme, 109 Thromboembolique (maladie, événement, risque), 167 Thrombopathie, 126 Thrombopénie, 4, 197 –– induite par l'héparine (TIH), 197 Thrombophilie, 169 Thromboplastine, 84 Thrombopoïétine, 11 Thromboses, 31, 91, 165, 169, 178, 199 318 Index TP53 (mutation), 287 TRALI, 256 Transcrits de fusion, 312 Transferrine, 62, 64 Transfusion, 230 –– concentrés de globules rouges, 240 –– concentrés plaquettaires, 109 V Vitesse de sédimentation, 23 Vitré, 15 Voie endogène de la coagulation, 105 W Willebrand –– activité inhibitrice du, 131 –– facteur, 86 –– maladie, 101 –– multimères, 128 –– propeptide, 130 –– protéase du (ADAMTS13), 208, 210 X X (facteur Stuart) –– V (proaccélérine), 84
