L2 BOPE 2020-2021 Outils Moléculaires pour la Biologie des Organismes et l’Ecologie Caroline Fabioux I. Introduction • Idée reçue: Les outils de biologie moléculaire sont sans intérêt pour la biologie des organismes et l’écologie. C’est FAUX !!! • Pourquoi ? 2 I. Introduction • Biologie moléculaire = étude de l’ADN/ARN • L’ADN/l’ARN codent la vie et le fonctionnement des êtres vivants • Biologie des organismes et l’écologie: étude des êtres vivants et de leur fonctionnement au sein des écosystèmes • Donc l’étude de l’ADN/ARN est un élément essentiel pour comprendre le fonctionnement et l’évolution des êtres vivants !!! CQFD 3 L’ADN est présent dans tous les êtres vivants • Support de l’information génétique présent dans tous les êtres vivants • Présent ou passé (fossile) • Environnemental (eau, sédiment, poussières, glace…) 4 ADN= acide désoxyribonucléique • L’ADN contient le programme nécessaire au développement et à la vie de chaque cellule. • Mais pas seulement…. • donne des informations sur l’histoire de l’espèce, • Sur le fonctionnement de l’individu, l’évolution des populations, les interactions entre espèces… 5 L’ADN, une mine d’information inestimable • Quel que soit le domaine de recherche, étudier l’ADN/ l’ARN peut fournir des informations inestimables sur : – Les espèces, les populations, les individus – Leur environnement – Leur histoire – Leur mode de vie 6 Exemple 1 https://oceans.taraexpeditions.org 7 Exemple 2 L’ormeau Haliotis rufescens, Mollusque gastéropode ? 8 Exemple 2 Le moment de la fixation et de la métamorphose ne doit rien au hasard! • Il est déterminé par des inducteurs chimiques exogènes finement perçus et analysés par les invertébrés marins • Ceci a été compris grâce à la caractérisation moléculaire des récepteurs et des transducteurs cellulaires des signaux chimiques externes 9 Exemple 3 Par exemple, les analyses moléculaires ont permis de comprendre le mécanisme d’infection des plantes par la bactérie Agrobacterium tumefaciens…grâce l’étude de son génome et des gènes qu’elle exprime au moment de l’infection Agrobacterium tumefaciens en train de coloniser une racine de carotte Galle formée suite à la contamination d’un manguier par Agrobacterium tumefaciens 10 Exemple 4 • Des millions de tonnes de poussières des déserts Africain traversent l’Atlantique chaque année. • Les analyses moléculaires démontrent qu’ils transportent des bactéries, des champignons, des virus, potentiellement pathogènes pour l’homme! 11 A vous de trouver l’étude qui vous intéresse… • Vous constituez un groupe de 2 à 4 étudiants • Vous rechercher une technique de biologie moléculaire et son application dans le domaine de l’écologie ou de la biologie des organismes qui vous interesse (La technique choisie peut être une technique qui n’a pas été abordée en cours) • Concertez-vous pour ne pas prendre tous les mêmes études ! • Sources pour vos recherches: Livres de cours, publications scientifiques (https://scholar.google.fr/), sites internet …. • Pour le jeudi 11 février au plus tard, m’envoyer par mail ([email protected]): – Titre du message : Sujet TD OMBOE – Le corps du message devra comporter les informations suivantes: Le descriptif du groupe : noms et prénoms des membres du groupe, votre groupe de TD d’appartenance, La technique de biologie moléculaire choisie et son application, la source bibliographique principale utilisée. 12 Restitution le jour du TD • Pour le jour du TD (semaines du 22 mars et du 6 avril) vous devrez restituer le compte-rendu de vos recherches sous la forme d’une petite vidéo La vidéo peut être par exemple du type « ma thèse en 180 sec » https://www.youtube.com/watch?v=NTk1sOfos8g (24’00’’) Ou d’une capsule vidéo : https://www.youtube.com/watch?v=DyVgaUBms2Y …mais attention, pas de plagiat ! 13 Restitution le jour du TD • …le contenu est relativement libre (illustrations, animations, vous vous filmez ou vous êtes en voix-off) mais la vidéo doit contenir les informations suivantes : – Le domaine d’étude choisi et l’objectif de l’étude – la technique de biologie moléculaire utilisée – les principaux résultats obtenus • Pour enregistrer vos vidéos et me les envoyer, utilisez un format video courant de type : MP4, MOV, AVI… • Vous pouvez utiliser des logiciels gratuits de type “Movie Maker” pour Windows ou “iMovie” pour Mac….simples de prise en main • Aucun rapport écrit n’est demandé • Ce travail comptera pour 3 points sur la note de l’UE (/20) 14 II. Extraction et purification de l’ADN 15 Où trouve-t-on de l’ADN ? Animal cell structure ADN mitochondrial_ ADNmt EUKARYOTE ADN chloroplastique_ ADNcp ADN génomique_ADNg (noyau_chromosomes) ADN bactérien (chromosome) Source: https://en.wikipedia.org ADN plasmidique 16 Source: https://www.ancestry.com Taille des génomes Species classification Genome size (Mb)* Number of genes Escherichia coli Procaryote 4,7 ~ 4,500 Saccharomyces cerevisiae Eucaryote_yeast 13 ~ 6,000 Arabidopsis thaliana Eucaryote_plant 125 ~ 25,500 Nicotiana tabacum Eucaryote_plant 4,500 ~ 70,000 Crassostrea gigas Eucaryote_mollusc 559 ~ 28,000 Caenorhabditis elegans Eucaryote_nematode 100 ~ 22,000 Drosophila melanogaster Eucaryote_insect 180 ~ 13,600 Homo sapiens Eucaryote_Human 3,300 ~ 30,000 *1Mb = 1 mégabase = 1 million de bases https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/Crassostrea_gigas/100/ https://metazoa.ensembl.org/Crassostrea_gigas/Info/Index 17 Organisation de l’ADN dans les cellules eucaryotes • Nucléaire : sous forme de chromosomes Déroulé complètement, l’ADN d’une cellule donne un fragment de près de 2 mètres de long… = un fil de 20 km de long dans une balle de tennis • Mitochondrial (mtDNA) : Généralement circulaire, pas d’introns, très hétérogène en taille (env. 10 - 800 kb) et en composition suivant les phylla. Transmission maternelle majoritaire • Chloroplastique (cpDNA): ADN généralement linéaire ou ramifié. Génome très réduit: 37 à 220 kb et environ une centaine de gènes http://www.ulb.ac.be 18 Structure de l’ADN purines pyrimidines 19 ncbi Les objectifs de l’extraction d’ADN • Séparer l’ADN des autres composants cellulaires comme les protéines, les lipides, les ARN… • Eviter la fragmentation des longues molécules d’ADN par des coupures mécaniques ou l’action de nucléases endogènes • Inactiver les nucléases endogènes (Dnases) pour éviter qu’elles ne dégradent l’ADN est une étape indispensable de l’extraction d’ADN 20 Extraction d’ADN Différentes méthodes existent pour extraire l’ADN Mais les étapes principales restent les mêmes: Elimination Lyse du matériel cellulaire soit mécaniquement soit chimiquement Lyse cellulaire Libération de l’ADN et autres biomolécules (lipides, complexes nucléoprotéiques…) dans la solution Dénaturation des biomolécules par des enzymes/tampon de digestion puis isolement de l’ADN Récupération de l’ADN Modifié d’après: Ayoib, A. et al. “DNA extraction on bio-chip: history and preeminence over conventional and solid-phase extraction methods.” Applied Microbiology and Biotechnology 101 (2017): 8077-8088. 21 A partir de quel matériel biologique extrait-on de l’ADN ? • L’ADN peut-être extrait à partir de toutes sortes de matrices: – Procaryotes, Eucaryotes (végétaux, animaux, champignons…) – Cellules en culture, organismes entiers, organes entiers, morceaux de tissus, sang, échantillons environnementaux (sédiment, eau, air…) – Echantillons “frais”, congelés, restes fossilisés, tissus inclus dans la paraffine… 22 Weevil = charançon 23 Extraction d’ADN_les étapes de l’extraction « organique » 1. 2. 3. Lyse du matériel cellulaire de départ Elimination des protéines et autres « contaminants » Récupération de l’ADN concentré par précipitation Source: McKiernan, H. E., & Danielson, P. B. (2017). Molecular diagnostic applications in forensic science. In Molecular diagnostics (pp. 371-394). Academic Press. 24 Etape 1_la lyse cellulaire 1_ Broyage mécanique possible pour faciliter la destruction des tissus pour accéder aux cellules et à l’ADN. Par exemple au mortier/piston, au mixeur… 25 Etape 1_la lyse cellulaire a_ Broyage mécanique possible pour faciliter la destruction des tissus pour accéder aux cellules et à l’ADN. Par exemple au mortier/piston, au mixeur… Et /ou b_Un tampon de lyse est utilisé pour lyser les cellules et inactiver les nucléases qui pourraient dégrader l’ADN Le tampon de lyse contient: - des détergents qui dispersent les bicouches lipidiques des membranes (SDS, Triton X100) - des produits qui dénaturent les protéines = déprotéinisation (protéinase K), notamment les histones associées à l’ADN - protéinase K + détergent+ température élevée inactivation des nucléases endogènes 26 Etape 2_l’élimination des protéines • L’élimination des protéines • Dans la méthode dite « d’extraction organique », les protéines sont séparées de l’ADN par des solvants organiques, généralement un mélange phénol: chloroforme • Quand on mélange le phénol avec le lysat cellulaire et après centrifugation, 3 phases se forment: – Phase aqueuse supérieure: ADN (et ARN) – Une couche intermédiaire : protéines – Phase inférieure organique: lipides, phénol et autres protéines • Phénol équilibré à pH 8,0 !!! 27 Extraction ADN vs. ARN _une histoire de pH ! Si on veut une solution d’ADN sans ARN, on peut traiter l’échantillon d’ADN avec une enzyme qui dégrade les ARN: un RNase 28 Etape 3_La précipitation des ADN • L’ADN est précipité avec de l’éthanol absolu (100 %) ou de l’isopropanol: « méduse » d’ADN • L’ADN est soluble dans l’eau mais pas dans l’alcool ! Méduse d’ADN • Puis centrifugation à grande vitesse afin d’obtenir un culot d’ADN. • Lavages avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer les sels. • Après séchage, précipité repris (dissous) dans eau stérile ou tampon Tris-EDTA (TE). Culot d’ADN 29 Paramètres de qualité/quantité des ADN • Une fois les ADN extraits, il faut : – Vérifier leur qualité – Mesurer leur concentration 30 Paramètres de qualité des ADN • ADN de bonne qualité = pas de dégradation et pas de contaminants : – ADN dégradés = coupés en petits fragments…impossible de travailler sur des gènes entiers – ADN contaminés par des protéines, des sels, des solvants…peut inhiber les réactions enzymatiques utilisées par la suite 31 Paramètres de qualité des ADN • Connaître la concentration en ADN est important car: – Trop peu: certaines applications impossibles, comme le séquençage – Trop d’ADN: inhibition de certaines réactions comme la PCR 32 Analyse de l’ADN par spectrophotométrie Permet de quantifier l’ADN et d’estimer son niveau de contamination • Rappel sur le principe de la spectrophotométrie Source:http://ressources.unisciel.fr Spectrophotomètre: mesure de l’absorbance d’une substance chimique (A) A = log (I0/I) La loi de Beer-Lambert : l’absorbance est proportionnelle à la concentration de la solution 33 Analyse de l’ADN par spectrophotométrie Permet de quantifier l’ADN et d’estimer son niveau de contamination Pour la quantification : • 260nm= longueur d’onde à laquelle l’absorbance des acides nucléiques est maximale • Concentration en ADN déterminée par l’absorbance à 260nm. • Concentration en ADN en µg/mL calculée avec la formule: A260nm x 50 • Donc Quantité totale d’ADN en µg de la solution : conc. ADN x volume de la solution d’ADN 34 Analyse de l’ADN par spectrophotométrie • 1 mole de nucléotide 309 mg/mL • Conditions standards: cuve 1cm, solution à 1M, Temp. ambiante • dsADN =6200 A260.M-1.cm-1 1 A260 =309/6200 = 50 µg/mL • ARN =7700 A260.M-1.cm-1 1 A260 =309/7700 =40 µg/mL D’après l’équation de la Loi de Beer-Lambert : A=.l.C où =coefficient d’extinction molaire, l=longueur du trajet optique (largeur de la cuve), C=concentration de la solution 35 Analyse de l’ADN par spectrophotométrie Pour la contamination: Mesure de l’absorbance (A) de la solution à 280nm et 230nm • 280nm= longueur d’onde d’absorbance maximale des protéines • Contamination par les protéines indiquée par le ratio A260nm/A280 nm : Si 1,8 < A 260nm/ A 280 nm <2,1 Pas de contamination en protéines 36 Analyse de l’ADN par spectrophotométrie Pour la contamination: Mesure de l’absorbance (A) de la solution à 280nm et 230nm • 230 nm : absorbance de différents contaminants : phénol, isothiocyanate de guanidine, carbohydrates, peptides, acide humique, urée, EDTA, polysaccharides, sels… • Contamination ces contaminants indiquée par le ratio A260nm/A230 nm: Si 2 < A 260nm/ A 230 nm <2,2 Pas de contamination 37 Les différents spectrophotomètres Spectrophotomètre, Source: Wikipedia • Dosage long et consommateur en solution d’ADN • Ne convient pas bien à la biologie moléculaire 38 Les différents spectrophotomètres • Mini-spectrophotomètres, plus adaptés à la biologie moléculaire http://tools.thermofisher.com Exemple de microspectrophotomètre • Mesure sur 1 à 2µL de solution d’ADN • Réalise le spectre d’absorbance pour toutes les longueurs d’onde en une seule mesure • Très rapide 39 Mini-spectrophotomètre ADN non contaminé, avec une concentration assez élevée 40 Mini-spectrophotomètre L’absorbance de l’ADN est masquée par la contamination en phénol ADN contaminé par un solvant type phénol 41 Analyse de l’ADN par spectrophotométrie • Attention l’analyse de l’ADN par spectrophotométrie ne permet pas de déterminer si l’ADN est dégradé ou non ! 42 Vérification de la qualité de l’ADN par électrophorèse • La technique la plus utilisée est l’élèctrophorèse en gel d’agarose ou de polyacrylamide • Elle permet de séparer les fragments d’ADN selon leur taille. • Utilisable pour des ADN de 100 paires de bases (bp) à 25 000 bp 43 Principe de l’élèctrophorèse en gel d’agarose • Permet de séparer les ADN suivant leur taille sous l’effet d’un courant électrique. • Les groupes phosphates des squelettes ribosephosphate des acides nucléiques sont chargés négativement à pH neutre à basique. • Par conséquent, lorsqu'ils sont soumis à un champ électrique, les acides nucléiques migrent de l'électrode négative (cathode) vers l'électrode positive (anode). Source: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-ofmolecular-biology/na-electrophoresis-education/na-separation-overview.html 44 Les étapes de l’élèctrophorèse_résumé 1) Préparation du gel d’agarose 3) Migration des ADN grâce au courant électrique 2) Dépôt des échantillons d’ADN dans les puits 4) Visualisation de l’ADN sous UV (grâce à un intercalant de l’ADN) 45 http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio2960/labs/07DNA/Gel/index.html Vérification de la qualité de l’ADN par électrophorèse L’ADN génomique apparait comme une bande large et intense en haut du gel si l’ADN n’est pas dégradé 46 Vérification de la qualité de l’ADN par électrophorèse Lorsque l’on ne travaille que sur des fragments spécifiques du génome, on visualise des bandes distinctes Marqueur de taille (bp) 1000 600 400 200 Fragments d’ADN de tailles variables 47 Les élèctrophorèses sur puce • Bioanalyseur élèctrophorèse sur puce ou sur microgels • Migration des ADN dans un réseau de micro-capillaires • Idéal pour vérifier la qualité des ADN, mais pas pour la quantification 48 Les élèctrophorèses sur puce • Taille des fragments déterminée par rapport à un marqueur de taille 49 Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Détermination de la qualité et de la quantité de l’ADN APPLICATION 1 : Estimation de la croissance avec le ratio ARN/ADN 50 Application 1 • ADN: “taux constant”, insensible aux variations environnementales indicateur de la biomasse vivante • ARN impliqué dans la synthèse protéique Taux d’ARN très dépendant du taux de croissance cellulaire Image courtesy of Richard Kirby, Plymouth University, Plymouth, United Kingdom. - See more at: http://firstlook.pnas.org/seeking-sailorsto-help-measure-phytoplankton- 51 populations/#sthash.OBnZBxTe.dpuf • Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA) • Mesure du ratio ARN/ADN entre mars et juillet à partir de prélèvements d’eau du lac 52 • Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA) • Comparaison avec le taux de chlorophylle a, indicateur des populations phytoplanctoniques 53 • Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA) Bloom de printemps • Ratio ARN / ADN maximal pendant le bloom de printemps 54 • Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA) Bloom de printemps • Ratio ARN / ADN maximal pendant le bloom de printemps • Ratio ARN / ADN : bon indicateur du taux de croissance des populations phytoplanctoniques 55 • Hovenkamp et coll. ont démontré que les otolithes et les ratio d’acides nucléiques donnaient des informations robustes sur l’état des larves. Le ratio RNA:DNA peut donner une estimation du taux de croissance sur des périodes courtes entre 1 jour et 1 semaine. Autre référence : Casabianca, S., Capellacci, S., Ricci, F., Scardi, M., & Penna, A. (2021). Phytoplankton RNA/DNA and 18S rRNA/rDNA ratios in a coastal marine ecosystem. Journal of Plankton Research. 56 III. Techniques d’étude de l’ADN et applications en biologie des organismes et en écologie 57 Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Hybridation in situ Détermination de la qualité et de la quantité de l’ADN 58 III.1 L’hybridation in situ 59 Principe de l’ISH • Objectif: Visualiser un gène cible (ADN ou ARNm) dans un tissu ou un organisme entier • Principe: Utilisation d’une sonde marquée complémentaire de la séquence cible à marquer • Sur une coupe de tissu : hybridation in situ = ISH • Dans un organisme entier, s’il est petit et translucide : Whole mount ISH ou ISH in toto 60 hybridation in situ - démarche 1. Synthèse des sondes (ADN, ARN, oligonucléotides) 2. Marquage des sondes – marquage « froid » : utilisation de molécules aux propriétés fluorescentes, luminescentes, colorimétriques – marquage « chaud » : utilisation d’isotopes radioactifs 61 Marquage fluorescent • Marquage direct : Le nucléotide portant le marqueur est incorporé directement dans la séquence nucléotidique – Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) absorbe l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et la restitue rapidement sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). • λ excitation ≠ λ émission • Nombreux fluorochromes : Fluoresceine, Cy5, Cy3, Rhodamine, Texas red, FITC, DAPI … 62 Marquage colorimétrique • Marquage indirect a) Digoxigénine (DIG) incorporée dans la sonde b) Révélation par un anticorps anti-DIG marqué par : - une enzyme : addition d’un substrat chromogène (phosphatase alcaline) Phosphatase alcaline - un fluorochrome (fluorescéine, rhodamine) 63 hybridation in situ - démarche 3. Hybridation des sondes sur la coupe, le tissu ou l’organisme Coupe d’embryon sur lame Expression spécifique du gène cible dans l’encéphale de l’embryon 64 hybridation in situ - démarche 4. Détection du signal par microscopie Localisation, par hybridation in situ, de l’ARN messager codant pour l’endophiline A exprimée dans le système nerveux de l’embryon de Drosophile (marquage violet). Confocal image of septuple in situ hybridization exhibiting the spatial expression of Hox gene transcripts in a developing Drosophila embryo. Stage 11 germband extended embryo (anterior to the left) is stained for labial (lab), Deformed (Dfd), Sex combs reduced (Scr), Antennapedia (Antp), Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-A), Abdominal-B (Abd-B). Their orthologous relationships to vertebrate Hox homology groups are indicated below each gene. 65 Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Détermination de la qualité et de la quantité de l’ADN Hybridation in situ APPLICATIONS 66 Application ISH 1_détection de pathogènes • Application en pathologie • Bonamia ostreae parasite protiste, responsable de maladies hémocytaires chez les huîtres plates ostrea edulis Bonamia hémocyte • Détection du parasite dans le tissu conjonctif de l’huître plate par ISH 67 Application ISH 2_ Détermination d’espèces dans un mélange complexe Détermination spécifique des larves de bivalves quasiment impossible sur des critères morphologiques Huître creuse C. gigas Coquille Saint Jacques P. maximus Moule bleue M. edulis Huître plate O. edulis 68 Cra gig 18 s probe Pec 18 s probe Myt 18 s probe Ost ed 18 s probe C. gigas P. maximus M. edulis O. edulis 69 Application ISH 3_Identification de communautés microbiennes dans un mélange complexe • FISH : fluorescent in situ hybridization 70 71 Application ISH 4_ suivre l’expression d’une gène • Objectif : suivre le développement des cellules germinales chez l’embryon d’anémone de mer • Utilisation du gène vasa comme marqueur des cellules germinales, ISHDIG 72 Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Hybridation in situ Détermination de la qualité et de la quantité de l’ADN Southern blot 73 III.2 Le Southern blot 74 Southern blot_Hybridation sur membrane • Détection ET quantification d’un ADN cible dans un échantillon complexe d’ADN - Technique inventée en 1975 par le biochimiste Edward Southern - Même principe que l’ISH: hybridation d’une sonde spécifique à l’ADN cible sur un échantillon d’ADN - Mais ici les ADN sont d’abord extraits de l’échantillon, séparés sur gel et transférés sur une membrane 75 Southern blot - Hybridation sur membrane DNA • Intensité de la bande proportionnelle à la quantité d’ADN du gène cible présent dans l’échantillon • Gène de référence (housekeeping gene) est utilisé comme contrôle 76 ©1998 by Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. http://www.garlandscience.com/ECB/about.html Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Hybridation in situ Détermination de la qualité et de la quantité de l’ADN Amplification par PCR Southern blot Application 77 Application southern blot et PCR_Identification de communautés microbiennes dans l’eau 78 Système de filtration d’eau sur berge • Système très utilisé en Allemagne • L’eau de rivière est filtrée naturellement par les sédiments fins à proximité_permet d’éliminer les contaminants. • Elle est ensuite récupérée dans des puits creusés. • L’eau est ensuite chlorée et/ passée aux UV pour éliminer les pathogènes. 79 Le biofilm • Le biofilm est un groupe de microorganismes dans lequel les cellules se collent les unes aux autres sur une surface et dans une matrice de sucres complexes ou de protéines. morgellonssurvey.org Les biofilms sont composés de bactéries, de champignons, d’algues ou d’autres micro-organismes eucaryotes. On en trouve dans les systèmes de filtration, dans les bassins de rétention, dans les lignes de distribution d’eau potable…. Certains de ces micro-organismes peuvent être pathogènes et doivent donc être surveillés de près. 80 Méthodes d’analyse • Méthodes appropriées nécessaires pour la détection de ces micro-organismes • Par culture: applicable à une partie seulement des micro-organismes • Besoin de techniques de biologie moléculaire basées sur la détection de l’ADN (qui ne change pas en fonction de l’état des micro-organismes). 81 Méthodes d’analyse • Dans l’étude, techniques de biologie moléculaire utilisées pour déterminer les espèces de micro-organismes composant les biofilms: – Polymerase chain reaction (PCR), – (Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)), – Southern blot • Recherche en particulier de bactéries pathogènes comme les legionelles, ou des mycobacteries, enterococci Bactéries legionellae mycobactéries enterococci 82 Dans l’étude, • Analyses réalisées sur les biofilms : – Des eaux de surface (rivière, lacs…) – De l’eau brute après filtration sur berges, – De potable avant et après la désinfection UV – De l’eau distribuée dans la municipalité en aval du système de traitement 83 Protocole expérimental • Des plaquettes d’acier sont fixées aux différents sites de prélèvement pour 4 semaines. • Le biofilm formé est ensuite gratté. • L’ADN en est extrait. • Pour le Southern blot: – Electrophorèse des échantillons ADN de tous les biofilms – Transfert sur membrane – Hybridation des sondes spécifiques des catégories de micro-organismes recherchés 84 L’un des résultats • Identification de mycobactéries pathogènes facultatives par PCR et Southern blot. PCR Southern blot 85 L’un des résultats • Identification de mycobactéries potentiellement pathogènes par PCR et Southern blot. PCR Southern blot Amorces de PCR ou sondes de southern blot ciblant: Mycobactéries Mycobactéries pathogènes facultatives saprophytiques (2b1) (2b2) 86 L’un des résultats • Identification de mycobactéries pathogènes facultatives par PCR et Southern blot. PCR Southern blot Amorces de PCR ou sondes de southern blot ciblant: Mycobactéries Mycobactéries pathogènes facultatives saprophytiques (2b1) (2b2) 1 et 2: eaux de surface 3 : eau du puits 4 : eau potable après traitement sur un filtre à charbon 5 : eau potable après désinfection 6 : eau du robinet 7 : eau du robinet 8 : témoin positif Mycobacterium avium 9 : témoin positif Mycobacterium kansasii 87 Synthèse des résultats • Des mycobactéries saprophytiques (se nourrissant de matière organique) ont été retrouvées dans tous les échantillons. • Des mycobactéries pathogènes facultatives ont été retrouvées dans l’eau du robinet d’un échantillon • Des legionella spp. ont été retrouvées dans les eaux de surface et dans l’eau du robinet • Pseudomonas aeruginosa, pathogène responsable d’infections nosocomiales, détectée dans un échantillon d’eau du robinet mais pas dans tout le système de traitement 88 Synthèse des résultats • Les mycobactéries atypiques et pathogène facultatif, Legionella spp., et Pseudomonas aeruginosa peuvent avoir été transféré de leur habitat naturel (l'eau de surface) vers le système de distribution d'eau potable, bien que le traitement de l'eau implique la filtration et la désinfection. • La présence de ces micro-organismes peut poser des problèmes de santé publique et le traitement de l’eau devra être amélioré. 89 • PCR et Northern blot : permettent des analyses ciblées. • On ne cible que quelques gènes ou quelques organismes (détection d’espèces). • Il faut connaitre au préalable les gènes que l’on veut étudier et avoir des informations sur leur séquence. • Les techniques de séquençage haut-débit permettent de séquencer l’ensemble d’un génome ou de déterminer, sans « a priori » les espèces présentes dans un échantillon complexe (microbiote, bactéries du sol, espèces planctoniques….). 90 Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Hybridation in situ Dosage/vérification de la qualité Southern blot Amplification _PCR 91 III.3 La réaction de polymérisation en chaine ou PCR 92 Quelques vidéos explicatives Le principe de la PCR: https://www.youtube.com/watch?v=JPlTtFYd6e4 https://www.youtube.com/watch?v=QBcxFwp3Byo https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/an-introduction-to-pcr345445?utm_campaign=NEWSLETTER_TN_Genomics%20%26%20Epigenetics&utm _medium=email&_hsmi=110806012&_hsenc=p2ANqtz_5ZxiLWHlX_f3Xl3PKbLFOhRn5h0foi09ioWw91AbFlVjrv4TXOMPPUP9cX3hT6Jyw4gLelWZWFopkniCkO7vdEQfbw&utm_content=110806012& utm_source=hs_email 93 La PCR - La PCR est LA technique qui a révolutionné la biologie moléculaire - PCR= Polymerase Chain Reaction ou Réaction de polymérisation en chaine 1986: première publication sur la PCR par Kary Mullis (Prix Nobel de chimie en 1993) - Permet une réplication in vitro d’un ADN cible - Permet d’obtenir de grandes quantités d’ADN à partir de l’ADN extrait des cellules (=peu abondant) - La séquence cible est un segment d’ADN, de taille définie, “délimité” spécifiquement par les amorces 94 Les “ingrédients” pour la PCR 95 Les “étapes” de la PCR 96 L’hybridation des amorces La séquence de l’amorce sens est identique à l’extrémité 5’ du brin sens et complémentaire de l’extrémité 3’ du brin antisens auquel elle s’hybride 97 La PCR : le principe - Succession de réplications d’une matrice d’ADN double brin - Une ADN polymérase se fixe sur les amorces et synthétise le brin complémentaire Electrophorèse 98 End Point PCR ou PCR point final Electrophoresis 99 PCR_”ingredients” - Template DNA (50-100ng/µl) - Primers (0.1 – 0.5 µM) (18-25nt oligonucleotide primers) specific and complementary - to the 5'-3 ‘strand of target DNA = reverse primer To the 3'-5' strand of the target DNA= forward primer - dNTP nucleotides (A, T, G, C), equimolar ratios (200µM) each dNTP - DNA Polymerase (Taq) ( 1-2 unit) to synthesize new copies of target DNA (amplicons) - Reaction buffer (Tris-HCl, Ammonium ions, KCl, Magnesium ions, BSA) : provides the ionic strenght and buffering capacity needed during the reaction. - MgCl2 (1,5-3mM): complex nucleotides, only Mg / nucleotides complexes are a substrate for polymerase 100 - 3 genes targeted by PCR: - toxR (central regulatory factor gene) for V. fluvialis V. fluvialis V. cholerae V. parahae molyticus neg - hlyA (haemolysin) for V. cholerae - hutA (haem-utilizing gene) for V. parahaemolyticus - The 3 genes exist in the 3 species but the primers used target the specific zones for each species. 101 La PCR quantitative ou PCR en temps réel La PCR et le test PCR du Sars-Cov2 https://www.youtube.com/watch?v=wUDysO8bFbA La PCR et le test PCR du Sars-Cov2 https://www.youtube.com/watch?v=hNVDHCf8bGA 102 La PCR quantitative ou PCR en temps réel En phase exponentielle, le log de la fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN matrice initiale 103 La PCR quantitative ou PCR en temps réel Le Sybr Green est un fluorochrome qui s’intercale dans l’ADN double brin. La fluorescence est proportionnelle à la quantité d’ADN néoformé La sonde Taqman est une sonde d’hydrolyse, la quantité de sonde hydrolysée est proportionnelle à la quantité d’ADN néoformé 104 Détection du coronavirus responsable de la COVID-19 par PCR en temps réel 105 Détection du coronavirus responsable de la COVID-19 par PCR en temps réel 106 Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR Rhopaloeides odorabile Contexte de l’étude : réchauffement climatique. Pics de températures dans les eaux tropicales responsables du blanchiment des coraux notamment. Qu’en est-il de la tolérance thermique des éponges le long de la grande barrière de corail en Australie, organismes importants dans les écosystèmes coralliens ? 107 Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR Certains gènes sont sur-exprimés (ou sousexprimés) en cas de stress pour contrer l’effet du stress sur l’organisme Augmentation de la transcription des gènes Augmentation de la quantité d’ARNm pour ces gènes Mesure de la quantité de ces ARNm par PCR quantitative 108 Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR • Gènes cibles : – Hsp 40 et Hsp 90 (Heat shock protein) protéines qui participent à la bonne régulation des protéines du cytosol, notamment en cas de stress – UbC = Ubiquinone –conjugated enzyme, participe à l’élimination des protéines endomagées en cas de stress – FER = ferritine, participe à la protection antioxydante des cellules – CaM = Calmoduline, protéine de liaison au Ca2+, régualtion de l’homéostasie cellulaire, régulation négative en cas de stress oxydatif et thermique 109 Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR • L’expérimentation : - Récolte éponges - Mise en aquarium - 3 températures 27°C 31°C Pelorus island (Australie) Analyses aux jours : 0, 1, 3, 14 et 15 Australian Institute of Marine Science, Townsville (Queensland) 32°C Mortalité au bout de 4 jours 110 Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR • Analyses: - Prélèvements éponges - Extraction ARN - Transcription inverse (ARNm vers ADN) - qPCR 111 Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR Niveau d’expression des gènes par rapport au contrôle (27°C) • Seuil net à la tolérance thermique entre 31 et 32°C • Stress important à 32°C, surtout au bout de 3 jours ! Induction des gènes de réponse au stress 112 Organisme/Tissus/cellules / éch. environnemental Extraction ADN Hybridation in situ Dosage/vérification de la qualité Southern blot Puces à ADN 113 Puces à ADN = microarrays • Deux grands types d’applications: Etude du niveau d’expression des gènes = transcriptome Etude du polymorphisme à savoir : mettre en évidence des mutations ponctuelles (SNP=single nucleotid polymorphism) dans un génome = génotypage • Mesure simultanée de plusieurs milliers de gènes, dans des conditions différentes • Permet d’avoir une vision globale qui permet d’analyser un phénomène biologique sans a priori Puces à ADN = microarrays • La puce est un petit support sur lequel des milliers d’ADN ou d’ADNc sont attachés 115 Puces à ADN = microarrays • support = lame de verre ou puce en silicone dans un support plastique (taille d’un ongle) • des milliers de fragments d’ADN ou d’ADNc, représentant un partie ou tout le génome ou le transcriptome d’une espèce est “spotté” sur la puce (= probe= sonde) Microarrays taille des sondes : 500-2000nt >10,000 sondes/puce 2 conditions/run Oligo chips taille des sondes (oligonucleotides): 25nt) 500,000 sondes /puce 1 condition/run 116 Puces à ADN = microarrays Probes=sonde 117 Les différentes étapes des puces à ADN • L’ADN ou l’ADNc de l’échantillon que l’on étudie (target=cible) est chargé sur la puce et s’hybride à la sonde s’ils sont complémentaires target target target https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM 118 Les différentes étapes des puces à ADN target target target Research gate.net https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM 119 Les différentes étapes des puces à ADN target target target 120 https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM Analyse des puces à ADN Ensuite il faut normaliser les données de fluorescence et représenter les ratio de fluorescence verte/rouge Green intensity Allow determining the fold-change threshold Genes un différentiel d’expression Ratio rouge/vert >0,5 or <2 Red intensity https://www.youtube.com/watch?v=0ATUjAxNf6U 121 Microarray_exemple 1 Mesure de l’expression des gènes • Etudier la réponse de différentes souches de riz au stress salin. • Certaines souches résistent mieux à un excès de sel: quels mécanismes cellulaires le leur permettent ? Microarray_exemple 1 Mesure de l’expression des gènes Shoot Root Microarray_exemple 1 Mesure de l’expression des gènes • Les gènes les plus différentiellement exprimés entre les souches sont liés aux échanges ioniques : Na+, K+, Cl• En particulier en condition de stress hypersalin, la différence entre les souches repose sur l’homéostasie ionique, le transport et l’activité transmembranaire. • Ce type d’étude permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en place par les plantes pour contrer le stress salin et de choisir des souches adaptées dans un environnement où ce type de stress environnemental est fréquent Exemple 2: Etude des mécanismes impliqués dans la résistance des huîtres aux mortalités estivales • Mortalités à grande échelle des huîtres creuses Crassostrea gigas • Résultent d’une interaction complexe entre les huîtres, leur environment et des pathogènes opportunistes Ifremer Contexte physiologique : période de reproduction Environment oyster pathogens 125 Exemple 2: Design expérimental pour les microarrays Huîtres R & S, Bretagne Sud en condition d’élevage standard 70 56% 60 Resistant Susceptible Mortality (%) 50 40 22% 30 20 D4 10 0 D1 May, 9 D2 May, 16 May, 25 D3 May, 30 June,6 June, 20 D5 June, 27 July, 7 126 70 56% 60 Resistant Susceptible 50 Mortality (%) Exemple 2: Résultats des microarrays 40 22% 30 20 D4 10 D1 D2 D3 D5 0 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 34 gènes differentiellement exprimés entre R et S dans la gonade, expression uniquement dépendante du facteur « souche R/S » (ANOVA P<0.01 ; FDR 2.6%) Fleury et al,127 2010 70 56% 60 Resistant Susceptible 50 Mortality (%) Exemple 2: Résultats des microarrays 40 22% 30 20 D4 10 D1 D2 D3 D5 0 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 Annotation de ces gènes désigne la reproduction et le stress oxydant, révélateurs d’une fragilité physiologique des huîtres S durant toute la période précédant les mortalités Fleury et al,128 2010 70 60 Mortality (%) 50 Affaiblissement physiologique Resistant . Effort reproducteur Susceptible . Stress oxydant [R>S] 40 30 20 D4 10 D1 D2 D3 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 D5 0 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 129 process ocess process nion process 70 date par date Resistant Susceptible 50 Mortality (%) 3 tissus: gonade, branchies, muscle 56% 60 40 22% 30 20 10 D1 D1 D4 D4 D3 D3 D2 D2 D5 0 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 66 gènes différentiellement exprimés entre R et S Processus biologiques reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response Réponse immunitaire reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response carbohydrate metabolic process carbohydrate metabolic process carbohydrate metabolic process carbohydrate metabolic process lipid metabolic process lipid metabolic lipid metabolic process lipid metabolicprocess process carbohydrate metabolic process generation of precursor metabolites and energy lipid metabolic process response to stress cell death catabolic process antioxidant activity growth response to oxidative stress energy reserve DNA metabolic processprocess generation precursor metabolites and energy metabolic generation ofof precursor metabolites and energy DNA metabolic process generation precursor metabolites and energyDNA generation ofof precursor metabolites and energy metabolic process response to stress cell cycle response stress cell cycle response to stress response toto stress cell cycle carbohydrate metabolic process lipid metabolic process cell death antioxidant activity response to oxidative stress DNA metabolic process cell cycle response to external stimulus regulation of gene expression, epigenetic 130 process n process 70 56% 60 date par date Resistant Susceptible Mortality (%) 50 3 tissus: gonade, branchies, muscle 40 22% 30 20 10 D1 D1 D4 D4 D3 D3 D2 D5 0 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 90 gènes différentiellement exprimés entre R et S Processus biologiques reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response Réponse immunitaire reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response carbohydrate process carbohydrate metabolic metabolic process lipid lipidmetabolic metabolic process process carbohydrate metabolic process generation of precursor metabolites and energy lipid metabolic process response to stress cell death catabolic process antioxidant activity growth response to oxidative stress energy reserve metabolic process generation precursor metabolites energyDNADNA metabolic process generation of of precursor metabolites andand energy metabolic process response stress response to to stress cell cycle cell cycle carbohydrate metabolic process lipid metabolic process cell death antioxidant activity response to oxidative stress DNA metabolic process cell cycle response to external stimulus regulation of gene expression, epigenetic 131 process ocess process nion process 70 date par date Resistant Susceptible 50 Mortality (%) 3 tissus: gonade, branchies, muscle 56% 60 40 22% 30 20 10 D1 D1 D4 D4 D3 D3 D2 D2 D5 0 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 55 gènes différentiellement exprimés entre R et S Processus biologiques reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response Réponse immunitaire reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response carbohydrate metabolic process carbohydrate metabolic process carbohydrate metabolic process carbohydrate metabolic process lipid metabolic process lipid metabolic lipid metabolic process lipid metabolicprocess process carbohydrate metabolic process generation of precursor metabolites and energy lipid metabolic process response to stress cell death catabolic process antioxidant activity growth response to oxidative stress energy reserve DNA metabolic processprocess generation precursor metabolites and energy metabolic generation ofof precursor metabolites and energy DNA metabolic process generation precursor metabolites and energyDNA generation ofof precursor metabolites and energy metabolic process response to stress cell cycle response stress cell cycle response to stress response toto stress cell cycle carbohydrate metabolic process lipid metabolic process cell death antioxidant activity response to oxidative stress DNA metabolic process cell cycle response to external stimulus regulation of gene expression, epigenetic 132 process process nion process 70 date par date Resistant Susceptible 50 Mortality (%) 3 tissus: gonade, branchies, muscle 56% 60 40 22% 30 20 10 D1 D1 D4 D4 D3 D3 D2 D2 D5 0 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 55 gènes différentiellement exprimés entre R et S Processus biologiques 59% gènes « Défense » reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response Réponse immunitaire reproduction protein modification process cell proliferation protein transport immune response carbohydratemetabolic metabolicprocess process carbohydrate process carbohydrate metabolic lipid metabolic process lipid lipidmetabolic metabolic process process carbohydrate metabolic process generation of precursor metabolites and energy lipid metabolic process response to stress cell death catabolic process antioxidant activity growth response to oxidative stress energy reserve DNA metabolic processprocess generation precursor metabolites and energy metabolic generation precursor metabolites and energyDNA DNA metabolic process generation ofofof precursor metabolites and energy metabolic process response stress cellcycle cyclecycle response stress cell response tototo stress cell carbohydrate metabolic process lipid metabolic process cell death antioxidant activity response to oxidative stress DNA metabolic process cell cycle response to external stimulus regulation of gene expression, epigenetic 133 Profil d’expression chez R et S des 10 gènes immunitaires communément détectés dans les 3 tissus détection de pathogènes et activation de la réponse immunitaire 1.60 Gonad 1.40 R 1.20 R S 1.00 0.80 Toll-like receptor 3 1.60 Prostaglandin E2 receptor 0.60 1.40 Thyroid peroxidase B-cell lymphoma/leukemia 0.40 1.20 0.20 1.00 S 0.80 Superoxide dismutase [Cu-Zn] a NF-kappa-B inhibitor cactus a May 25th -0.40 Supre ssor of cytokine signal ling Superoxide dismutase [Cu-Zn] b 0.00 -0.20 Complement C1-q protein 0.60 June 6th June 20th NF-kappa-B inhibitor cactus b R 0.40 0.20 0.00 -0.60 May 25th -0.20 June 6th June 20th Toll-like receptor 3 inhibitors of NF-κB Thyroid peroxidase B-cell lymphoma/leukemia suppressor of cytokine signaling Complement C1-q protein Prostaglandin E2 receptor Supressor of cytokine signalling Superoxide dismutase [Cu-Zn] a -0.40 Superoxide dismutase [Cu-Zn] b NF-kappa-B inhibitor cactus a R = capacité de réaction, en terme d’expression de gènes de la voie immunitaire NF-κB > Avantage pour survivre -0.60 NF-kappa-B inhibitor cactus b 134 70 60 Affaiblissement physiologique Défense/immunité Resistant . Effort reproducteur Toll-like receptor 2 SOD [Cu-Zn] 2 NF-kappa-B inhibitors Peroxinectin Complement C1q Suppressor of cytokine signalling B-cell lymphoma Prostaglandin E2 receptor og-TGFβ – GPCR/NPYr Mortality (%) 50 Susceptible . Stress oxydant Catalase – SOD [Cu-Zn] 40 [R>S] 30 20 Vibrio splendidus 10 D1 D2 D3 May, 9 May, 16 May, 25 May, 30 D4 D5 0 June,6 June, 20 June, 27 July, 7 135