CM OMBOE 2021 partie1

L2 BOPE
2020-2021
Outils Moléculaires pour la Biologie
des Organismes et l’Ecologie
Caroline Fabioux
I. Introduction
• Idée reçue: Les outils de biologie moléculaire
sont sans intérêt pour la biologie des
organismes et l’écologie.
C’est FAUX !!!
• Pourquoi ?
2
I. Introduction
• Biologie moléculaire = étude de l’ADN/ARN
• L’ADN/l’ARN codent la vie et le fonctionnement des êtres vivants
• Biologie des organismes et l’écologie: étude des êtres vivants et de
leur fonctionnement au sein des écosystèmes
• Donc l’étude de l’ADN/ARN est un élément essentiel pour
comprendre le fonctionnement et l’évolution des êtres vivants !!!
CQFD
3
L’ADN est présent dans tous les êtres vivants
• Support de l’information génétique
présent dans tous les êtres vivants
• Présent ou passé (fossile)
• Environnemental (eau, sédiment,
poussières, glace…)
4
ADN= acide désoxyribonucléique
• L’ADN contient le programme
nécessaire au développement et à la
vie de chaque cellule.
• Mais pas seulement….
• donne des informations sur l’histoire
de l’espèce,
• Sur le fonctionnement de l’individu,
l’évolution des populations, les
interactions entre espèces…
5
L’ADN, une mine d’information inestimable
• Quel que soit le domaine de recherche,
étudier l’ADN/ l’ARN peut fournir des
informations inestimables sur :
– Les espèces, les populations, les individus
– Leur environnement
– Leur histoire
– Leur mode de vie
6
Exemple 1
https://oceans.taraexpeditions.org
7
Exemple 2
L’ormeau Haliotis rufescens,
Mollusque gastéropode
?
8
Exemple 2
 Le moment de la fixation et de la métamorphose ne doit rien au hasard!
• Il est déterminé par des inducteurs chimiques exogènes finement perçus
et analysés par les invertébrés marins
• Ceci a été compris grâce à la caractérisation moléculaire des récepteurs et
des transducteurs cellulaires des signaux chimiques externes
9
Exemple 3
Par exemple, les analyses moléculaires ont
permis de comprendre le mécanisme
d’infection des plantes par la bactérie
Agrobacterium tumefaciens…grâce l’étude de
son génome et des gènes qu’elle exprime au
moment de l’infection
Agrobacterium
tumefaciens en train de
coloniser une racine de
carotte
Galle formée suite à la contamination d’un
manguier par Agrobacterium tumefaciens
10
Exemple 4
• Des millions de tonnes de
poussières des déserts
Africain traversent
l’Atlantique chaque année.
• Les analyses moléculaires démontrent qu’ils transportent des
bactéries, des champignons, des virus, potentiellement pathogènes
pour l’homme!
11
A vous de trouver l’étude qui vous intéresse…
•
Vous constituez un groupe de 2 à 4 étudiants
•
Vous rechercher une technique de biologie moléculaire et son application dans le
domaine de l’écologie ou de la biologie des organismes qui vous interesse (La technique
choisie peut être une technique qui n’a pas été abordée en cours)
•
Concertez-vous pour ne pas prendre tous les mêmes études !
•
Sources pour vos recherches: Livres de cours, publications scientifiques
(https://scholar.google.fr/), sites internet ….
•
Pour le jeudi 11 février au plus tard, m’envoyer par mail ([email protected]):
– Titre du message : Sujet TD OMBOE
– Le corps du message devra comporter les informations suivantes: Le descriptif du
groupe : noms et prénoms des membres du groupe, votre groupe de TD
d’appartenance, La technique de biologie moléculaire choisie et son application, la
source bibliographique principale utilisée.
12
Restitution le jour du TD
• Pour le jour du TD (semaines du 22 mars et du 6 avril) vous devrez
restituer le compte-rendu de vos recherches sous la forme d’une petite
vidéo
La vidéo peut être par exemple du type « ma thèse en 180 sec »
https://www.youtube.com/watch?v=NTk1sOfos8g (24’00’’)
Ou d’une capsule vidéo : https://www.youtube.com/watch?v=DyVgaUBms2Y
…mais attention, pas de plagiat !
13
Restitution le jour du TD
• …le contenu est relativement libre (illustrations, animations, vous vous
filmez ou vous êtes en voix-off) mais la vidéo doit contenir les informations
suivantes :
– Le domaine d’étude choisi et l’objectif de l’étude
– la technique de biologie moléculaire utilisée
– les principaux résultats obtenus
• Pour enregistrer vos vidéos et me les envoyer, utilisez un format video
courant de type : MP4, MOV, AVI…
• Vous pouvez utiliser des logiciels gratuits de type “Movie Maker” pour
Windows ou “iMovie” pour Mac….simples de prise en main
• Aucun rapport écrit n’est demandé
• Ce travail comptera pour 3 points sur la note de l’UE (/20)
14
II. Extraction et purification de
l’ADN
15
Où trouve-t-on de l’ADN ?
Animal cell structure
ADN mitochondrial_
ADNmt
EUKARYOTE
ADN chloroplastique_
ADNcp
ADN génomique_ADNg
(noyau_chromosomes)
ADN bactérien
(chromosome)
Source: https://en.wikipedia.org
ADN plasmidique
16
Source: https://www.ancestry.com
Taille des génomes
Species
classification
Genome size
(Mb)*
Number of
genes
Escherichia coli
Procaryote
4,7
~ 4,500
Saccharomyces
cerevisiae
Eucaryote_yeast
13
~ 6,000
Arabidopsis thaliana
Eucaryote_plant
125
~ 25,500
Nicotiana tabacum
Eucaryote_plant
4,500
~ 70,000
Crassostrea gigas
Eucaryote_mollusc
559
~ 28,000
Caenorhabditis elegans
Eucaryote_nematode
100
~ 22,000
Drosophila
melanogaster
Eucaryote_insect
180
~ 13,600
Homo sapiens
Eucaryote_Human
3,300
~ 30,000
*1Mb = 1 mégabase = 1 million de bases
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_euk/Crassostrea_gigas/100/
https://metazoa.ensembl.org/Crassostrea_gigas/Info/Index
17
Organisation de l’ADN dans les cellules eucaryotes
• Nucléaire : sous forme de
chromosomes
Déroulé complètement, l’ADN
d’une cellule donne un fragment
de près de 2 mètres de long…
= un fil de 20 km de long dans une
balle de tennis
• Mitochondrial (mtDNA) :
Généralement circulaire, pas
d’introns, très hétérogène en taille
(env. 10 - 800 kb) et en
composition suivant les phylla.
Transmission maternelle
majoritaire
• Chloroplastique (cpDNA):
ADN généralement linéaire ou
ramifié. Génome très réduit: 37 à
220 kb et environ une centaine de
gènes
http://www.ulb.ac.be
18
Structure de l’ADN
purines pyrimidines
19
ncbi
Les objectifs de l’extraction d’ADN
• Séparer l’ADN des autres composants cellulaires
comme les protéines, les lipides, les ARN…
• Eviter la fragmentation des longues molécules d’ADN
par des coupures mécaniques ou l’action de
nucléases endogènes
• Inactiver les nucléases endogènes (Dnases) pour
éviter qu’elles ne dégradent l’ADN est une étape
indispensable de l’extraction d’ADN
20
Extraction d’ADN
 Différentes méthodes existent pour extraire l’ADN
 Mais les étapes principales restent les mêmes:
Elimination
Lyse du matériel
cellulaire soit
mécaniquement soit
chimiquement
Lyse cellulaire
Libération de l’ADN
et autres
biomolécules
(lipides, complexes
nucléoprotéiques…)
dans la solution
Dénaturation des
biomolécules par des
enzymes/tampon de
digestion puis
isolement de l’ADN
Récupération
de l’ADN
Modifié d’après: Ayoib, A. et al. “DNA extraction on bio-chip: history and preeminence over conventional and
solid-phase extraction methods.” Applied Microbiology and Biotechnology 101 (2017): 8077-8088.
21
A partir de quel matériel biologique extrait-on de l’ADN ?
• L’ADN peut-être extrait à partir de toutes sortes de matrices:
– Procaryotes, Eucaryotes (végétaux, animaux, champignons…)
– Cellules en culture, organismes entiers, organes entiers, morceaux de
tissus, sang, échantillons environnementaux (sédiment, eau, air…)
– Echantillons “frais”, congelés, restes fossilisés, tissus inclus dans la
paraffine…
22
Weevil = charançon
23
Extraction d’ADN_les étapes de l’extraction « organique »
1.
2.
3.
Lyse du matériel cellulaire de départ
Elimination des protéines et autres « contaminants »
Récupération de l’ADN concentré par précipitation
Source: McKiernan, H. E., & Danielson, P. B. (2017). Molecular diagnostic applications
in forensic science. In Molecular diagnostics (pp. 371-394). Academic Press.
24
Etape 1_la lyse cellulaire
1_ Broyage mécanique possible pour faciliter la
destruction des tissus pour accéder aux cellules et à
l’ADN.
Par exemple au mortier/piston, au mixeur…
25
Etape 1_la lyse cellulaire
a_ Broyage mécanique possible pour faciliter la destruction
des tissus pour accéder aux cellules et à l’ADN.
Par exemple au mortier/piston, au mixeur…
Et /ou
b_Un tampon de lyse est utilisé pour lyser les cellules et
inactiver les nucléases qui pourraient dégrader l’ADN
Le tampon de lyse contient:
- des détergents qui dispersent les bicouches
lipidiques des membranes (SDS, Triton X100)
- des produits qui dénaturent les protéines =
déprotéinisation (protéinase K), notamment les histones
associées à l’ADN
- protéinase K + détergent+ température élevée 
inactivation des nucléases endogènes
26
Etape 2_l’élimination des protéines
• L’élimination des protéines
• Dans la méthode dite « d’extraction organique », les
protéines sont séparées de l’ADN par des solvants
organiques, généralement un mélange phénol: chloroforme
• Quand on mélange le phénol avec le lysat cellulaire et après
centrifugation, 3 phases se forment:
– Phase aqueuse supérieure: ADN (et ARN)
– Une couche intermédiaire : protéines
– Phase inférieure organique: lipides, phénol et autres
protéines
• Phénol équilibré à pH 8,0 !!!
27
Extraction ADN vs. ARN _une histoire de pH !
Si on veut une solution d’ADN sans ARN, on peut traiter l’échantillon
d’ADN avec une enzyme qui dégrade les ARN: un RNase
28
Etape 3_La précipitation des ADN
• L’ADN est précipité avec de l’éthanol absolu (100 %) ou
de l’isopropanol: « méduse » d’ADN
• L’ADN est soluble dans l’eau mais pas dans l’alcool !
Méduse
d’ADN
• Puis centrifugation à grande vitesse afin d’obtenir un
culot d’ADN.
• Lavages avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer les sels.
• Après séchage, précipité repris (dissous) dans eau
stérile ou tampon Tris-EDTA (TE).
Culot
d’ADN
29
Paramètres de qualité/quantité des ADN
• Une fois les ADN extraits, il faut :
– Vérifier leur qualité
– Mesurer leur concentration
30
Paramètres de qualité des ADN
• ADN de bonne qualité = pas de dégradation et pas de contaminants :
– ADN dégradés = coupés en petits fragments…impossible de
travailler sur des gènes entiers
– ADN contaminés par des protéines, des sels, des solvants…peut
inhiber les réactions enzymatiques utilisées par la suite
31
Paramètres de qualité des ADN
• Connaître la concentration en ADN est important car:
– Trop peu: certaines applications impossibles, comme le
séquençage
– Trop d’ADN: inhibition de certaines réactions comme la PCR
32
Analyse de l’ADN par spectrophotométrie
Permet de quantifier l’ADN et d’estimer son niveau de contamination
• Rappel sur le principe de la spectrophotométrie
Source:http://ressources.unisciel.fr
Spectrophotomètre: mesure de l’absorbance d’une substance chimique (A)
A = log (I0/I)
La loi de Beer-Lambert : l’absorbance est proportionnelle à la concentration
de la solution
33
Analyse de l’ADN par spectrophotométrie
Permet de quantifier l’ADN et d’estimer son niveau de contamination
Pour la quantification :
• 260nm= longueur d’onde à laquelle l’absorbance des acides nucléiques est
maximale
• Concentration en ADN déterminée par l’absorbance à 260nm.
• Concentration en ADN en µg/mL calculée avec la formule:
A260nm x 50
• Donc Quantité totale d’ADN en µg de la solution :
conc. ADN x volume de la solution d’ADN
34
Analyse de l’ADN par spectrophotométrie
• 1 mole de nucléotide  309 mg/mL
• Conditions standards: cuve 1cm, solution à 1M, Temp.
ambiante
• dsADN
=6200 A260.M-1.cm-1
1 A260 =309/6200 = 50 µg/mL
• ARN
=7700 A260.M-1.cm-1
1 A260 =309/7700 =40 µg/mL
D’après l’équation de la Loi de Beer-Lambert : A=.l.C
où =coefficient d’extinction molaire, l=longueur du trajet optique
(largeur de la cuve), C=concentration de la solution
35
Analyse de l’ADN par spectrophotométrie
Pour la contamination: Mesure de l’absorbance (A) de la solution à
280nm et 230nm
•
280nm= longueur d’onde d’absorbance maximale des
protéines
•
Contamination par les protéines indiquée par le ratio
A260nm/A280 nm :
Si 1,8 < A 260nm/ A 280 nm <2,1
Pas de contamination en protéines
36
Analyse de l’ADN par spectrophotométrie
Pour la contamination: Mesure de l’absorbance (A) de la solution à
280nm et 230nm
• 230 nm : absorbance de différents contaminants : phénol,
isothiocyanate de guanidine, carbohydrates, peptides, acide
humique, urée, EDTA, polysaccharides, sels…
• Contamination ces contaminants indiquée par le ratio
A260nm/A230 nm:
Si 2 < A 260nm/ A 230 nm <2,2
Pas de contamination
37
Les différents spectrophotomètres
Spectrophotomètre,
Source: Wikipedia
• Dosage long et consommateur en solution d’ADN
• Ne convient pas bien à la biologie moléculaire
38
Les différents spectrophotomètres
• Mini-spectrophotomètres, plus adaptés à la biologie moléculaire
http://tools.thermofisher.com
Exemple de microspectrophotomètre
• Mesure sur 1 à 2µL de solution d’ADN
• Réalise le spectre d’absorbance pour toutes les longueurs
d’onde en une seule mesure
• Très rapide
39
Mini-spectrophotomètre
ADN non contaminé, avec une concentration assez élevée
40
Mini-spectrophotomètre
L’absorbance de l’ADN est masquée par
la contamination en phénol
ADN contaminé par un solvant type phénol
41
Analyse de l’ADN par spectrophotométrie
• Attention l’analyse de l’ADN par spectrophotométrie ne
permet pas de déterminer si l’ADN est dégradé ou non !
42
Vérification de la qualité de l’ADN par électrophorèse
•
La technique la plus utilisée est l’élèctrophorèse en gel d’agarose ou
de polyacrylamide
• Elle permet de séparer les fragments d’ADN selon leur taille.
• Utilisable pour des ADN de 100 paires de bases (bp) à 25 000 bp
43
Principe de l’élèctrophorèse en gel d’agarose
• Permet de séparer les ADN suivant
leur taille sous l’effet d’un courant
électrique.
• Les groupes phosphates des squelettes ribosephosphate des acides nucléiques sont chargés
négativement à pH neutre à basique.
• Par conséquent, lorsqu'ils sont soumis à un
champ électrique, les acides nucléiques migrent
de l'électrode négative (cathode) vers
l'électrode positive (anode).
Source: https://www.thermofisher.com/fr/fr/home/life-science/cloning/cloning-learning-center/invitrogen-school-ofmolecular-biology/na-electrophoresis-education/na-separation-overview.html
44
Les étapes de l’élèctrophorèse_résumé
1) Préparation du gel d’agarose
3) Migration des ADN grâce au
courant électrique
2) Dépôt des échantillons
d’ADN dans les puits
4) Visualisation de l’ADN sous UV
(grâce à un intercalant de l’ADN)
45
http://www.nslc.wustl.edu/courses/bio2960/labs/07DNA/Gel/index.html
Vérification de la qualité de l’ADN par électrophorèse
L’ADN génomique apparait comme
une bande large et intense en haut
du gel si l’ADN n’est pas dégradé
46
Vérification de la qualité de l’ADN par électrophorèse
Lorsque l’on ne travaille que sur des fragments spécifiques du
génome, on visualise des bandes distinctes
Marqueur
de taille
(bp)
1000
600
400
200
Fragments d’ADN de tailles variables
47
Les élèctrophorèses sur puce
• Bioanalyseur  élèctrophorèse sur
puce ou sur microgels
• Migration des ADN dans un réseau de
micro-capillaires
• Idéal pour vérifier la qualité des ADN,
mais pas pour la quantification
48
Les élèctrophorèses sur puce
• Taille des fragments déterminée par rapport à un
marqueur de taille
49
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Détermination de la qualité et de la
quantité de l’ADN
APPLICATION 1 :
Estimation de la croissance
avec le ratio ARN/ADN
50
Application 1
• ADN: “taux constant”, insensible aux variations
environnementales  indicateur de la biomasse
vivante
• ARN impliqué dans la synthèse protéique Taux d’ARN
très dépendant du taux de croissance cellulaire
Image courtesy of Richard Kirby, Plymouth
University, Plymouth, United Kingdom. - See
more at: http://firstlook.pnas.org/seeking-sailorsto-help-measure-phytoplankton- 51
populations/#sthash.OBnZBxTe.dpuf
• Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA)
• Mesure du ratio ARN/ADN entre mars et
juillet à partir de prélèvements d’eau du
lac
52
• Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA)
• Comparaison avec le taux de
chlorophylle a, indicateur des populations
phytoplanctoniques
53
• Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA)
Bloom de printemps
• Ratio ARN / ADN maximal pendant le
bloom de printemps
54
• Field study_ Dabob bay (Jefferson, Washington, USA)
Bloom de printemps
• Ratio ARN / ADN maximal pendant le
bloom de printemps
• Ratio ARN / ADN : bon indicateur du
taux de croissance des populations
phytoplanctoniques
55
• Hovenkamp et coll. ont démontré que les otolithes et les ratio
d’acides nucléiques donnaient des informations robustes sur
l’état des larves. Le ratio RNA:DNA peut donner une
estimation du taux de croissance sur des périodes courtes
entre 1 jour et 1 semaine.
Autre référence : Casabianca, S., Capellacci, S., Ricci, F., Scardi, M., & Penna,
A. (2021). Phytoplankton RNA/DNA and 18S rRNA/rDNA ratios in a coastal
marine ecosystem. Journal of Plankton Research.
56
III. Techniques d’étude de l’ADN et
applications en biologie des
organismes et en écologie
57
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Hybridation in situ
Détermination de la qualité et de la
quantité de l’ADN
58
III.1 L’hybridation in situ
59
Principe de l’ISH
• Objectif: Visualiser un gène cible (ADN ou ARNm) dans
un tissu ou un organisme entier
• Principe: Utilisation d’une sonde marquée
complémentaire de la séquence cible à marquer
• Sur une coupe de tissu : hybridation in situ = ISH
• Dans un organisme entier, s’il est petit et translucide :
Whole mount ISH ou ISH in toto
60
hybridation in situ - démarche
1. Synthèse des sondes (ADN, ARN,
oligonucléotides)
2. Marquage des sondes
– marquage « froid » : utilisation de molécules aux
propriétés fluorescentes, luminescentes,
colorimétriques
– marquage « chaud » : utilisation d’isotopes
radioactifs
61
Marquage fluorescent
• Marquage direct : Le nucléotide
portant le marqueur est incorporé
directement dans la séquence nucléotidique
– Une molécule fluorescente (fluorophore
ou fluorochrome) absorbe l'énergie
lumineuse (lumière d'excitation) et la
restitue rapidement sous forme de
lumière fluorescente (lumière
d'émission).
• λ excitation ≠ λ émission
• Nombreux fluorochromes : Fluoresceine, Cy5,
Cy3, Rhodamine, Texas red, FITC, DAPI …
62
Marquage colorimétrique
• Marquage indirect
a) Digoxigénine (DIG) incorporée
dans la sonde
b) Révélation par un anticorps
anti-DIG marqué par :
- une enzyme : addition d’un
substrat chromogène
(phosphatase alcaline)
Phosphatase alcaline
- un fluorochrome (fluorescéine,
rhodamine)
63
hybridation in situ - démarche
3. Hybridation des sondes sur la
coupe, le tissu ou l’organisme
Coupe
d’embryon
sur lame
Expression spécifique du gène cible dans l’encéphale de l’embryon
64
hybridation in situ - démarche
4. Détection du signal par microscopie
Localisation, par hybridation in situ, de
l’ARN messager codant pour l’endophiline
A exprimée dans le système nerveux de
l’embryon de Drosophile (marquage violet).
Confocal image of septuple in situ hybridization
exhibiting the spatial expression of Hox gene
transcripts in a developing Drosophila embryo.
Stage 11 germband extended embryo (anterior to
the left) is stained for labial (lab), Deformed
(Dfd), Sex combs reduced (Scr), Antennapedia
(Antp), Ultrabithorax (Ubx), abdominal-A (abd-A),
Abdominal-B (Abd-B). Their orthologous
relationships to vertebrate Hox homology groups
are indicated below each gene.
65
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Détermination de la qualité et de la
quantité de l’ADN
Hybridation in situ
APPLICATIONS
66
Application ISH 1_détection de pathogènes
• Application en pathologie
• Bonamia ostreae parasite
protiste, responsable de
maladies hémocytaires chez
les huîtres plates ostrea
edulis
Bonamia
hémocyte
• Détection du parasite dans le
tissu conjonctif de l’huître
plate par ISH
67
Application ISH 2_
Détermination d’espèces dans un mélange complexe
Détermination
spécifique des
larves de
bivalves
quasiment
impossible sur
des critères
morphologiques
Huître creuse
C. gigas
Coquille
Saint
Jacques
P. maximus
Moule
bleue
M. edulis
Huître plate
O. edulis
68
Cra gig 18 s
probe
Pec 18 s
probe
Myt 18 s
probe
Ost ed 18 s
probe
C. gigas
P. maximus
M. edulis
O. edulis
69
Application ISH 3_Identification de communautés
microbiennes dans un mélange complexe
• FISH : fluorescent in situ hybridization
70
71
Application ISH 4_ suivre l’expression d’une gène
• Objectif : suivre le
développement des
cellules germinales chez
l’embryon d’anémone de
mer
• Utilisation du gène vasa
comme marqueur des
cellules germinales, ISHDIG
72
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Hybridation in situ
Détermination de la qualité et
de la quantité de l’ADN
Southern blot
73
III.2 Le Southern blot
74
Southern blot_Hybridation sur membrane
• Détection ET quantification d’un ADN cible dans un
échantillon complexe d’ADN
- Technique inventée en 1975 par le biochimiste
Edward Southern
- Même principe que l’ISH: hybridation d’une sonde
spécifique à l’ADN cible sur un échantillon d’ADN
- Mais ici les ADN sont d’abord extraits de l’échantillon,
séparés sur gel et transférés sur une membrane
75
Southern blot - Hybridation sur membrane
DNA
• Intensité de la bande proportionnelle à la
quantité d’ADN du gène cible présent dans
l’échantillon
• Gène de référence (housekeeping gene)
est utilisé comme contrôle
76
©1998 by Alberts, Bray, Johnson, Lewis, Raff, Roberts, Walter. http://www.garlandscience.com/ECB/about.html
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Hybridation in situ
Détermination de la qualité et
de la quantité de l’ADN
Amplification
par PCR
Southern blot
Application
77
Application southern blot et PCR_Identification de
communautés microbiennes dans l’eau
78
Système de filtration d’eau sur berge
• Système très utilisé en Allemagne
• L’eau de rivière est filtrée naturellement par les sédiments
fins à proximité_permet d’éliminer les contaminants.
• Elle est ensuite récupérée dans des puits creusés.
• L’eau est ensuite chlorée et/ passée aux UV pour éliminer les
pathogènes.
79
Le biofilm
• Le biofilm est un groupe de microorganismes dans lequel les cellules se
collent les unes aux autres sur une
surface et dans une matrice de sucres
complexes ou de protéines.
morgellonssurvey.org
 Les biofilms sont composés de bactéries, de champignons, d’algues
ou d’autres micro-organismes eucaryotes.
 On en trouve dans les systèmes de filtration, dans les bassins de
rétention, dans les lignes de distribution d’eau potable….
 Certains de ces micro-organismes peuvent être pathogènes et
doivent donc être surveillés de près.
80
Méthodes d’analyse
• Méthodes appropriées nécessaires pour la
détection de ces micro-organismes
• Par culture: applicable à une partie seulement
des micro-organismes
• Besoin de techniques de biologie moléculaire
basées sur la détection de l’ADN (qui ne change
pas en fonction de l’état des micro-organismes).
81
Méthodes d’analyse
• Dans l’étude, techniques de biologie
moléculaire utilisées pour déterminer les
espèces de micro-organismes composant
les biofilms:
– Polymerase chain reaction (PCR),
– (Denaturing gradient gel electrophoresis
(DGGE)),
– Southern blot
• Recherche en particulier de bactéries
pathogènes comme les legionelles, ou des
mycobacteries, enterococci
Bactéries legionellae
mycobactéries
enterococci
82
Dans l’étude,
• Analyses réalisées sur les biofilms :
– Des eaux de surface (rivière, lacs…)
– De l’eau brute après filtration sur
berges,
– De potable avant et après la
désinfection UV
– De l’eau distribuée dans la municipalité
en aval du système de traitement
83
Protocole expérimental
• Des plaquettes d’acier sont fixées aux différents sites
de prélèvement pour 4 semaines.
• Le biofilm formé est ensuite gratté.
• L’ADN en est extrait.
• Pour le Southern blot:
– Electrophorèse des échantillons ADN de tous les
biofilms
– Transfert sur membrane
– Hybridation des sondes spécifiques des catégories de
micro-organismes recherchés
84
L’un des résultats
• Identification de mycobactéries pathogènes
facultatives par PCR et Southern blot.
PCR
Southern blot
85
L’un des résultats
• Identification de mycobactéries potentiellement pathogènes par
PCR et Southern blot.
PCR
Southern blot
Amorces de PCR ou sondes de southern blot ciblant:
Mycobactéries
Mycobactéries
pathogènes facultatives
saprophytiques (2b1)
(2b2)
86
L’un des résultats
• Identification de mycobactéries pathogènes facultatives par PCR
et Southern blot.
PCR
Southern blot
Amorces de PCR ou sondes de southern blot ciblant:
Mycobactéries
Mycobactéries
pathogènes facultatives
saprophytiques (2b1)
(2b2)
1 et 2: eaux de surface
3 : eau du puits
4 : eau potable après traitement
sur un filtre à charbon
5 : eau potable après désinfection
6 : eau du robinet
7 : eau du robinet
8 : témoin positif Mycobacterium
avium
9 : témoin positif Mycobacterium
kansasii
87
Synthèse des résultats
• Des mycobactéries saprophytiques (se nourrissant de matière
organique) ont été retrouvées dans tous les échantillons.
• Des mycobactéries pathogènes facultatives ont été retrouvées
dans l’eau du robinet d’un échantillon
• Des legionella spp. ont été retrouvées dans les eaux de surface et
dans l’eau du robinet
• Pseudomonas aeruginosa, pathogène responsable d’infections
nosocomiales, détectée dans un échantillon d’eau du robinet mais
pas dans tout le système de traitement
88
Synthèse des résultats
• Les mycobactéries atypiques et pathogène facultatif,
Legionella spp., et Pseudomonas aeruginosa peuvent
avoir été transféré de leur habitat naturel (l'eau de
surface) vers le système de distribution d'eau potable,
bien que le traitement de l'eau implique la filtration et
la désinfection.
• La présence de ces micro-organismes peut poser des
problèmes de santé publique et le traitement de l’eau
devra être amélioré.
89
• PCR et Northern blot : permettent des analyses ciblées.
• On ne cible que quelques gènes ou quelques organismes
(détection d’espèces).
• Il faut connaitre au préalable les gènes que l’on veut étudier
et avoir des informations sur leur séquence.
• Les techniques de séquençage haut-débit permettent de
séquencer l’ensemble d’un génome ou de déterminer, sans
« a priori » les espèces présentes dans un échantillon
complexe (microbiote, bactéries du sol, espèces
planctoniques….).
90
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Hybridation in situ
Dosage/vérification de la qualité
Southern blot
Amplification _PCR
91
III.3 La réaction de
polymérisation en chaine
ou PCR
92
Quelques vidéos explicatives
Le principe de la PCR:
https://www.youtube.com/watch?v=JPlTtFYd6e4
https://www.youtube.com/watch?v=QBcxFwp3Byo
https://www.technologynetworks.com/genomics/articles/an-introduction-to-pcr345445?utm_campaign=NEWSLETTER_TN_Genomics%20%26%20Epigenetics&utm
_medium=email&_hsmi=110806012&_hsenc=p2ANqtz_5ZxiLWHlX_f3Xl3PKbLFOhRn5h0foi09ioWw91AbFlVjrv4TXOMPPUP9cX3hT6Jyw4gLelWZWFopkniCkO7vdEQfbw&utm_content=110806012&
utm_source=hs_email
93
La PCR
-
La PCR est LA technique qui a révolutionné
la biologie moléculaire
-
PCR= Polymerase Chain Reaction ou
Réaction de polymérisation en chaine
1986: première publication sur
la PCR par Kary Mullis (Prix
Nobel de chimie en 1993)
-
Permet une réplication in vitro d’un ADN cible
-
Permet d’obtenir de grandes quantités d’ADN à
partir de l’ADN extrait des cellules (=peu abondant)
-
La séquence cible est un segment d’ADN, de taille
définie, “délimité” spécifiquement par les amorces
94
Les “ingrédients” pour la PCR
95
Les “étapes” de la PCR
96
L’hybridation des amorces
La séquence de l’amorce sens
est identique à l’extrémité 5’ du
brin sens et complémentaire de
l’extrémité 3’ du brin antisens
auquel elle s’hybride
97
La PCR : le principe
- Succession de réplications d’une
matrice d’ADN double brin
- Une ADN polymérase se fixe sur
les amorces et synthétise le brin
complémentaire
Electrophorèse
98
End Point PCR ou PCR point final
Electrophoresis
99
PCR_”ingredients”
- Template DNA (50-100ng/µl)
-
Primers (0.1 – 0.5 µM) (18-25nt oligonucleotide primers) specific and
complementary
-
to the 5'-3 ‘strand of target DNA = reverse primer
To the 3'-5' strand of the target DNA= forward primer
- dNTP nucleotides (A, T, G, C), equimolar ratios (200µM) each dNTP
-
DNA Polymerase (Taq) ( 1-2 unit) to synthesize new copies of target DNA
(amplicons)
-
Reaction buffer (Tris-HCl, Ammonium ions, KCl, Magnesium ions, BSA) :
provides the ionic strenght and buffering capacity needed during the
reaction.
- MgCl2 (1,5-3mM): complex nucleotides, only Mg / nucleotides complexes
are a substrate for polymerase
100
- 3 genes targeted by PCR:
- toxR (central regulatory factor gene) for
V. fluvialis
V.
fluvialis
V.
cholerae
V.
parahae
molyticus
neg
- hlyA (haemolysin) for V. cholerae
- hutA (haem-utilizing gene) for V.
parahaemolyticus
- The 3 genes exist in the 3 species but
the primers used target the specific
zones for each species.
101
La PCR quantitative ou PCR en temps réel
La PCR et le test PCR du Sars-Cov2
https://www.youtube.com/watch?v=wUDysO8bFbA
La PCR et le test PCR du Sars-Cov2
https://www.youtube.com/watch?v=hNVDHCf8bGA
102
La PCR quantitative ou PCR en temps réel
En phase exponentielle, le log de la fluorescence est proportionnelle à la
quantité d’ADN matrice initiale
103
La PCR quantitative ou PCR en temps réel
Le Sybr Green est un fluorochrome
qui s’intercale dans l’ADN double
brin. La fluorescence est
proportionnelle à la quantité d’ADN
néoformé
La sonde Taqman est une sonde
d’hydrolyse, la quantité de sonde
hydrolysée est proportionnelle à la
quantité d’ADN néoformé
104
Détection du coronavirus responsable de la COVID-19 par
PCR en temps réel
105
Détection du coronavirus responsable de la COVID-19 par
PCR en temps réel
106
Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge
tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR
Rhopaloeides odorabile
Contexte de l’étude : réchauffement climatique. Pics de températures dans les eaux
tropicales responsables du blanchiment des coraux notamment.
Qu’en est-il de la tolérance thermique des éponges le long de la grande barrière de
corail en Australie, organismes importants dans les écosystèmes coralliens ?
107
Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge
tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR
Certains gènes sont sur-exprimés (ou sousexprimés) en cas de stress pour contrer
l’effet du stress sur l’organisme
 Augmentation de la transcription des
gènes  Augmentation de la quantité
d’ARNm pour ces gènes
 Mesure de la quantité de ces ARNm par
PCR quantitative
108
Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge
tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR
• Gènes cibles :
– Hsp 40 et Hsp 90 (Heat shock protein) protéines qui participent à la
bonne régulation des protéines du cytosol, notamment en cas de
stress
– UbC = Ubiquinone –conjugated enzyme, participe à l’élimination des
protéines endomagées en cas de stress
– FER = ferritine, participe à la protection antioxydante des cellules
– CaM = Calmoduline, protéine de liaison au Ca2+, régualtion de
l’homéostasie cellulaire, régulation négative en cas de stress oxydatif
et thermique
109
Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge
tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR
• L’expérimentation :
- Récolte éponges
- Mise en aquarium
- 3 températures
27°C
31°C
Pelorus island (Australie)
Analyses aux
jours : 0, 1, 3,
14 et 15
Australian Institute of Marine Science,
Townsville (Queensland)
32°C
Mortalité au
bout de 4 jours
110
Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge
tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR
• Analyses:
- Prélèvements éponges
- Extraction ARN
- Transcription inverse (ARNm
vers ADN)
- qPCR
111
Détermination du seuil de tolérance thermique chez l’éponge
tropicale Rhopaloeides odorabile par qPCR
Niveau d’expression des gènes par rapport au contrôle (27°C)
• Seuil net à la tolérance thermique entre 31 et 32°C
• Stress important à 32°C, surtout au bout de 3 jours ! Induction des gènes de
réponse au stress
112
Organisme/Tissus/cellules / éch.
environnemental
Extraction ADN
Hybridation in situ
Dosage/vérification de la qualité
Southern blot
Puces à ADN
113
Puces à ADN = microarrays
• Deux grands types d’applications:
 Etude du niveau d’expression des gènes = transcriptome
 Etude du polymorphisme à savoir : mettre en évidence des
mutations ponctuelles (SNP=single nucleotid polymorphism) dans un
génome = génotypage
• Mesure simultanée de plusieurs milliers de gènes, dans des conditions
différentes
• Permet d’avoir une vision globale qui permet d’analyser un phénomène
biologique sans a priori
Puces à ADN = microarrays
• La puce est un petit support sur lequel des milliers d’ADN
ou d’ADNc sont attachés
115
Puces à ADN = microarrays
• support = lame de verre ou puce en silicone dans un support plastique
(taille d’un ongle)
•
des milliers de fragments d’ADN ou d’ADNc, représentant un partie ou
tout le génome ou le transcriptome d’une espèce est “spotté” sur la
puce (= probe= sonde)
 Microarrays
taille des sondes : 500-2000nt
>10,000 sondes/puce
2 conditions/run
 Oligo chips
taille des sondes (oligonucleotides): 25nt)
500,000 sondes /puce
1 condition/run
116
Puces à ADN = microarrays
Probes=sonde
117
Les différentes étapes des puces à ADN
• L’ADN ou l’ADNc de
l’échantillon que l’on
étudie (target=cible)
est chargé sur la puce
et s’hybride à la sonde
s’ils sont
complémentaires
target
target
target
https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
118
Les différentes étapes des puces à ADN
target
target
target
Research gate.net
https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
119
Les différentes étapes des puces à ADN
target
target
target
120
https://www.youtube.com/watch?v=VNsThMNjKhM
Analyse des puces à ADN
Ensuite il faut normaliser
les données de
fluorescence et
représenter les ratio de
fluorescence verte/rouge
Green intensity
Allow determining the
fold-change threshold
Genes un différentiel
d’expression
Ratio rouge/vert >0,5
or <2
Red intensity
https://www.youtube.com/watch?v=0ATUjAxNf6U
121
Microarray_exemple 1
Mesure de l’expression des gènes
• Etudier la réponse de différentes souches de riz au stress salin.
• Certaines souches résistent mieux à un excès de sel: quels mécanismes
cellulaires le leur permettent ?
Microarray_exemple 1
Mesure de l’expression des gènes
Shoot
Root
Microarray_exemple 1
Mesure de l’expression des gènes
• Les gènes les plus différentiellement exprimés entre les souches sont
liés aux échanges ioniques : Na+, K+, Cl• En particulier en condition de stress hypersalin, la différence entre les
souches repose sur l’homéostasie ionique, le transport et l’activité
transmembranaire.
• Ce type d’étude permet de comprendre les mécanismes cellulaires
mis en place par les plantes pour contrer le stress salin et de choisir
des souches adaptées dans un environnement où ce type de stress
environnemental est fréquent
Exemple 2: Etude des mécanismes impliqués dans la
résistance des huîtres aux mortalités estivales
• Mortalités à grande échelle des huîtres creuses
Crassostrea gigas
• Résultent d’une interaction complexe entre les
huîtres, leur environment et des pathogènes
opportunistes

Ifremer
Contexte physiologique : période de reproduction
Environment
oyster
pathogens
125
Exemple 2: Design expérimental
pour les microarrays
Huîtres R & S, Bretagne Sud en
condition d’élevage standard
70
56%
60
Resistant
Susceptible
Mortality (%)
50
40
22%
30
20
D4
10
0
D1
May, 9
D2
May, 16
May, 25
D3
May, 30
June,6
June, 20
D5
June, 27
July, 7
126
70
56%
60
Resistant
Susceptible
50
Mortality (%)
Exemple 2: Résultats
des microarrays
40
22%
30
20
D4
10
D1
D2
D3
D5
0
May, 9
May, 16
May, 25
May, 30
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
34 gènes differentiellement exprimés
entre R et S dans la gonade,
expression uniquement dépendante du
facteur « souche R/S »
(ANOVA P<0.01 ; FDR 2.6%)
Fleury et al,127
2010
70
56%
60
Resistant
Susceptible
50
Mortality (%)
Exemple 2: Résultats
des microarrays
40
22%
30
20
D4
10
D1
D2
D3
D5
0
May, 9
May, 16
May, 25
May, 30
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
Annotation de ces gènes désigne la
reproduction et le stress oxydant,
révélateurs d’une fragilité
physiologique des huîtres S durant
toute la période précédant les
mortalités
Fleury et al,128
2010
70
60
Mortality (%)
50
Affaiblissement physiologique
Resistant
. Effort reproducteur
Susceptible
. Stress oxydant
[R>S]
40
30
20
D4
10
D1
D2
D3
May, 9
May, 16 May, 25
May, 30
D5
0
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
129
process
ocess
process
nion
process
70
date par date
Resistant
Susceptible
50
Mortality (%)
3 tissus: gonade,
branchies, muscle
56%
60
40
22%
30
20
10
D1
D1
D4
D4
D3
D3
D2
D2
D5
0
May, 9
May, 16
May, 25
May, 30
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
66 gènes différentiellement exprimés entre R et S
Processus biologiques 
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune
response
Réponse
immunitaire
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune response
carbohydrate
metabolic
process
carbohydrate
metabolic
process
carbohydrate
metabolic
process
carbohydrate
metabolic
process
lipid
metabolic
process
lipid
metabolic
lipid
metabolic
process
lipid
metabolicprocess
process
carbohydrate metabolic process
generation of precursor metabolites and energy
lipid metabolic process
response to stress
cell death
catabolic process
antioxidant activity
growth
response to oxidative
stress
energy
reserve DNA
metabolic
processprocess
generation
precursor
metabolites
and
energy
metabolic
generation
ofof
precursor
metabolites
and
energy
DNA
metabolic
process
generation
precursor
metabolites
and
energyDNA
generation
ofof
precursor
metabolites
and
energy
metabolic
process
response
to
stress
cell
cycle
response
stress
cell cycle
response
to
stress
response
toto
stress
cell cycle
carbohydrate metabolic process
lipid metabolic process
cell death
antioxidant activity
response to oxidative stress
DNA metabolic process
cell cycle
response to external stimulus
regulation of gene expression, epigenetic
130
process
n process
70
56%
60
date par date
Resistant
Susceptible
Mortality (%)
50
3 tissus: gonade,
branchies, muscle
40
22%
30
20
10
D1
D1
D4
D4
D3
D3
D2
D5
0
May, 9
May, 16
May, 25
May, 30
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
90 gènes différentiellement exprimés entre R et S
Processus biologiques 
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune
response
Réponse
immunitaire
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune response
carbohydrate
process
carbohydrate metabolic
metabolic process
lipid
lipidmetabolic
metabolic process
process
carbohydrate metabolic process
generation of precursor metabolites and energy
lipid metabolic process
response to stress
cell death
catabolic process
antioxidant activity
growth
response to oxidative stress
energy reserve metabolic process
generation
precursor
metabolites
energyDNADNA
metabolic
process
generation
of of
precursor
metabolites
andand
energy
metabolic
process
response
stress
response
to to
stress
cell cycle
cell cycle
carbohydrate metabolic process
lipid metabolic process
cell death
antioxidant activity
response to oxidative stress
DNA metabolic process
cell cycle
response to external stimulus
regulation of gene expression, epigenetic
131
process
ocess
process
nion
process
70
date par date
Resistant
Susceptible
50
Mortality (%)
3 tissus: gonade,
branchies, muscle
56%
60
40
22%
30
20
10
D1
D1
D4
D4
D3
D3
D2
D2
D5
0
May, 9
May, 16
May, 25
May, 30
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
55 gènes différentiellement exprimés entre R et S
Processus biologiques 
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune
response
Réponse
immunitaire
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune response
carbohydrate
metabolic
process
carbohydrate
metabolic
process
carbohydrate
metabolic
process
carbohydrate
metabolic
process
lipid
metabolic
process
lipid
metabolic
lipid
metabolic
process
lipid
metabolicprocess
process
carbohydrate metabolic process
generation of precursor metabolites and energy
lipid metabolic process
response to stress
cell death
catabolic process
antioxidant activity
growth
response to oxidative
stress
energy
reserve DNA
metabolic
processprocess
generation
precursor
metabolites
and
energy
metabolic
generation
ofof
precursor
metabolites
and
energy
DNA
metabolic
process
generation
precursor
metabolites
and
energyDNA
generation
ofof
precursor
metabolites
and
energy
metabolic
process
response
to
stress
cell
cycle
response
stress
cell cycle
response
to
stress
response
toto
stress
cell cycle
carbohydrate metabolic process
lipid metabolic process
cell death
antioxidant activity
response to oxidative stress
DNA metabolic process
cell cycle
response to external stimulus
regulation of gene expression, epigenetic
132
process
process
nion
process
70
date par date
Resistant
Susceptible
50
Mortality (%)
3 tissus: gonade,
branchies, muscle
56%
60
40
22%
30
20
10
D1
D1
D4
D4
D3
D3
D2
D2
D5
0
May, 9
May, 16
May, 25
May, 30
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
55 gènes différentiellement exprimés entre R et S
Processus biologiques 
59% gènes « Défense »
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune
response
Réponse
immunitaire
reproduction
protein modification process
cell proliferation
protein transport
immune response
carbohydratemetabolic
metabolicprocess
process
carbohydrate
process
carbohydrate
metabolic
lipid
metabolic
process
lipid
lipidmetabolic
metabolic process
process
carbohydrate metabolic process
generation of precursor metabolites and energy
lipid metabolic process
response to stress
cell death
catabolic process
antioxidant activity
growth
response to oxidative
stress
energy
reserve DNA
metabolic
processprocess
generation
precursor
metabolites
and
energy
metabolic
generation
precursor
metabolites
and
energyDNA
DNA
metabolic
process
generation
ofofof
precursor
metabolites
and
energy
metabolic
process
response
stress
cellcycle
cyclecycle
response
stress
cell
response
tototo
stress
cell
carbohydrate metabolic process
lipid metabolic process
cell death
antioxidant activity
response to oxidative stress
DNA metabolic process
cell cycle
response to external stimulus
regulation of gene expression, epigenetic
133
Profil d’expression chez R et S des 10 gènes immunitaires
communément détectés dans les 3 tissus
détection de pathogènes et
activation de la réponse immunitaire
1.60
Gonad
1.40
R
1.20
R
S
1.00
0.80
Toll-like receptor 3
1.60
Prostaglandin E2 receptor
0.60
1.40
Thyroid peroxidase
B-cell lymphoma/leukemia
0.40
1.20
0.20
1.00
S
0.80
Superoxide dismutase [Cu-Zn] a
NF-kappa-B inhibitor cactus a
May 25th
-0.40
Supre ssor of cytokine signal ling
Superoxide dismutase [Cu-Zn] b
0.00
-0.20
Complement C1-q protein
0.60
June 6th
June 20th
NF-kappa-B inhibitor cactus b
R
0.40
0.20
0.00
-0.60
May 25th
-0.20
June 6th
June 20th
Toll-like receptor 3
inhibitors
of NF-κB
Thyroid peroxidase
B-cell lymphoma/leukemia
suppressor
of cytokine signaling
Complement C1-q protein
Prostaglandin E2 receptor
Supressor of cytokine signalling
Superoxide dismutase [Cu-Zn] a
-0.40
Superoxide dismutase [Cu-Zn] b
NF-kappa-B inhibitor cactus a
R = capacité de réaction, en terme d’expression
de gènes de la voie immunitaire NF-κB
> Avantage pour survivre
-0.60
NF-kappa-B inhibitor cactus b
134
70
60
Affaiblissement physiologique
Défense/immunité
Resistant
. Effort reproducteur
Toll-like receptor
2 SOD [Cu-Zn]
2 NF-kappa-B inhibitors
Peroxinectin
Complement C1q
Suppressor of cytokine signalling
B-cell lymphoma
Prostaglandin E2 receptor
og-TGFβ – GPCR/NPYr
Mortality (%)
50
Susceptible
. Stress oxydant
Catalase – SOD [Cu-Zn]
40
[R>S]
30
20
Vibrio
splendidus
10
D1
D2
D3
May, 9
May, 16 May, 25
May, 30
D4
D5
0
June,6
June, 20
June, 27
July, 7
135