Exploration fonctionnelle rénale ! MBOUSSOU Yoan – interne Laboratoire de Biochimie 2011/2012 CORTEX (VAISSEAUX) MÉDULLAIRE (NÉPHRONS) BASSINET (URETERE) LE NÉPHRON Unité fonctionnelle du rein Le rein, un organe noble • Régulation du milieu intérieur • Excréteur de déchets • formation de l’urine Maintient volume ! • En eau • En électrolytes Filtration, réabsorption et Excretion La Fonction EXCRETOIRE élimination des déchets du métabolisme plasmatique via l’urine ! ! – Urée – Créatinine – Acide urique – Médicamentss et autres exogènes La Fonction ENDOCRINE • Rénine • Erythropoïétine • Vitamine D active Régulation hémodynamique vasculaire et rénale La RENINE Régulation hémodynamique vasculaire et rénale La RENINE Régulation hémodynamique vasculaire et rénale L’ERYTHROPOÏETINE (EPO) Hormone de nature glycoprotéique sécrétée à 90 % par le CORTEX RENAL L’ERYTHROPOÏETINE (EPO) Facteur de croissance des précurseurs des GR L’ERYTHROPOÏETINE (EPO) Facteur de croissance des précurseurs des GR VITAMINE D ACTIVE Participe au métabolisme phosphocalcique L’insuffisance rénale Généralités • Complexe • Fréquente +++ • Augmentation • Urgence • Nécessité d’un Diagnostic précoce • Impact sur la prise en charge --> EER ? • PEC selon étiologie IRA Insuffisance Rénal Aigu • ’’ état pathologique résultant de la baisse brutale du débit de filtration glomérulaire ‘’ • Diminution du nombre de néphrons fonctionnels • rétention des déchets azotés • déséquilibre de l’homéostasie hydroélectrolytique. IRA Insuffisance Rénal Aigu • DFG est le meilleur indice global de la fonction rénale ! • Le principal paramètre utilisé en pratique courante pour évaluer la fonction glomérulaire = créatininémie Circonstances de découverte • Asymptomatique +++ • diagnostiquée devant une élévation de la créatinine sanguine. • diminution du débit urinaire. • anomalies biologiques (hyperK+…) • signes cliniques tardifs et non spécifiques. Affirmer l’IRA • antécédents du patient • événements médicaux récents • examen clinique • traitements pris et en cours • examens biologiques • échographie rénale et des voies urinaires Quantifier l’insuffisance rénale définition clairance traitement IR légère 60-100 Ø IR modérée 30-60 Mesures de protection rénale IR sévère 15-30 correction des troubles hydroélectrolytique, acido- basique, ou phosphocalciques. IR évoluée 10-15 IR terminale < 10 traitements substitutifs , dialyse. Etiologies Pré-rénale ( cause fonctionnelle) • Hypovolémie • Hypoperfusion rénale • Médicaments Etiologies De l’IRA pré rénale ou fonctionnelle +++ • hypo perfusion rénale avec parenchyme intact Etiologies Post-rénale ( cause obstructive) • Lithiase obstructive • Tumeur pelvienne • Hypertrophie bénigne de la prostate • Ligature chirurgicale accidentelle Etiologies rénale ( cause organique ) • Nécrose tubulaire aiguë • Glomérulonéphrite Etiologies IRC Insuffisance Rénal Chronique Réduction permanente de la masse fonctionnelle rénale > 3 mois IRC Insuffisance Rénal Chronique Plusieurs stades STADE DESCRIPTION DFG (ml/min/1,73 m2) 1 MRC >90 2 IR légère 60 à 89 3 IR modérée 30 à 59 4 IR sévère 15 à 29 5 IR terminale < 15 IRC Insuffisance Rénal Chronique L’IRC est 2 à 3 fois plus fréquente chez l’homme que chez la femme ! Sa fréquence augmente avec l’âge 1 cas / 10 000hommes < 40 ans 1 / 1000 hommes > 75 ans ! 30 000 dialysés en France 7000 patients en attente de greffe 2000 greffes par an IRC Conséquences Altération de la filtration glomérulaire Accumulation de déchets azotés (urée, créatinine, acide urique) et de toxines urémiques ! Altération des fonctions tubulaires Altération de l’équilibre hydro-­‐electrolytique ! Altération des fonctions endocrines Baisse de l’EPO Baisse de calcitriol Marqueurs classiques de l’IR • Pb précocité • Pb sensibilité • Pb spécificité Critères d’un bon marqueur de la fonction rénale? • Etre totalement filtré / non réabsorbé / non sécrété par l’appareil rénal • Différencier IRA et IRC • Différencier les sous types d’IRA • Identifier l’étiologie précise • Etre prédictif de l’intensité de l’IRA • Facteur pronostic • Mise en place de thérapeutique adaptée Dont dosage • Non invasif et sanguin • Facile à réaliser • Rapide • Reproductible • Sensible • Spécifique • Précocité - cinétique rapide • Coût faible LES DIFFERENTS MARQUEURS DE LA FONCTION RENALE Le Débit de Filtration Glomérulaire (DFG) Le Volume de liquide filtré par le rein par unité de temps Pourquoi le DFG ? • Sa Diminution précède la symptomatologie de l’IR • Baisse corrélée à certaines lésions morphologiques (degré de fibrose tubulointerstitielle) • DFG dépend du nombre de néphrons fonctionnels, des propriétés de la membrane de filtration, du flux sanguin rénal Attention au DFG • Le DFG peut rester normal dans les phases précoces de maladies rénales • • Peu sensible au cours de la phase précoce Vision partielle du rein ESTIMATION du DFG Clairance de la créatinine « calculée » Formule de Gault et Cockroft ! ! (140 – âge) x poids x k ml/min créatininémie k=1,04 (femme) k=1,23 (homme) Attention à la formule de Gault et Crockroft Attention à la formule de Gault et Crockroft Attention à la formule de Gault et Crockroft Attention à la formule de Gault et Crockroft Attention à la formule de Gault et Crockroft ESTIMATION du DFG Formule MDRD (Modification of the Diet in Renal Disease CLCR = K x 170 x Cr–0,999 x Âge–0,176 x U–0,170 x Alb0,318 ESTIMATION du DFG Formule MDRD (Modification of the Diet in Renal Disease ! mieux corrélée au DFG meilleures performances diagnostiques plus précise en cas d ’insuffisance rénale + ! - plus compliquée sous-estime les DGF normaux et hauts ESTIMATION du DFG Formule de SCWHARTZ (PEDIATRIE) ! Cl = K x T Créatm K = 29 (Nouveau-né) K = 40 (Nourisson) K = 49 (Enfant jusqu’à 12ans) ESTIMATION du DFG Clairance de la créatinine « mesurée » ! Cl = U x V P (U) Créatinine urinaire (en umol/l) (P) Créatinine plasmatique (en umol/l) (V) Débit urinaire (en ml/min) sur 24 HEURES Clairance de l’inuline • polysaccharide du fructose exogène, • petit PM +++ • physiologiquement inerte , • non stockée par les tissus , non lié aux Pr plasma • éliminé librement au niveau du glomérule • clairance de l'inuline est strictement égale au DFG !!! Clairance de l’inuline + méthode de référence pour l’estimation du DFG (Gold Standard!) ! ! - difficile a mettre en œuvre La créatinine La créatinine – Produit azoté du métabolisme musculaire dérivant de la créatine – Biosynthèse de la créatine: hépatique+++ – Production constante – Dépend de la masse musculaire – Formation de la créatinine dans le muscle – Elimination rénale +++ – Reste relativement stable. – Permet d'apprécier le DFG et donc la fonction rénale La créatinine Différentes méthodes de dosage – Méthode colorimétrique (cinétique de Jaffe) – Méthode enzymatique –à lecture UV –action d’une oxydase spécifique Méthode enzymatique Méthode enzymatique Créatinase Créatinin + H2O Créatine Méthode enzymatique Créatinase Créatinin + H2O Créatine Créatine aminohydrolase Créatine + H2O Sarcosine Urée Méthode enzymatique Créatinase Créatinin + H2O Créatine Créatine aminohydrolase Créatine + H2O Sarcosine Urée Sarcosine oxydase Sarcosin + H2O + O2 Glycine Formaldéhyde H2O2 Méthode enzymatique Créatinase Créatinin + H2O Créatine Créatine aminohydrolase Créatine + H2O Sarcosine Urée Sarcosine oxydase Sarcosin + H2O + O2 Glycine Peroxydase H2O2 + Leucodériv Formaldéhyde H2O2 Coloration % à la concentration en créatinine Méthode enzymatique LABO Créatinase Créatinin + H2O Créatine Créatine aminohydrolase Créatine + H2O Sarcosine Urée Sarcosine oxydase Sarcosin + H2O + O2 Glycine Peroxydase H2O2 + Leucodériv Formaldéhyde H2O2 Coloration % à la concentration en créatinine Méthode Enzymatique - lecture UV Méthode Enzymatique - lecture UV Créatinase bactérienne Créatinine Créatine Méthode Enzymatique - lecture UV Créatinase bactérienne Créatinine Créatine Créatine kinase Créatine + ATP Créatine (P) + ADP Méthode Enzymatique - lecture UV Créatinase bactérienne Créatinine Créatine Créatine kinase Créatine + ATP Créatine (P) + ADP + ATP Pyruvate kinase Sarcosine + ADP Pyruvate Méthode Enzymatique - lecture UV Créatinase bactérienne Créatinine Créatine Créatine kinase Créatine + ATP + ADP Pyruvate + ATP Lactate + NAD+ Créatine (P) Pyruvate kinase Sarcosine Pyruvate + ADP + NADH.H+ LDH Cinétique décroissante suivie à 340 nm Méthode Enzymatique - Oxydase + spécifique + Méthode Enzymatique - Oxydase spécifique Oxydase créatinase Créatinine H2O2 Sarcosine + + Méthode Enzymatique - Oxydase spécifique Oxydase créatinase Créatinine H2O2 Sarcosine H2O2 Chromogène incolore + H2O2 Chromogène coloré + Méthode Enzymatique - Oxydase spécifique Oxydase créatinase Créatinine H2O2 Sarcosine H2O2 Chromogène incolore H2O2 Chromogène coloré Chromogène incolore 4- aminophénazone acide 3-5 dichloro 2 hydroxybenzène sulfonique Chromogène coloré complexe quinone-imine rouge (absorbe à 520 nm) + + Réaction de Jaffé – Utilisation d’acide picrique en milieu alcalin – Formation de picrate de sodium et de picrate de créatine --> coloration jaune-orangée. Réaction de Jaffé ! • tube sec ou héparinate de lithium. • à jeun si possible • Prélèvements urinaires à effectuer sur 24h00 • Principe : – Technique de dosage direct – Méthode colorimétrique Réaction de Jaffé ! • tube sec ou héparinate de lithium. • à jeun si possible • Prélèvements urinaires à effectuer sur 24h00 • Principe : – Technique de dosage direct – Utilisation d’acide picrique en milieu alcalin --> formation de picrate de sodium et de picrate de créatine --> coloration jaune-orangée. Réaction de Jaffé •+ rapide sensible automatisable peu coûteuse. ! •- sensible a la température ( 37°C seulement ) spécificité nombreuses interférences par divers chromogènes dont bilirubine, glucose,protéines, hémoglobine, céphalosporine. Créatininémie ! Homme 65 à 120 Femme 50à 100 μmol/L μmol/L ! ! Enfant de 4 à 14 ans, 30% de ces valeurs. ! Créatininémie et DFG Créatininémie Possibilité de prise en charge précoce 4,0 3,5 100,0 3,0 80,0 2,5 60,0 2,0 1,5 40,0 1,0 20,0 0,0 0,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0,0 Time (days) Créatinine + Elevation tardive Serum Cr (mg/dL) GFR (mL/min) 120,0 Créatininémie - variations ! •Pas d’influence par l’alimentation du sujet •grossesse •Fonction de la masse musculaire •du sexe et de l’âge ! Créatininémie • permet d’évaluer la fonction rénale • indicateur pour évaluer la filtration glomérulaire ! • Valeurs patho • : fonte musculaire • : IR Créatininurie ! ! • Homme : 7 - 18mmol/24h • Femme : 5 - 16mmol/24h • Permet de calculer la clairance • En dehors de tte patho rénale , elle peut être considérée comme le reflet de l’importance de la masse protéique musculaire L’urée déchet azoté majeur du catabolisme protéique L’urée • Généralités – déchet azoté majeur du catabolisme protéique – = transformation ammoniac toxique – soluble +++ – électriquement neutre – peu toxique – synthèse hépatique / cycle de l’urée – élimination rénale +++ – pas de dégradation dans les tissus Méthode enzymatique à l'uréase ! – tube sec ou hépariné. – Mieux matin a jeun ! ! Méthode Enzymatique - lecture UV Méthode Enzymatique - lecture UV Uréase Urée + 2 H2O 2 NH4+ + CO3 2- Méthode Enzymatique - lecture UV Uréase Urée 2-Oxoglutarate + 2 H2O + NAD + 2 2 NH4+ CO3 2- + GLDH NH4+ 2L Glutamate Cinétique décroissante suivie à 340 nm +2 NAD+ +2 H2O Méthode Enzymatique - lecture UV Uréase Urée 2-Oxoglutarate + 2 H2O + NAD + 2 2 NH4+ CO3 2- + GLDH NH4+ 2L Glutamate +2 NAD+ Cinétique décroissante suivie à 340 nm LABO +2 H2O L’urée - dosage ✦ Prélèvement : sérum, plasma ou urine des 24 h • Dosage à l'hypobromite – déprotéiniser le sérum à l'acide trichloro-acétique – ajout d'hypobromite de sodium en milieu alcalin => dégagement d'azote quantifiable via uréomètre – rapport aux courbes de calibration – + : rapide – - : spécificité ! Méthode au diacétylmonoxime ! – pH acide – température élevée – urée + diacétylmonoxime =>diazine – = chromogène orange => lecture à 520 nm. – Spé / rapide – sensible à la lumière. Urée - Valeurs physiologiques Adulte Enfant Nourrissons 2.5 à 7.5 mmol/L 2.5 à 5.5 mmol/L 1 à 3 mmol/L Urée - Variations physiologiques ! ! ! • En fonction de l’apport en protides • En fonction du catabolisme protidique • En fonction de l’âge • Au cours de la grossesse (augmente) • En fonction de la diurèse ! Urée - En pathologie Témoin majeur du catabolisme azoté ! Atteintes hépatiques Atteintes rénales paramètre grossier de dépistage des maladies rénales. Urée urinaire = azoturie • Dosée ds l’urine • Valeur physiologiques : 250-500mmol/24h • Variation • apport alimentaire en protides • l’âge • infections urinaires à bactéries uréase+. Urée urinaire - Valeurs pathologiques ! Hypoazoturies •IRA –IRC •IH sévères •États d’acidose (utilisation des éléments azotés pr éliminer les ions H+ ss forme de NH4+) ! Hyperazoturies •Hypercatabolisme protidique La Cystatine C ! Cystatine C • Inhibiteur de protéase • Petit PM • Toutes cellules nucléés. • Taux constant • Filtrée par le glomérule, complètement réabsorbée par le TCP et non sécrétée. • Concentration sg ne dépend donc que du DFG Cystatine C • • • • Bon marqueur atteinte glomérulaire Marqueur atteinte AIGU (>créatinine) Coût élevée (x2 créatinine) Absence de standardisation Cystatine C • rôle de protection contre les destructions des tissus cellulaires et extracellulaires dues au relargage d’enzymes par les cellules mortes ou malignes. ! ! • rôle dans la lutte contre les infections. Cystatine C • dosée par néphélémétrie • Valeurs : 0,5-1 mg/L ! • Intérêt du dosage • + sensible • pas d’interférence • indépendant du sexe- âge-masse corporelle-régime alimentaire Cystatine C Utilisé actuellement pour le suivit de certains patients • Greffé • Obèse • Cirrhotique • Dénutris • Diabétiques NGAL Gélatinase de Neutrophile Associée à la Lipocaline SERVICE DE REA ! • • • Mortalité = 15% si IRA « de néphrologie ». Mortalité = 50% si IRA de « réanimation ». Mortalité > 70% si IRA « de réanimation + EER». SERVICE DE REA 40 à 50 % des sepsis sévères nécessitent une EER (épuration extra rénale) ! Sepsis sévère : 22500 mort / an en France Possibilité de prise en charge précoce 4,0 3,5 100,0 3,0 80,0 2,5 60,0 2,0 1,5 40,0 1,0 20,0 0,0 0,5 0 1 2 3 4 5 6 Time (days) Créatinine + 7 8 0,0 Serum Cr (mg/dL) GFR (mL/min) 120,0 Créatinine ( > 2 jours ) Près de 40% des patients avec une baisse de la filtration glomérulaire ont une créatininémie normale NGAL • • • Protéine de 25 kDa Superfamille des lipocalines Ubiquitaire à faible dose (rein, estomac, poumon, colon) BIOMARQUEUR PRECOCE 1 à 2 HEURES après agression LA TECHNIQUE Test Triage NGAL • • • Immuno-dosage Lecture par fluorescence rapide détermination quantitative 250 ul de sang ou plasma sur tube EDTA • • • Stabilité 8 heures à T° ambiante plusieurs mois à - 20°C Durée dosage : 15 min La cassette-test • Un anticorps monoclonal de souris anti-NGAL • marqué par un agent fluorescent • NGAL immobilisé sur phase solide • stabilisants Sample Port L’échantillon est déposé Filtre Chambre de réaction Séparation GR/ plasma Mélange d’une fraction de l’échantillon avec le réactif lyophilisé Controles internes (3) Contrôles indépendants permettant de s’assurer que la réaction a lieu convenablement Poubelle L’échantillon est collecté Réaction Une surface hydrophobe assure le temps de réaction Zone de lecture L’échantillon à doser et les Ac fluorescents sont stockés dans des zones distinctes • • • • Bon marqueur précoce de l’IRA Examen pour l’instant occasionnel Réservé au service de REA Prix élevé : 28€ le test Il semblerait que… • Marqueur de souffrance tubulaire ischémique • Taux plasmatique stable au cours des 48 premières heures • Valeur J0 semble suffisante • Plus discriminant pour prédire la mise en EER • Valeurs seuil NGAL J0 – ≥ 540 : EER précoce recommandée – < 250 : EER précoce non recommandée CONCLUSION Evaluation de la fonction rénale par la DFG Limites de la créatinine en tant que marqueur précoce du DFG limites de l’estimation de la DFG par la clairance calculée Limites du dosage de la créatinine Limites paradoxales / importance accordée à ce paramètre! NGAL / Cystatine C marqueurs précoces mais «trop cher»! THE END THE END