Université Alger I BenYoucef Benkhedda Faculté de Médecine, Département de Pharmacie Laboratoire de Chimie Analytique Novembre 2017 Spectrophotométrie d’absorption moléculaire dans UV-Visible Dr D. OUNAS I- Introduction Méthode fondée sur les modifications de la structure électronique des molécules. Longueur D’onde Fréquence Énergie Figure.1 : Spectre électromagnétique. λ < 200 nm : UV Lointain Absorption de l’oxygène atmosphérique Nécessité d’opérer sous courant d’azote ou sous–vide Les matériaux tels que le verre ou le quartz absorbent le rayonnement. 200 nm à 400 nm : UV Proche L’atmosphère est transparente Possibilité d’utiliser du matériel optique en quartz. C’est la région du spectre la plus couramment utilisée en raison de son accessibilité aux équipements couramment commercialisés. 400 nm à 800 nm : Visible Le verre n’absorbe pas. L’atmosphère est transparente. II- Principe A- États d’énergie d’une molécule ET = Eelec + Evib + Erot Eélec : Énergie électronique dépend du nombre d’électrons et de la forme de la molécule. Evib : Énergie vibrationnelle dépend de la nature des noyaux et de leurs arrangements. Erot : Énergie rotationnelle dépend de la structure de la molécule. Figure .2 : Diagramme énergétique pour une molécule diatomique. Le principe de la spectrométrie UV-Visible repose sur l’absorption d’une radiation par une molécule dans le domaine allant de 200 à 800 nm. Après absorption de la radiation, la molécule a pour énergie : E1 = E0 + h עou ∆E = h = עhC/λ E1 : Énergie après excitation. E0 : Énergie fondamentale. h : Constante de Planck (6.63 10-34 J.s). ע: Fréquence (Hz). C : Vitesse de la lumière dans le milieu ou se propage l’onde. λ : longueur d’onde. Transition électronique Figure .3 : Transition électronique. Relaxation vibrationnelle E2 S2 Tn E1 S1 Croisement Intersystème T1 A b s o r p t i o n E0 S0 Conversion Interne F l u o r e s c e n c e P h o s p h o r e sc e n c e Figure .4 : Diagramme de JABLONSKI S0 : état fondamental S1 : premier état excité singulet S2 : second état excité singulet T1 : premier état excité triplet Augmentation de l’énergie d’un ou plusieurs électrons de valence lorsqu’une molécule isolée absorbe un photon dans le domaine UV-VIS. L’électron passe d’une orbitale liante à une orbitale antiliante. Le retour à l’état fondamental se fait par : ▪ Relaxation non rayonnante : le processus dure environ 10-11 secondes et s’accompagne d’une restitution de l’énergie d’excitation sous forme de chaleur . ▪ Relaxation rayonnante : le retour à l’état fondamental se fait avec émission de lumière. La désactivation dure environ 10-8 secondes. C’est le phénomène de fluorescence et phosphorescence . Caractéristiques de la transition électronique En général les spectres électroniques mettent en jeu des transferts de charges entre le niveau fondamental (Eo) et le premier niveau électronique excité (E1). Le processus de retour à l’état fondamental est une relaxation non rayonnante. En respectant le principe d’exclusion de Pauli, en absorption UV/Visible seules les transitions singulet sont envisageables La différence d’énergie entre les deux états concernés correspond à la fréquence de la radiation électromagnétique: ΔE = hν Les électrons concernés sont les plus éloignés du noyau : ▪Électrons de valence (couche externe) ▪Électrons impliqués dans des liaisons (simples et multiples). ▪Électrons non liés (paires libres). La transition électronique d’un niveau fondamental à un niveau excité s’accompagne de nombreuses transitions vibrationnelles et rotationnelles. Le spectre UV sera donc une succession de raies très peu distantes les unes des autres : Spectre de bande. III- Terminologie Chromophore Groupement insaturé covalent électronique (C=C, C=O, NO2). responsable de l'absorption Auxochrome Groupement covalent saturé avec des électrons libres qui relié à un chromophore modifie les caractéristiques d’absorption de ce dernier (OH, NH2, Cl..). Effet hyperchrome Augmentation de l’intensité d’absorption. Effet hypochrome Diminution de l’intensité d’absorption. Effet bathochrome Déplacement vers des longueurs d’onde plus grandes dû à une substitution ou un à effet de solvant (déplacement vers le rouge ou red shift). Effet hypsochrome Déplacement de l’absorption vers des longueurs d’onde plus courtes dû à une substitution ou à un effet de solvant (déplacement vers le bleu ou bleu shift). Figure .5 : Différents types d’effet sur un spectre. IV- Transitions électroniques a) Différents types d’électrons Electrons « n » Electrons libres des hétéro-atomes (N, O, S, halogène,…) Ils peuvent subir deux types de transitions. Electrons « σ » Électrons fortement liés qui assurent les liaisons monovalentes des hydrocarbures saturés. Ex : C – C Électrons « π » Les liaisons insaturées sont constituées d’une liaison par des électrons σ et d’une ou plusieurs liaisons par des électrons π. π Ex : C=C σ C π2 π1 C b) Types de transitions électroniques OM σ* anti-liante π* anti-liante Énergie n non liante π liante σ liante Figure .6 : Énergies des orbitales moléculaires (OM). Transition σ → σ* : (UV lointain) σ* σ* hע σ σ État fondamental État excité Nécessite une forte énergie et se traduit par des absorptions situées à une longueur d’onde λ voisine de 180 nm non décelables par les appareils usuels. Transition n → σ* σ* σ* hע n n σ σ État fondamental État excité La longueur d’onde d’absorption est aux environs de 180 à 190 nm avec une intensité moyenne (ε varie entre 100 à 5000 l.mol-1.cm-1). Tableau.1 : Exemples de transitions n→σ*. .. NH Composés λmax ( nm ) ε ( l.mol-1.cm-1) Méthanol 183 50 Éther 190 2000 Éthylamine 210 800 A- + 2 HA hע Aniline + NH2 Figure.7 : Transition n→σ* d’une amine primaire. NH3 Transition π → π* σ* σ* π* π* hע π π σ σ État fondamental État excité - Si la liaison π est isolée on observe une absorption à 190 nm (caractéristique des éthyléniques). - Dans certains cas la bande d’absorption peut subir un effet bathochrome. L’absorption a lieu alors à des longueurs d’ondes plus élevées. Transition n → π* σ* σ* π* π* hע n n π π σ σ État fondamental État excité - C’est la transition la moins énergétique. Elle donne lieu à des bandes de faible intensité (ε compris entre 10 et 100 l. mol-1 cm-1). - On la rencontre pour des molécules comportant un hétéro-atome porteur de doublets électroniques libres et appartenant à un système insaturé Transition d - d Dans les complexes des métaux de transition, on assiste sous l’effet du champ cristallin à une levée de dégénérescence des orbitales d. En général, ces complexes sont colorés. Par exemple, les solutions des complexes de cuivre(II) [Cu(H2O)6]2+ sont bleues. Les absorptions dans le visible sont le plus souvent dues à une transition d'un électron d'une orbitale d peuplée à une orbitale d vide (Ex. un électron passe du niveau t2g au niveau eg pour une géométrie octaédrique). On parle de transition d–d. Les coefficients d’extinction molaire sont souvent très faibles, de 1 à 100 L.mol-1.cm-1. Figure .8 : Comparatif des plages spectrales des différentes transitions électroniques dans l’UV. c) Caractéristiques et nomenclature des bandes d’absorption Caractéristiques Deux paramètres caractérisent la bande d’absorption Sa position dans l’échelle des longueurs d’onde : λ max ou fréquence (). Son intensité exprimée par coefficient d’absorption molaire : max Nomenclature Bandes R (Radicalaire) Bandes K (Conjuguée) n → π* C=O, NO2 Chromophore avec un hétéroatome, porteur d'électrons libres π → π* C Double C C Simple Bandes B (Benzénoïde) Bandes E (Ethylénique) π → π* π → π* C X O R Double conjugaison C C conjugaison molécules aromatiques ou hétéroaromatiques. molécules aromatiques substituées par des groupements auxochromes. Tableau 02 : Classification des bandes d’absorption selon A. BURAWOY Bande R K B Ε Transition Origine Remarques n → π* Chromophores Isolés, EX : –C = O , NO2 max faible < 100 π → π* Doubles liaisons conjuguées Bandes existant aussi dans des molécules aromatiques portant des substituant chromophoriques (acétophénone –styrène) max élevée > 10.000 π → π* molécules aromatiques et hétéroaromatiques les substituants chromophoriques ont un effet bathochrome. Bande de structure fine. max < 1000 π → π* Structures aromatiques attribuées aux 3doubles liaisons cycliques conjuguées Benzène 2 bandes : Ε1 E2 vers 180 200nm max≈ 2000 1400 V- Spectre d’absorption UV-Visible Les spectres des composés examinés se présentent sous la forme d’un tracé soit de la transmittance « T » soit de l’absorbance « A » en fonction des longueurs d’onde, ce spectre est caractérisé par son λmax et son εmax. Figure .9: Spectre UV d’isoprene : absorbance en fonction de la longueur d’onde. Les cellules de mesure ou cuves sont fabriquées avec un matériau transparent dans le domaine spectral utilisé. Domaine de l’Ultra-Violet Domaine du visible Cuves en quartz ou en silice fondue Cuves en quartz , en silice fondue, en verre ou en matière plastique Spectre en phase gazeuse A l’état gazeux les spectres présentent des structures fines. Figure 10 : Spectre d’absorption du benzène à l’état gazeux Spectre en solution En solution, les spectres des composés présentent généralement des bandes larges et peu nombreuses. Figure 11 : Spectre d’absorption du benzène en solution VI- Principaux Chromophores Simples Le chromophore correspond au site qui, dans la molécule, est à l’origine de la transition électronique. Tableau.3 : Principaux groupements chromophores. a) Absorption des structures électroniques de base Pour un composé organique, la capacité d’absorber des radiations UV dépend de sa structure électronique. Composés ne contenant que des électrons σ ▪ Composés : Hydrocarbures saturés. ▪ Transition : σ → σ* ▪ Énergie : 185 K cal/mol (UV lointain). ▪ Conséquence : Utilisation comme des solvant dans le proche UV. Composés saturés contenant des électrons « n » Composés saturés contenant des hétéro-atomes (O, N, S, X (halogène)) possédant des électrons non liants n. ▪ Transitions : σ → σ* (plus d’énergie) n → σ* (moins d’énergie) La majorité des composés de cette classe ne montrent toujours pas d’absorption dans l’UV proche. Tableau 04 : Caractéristiques d’absorption des composés saturés contenant des hétéro-atomes. λ max (nm) ε max (l mol-1 cm-1) Solvant CH3OH 177 200 Hexane (saturé) CH3-N-CH3 CH3 199 3950 Hexane 259 400 Hexane 188 171 1995 3981 Phase gazeuse - 224 126 Cyclohexane Composé Méthanol Triméthylamine Iodure de méthyle I-CH3 Diéthyl ether C2H5-O-C2H5 Hexanethiol Les sulfures, les thiols, les amines, les bromures et iodures peuvent présenter une faible absorption dans l’UV proche. Cette absorption apparaît souvent comme un simple épaulement ou une inflexion. Epaulement Inflexion Composés contenant des chromophores à électrons « π » Tableau.5 : Données d’absorption pour quelques chromophores isolés. Chromophore Éthylénique RCH=CHR Carbonyle R1R2C=O Azo -N=N- Exemple λmax (nm) εmax (l mol-1 cm-1) Solvant Transition Éthylène 165 15000 Vapeur π→π* Acétone 188 900 n-Hexane π→π* azométhane 347 4.5 Dioxane n→π* Tous les composés ci-dessus contiennent : Un chromophore unique isolé Des électrons π Certains des électrons « n ». -La plupart des composés absorbent dans l’UV lointain sans absorber dans l’UV proche. -Les transitions possibles : n→ σ*, n→ π* et π → π*. - L’absorption dans le proche UV des chromophores isolés provient de la transition n → π* de faible énergie. b) Chromophore éthylénique Chromophore isolé Transition : π → π* max = 165 nm max = 10000 (l mol-1 cm-1) Polyènes EX : H2-C=HC-CH2-CH=CH2 Molécules renfermant deux ou plusieurs chromophores éthyléniques : Les chromophores sont séparés par deux ou plusieurs liaisons simples. La molécule absorbe à la même longueur d’onde que le chromophore isolé et l’intensité d’absorption est proportionnelle au nombre de groupes chromophores isolés dans la molécule. Effet de la conjugaison Si les chromophores éthyléniques ne sont séparés que par une seule simple liaison, le système est dit conjugué : il y a interaction des orbitales π. Le recouvrement efficace des orbitales π donne un système π → π* conjugué et crée deux niveaux d’énergie supplémentaires. Exemple : Cas du butadiène L’enchaînement d’insaturations entraîne la délocalisation des électrons π. Cette délocalisation qui traduit la facilité des électrons à se mouvoir le long de la molécule est accompagnée d’un rapprochement des niveaux d’énergies. π4 * π3 * π2 π1 Figure .12 : Effet bathochrome de la conjugaison. Cas du butadiène par rapport à l’éthylène. La transition du butadiène de l’orbitale fondamentale la plus élevée π2 à l’orbitale excitée la plus basse π*3 correspond à une énergie inférieure à celle du chromophore éthylénique. Effet BATHOCHROME HYPERCHROME. Intérêt de la conjugaison dans l’analyse Déplacement de la bande d’absorption d’une région non accessible par les appareils classiques vers une région du spectre accessible au spectrophotomètre UV/Vis commercialement disponibles. Effet bathochrome et un effet hyperchrome sur la bande d’absorption correspondant à la transition π --> π*. Figure .13 : Effets bathochrome et hyperchrome de la conjugaison sur les polyènes. c) Chromophore carbonyle Trois types d’électrons : ▪ Électrons σ. ▪ Électrons π. ▪ Deux paires d’électrons libres « n ». Transitions possibles et bandes correspondantes : n → σ* λmax = 190 nm π → π* λmax = 150 nm (bande K forte) n → π* λmax = 270 / 300 nm (bande R faible ε ≤ 30) Exemple : Les cétones et aldéhydes saturés. d) Chromophore benzénique Le benzène montre 3 bandes d’absorption : Ces bandes ont pour origine les transitions π → π*. Benzène Tableau 06 : Les bandes benzéniques λmax = 184 nm εmax = 60000 λmax = 204 nm εmax = 7900 λmax = 256 nm εmax = 200 Classification E1 E2 B d’après BRAUDE K B D’après BURAWOY Figure.14 : Représentation schématique des trois bandes d’absorption du benzène. VII- Facteurs influençant les caractéristiques d’absorption Facteurs propres à la molécule Facteurs environnementaux a) Facteurs propres à la molécule 1. Influence des substituants Modification de la position et de l’intensité des bandes d’absorption. ↗λ ↘λ Effet Bathochrome Effet Hypsochrome λ = 198nm λ = 210nm λ = 235nm Benzène Chlorobenzène Phénate de sodium Substitution par des groupes alkyles Bande B : Effet BATHOCHROME Bande E : Effet mal défini Substitution par 2 groupes alkyles (isomères para et ortho) max d’absorption (isomère para) max absorption (isomère ortho) max max Substitution Par des groupes auxochromes (OH, NH2….) Bande B : Effet BATHOCHROME - HYPERCHROME Bande E : Effet BATHOCHROME - HYPERCHROME 2. Effet mésomère E π* π* E1 n E2 n Figure.15 : Effet hypsochrome sur transition n → π* par effet mésomère. Transfert de charge (résonance) entre un groupement insaturé et une paire d’électrons libres « n » Transition concernée : n --> π* Niveau excité π augmente L’énergie nécessaire est augmentée la bande R subit un effet hypsochrome. 3. Effet inductif C’est un effet de polarisation causé par les substituants Tableau 07 : Impact de l’effet inductif sur l’absorption dans l’UV/V Effet inductif positif (> 0) Effet inductif négatif (< 0) Groupements donneurs d’électrons : Groupements accepteurs d’électrons : -CH3, -C2H5, -C3H7 X, NH3, NO2, OCH3, COOH Les groupements augmentent le niveau énergétique de tous les Provoquent un effet Hypsochrome niveau sauf celui du niveau Provoquent un effet Bathochrome Les effets mésomères et inductifs sont souvent associés, ils peuvent soit se renforcer soit s’opposer. Exemple plus le groupe éthylénique est substitué, plus la bande d’absorption due à la transition π → π* est déplacée vers le visible : effet bathochrome. 4. Effets stériques Empêchement stérique de la conjugaison Dans un système conjugué, l’introduction d’un substituant qui provoque une gêne stérique entraîne une déconjugaison des deux insaturations. Gêne stérique faible ≈λ Chlorodiméthylaniline Effet hypochrome Gêne stérique moyenne Le système ne peut plus rester coplanaire. Effet Hypsochrome Hypochrome λ = 254 nm ε = 15000 λ = 247 nm ε = 6200 Gêne stérique majeure Les deux insaturations sont totalement déconjuguées. On n’observe que les absorptions de chacune des insaturations prises isolément. Bimésitylène Rotation autour d’une liaison simple La libre rotation autour de la liaison simple : Résonance maximum Absorption importante. Si la rotation est contrariée par les deux méthyles : Diminution de la résonance Augmentation de l’énergie de transition électronique Effet hypsochrome Isomérie Cis / Trans Cis Stilbène H H C=C Trans Stilbène H C=C H λmax = 283nm, εma x= 12300 λmax = 295nm, εma x= 2500 Double liaison éthylénique subit une torsion due à aux deux substituants volumineux en cis. Transition π→π* correspondante subit un déplacement Bathochrome. La non coplaneité peut entraîner une modification de max, max ou les deux. b) Facteurs environnementaux 1. Influence du solvant Absorption propre du solvant Chaque solvant à un spectre d’absorption dû à ses propres groupements fonctionnels, dont Il faut tenir compte lors des analyses (détecteurs en CHLP). On définit pour chaque solvant une limite d’utilisation (Cut-off point) qui est la longueur d’onde au dessous de laquelle le solvant ne peut être utilisé. Tableau 08 : limite d’utilisation (Cut off) de quelques solvants Solvant Cut off (nm) Eau 205 Méthanol 210 Acétonitrile 210 Acétone 330 Dichlorométhane 235 Polarité du solvant Solvant apolaire Solvant polaire Spectre analogue à celui observé en phase vapeur. Elargissement des bandes qui augmente avec la polarité du solvant. Solvant Polaire Solvant Apolaire Figure 16 : Variation de l’allure du spectre en fonction de la polarité du solvant. 2. Interaction dipôle – dipôle Effet bathochrome pour la bande K (électrons π) Un solvant polaire va stabiliser la forme excitée ce qui favorise la transition et un déplacement vers les grandes longueurs d’ondes (effet bathochrome). E π* π* π Solvant apolaire π Solvant polaire Effet hypsochrome pour la bande R (électrons n) La molécule étant déjà polaire il y a forte attraction au niveau fondamental, Il y a abaissement important du niveau énergétique « n » abaissement moindre du niveau π*. Effet hypsochrome. E π* π* n n Solvant apolaire Solvant polaire , avec E n → π* Apolaire polaire E π→ π* Apolaire polaire Figure .17 : spectres d’absorption de la benzophénone. Effet bathochrome ou hypsochrome sur les deux types de transition suivant la polarité du solvant. 3. Liaisons hydrogènes Elles résultent de l’interaction entre : un atome d’hydrogène du solvant et un doublet d’une orbitale n du soluté. un hydrogène à caractère acide de la molécule et un doublet d’électrons d’une molécule de solvant. La liaison hydrogène provoque la diminution du niveau énergétique n (transition n → п* plus énergétique) effet hypsochrome (Bande R). E π* π* n π n π Liaison hydrogène 4. Influence du pH Cette influence se manifeste uniquement sur les molécules susceptibles d’échanger des protons ( acides ou bases faibles). Cas d’une amine primaire Forme ionisée Forme moléculaire NH2 NH3+ + H+ Indisponibilité des doublets électroniques λmax = 280nm λmax = 250nm Effet hypsochrome Cas du phénol Forme moléculaire Forme ionisée Disponibilité des + H+ doublets électroniques λmax = 270nm λmax = 290nm Effet bathochrome Cas de la Phénophthaleïne Faible résonance Absence de coloration. Forte Résonance couleur Rose. Perte de résonance disparition de coloration. Figure .18 : Effet du pH sur l’absorption de la Phénophthaleïne. Exemple : Monographie du Chlorhydrate de Morphine dans la Pharmacopée Européenne Déprotonation IDENTIFICATION B. : IDENTIFICATION A. : 10mg de M dans 100 ml d’eau R 10mg de M dans 100 ml d’NaOH (0.1M) Effet Bathochrome λmax = 285nm λmax = 298nm Aspé = 41 Aspé = 70 10 VIII- Appareillage Consiste en un système optique susceptible de fournir un rayonnement monochromatique dans la région 200-800nm et un dispositif approprié à la mesure de l’absorbance. Il y a deux types d’appareillage : Appareils à simple faisceau Appareils à montage optique direct ou à montage optique inversé. Appareils à double faisceau Figure.19 : Schéma des appareils à simple faisceau. Figure.20 : Schéma de principe du spectrophotomètre à double faisceau. IX- Applications a) Analyse qualitative 1.Analyse structurale et identification Les informations qualitatives (max , ) fournies par le spectre UVVisible peuvent parfois compléter les données obtenues par des techniques plus puissantes telles que la spectroscopie dans l’infrarouge, la spectrométrie de masse, la RMN, RAMAN etc... L’identification permet de confirmer l’identité de la matière première. 2.Contrôle de pureté La présence d’impuretés peut modifier le spectre d’absorption UV/Vis et se traduire par des : ▪ Changement de positions des maxima d’absorption. ▪ Apparition d’épaulements ou de pics supplémentaires. Pour un composé le est constant dans un solvant donné, sa valeur est liée à la pureté du produit. Si le composé pur est transparent et que l’impureté qu’il renferme absorbe, l’absorbance va décroître quand la pureté augmente. Si le composé n’est pas transparent (), la valeur de augmente avec le degré de pureté du composé. Spectrophotométrie d'absorption dans l‘ultraviolet et le visible La spectrophotométrie UV/Vis, cette méthode est non spécifique (en tant qu'identification), à moins que la courbe d'absorption ne présente plusieurs maximums et minimums. Spectre UV d'une substance (rarement servir à lui seul de critère d'identification). Absorbance spécifique Rapport des absorbances spécifiques. Exemple – Méthodes spectrales : Primaquine (diphosphate de). Exemple – Spectro. dans l’UV-Visible : Vitamine A. b) Analyse quantitative Elle est basée sur l’application de la loi de BEER-LAMBERT Radiation Incidente Radiation Transmise I ≤ I0 ➢ Si la concentration C est exprimée en gramme pour 100 ml de solution (g/100ml), on remplace dans la loi de Beer-Lambert le coefficient d’absorption molaire du soluté par le cœfficient d’absorption spécifique: A = 1% A 1cm l C Choix de la longueur d’onde Choix de la longueur d’onde de travail (en général max ) à partir de la courbe d’absorption du ou des composés à analyser en solution (dans un solvant approprié). Choix du solvant - Inerte vis à vis des substances à étudier - Transparent à la choisie 1.Méthodes utilisées en analyse quantitative Méthode directe Le composé à doser est le seul à absorber à la longueur d’onde utilisée. Gamme d’étalonnage ▪ Préparer une gamme étalon. ▪ Mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons ▪ Tracer la courbe d'étalonnage A = f(c) ▪ Mesurer l'absorbance de la solution à doser ▪ Déterminer la concentration à partir de la courbe d'étalonnage (la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser). Gamme d’étalonnage Figure.21 : Dosage direct d’une substance S en utilisant une courbe d’étalonnage. Etalonnage à un seul point Solution contenant le produit à doser : concentration inconnue «Cx» : = Ax/Cx .l .........................(1) Solution du produit à doser à une concentration connue « C » : = A/C .l …………............(2) (1) = (2) = = Ax/Cx .l = A/C .l Cx = C . Ax /A Ax et A sont mesurées directement. Méthode indirecte 1 Composé à doser Constituants de la matrice Absorbent à λ choisie Transformation du composé à doser (réaction totale) Dérivé dont l’absorption est située dans une autre région spectrale (absence d’interférences). Dosage du dérivé obtenu. 2 Composé à doser sans chromophore exploitable Transformation du composé à doser (Dérivatisation) Dérivé absorbant dans le domaine UV-Visible. Dosage du dérivé obtenu. Figure.22 : 1 : Composé masqué dans un mélange . 2 : Composé ne présentant pas d’absorption nette. 2.Dosage simultané de deux composés λ1 : maximum d’absorption du composé 1 dont la concentration est C1 λ2 : maximum d’absorption du composé 2 dont la concentration est C2 (A1) 1 + ( A2) 1 = A 1 (A1) 2 + (A2) 2 = A 2 1et 2 : coefficients d ‘extinction molaire des composés 1 et 2. A1 = l 11 C1 + l 21 C2 A2 = l 12 C1 + l 22 C2 2 équations à 2 inconnues C1 et C2 1 et 2 peuvent être déterminés en mesurant l’absorbance de solutions pures de chaque composé. 1+2 1 2 Figure.23 : Spectres d’absorption d’un mélange de deux composés. 3.Détermination des points de fin de titrage Les mesures spectrophotométriques dans L’UV /VIS peuvent être utilisées pour déterminer les points de fin de titrage. Il faudrait qu’ au moins un des réactifs, des produits de réaction, ou un indicateur soit absorbant. S + T → P Substrat Titrant Produit Point de fin de titrage : intersections des droites obtenues par extrapolation des deux parties linéaires. Figure.24 : Aspects des courbes de titrages spectrophotométriques. 4.Détermination des constantes thermodynamiques Détermination des pka Méthode basée sur la modification des absorbances en fonction du pH Exemple : Cas d’un acide faible AH AH ↔ C-x A- + H+ x x AH et A- ont des propriétés d’absorption différentes ▪ ▪ ▪ pH = 2 : Forme moléculaire AH → εm pH = 8 : Forme ionisée A-→ εi pH = 5,5 : il y a équilibre et cœxistence de AH et A-. Le pH est donné par la relation : pH = pKa + log ( [A-] / [AH] ) Spectre de la forme ionisée Spectre du mélange des deux formes Spectre de la forme moléculaire Figure.25 :Tracés des courbes d’absorption au trois valeurs de pH. (pH=2, pH=5,5 et pH=8) Les différences d’absorbance sont maximales pour λ=358nm qui est choisie comme λ optimale. Atotale = l i x + l (C-x) m (pH = 5,5 et λ = 358nm) C : Concentration totale de l’acide l : 1 cm. Atotale = x i + C m - x m x = Atotale - C m / i - m (C-x) = C i – Atotale / i - m Am = C m : absorbance de la substance sous forme moléculaire à = 358 nm. Ai = C i : absorbance de la forme ionisée à = 358nm. ▪ La valeur du pKa du couple AH/A- est donnée par la formule suivante : AT- Am pKa = pH – log Ai - AT 5.Utilisation comme détecteur en CLHP La détection spectrophotométrique basée sur la loi de BEERLAMBERT est un système largement utilisé dans la chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Deux types d’appareils équipent les chromatographes Les systèmes classiques Source de lumière monochromatique. Les systèmes perfectionnés Source de lumière polychromatique. Figure.26 :Types de détecteurs UV-Vis en CLHP. Intérêt de la spectrophotométrie UV en analyse quantitative Méthode rapide ayant : Vaste champ d’application : Composés organiques, inorganiques et biochimiques. - Analyse directe = pour le grand nombre de composés qui absorbent dans l’UV et le visible. -Analyse après transformation pour de nombreux composés non absorbant . Grande sensibilité : Limites de détection entre 10-4 et 10-5 M. Bonne sélectivité : Possibilité de trouver une ou seul l’analyte absorbe. Bonne précision : Erreur de l’ordre de 1 à 5 . Facilité de mise en œuvre et possibilité d’automatisation. c) Spectrophotométrie dérivée Principe La spectrophotométrie dérivée est une méthode d’analyse basée sur l’exploitation des « spectres dérivés ». Spectre dérivé Un spectre de dérivée première représente le tracé du gradient de la courbe d’absorption (taux du changement de l’absorbance dA/dλ) en fonction de la longueur d’onde. Il est possible de calculer les dérivées successives d’ordre 1, 2,… et n : A = f (λ) Obtention des spectres dérivés A Ordre 1 Ordre 2 E B C D G Ordre 0 H F I Figure 27 : Dérivation d’un spectre d’origine. Spectre originel d’ordre 0 ▪ Point A : maximum du spectre ▪ Point B et C : points d’inflexion Spectre dérivé d’ordre 1 Courbe tracée à partir de la dérivée première. ▪ Point E : maximum de la courbe correspondant au point d’inflexion B. ▪ Point F : minimum de la courbe correspondant au point d’inflexion C. ▪ Point D : point d’annulation correspondant au maximum A. Spectre dérivé d’ordre 2 Courbe tracée à partir de la dérivée seconde. ▪ Points G et H : deux points d’annulation correspondant au maximum E et au minimum F du spectre d’ordre 1 et aux points d’inflexion B et C du spectre d’origine. ▪ Point I : minimum de la courbe correspondant au point d’annulation D du spectre d’ordre 1 et au maximum A du spectre d’ordre 0. Intensité du signal La dérivée d’ordre « n » Dn de la loi de Beer-Lambert par rapport à la longueur d’onde , donne les résultats suivants: Dn = dnA / dn = (dn / dn) l C Le signal obtenu après dérivation est proportionnel à la concentration. Ordre 0 Ordre 1 Figure 28 : Dérivée d’ordre 1 du spectre d’absorption UV/V Avantages de la spectrophotométrie dérivée Détermination précise de la position des maximums d’absorption et des points d’inflexion. Amélioration de la résolution spectrale (augmentation de la spécificité). Mesures quantitatives directes en milieu trouble ou coloré. Mesures quantitatives dans des systèmes complexes. ▪ Gwenola Burgot; Jean-Louis Burgot. Méthodes instrumentales d’analyse chimique et applications. ▪ M.Hamon; F.Pellerin; M.Guernet; G.Mahuzier. Abrégés de chimie analytique. Tome 3. ▪ Robert.M.Silverstein; Francis.X.Webster; David.J.Kiemle. Spectrometric identification of organic compunds. ▪ Douglas.skoog; F.James Holler; Timothey A.Nieman. Principes d’analyse instrumentale. ▪ F.Rouessac; A.Rouessac; D.Cruché. Analyse chimique : Méthodes et techniques instrumentales modernes. ▪ Skoog; West; Holler. Chimie Analytique.
