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2 Spectrom trie UV - visible(1)

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Université Alger I BenYoucef Benkhedda
Faculté de Médecine, Département de Pharmacie
Laboratoire de Chimie Analytique
Novembre 2017
Spectrophotométrie
d’absorption moléculaire
dans UV-Visible
Dr D. OUNAS
I- Introduction
Méthode fondée sur les modifications de la structure électronique des
molécules.
Longueur
D’onde
Fréquence
Énergie
Figure.1 : Spectre électromagnétique.
λ < 200 nm : UV Lointain
Absorption de l’oxygène atmosphérique
Nécessité d’opérer sous courant d’azote ou sous–vide
Les matériaux tels que le verre ou le quartz absorbent le rayonnement.
200 nm à 400 nm : UV Proche
L’atmosphère est transparente
Possibilité d’utiliser du matériel optique en quartz.
C’est la région du spectre la plus couramment utilisée en
raison de son accessibilité aux équipements couramment
commercialisés.
400 nm à 800 nm : Visible
Le verre n’absorbe pas.
L’atmosphère est transparente.
II- Principe
A- États d’énergie d’une molécule
ET = Eelec + Evib + Erot
Eélec : Énergie électronique dépend du nombre d’électrons et de la forme
de la molécule.
Evib : Énergie vibrationnelle dépend de la nature des noyaux et de leurs
arrangements.
Erot : Énergie rotationnelle dépend de la structure de la molécule.
Figure .2 : Diagramme énergétique pour une molécule diatomique.
Le principe de la spectrométrie UV-Visible repose sur l’absorption d’une
radiation par une molécule dans le domaine allant de 200 à 800 nm.
Après absorption de la radiation, la molécule a pour énergie :
E1 = E0 + h‫ ע‬ou ∆E = h‫ = ע‬hC/λ
E1 : Énergie après excitation.
E0 : Énergie fondamentale.
h : Constante de Planck (6.63 10-34 J.s).
‫ ע‬: Fréquence (Hz).
C : Vitesse de la lumière dans le milieu ou se propage l’onde.
λ : longueur d’onde.
Transition électronique
Figure .3 : Transition électronique.
Relaxation vibrationnelle
E2 S2
Tn
E1 S1
Croisement Intersystème
T1
A
b
s
o
r
p
t
i
o
n
E0 S0
Conversion
Interne
F
l
u
o
r
e
s
c
e
n
c
e
P
h
o
s
p
h
o
r
e
sc
e
n
c
e
Figure .4 : Diagramme de JABLONSKI
S0 : état fondamental
S1 : premier état excité singulet
S2 : second état excité singulet
T1 : premier état excité triplet
 Augmentation de l’énergie d’un ou plusieurs électrons de valence
lorsqu’une molécule isolée absorbe un photon dans le domaine UV-VIS.
L’électron passe d’une orbitale liante à une orbitale antiliante.
 Le retour à l’état fondamental se fait par :
▪ Relaxation non rayonnante : le processus dure environ 10-11 secondes et
s’accompagne d’une restitution de l’énergie d’excitation sous forme de
chaleur .
▪ Relaxation
rayonnante : le retour à l’état fondamental se fait avec
émission de lumière. La désactivation dure environ 10-8 secondes. C’est le
phénomène de fluorescence et phosphorescence .
Caractéristiques de la transition électronique
En général les spectres électroniques mettent en jeu des transferts de
charges entre le niveau fondamental (Eo) et le premier niveau électronique
excité (E1).
Le processus de retour à l’état fondamental est une relaxation non
rayonnante.
En respectant le principe d’exclusion de Pauli, en absorption UV/Visible
seules les transitions singulet sont envisageables
La différence d’énergie entre les deux états concernés correspond à la
fréquence de la radiation électromagnétique:
ΔE = hν
Les électrons concernés sont les plus éloignés du noyau :
▪Électrons de valence (couche externe)
▪Électrons impliqués dans des liaisons (simples et multiples).
▪Électrons non liés (paires libres).
La transition électronique d’un niveau fondamental à un niveau excité
s’accompagne de nombreuses transitions vibrationnelles et rotationnelles.
Le spectre UV sera donc une succession de raies très peu distantes les unes
des autres : Spectre de bande.
III- Terminologie
 Chromophore
Groupement insaturé covalent
électronique (C=C, C=O, NO2).
responsable
de
l'absorption
 Auxochrome
Groupement covalent saturé avec des électrons libres qui relié à un
chromophore modifie les caractéristiques d’absorption de ce dernier
(OH, NH2, Cl..).
 Effet hyperchrome
Augmentation de l’intensité d’absorption.
 Effet hypochrome
Diminution de l’intensité d’absorption.
 Effet bathochrome
Déplacement vers des longueurs d’onde plus grandes dû à une
substitution ou un à effet de solvant (déplacement vers le rouge ou
red shift).
 Effet hypsochrome
Déplacement de l’absorption vers des longueurs d’onde plus courtes
dû à une substitution ou à un effet de solvant (déplacement vers le
bleu ou bleu shift).
Figure .5 : Différents types d’effet sur un spectre.
IV- Transitions électroniques
a) Différents types d’électrons
 Electrons « n »
Electrons libres des hétéro-atomes (N, O, S, halogène,…) Ils peuvent
subir deux types de transitions.
 Electrons « σ »
Électrons fortement liés qui assurent les liaisons monovalentes des
hydrocarbures saturés. Ex : C – C
 Électrons « π »
Les liaisons insaturées sont constituées d’une liaison par des
électrons σ et d’une ou plusieurs liaisons par des électrons π.
π
Ex :
C=C
σ
C
π2
π1
C
b) Types de transitions électroniques
OM
σ* anti-liante
π* anti-liante
Énergie
n non liante
π liante
σ liante
Figure .6 : Énergies des orbitales moléculaires (OM).
Transition σ → σ* : (UV lointain)
σ*
σ*
h‫ע‬
σ
σ
État fondamental
État excité
Nécessite une forte énergie et se traduit par des absorptions
situées à une longueur d’onde λ voisine de 180 nm non décelables
par les appareils usuels.
Transition n → σ*
σ*
σ*
h‫ע‬
n
n
σ
σ
État fondamental
État excité
La longueur d’onde d’absorption est aux environs de 180 à 190 nm avec
une intensité moyenne (ε varie entre 100 à 5000 l.mol-1.cm-1).
Tableau.1 : Exemples de transitions n→σ*.
.. NH
Composés
λmax ( nm )
ε ( l.mol-1.cm-1)
Méthanol
183
50
Éther
190
2000
Éthylamine
210
800
A-
+
2
HA
h‫ע‬
Aniline
+
NH2
Figure.7 : Transition n→σ* d’une amine primaire.
NH3
Transition π → π*
σ*
σ*
π*
π*
h‫ע‬
π
π
σ
σ
État fondamental
État excité
- Si la liaison π est isolée on observe une absorption à 190 nm
(caractéristique des éthyléniques).
- Dans certains cas la bande d’absorption
peut subir un effet
bathochrome. L’absorption a lieu alors à des longueurs d’ondes plus
élevées.
Transition n → π*
σ*
σ*
π*
π*
h‫ע‬
n
n
π
π
σ
σ
État fondamental
État excité
- C’est la transition la moins énergétique. Elle donne lieu à des
bandes de faible intensité (ε compris entre 10 et 100 l. mol-1 cm-1).
- On la rencontre pour des molécules comportant un hétéro-atome
porteur de doublets électroniques libres et appartenant à un système
insaturé
Transition d - d
Dans les complexes des métaux de transition, on assiste sous l’effet du champ
cristallin à une levée de dégénérescence des orbitales d.
En général, ces complexes sont colorés. Par exemple, les solutions des complexes
de cuivre(II) [Cu(H2O)6]2+ sont bleues. Les absorptions dans le visible sont le
plus souvent dues à une transition d'un électron d'une orbitale d peuplée à une
orbitale d vide (Ex. un électron passe du niveau t2g au niveau eg pour une
géométrie octaédrique). On parle de transition d–d. Les coefficients d’extinction
molaire sont souvent très faibles, de 1 à 100 L.mol-1.cm-1.
Figure .8 : Comparatif des plages spectrales des différentes transitions
électroniques dans l’UV.
c) Caractéristiques et nomenclature des bandes d’absorption
Caractéristiques
Deux paramètres caractérisent la
bande d’absorption
Sa position dans l’échelle
des longueurs d’onde :
λ max ou fréquence ().
Son intensité exprimée par
coefficient d’absorption
molaire :  max
Nomenclature
Bandes R
(Radicalaire)
Bandes K
(Conjuguée)
n → π*
C=O,
NO2
Chromophore
avec un
hétéroatome,
porteur
d'électrons
libres
π → π*
C
Double
C
C
Simple
Bandes B
(Benzénoïde)
Bandes E
(Ethylénique)
π → π*
π → π*
C
X
O R
Double
conjugaison
C
C
conjugaison
molécules
aromatiques ou
hétéroaromatiques.
molécules aromatiques
substituées par des
groupements
auxochromes.
Tableau 02 : Classification des bandes d’absorption selon A. BURAWOY
Bande
R
K
B
Ε
Transition
Origine
Remarques
n → π*
Chromophores
Isolés, EX :
–C = O , NO2
 max faible < 100
π → π*
Doubles liaisons
conjuguées
Bandes existant aussi dans des
molécules aromatiques portant
des substituant chromophoriques
(acétophénone –styrène)
max élevée > 10.000
π → π*
molécules
aromatiques et
hétéroaromatiques
les substituants chromophoriques
ont un effet bathochrome.
Bande de structure fine.
max < 1000
π → π*
Structures
aromatiques
attribuées aux
3doubles
liaisons cycliques
conjuguées
Benzène 2 bandes :
Ε1
E2
vers
180
200nm
max≈
2000
1400
V- Spectre d’absorption UV-Visible
Les spectres des composés examinés se présentent sous la forme d’un
tracé soit de la transmittance « T » soit de l’absorbance « A » en
fonction des longueurs d’onde, ce spectre est caractérisé par son λmax et
son εmax.
Figure .9: Spectre UV d’isoprene : absorbance en fonction de la longueur
d’onde.
Les cellules de mesure ou cuves sont fabriquées avec un matériau
transparent dans le domaine spectral utilisé.
Domaine de l’Ultra-Violet
Domaine du visible
Cuves en quartz
ou en
silice fondue
Cuves en quartz ,
en silice fondue,
en verre
ou en matière plastique
Spectre en phase gazeuse
A l’état gazeux les spectres présentent des structures fines.
Figure 10 : Spectre d’absorption du benzène à l’état gazeux
Spectre en solution
En solution, les spectres des composés présentent généralement des
bandes larges et peu nombreuses.
Figure 11 : Spectre d’absorption du benzène en solution
VI- Principaux Chromophores Simples
Le chromophore correspond au site qui, dans la molécule, est à
l’origine de la transition électronique.
Tableau.3 : Principaux groupements chromophores.
a) Absorption des structures électroniques de base
Pour un composé organique, la capacité d’absorber des radiations
UV dépend de sa structure électronique.
Composés ne contenant que des électrons σ
▪ Composés : Hydrocarbures saturés.
▪ Transition : σ → σ*
▪ Énergie : 185 K cal/mol (UV lointain).
▪ Conséquence : Utilisation comme des solvant dans le proche UV.
Composés saturés contenant des électrons « n »
Composés saturés contenant des hétéro-atomes (O, N, S, X
(halogène)) possédant des électrons non liants n.
▪ Transitions : σ → σ* (plus d’énergie)
n → σ* (moins d’énergie)
La majorité des composés de cette classe ne montrent toujours
pas d’absorption dans l’UV proche.
Tableau 04 : Caractéristiques d’absorption des composés saturés
contenant des hétéro-atomes.
λ max (nm)
ε max (l mol-1 cm-1)
Solvant
CH3OH
177
200
Hexane (saturé)
CH3-N-CH3
CH3
199
3950
Hexane
259
400
Hexane
188
171
1995
3981
Phase gazeuse
-
224
126
Cyclohexane
Composé
Méthanol
Triméthylamine
Iodure de méthyle I-CH3
Diéthyl ether
C2H5-O-C2H5
Hexanethiol
Les sulfures, les thiols, les amines, les bromures et iodures
peuvent présenter une faible absorption dans l’UV proche.
Cette absorption apparaît souvent comme un simple épaulement ou
une inflexion.
Epaulement
Inflexion
Composés contenant des chromophores à électrons « π »
Tableau.5 : Données d’absorption pour quelques chromophores isolés.
Chromophore
Éthylénique
RCH=CHR
Carbonyle
R1R2C=O
Azo
-N=N-
Exemple
λmax (nm)
εmax (l
mol-1 cm-1)
Solvant
Transition
Éthylène
165
15000
Vapeur
π→π*
Acétone
188
900
n-Hexane
π→π*
azométhane
347
4.5
Dioxane
n→π*
Tous les composés ci-dessus contiennent :
Un chromophore unique isolé
Des électrons π
Certains des électrons « n ».
-La plupart des composés absorbent dans l’UV lointain sans absorber
dans l’UV proche.
-Les transitions possibles : n→ σ*, n→ π* et π → π*.
- L’absorption dans le proche UV des chromophores isolés provient de
la transition n → π* de faible énergie.
b) Chromophore éthylénique
 Chromophore isolé
Transition : π → π*
max = 165 nm
max = 10000 (l mol-1 cm-1)
 Polyènes
EX : H2-C=HC-CH2-CH=CH2
Molécules renfermant deux ou plusieurs chromophores
éthyléniques :
Les chromophores sont séparés par deux ou plusieurs liaisons
simples.
La molécule absorbe à la même longueur d’onde que le
chromophore isolé et l’intensité d’absorption est proportionnelle au
nombre de groupes chromophores isolés dans la molécule.
 Effet de la conjugaison
Si les chromophores éthyléniques ne sont séparés que par une seule
simple liaison, le système est dit conjugué : il y a interaction des
orbitales π.
Le recouvrement efficace des orbitales π donne un système π → π*
conjugué et crée deux niveaux d’énergie supplémentaires.
Exemple : Cas du butadiène
L’enchaînement d’insaturations entraîne la délocalisation des
électrons π.
Cette délocalisation qui traduit la facilité des électrons à se mouvoir
le long de la molécule est accompagnée d’un rapprochement des
niveaux d’énergies.
π4 *
π3 *
π2
π1
Figure .12 : Effet bathochrome de la conjugaison.
Cas du butadiène par rapport à l’éthylène.
La transition du butadiène de l’orbitale fondamentale la plus élevée
π2 à l’orbitale excitée la plus basse π*3 correspond à une énergie
inférieure à celle du chromophore éthylénique.
Effet BATHOCHROME HYPERCHROME.
Intérêt de la conjugaison dans l’analyse
Déplacement de la bande d’absorption d’une région non accessible par
les appareils classiques vers une région du spectre accessible au
spectrophotomètre UV/Vis commercialement disponibles.
Effet bathochrome et un effet hyperchrome sur la bande
d’absorption correspondant à la transition π --> π*.
Figure .13 : Effets bathochrome et hyperchrome de la conjugaison sur les
polyènes.
c) Chromophore carbonyle
Trois types d’électrons :
▪ Électrons σ.
▪ Électrons π.
▪ Deux paires d’électrons libres « n ».
Transitions possibles et bandes correspondantes :
n → σ*
λmax = 190 nm
π → π*
λmax = 150 nm (bande K forte)
n → π*
λmax = 270 / 300 nm (bande R faible ε ≤ 30)
Exemple : Les cétones et aldéhydes saturés.
d) Chromophore benzénique
Le benzène montre 3 bandes d’absorption :
Ces bandes ont pour origine les transitions π → π*.
Benzène
Tableau 06 : Les bandes benzéniques
λmax = 184 nm
εmax = 60000
λmax = 204 nm
εmax = 7900
λmax = 256 nm
εmax = 200
Classification
E1
E2
B
d’après BRAUDE
K
B
D’après
BURAWOY
Figure.14 : Représentation schématique des trois bandes d’absorption du
benzène.
VII- Facteurs influençant les caractéristiques
d’absorption
Facteurs propres
à la molécule
Facteurs
environnementaux
a) Facteurs propres à la molécule
1. Influence des substituants
Modification de la position et de l’intensité des bandes d’absorption.
↗λ
↘λ
Effet Bathochrome
Effet Hypsochrome
λ = 198nm
λ = 210nm
λ = 235nm
Benzène
Chlorobenzène
Phénate
de sodium
Substitution par des groupes alkyles
Bande B : Effet BATHOCHROME
Bande E : Effet mal défini
Substitution par 2 groupes alkyles (isomères para et ortho)
 max d’absorption (isomère para)   max absorption (isomère ortho)
 max

 max
Substitution Par des groupes auxochromes (OH, NH2….)
Bande B : Effet BATHOCHROME - HYPERCHROME
Bande E : Effet BATHOCHROME - HYPERCHROME
2. Effet mésomère
E
π*
π*
E1
n
E2
n
Figure.15 : Effet hypsochrome sur transition n → π* par effet mésomère.
Transfert de charge (résonance) entre un groupement insaturé et
une paire d’électrons libres « n »
Transition concernée : n --> π*
Niveau excité π augmente
L’énergie nécessaire est augmentée
la bande R subit un effet hypsochrome.
3. Effet inductif
C’est un effet de polarisation causé par les substituants
Tableau 07 : Impact de l’effet inductif sur l’absorption dans l’UV/V
Effet inductif positif (> 0)
Effet inductif négatif (< 0)
Groupements donneurs d’électrons : Groupements accepteurs d’électrons :
-CH3, -C2H5, -C3H7
X, NH3, NO2, OCH3, COOH
Les groupements augmentent le
niveau énergétique de tous les
Provoquent un effet Hypsochrome
niveau sauf celui du niveau 
Provoquent un effet Bathochrome
Les effets mésomères et inductifs sont souvent associés,
ils peuvent soit se renforcer soit s’opposer.
Exemple
plus le groupe éthylénique est substitué, plus la bande
d’absorption due à la transition π → π* est déplacée vers le
visible : effet bathochrome.
4. Effets stériques
Empêchement stérique de la conjugaison
Dans un système conjugué, l’introduction d’un substituant qui provoque
une gêne stérique entraîne une déconjugaison des deux insaturations.
Gêne stérique faible
≈λ
Chlorodiméthylaniline
Effet hypochrome
Gêne stérique moyenne
Le système ne peut plus rester coplanaire.
Effet Hypsochrome
Hypochrome
λ = 254 nm
ε = 15000
λ = 247 nm
ε = 6200
Gêne stérique majeure
Les deux insaturations sont totalement déconjuguées.
On n’observe que les absorptions de chacune des insaturations prises
isolément.
Bimésitylène
Rotation autour d’une liaison simple
La libre rotation autour de la liaison simple :
 Résonance maximum
 Absorption importante.
Si la rotation est contrariée par les deux
méthyles :
 Diminution de la résonance
 Augmentation de l’énergie
de transition électronique
 Effet hypsochrome
Isomérie Cis / Trans
Cis Stilbène
H
H
C=C
Trans Stilbène
H
C=C
H
λmax = 283nm, εma x= 12300
λmax = 295nm, εma x= 2500
Double liaison éthylénique subit une torsion due à aux deux
substituants volumineux en cis.
Transition π→π* correspondante subit un déplacement
Bathochrome.
La non coplaneité peut entraîner une modification de
max, max ou les deux.
b) Facteurs environnementaux
1. Influence du solvant
Absorption propre du solvant
Chaque solvant à un spectre d’absorption dû à ses propres groupements
fonctionnels, dont Il faut tenir compte lors des analyses (détecteurs en CHLP).
On définit pour chaque solvant une limite d’utilisation (Cut-off point) qui est
la longueur d’onde au dessous de laquelle le solvant ne peut être utilisé.
Tableau 08 : limite d’utilisation (Cut off) de quelques solvants
Solvant
Cut off (nm)
Eau
205
Méthanol
210
Acétonitrile
210
Acétone
330
Dichlorométhane
235
Polarité du solvant
Solvant apolaire
Solvant polaire
Spectre analogue à celui
observé
en phase vapeur.
Elargissement des bandes qui
augmente avec la polarité du
solvant.
Solvant Polaire
Solvant Apolaire
Figure 16 : Variation de l’allure du spectre en fonction de la polarité du solvant.
2. Interaction dipôle – dipôle
Effet bathochrome pour la bande K (électrons π)
Un solvant polaire va stabiliser la forme excitée ce qui favorise la
transition et un déplacement vers les grandes longueurs d’ondes
(effet bathochrome).
E
π*
π*
π
Solvant apolaire
π
Solvant polaire
Effet hypsochrome pour la bande R (électrons n)
La molécule étant déjà polaire il y a forte attraction au niveau fondamental,
Il y a abaissement important du niveau énergétique
« n »
abaissement moindre du niveau π*.
Effet hypsochrome.
E
π*
π*
n
n
Solvant apolaire
Solvant polaire
, avec
E
n → π*
Apolaire polaire
E
π→ π*
Apolaire polaire
Figure .17 : spectres d’absorption de la benzophénone.
Effet bathochrome ou hypsochrome sur les deux types de transition suivant la
polarité du solvant.
3. Liaisons hydrogènes
Elles résultent de l’interaction entre :
un atome d’hydrogène du solvant et un doublet d’une orbitale n du
soluté.
un hydrogène à caractère acide de la molécule et un doublet
d’électrons d’une molécule de solvant.
La liaison hydrogène provoque la diminution du niveau énergétique n
(transition n → п* plus énergétique)
effet hypsochrome (Bande R).
E π*
π*
n
π
n
π
Liaison hydrogène
4. Influence du pH
Cette influence se manifeste uniquement sur les molécules
susceptibles d’échanger des protons ( acides ou bases faibles).
Cas d’une amine primaire
Forme ionisée
Forme moléculaire
NH2
NH3+
+ H+
Indisponibilité
des
doublets
électroniques
λmax =
280nm
λmax =
250nm
Effet hypsochrome
Cas du phénol
Forme moléculaire
Forme ionisée
Disponibilité des
+ H+
doublets
électroniques
λmax =
270nm
λmax =
290nm
Effet bathochrome
Cas de la Phénophthaleïne
Faible résonance
Absence de coloration.
Forte Résonance
couleur Rose.
Perte de résonance
disparition de coloration.
Figure .18 : Effet du pH sur l’absorption de la Phénophthaleïne.
Exemple : Monographie du Chlorhydrate de Morphine dans la
Pharmacopée Européenne
Déprotonation
IDENTIFICATION B. :
IDENTIFICATION A. :
10mg de M dans 100 ml d’eau R
10mg de M dans 100 ml d’NaOH (0.1M)
Effet Bathochrome
λmax = 285nm
λmax = 298nm
Aspé = 41
Aspé = 70
10
VIII- Appareillage
Consiste en un système optique susceptible de fournir un rayonnement
monochromatique dans la région 200-800nm et un dispositif approprié
à la mesure de l’absorbance.
Il y a deux types d’appareillage :
 Appareils à simple faisceau
Appareils à montage optique direct ou à montage optique inversé.
 Appareils à double faisceau
Figure.19 : Schéma des appareils à simple faisceau.
Figure.20 : Schéma de principe du spectrophotomètre à double faisceau.
IX- Applications
a) Analyse qualitative
1.Analyse structurale et identification
Les informations qualitatives (max ,  ) fournies par le spectre UVVisible peuvent parfois compléter les données obtenues par des
techniques plus puissantes telles que la spectroscopie dans l’infrarouge, la spectrométrie de masse, la RMN, RAMAN etc...
L’identification permet de confirmer l’identité de la matière
première.
2.Contrôle de pureté
La présence d’impuretés peut modifier le spectre d’absorption
UV/Vis et se traduire par des :
▪ Changement de positions des maxima d’absorption.
▪ Apparition d’épaulements ou de pics supplémentaires.
Pour un composé le  est constant dans un solvant donné, sa
valeur est liée à la pureté du produit.
Si le composé pur est
transparent et que
l’impureté qu’il renferme
absorbe, l’absorbance va
décroître quand la pureté
augmente.
Si le composé n’est
pas transparent (),
la valeur de 
augmente avec le
degré de pureté du
composé.
Spectrophotométrie d'absorption dans
l‘ultraviolet et le visible
La spectrophotométrie UV/Vis, cette méthode est non
spécifique (en tant qu'identification), à moins que la courbe
d'absorption ne présente plusieurs maximums et minimums.
Spectre UV d'une substance (rarement servir à lui seul de
critère d'identification).
Absorbance spécifique
Rapport des absorbances spécifiques.
Exemple – Méthodes spectrales :
Primaquine (diphosphate de).
Exemple – Spectro. dans l’UV-Visible :
Vitamine A.
b) Analyse quantitative
Elle est basée sur l’application de la loi de BEER-LAMBERT
Radiation
Incidente
Radiation
Transmise
I ≤ I0
➢ Si la concentration C est exprimée en gramme pour 100
ml de solution (g/100ml), on remplace dans la loi de
Beer-Lambert le coefficient d’absorption molaire du
soluté par le cœfficient d’absorption spécifique:
A =
1%
A 1cm
l C
Choix de la longueur d’onde
Choix de la longueur d’onde de travail  (en général max ) à partir de
la courbe d’absorption du ou des composés à analyser en solution
(dans un solvant approprié).
Choix du solvant
- Inerte vis à vis des substances à étudier
- Transparent à la  choisie
1.Méthodes utilisées en analyse quantitative
Méthode directe
Le composé à doser est le seul à absorber à la longueur d’onde utilisée.
Gamme d’étalonnage
▪ Préparer une gamme étalon.
▪ Mesurer l'absorbance de chacune de ces solutions étalons
▪ Tracer la courbe d'étalonnage A = f(c)
▪ Mesurer l'absorbance de la solution à doser
▪ Déterminer la concentration à partir de la courbe d'étalonnage
(la gamme doit encadrer la valeur probable de la solution à doser).
Gamme
d’étalonnage
Figure.21 : Dosage direct d’une substance S en utilisant une courbe d’étalonnage.
Etalonnage à un seul point
Solution contenant le produit à doser : concentration inconnue «Cx» :
 = Ax/Cx .l
.........................(1)
Solution du produit à doser à une concentration connue « C » :
 = A/C .l
…………............(2)
(1) = (2) =  = Ax/Cx .l = A/C .l  Cx = C . Ax /A
Ax et A sont mesurées directement.
Méthode indirecte
1
Composé à doser
Constituants de la matrice
Absorbent à λ choisie
Transformation du composé à doser (réaction totale)
Dérivé dont l’absorption est située dans une autre région
spectrale (absence d’interférences).
Dosage du dérivé obtenu.
2
Composé à doser sans chromophore exploitable
Transformation du composé à doser (Dérivatisation)
Dérivé absorbant dans le domaine UV-Visible.
Dosage du dérivé obtenu.
Figure.22 : 1 : Composé masqué dans un mélange .
2 : Composé ne présentant pas d’absorption nette.
2.Dosage simultané de deux composés
λ1 : maximum d’absorption du composé 1 dont la concentration est C1
λ2 : maximum d’absorption du composé 2 dont la concentration est C2
(A1)  1 + ( A2)  1 = A 1
(A1)  2 + (A2)  2 = A 2
1et 2 : coefficients d ‘extinction molaire des composés 1 et 2.
A1 = l 11 C1 + l 21 C2
A2 = l 12 C1 + l 22 C2
2 équations à 2 inconnues C1 et C2
1 et 2 peuvent être déterminés en mesurant l’absorbance de
solutions pures de chaque composé.
1+2
1
2
Figure.23 : Spectres d’absorption d’un mélange de deux composés.
3.Détermination des points de fin de titrage
Les mesures spectrophotométriques dans L’UV /VIS peuvent être
utilisées pour déterminer les points de fin de titrage.
Il faudrait qu’ au moins un des réactifs, des produits de réaction, ou
un indicateur soit absorbant.
S
+
T
→ P
Substrat
Titrant
Produit
Point de fin de titrage : intersections des droites obtenues
par extrapolation des deux parties linéaires.
Figure.24 : Aspects des courbes de titrages spectrophotométriques.
4.Détermination des constantes thermodynamiques
Détermination des pka
Méthode basée sur la modification des absorbances en fonction du pH
Exemple : Cas d’un acide faible AH
AH ↔
C-x
A- + H+
x
x
AH et A- ont des propriétés d’absorption différentes
▪
▪
▪
pH = 2 : Forme moléculaire AH → εm
pH = 8 : Forme ionisée A-→ εi
pH = 5,5 : il y a équilibre et cœxistence de AH et A-.
Le pH est donné par la relation :
pH = pKa + log ( [A-] / [AH] )
Spectre de la forme ionisée
Spectre du mélange des deux
formes
Spectre de la forme moléculaire
Figure.25 :Tracés des courbes d’absorption au trois valeurs de pH.
(pH=2, pH=5,5 et pH=8)
Les différences d’absorbance sont maximales pour λ=358nm qui est
choisie comme λ optimale.
Atotale = l i x + l (C-x) m
(pH = 5,5 et λ = 358nm)
C : Concentration totale de l’acide
l : 1 cm.
Atotale = x i + C m - x m
x = Atotale - C m / i - m
(C-x) = C i – Atotale / i - m
Am = C m : absorbance de la substance sous forme moléculaire à  = 358 nm.
Ai = C i : absorbance de la forme ionisée à  = 358nm.
▪ La valeur du pKa du couple AH/A- est donnée par la formule
suivante :
AT- Am
pKa = pH – log
Ai - AT
5.Utilisation comme détecteur en CLHP
 La détection spectrophotométrique basée sur la loi de BEERLAMBERT est un système largement utilisé dans la chromatographie
liquide à haute performance (CLHP).
Deux types d’appareils équipent les chromatographes
Les systèmes classiques
Source de lumière monochromatique.
Les systèmes perfectionnés
Source de lumière polychromatique.
Figure.26 :Types de détecteurs UV-Vis en CLHP.
Intérêt de la spectrophotométrie UV en analyse quantitative
Méthode rapide ayant :
Vaste champ d’application : Composés organiques, inorganiques et
biochimiques.
- Analyse directe = pour le grand nombre de composés qui absorbent dans
l’UV et le visible.
-Analyse après transformation pour de nombreux composés non absorbant .
Grande sensibilité : Limites de détection entre 10-4 et 10-5 M.
Bonne sélectivité : Possibilité de trouver une  ou seul l’analyte absorbe.
Bonne précision : Erreur de l’ordre de 1 à 5 .
Facilité de mise en œuvre et possibilité d’automatisation.
c) Spectrophotométrie dérivée
Principe
La spectrophotométrie dérivée est une méthode d’analyse basée sur
l’exploitation des « spectres dérivés ».
Spectre dérivé
Un spectre de dérivée première représente le tracé du gradient de la
courbe d’absorption (taux du changement de l’absorbance dA/dλ) en
fonction de la longueur d’onde.
Il est possible de calculer les dérivées successives d’ordre 1, 2,… et n :
A = f (λ)
Obtention des spectres dérivés
A
Ordre 1
Ordre 2
E
B
C
D
G
Ordre 0
H
F
I
Figure 27 : Dérivation d’un spectre d’origine.
Spectre originel d’ordre 0
▪ Point A : maximum du spectre
▪ Point B et C : points d’inflexion
Spectre dérivé d’ordre 1
Courbe tracée à partir de la dérivée première.
▪ Point E : maximum de la courbe correspondant au point d’inflexion B.
▪ Point F : minimum de la courbe correspondant au point d’inflexion C.
▪ Point D : point d’annulation correspondant au maximum A.
Spectre dérivé d’ordre 2
Courbe tracée à partir de la dérivée seconde.
▪ Points G et H : deux points d’annulation correspondant au maximum
E et au minimum F du spectre d’ordre 1 et aux points d’inflexion B et C
du spectre d’origine.
▪ Point I : minimum de la courbe correspondant au point d’annulation
D du spectre d’ordre 1 et au maximum A du spectre d’ordre 0.
Intensité du signal
La dérivée d’ordre « n » Dn de la loi de Beer-Lambert par rapport à la
longueur d’onde , donne les résultats suivants:
Dn = dnA / dn = (dn  / dn) l C
Le signal obtenu après dérivation est proportionnel à la
concentration.
Ordre 0
Ordre 1
Figure 28 : Dérivée d’ordre 1 du spectre d’absorption UV/V
Avantages de la spectrophotométrie dérivée
Détermination précise de la position des maximums d’absorption
et des points d’inflexion.
Amélioration de la résolution spectrale (augmentation de la
spécificité).
Mesures quantitatives directes en milieu trouble ou coloré.
Mesures quantitatives dans des systèmes complexes.
▪ Gwenola Burgot; Jean-Louis Burgot. Méthodes instrumentales d’analyse
chimique et applications.
▪ M.Hamon; F.Pellerin; M.Guernet; G.Mahuzier. Abrégés de chimie
analytique. Tome 3.
▪ Robert.M.Silverstein; Francis.X.Webster; David.J.Kiemle. Spectrometric
identification of organic compunds.
▪ Douglas.skoog; F.James Holler; Timothey A.Nieman. Principes d’analyse
instrumentale.
▪ F.Rouessac; A.Rouessac; D.Cruché. Analyse chimique : Méthodes et
techniques instrumentales modernes.
▪ Skoog; West; Holler. Chimie Analytique.
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