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Extraction d'ADN ppt

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Université Mohamed Khider -BiskraFaculté des sciences exactes et des sciences de la nature et de la vie
Département des sciences de la nature et de la vie
1 er master biochimie fondamental et appliqué
-
Bendahmane Sabrine
Benrouane Sakina
Bensalem Ahlem
Behaz Imane
Ben Achour Mofida
Benchnaf Sakina
Chouia Amel
2016/2017
1- Introduction
2- Extraction d'ADN du sang
2-1- Protocol d’extraction de l'ADN de sang
3- Extraction d'ADN chez les animaux
3-1- Protocol d’extraction d'ADN de foie de mouton
4- Conclusion
L'extraction de l'ADN est une technique permettant
d'isoler l'ADN de cellules ou de tissus. L'ADN ainsi
extrait peut ensuite être utilisé pour des recherches
de biologie moléculaire, telles que la PCR. Il existe
différents protocoles pour extraire l'ADN mais le
principe est a peu près toujours le même.
L'extraction de l'ADN chez les animaux et le sang,
sont les deux protocoles en va étudié dans cette
travail, alors comment en peut extrait leurs matériel
génétique
Une première étape consiste à éliminer les globules rouges et toutes les
impuretés du milieu extra cellulaire. On ajoute aux prélèvements effectués une solution
hypotonique qui fera éclater les globules rouges. Les globules blancs étant beaucoup plus
résistants, ils ne seront pas détruits.
Comme les globules rouges ne contiennent pas d'ADN, il sera extrait des globules blancs.
La centrifugation permet de séparer les globules blancs des débris
de globules rouges. A la fin de la centrifugation, il apparaît au fond du tube un « culot »
blanc (ce sont les restes de globules blancs) et un « surnageant » rouge (ce sont les débris
de globules rouges) que l'on va retirer du tube.
La centrifugation se fait à la vitesse
de 4000 rpm pendant 5 minutes
Pour cette étape, on utilise une solution agressive
de détergent afin de déstabiliser la membrane des globules blancs et le noyau de la
cellule. Ensuite, une enzyme appelée « Protéinase K » est ajoutée à la solution. Elle va
dégrader les protéines de la cellule. Le tube est chauffé entre 55 et 65°C pendant un
temps pouvant allé de une heure à une nuit entière, afin d'avoir une activité optimale de
la protéinase K.
Détergent agressif
Protéinase K
Culot
Suite à cette étape, le tube contient
un mélange d'ADN, et les restes de
la cellules : fragments de protéines,
résidus de la membrane de la
cellule et toutes les molécules du
cytoplasme.
Chauffé entre 55 et 65 °C de 1 heure à
toute une nuit
Destruction des globules
blancs
Grâce à la précipitation, on peut séparer l'ADN du reste de la
solution de lysat. On ajouté d'abord délicatement de l'isopropanol pur (dit isopropanol
100%) et on mélange délicatement le tube. Après 4 à 5 agitations, on observe la
formation d'une masse opaque, sous forme de « pelote » : c'est l'ADN.
Ajouté l’isopropanol
agitation
ADN
Le tube doit repasser dans la centrifugeuse. La
centrifugation va mettre la pelote d'ADN au fond du tube. Ainsi, on pourra éliminer le
surnageant contenant les restes de la cellule sans toucher à l'ADN.
centrifugation
Éliminé le
surnagent
Pour éliminer le maximum de la solution de lyse, on ajoute
dans le tube de l'éthanol 70%. L'éthanol 70% sera plus efficace que l'isopropanol pour
éliminer les restes de la solution de lyse, car il contient 30% d'eau (C'est l'eau qui va
solubiliser les impuretés autour de la pelote d'ADN.
On centrifuge alors la solution
,afin que la pelote se dépose au
fond du tube et permette ainsi
d'éliminer plus facilement le
surnageant.
Cependant, l'éthanol peut fausser les analyses réalisées sur l'ADN ainsi
extrait. On laisse donc le tube ouvert pour que l'éthanol s'évapore.
Quand l'ADN est en pelote sèche, il ne peut être utilisé pour
des analyses de biologie moléculaire. On doit donc réhydraté l'ADN dans une solution.
L'ADN sera totalement réhydraté lorsque la pelote aura disparu. La solution est le plus
souvent du Tris-EDTA. Ces composants donnent un pH et une force ionique à l'eau qui
optimisent l'hydratation et la conservation de l'ADN. Pour une meilleure hydratation de
l'ADN, on chauffe le tube à 65°C pendant 1 à 2 heures après l'ajout du Tris-EDTA.
Tris- EDTA
2- Extraction d’ADN chez les animaux
(cellule animale)
1- on va couper un morceau de foie en 5 parties a peut prés égales.
2-on prépare le milieu d’extraction:
60 ml d’eau déminéralisée
On dissous 9 g de
NaCl
4 à 5 gouttes d’acide acétique
3-pour obtenir la solution:
- On versera dans un mortier 30 ml de cette solution ainsi que les morceaux de foie.
30 ml de solution
- On broie alors ces morceaux dans le mortier , mais dans ce broyat seule la phase liquide
nous intéresse ( mais ce liquide contient encore des débris de cellules dont on veut
débarrasser
3-on va placer le tube ( contente le mélange ) dans un centrifugeuse à 2000 rpm
pendant 10 minutes.
Après 10 minutes de centrifugation on récupère alors le surnageant
4- on placé un volume de ce surnageant dans un tube, puis on a rajouté deux volumes
d’éthanol
Éthanol, 2 volumes
Surnageant , 1 volume
- On incline délicatement de gauche a droite le liquide afin d’obtenir le résultats final
ADN
Toutes les cellules , animales ou
végétales contiennent un pelote
blanche filamenteuse ( ADN).
http://fr.calameo.com/read/000462342715fc79722ee
http://tpe-adn-police-scientifique.e-monsite.com/pages/methode-dextraction-de-l-adn.html
http://www.didier-pol.net/3ftextadnfoie.htm
https://fr.wikipedia.org/wiki/Eau_d%C3%A9min%C3%A9ralis%C3%A9e
http://wiki.scienceamusante.net/index.php?title=Extraction_de_son_propre_
ADN
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