Pyroséquençage BENJRINIJA Asmaa et EL MAHI Kaoutar - Le Pyroséquençage est une technique de séquençage basée sur la détection du pyrophosphate relâché lors de la réaction de polymérisation de l’ADN. - C’est un procédé de détection alternatif à la méthode Sanger. I. Principe de Pyroséquençage : C’est le séquençage d’un ADN monobrin par synthèse d’un brin complémentaire, base par base, en détectant à chaque étape l’activité de la polymérase par une autre enzyme chimiluminescence : la luciférase. - En 2005, on avait la commercialisation de premier Pyroséquenceur 454 qui est fondé sur l’intégration de plusieurs techniques : le pyroséquençage, les technologies des plaques en fibre optique picotitré [PicoTiterplate (PTP)] et la PCR en émulsion (emPCR) dans des microréacteurs (300 000 réactions PCR en parallèle). II. Protocole de Pyroséquençage 454 : - Le protocole est basé sur 3 étapes : 1. La préparation des librairies d’ADN simple brin : - Un fractionnement aléatoire aux échantillons d’ADN afin d’obtenir un ADN simple brin matrice. - Fixation des adaptateurs spécifiques aux extrémités de chaque fragment d’ADN. - L’ADN simple brin est mis en contact avec des billes fixant des amorces complémentaires de la séquence des adaptateurs. 2. La PCR en émulsion : - On fixe un seul fragment d’ADN sur chaque bille. - Les billes sont ensuite mises dans une émulsion contenant les composés nécessaires à PCR. - Chaque goutte d’émulsion devient un microréacteur dans lequel l’unique fragment d’ADN fixé sur la bille va pouvoir être amplifié. - Après plusieurs cycles de PCR la bille est ainsi recouverte de plusieurs millions de molécules d’ADN simple brin identiques. 3. La réaction de Pyroséquençage : - On dépose les billes sur une plaque PTP contenant plusieurs millions de puits dont les diamètres vont permettre de ne récupérer qu’une seule bille. - Les Nucléotides (dNTP) sont ajoutés les uns après les autres sous l’action de l’ADN polymérase. - Si c’est le bon nucléotide : incorporation et libération d’un pyrophosphate, sinon une Apyrase dégrade les nucléotides en surplus. - L’ATP sulfurylase va utiliser le pyrophosphate relâché lors de la polymérisation pour générer de l’ATP. - L’ATP apporte l’énergie nécessaire à la réaction de conversion de la luciférine par la luciférase. - Cette réaction génère de la lumière visible dont l’intensité est proportionnelle à la quantité d’ATP. - C’est ce signal lumineux qui est détecté par une caméra puis traduit en chromatogramme. - Tous les résultats sont ensuite analysés grâce aux techniques bioinformatiques afin d’identifier la séquence d’ADN initiale. III. Avantages et limites : - Les avantages de Pyroséquençage sont : • La rapidité à générer un nombre important de séquences. • La longueur de ces séquences est à peu près de 20Mb à chaque cycle. - Mais malheureusement chaque technique à ces limites : • Un signal lumineux émis proportionnel à delà de 5 nucléotides est perdu. • La présence de plusieurs billes dans la même goutte d'émulsion et la détection d'un signal provenant d'un puit adjacent, engendre des multiples erreurs de séquençage. IV. Applications thérapeutiques : - La technique de Pyroséquençage est impliquée dans l’indication de code génétique d’une partie d’ADN, la découverte de nouveaux virus, l’étude de quasi-espèces virales qui désigne en virologie l’étude d’une population de virions de la même espèce et finalement l’analyse transcriptomique qui regroupe un ensemble de techniques permettant une analyse quantitative relative des ARNs et une analyse qualitative par la caractérisation de variant d’épissage, de polymorphismes, de gène fusion.
