TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 Structure et composition chimique de l’ADN 1. Structure de l’ADN en double hélice L’ADN ou acide désoxyribonucléique est le support de l’information génétique, nécessaire au développement et au fonctionnement d’un organisme vivant. Une molécule d’ADN est formée de deux chaînes nucléotidiques, complémentaires et antiparallèles, enroulées l’une autour de l’autre formant ainsi une double hélice (Figure 1). Chacune se ces chaînes est constitué d’une succession de nucléotides. Chaque nucléotide est constitué d’un pentose (sucre formé de cinq atomes de carbone), d’un groupement phosphate et d’une base azotée. Les bases azotées des deux chaînes sont orientées vers l’intérieur de la double hélice et elles sont distantes l’une de l’autre de 3,4 Å (0,34 nm). Un tour complet d’hélice fait 34 Å (3,4 nm) et il est constitué de dix paires de bases. Le diamètre de la double hélice est de 20 Å (2 nm). Les grands sillons et les petits sillons permettent à la molécule d’ADN d’interagir avec les protéines. Petit sillon Squelette phosphodiester 3’ 3’ 20 Å Liaisons hydrogène Base 5’ Un tour d’hélice (10 pb = 34 Å) 5’ Grand sillon Figure 1 : Schématisation de la molécule d’ADN selon le modèle de la double hélice proposé par Watson et Crick en 1953. 2. Composition chimique de l’ADN 2.1. Le sucre L’acide ribonucléique (ARN) contient du ribose alors que l’ADN contient du désoxyribose. Chaque atome de carbone est défini par un nombre « prime ». Le désoxyribose possède un atome d’hydrogène à la position C-2’ alors que le ribose possède un groupement hydroxyle (Figure 2). L’atome C-1’ du sucre est impliqué dans la liaison avec chimique avec la base azotée. L’atome C-5’ est impliqué dans la liaison avec le groupement phosphate. Désoxyribose (β-D-2’-désoxyribofuranose) Ribose (β-D-Ribofuranose) Figure 2 : Structure du ribose et du 2’-désoxyribose qui constituent respectivement l’ARN et l’ADN. 1 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 2.2. Les bases azotées Les bases azotées dérivées de la purine sont appelées bases puriques et celles dérivées de la pyrimidine sont appelées bases pyrimidiques. Chaque atome du cycle des purines ou des pyrimidines est désigné par un nombre (Figure 3). Figure 3 : Structure des bases azotées qui constituent l’ADN et l’ARN. L’appariement des bases azotées se fait par le biais de liaisons hydrogène de cela de manière spécifique (par complémentarité) entre les bases A et T (trois liaisons hydrogène) et entre les bases C et G (trois liaisons hydrogène) (Figure 4 et Figure 5). Adénine Thymine Guanine Cytosine Figure 4 : Appariement des bases azotées (les liaisons hydrogène sont représentées par des pointillés. 2 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 Adénine Thymine Extrémité 5’ Extrémité 3’ Squelette phosphodiester Extrémité 3’ Cytosine Guanine Extrémité 5’ Figure 5 : Schéma détaillé de la double hélice d’ADN déroulée pour montrer le squelette phosphodiester st l’appariement des bases azotées (liaisons hydrogène). La structure et la composition en bases azotées d’une molécule d’ADN double-brin sont définies comme suit : - La quantité d’adénine est proportionnelle à la quantité de thymine et la quantité de guanine est proportionnelle à la quantité de cytosine (A=T et G=C). - La somme des bases puriques (A+G) est égale à la somme des bases pyrimidiques (T+C). Le rapport de Chargaff (somme des bases puriques/somme des bases pyrimidiques ou A+G / T+C) est donc égal ou à peu près égal à 1. - Le pourcentage de (G+C) n’est pas nécessairement égal à celui de (A+T). Le rapport (A+T)/(C+G) est propre à chaque espèce et il permet de déterminer la composition en bases d’une espèce. En effet, si ce rapport est supérieur à 1, l’ADN de l’espèce étudiée sera riche en A/T et inversement si ce rapport est supérieur à 1, l’ADN de l’espèce étudiée sera riche en G/C. 2.3. Le groupement phosphate Un nucléoside est formé d’un sucre (ribose ou désoxyribose) plus une base azotée (base purique ou pyrimidique). Si un acide phosphorique est lié au nucléoside, celui-ci devient un nucléotide (Figure 6). 3 TD de Génétique Moléculaire L3 BD Acide Phosphorique FSB-USTHB 2017-2018 Nucléoside Nucléotide Figure 6 : Structure d’un nucléoside et d’un nucléotide. Les nucléosides sont appelés du nom de la base (Adénosine, Guanosine, Cytidine, Thymidine, Uridine). Les nucléotides sont appelés nucléotides monophosphate (NMP), nucléotides diphosphate (NDP) ou nucléotides triphosphate (NTP) (Figure 7). Désoxyadénosine triphosphate (dATP) Désoxyadénosine diphosphate Figure 7 : Structure de base d’un désoxynucléotide diphosphate et d’un désoxynucléotide triphosphate. Remarque : La forme triphosphate d’un nucléotide est importante car elle sert de précurseur à la synthèse d’acide nucléique dans la cellule. De plus l’adénosine triphosphate (ATP) et la guanosine triphosphate (GTP) jouent un rôle important dans la bioénergétique de la cellule car l’élimination du groupe phosphate terminal produit une grande quantité d’énergie. En effet, les hydrolyses de l’ATP et du GTP en ADP et GDP et phosphate inorganique Pi libèrent une grande quantité d’énergie dans la cellule. Chaque nucléotide possède une extrémité 5’phosphate et une extrémité 3’hydroxyle. La liaison entre deux nucléotides successifs est appelée liaison phosphodiester (Figure 8). La liaison entre deux nucléotides produit un dinucléotide et celle entre trois nucléotides produit un trinucléotide et ainsi de suite. Les chaînes courtes, constituées d’environ 20 nucléotides sont appelées oligonucléotides. Les chaînes plus longues sont appelées polynucléotides. Lors de la polymérisation de l’ADN, l’extrémité 3’hydroxyle est indispensable à la formation de la liaison phosphodiester. L’utilisation de 2’-3’di-désoxynucléotides triphosphates synthétiques (ddNTP) provoque l’arrêt de la polymérisation (c’est le principe du séquençage de la méthode enzymatique de Sanger) (Figure 9). 4 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 Désoxynucléotide triphosphate (dNTP) Figure 8 : Formation de la liaison phosphodiester avec élimination d’un pyrophosphate. Didésoxynucléotide triphosphate (ddNTP) Désoxynucléotide triphosphate (dNTP) Figure 9 : Arrêt de la polymérisation par l’utilisation d’un didésoxynucléotide triphosphate 5 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 Propriétés physico-chimiques de l’ADN 1. Absorption de la lumière ultra-violette Les acides nucléiques absorbent la lumière ultra-violette (UV) à une longueur d’onde de 260 nm (Figure 1A). Ceci en raison de l’interaction entre la lumière UV et les cycles des bases puriques et pyrimidiques. Ce phénomène est appelé effet hyperchrome ou hyperchromicité. Les protéines par contre absorbent la lumière UV à 280 nm. Ces propriétés permettent de vérifier le degré de pureté d’un échantillon d’ADN après son extraction en calculant le rapport DO260/DO280. Si ce rapport est supérieur ou égal à 1,8 alors l’échantillon d’ADN est considéré comme étant pur (à condition de ne pas atteindre ou dépasser la valeur de 2 sinon il sera considéré comme étant contaminé par de l’ARN). Par contre, si ce rapport est inférieur à 1,8 alors l’échantillon d’ADN est considéré comme étant contaminé par des protéines. Lorsque l’on compare l’absorbance à 260 nm d’une solution d’ADN double-brin et celle de la même solution dénaturée (donc sous forme simple-brin), on constate que cette dernière solution présente une absorption beaucoup plus importante d’un facteur de 1,6 (Figure 1B). Protéines Acides nucléiques Longueur d’onde (nm) B A Figure 1 : (A) Spectre d’absorption des acides nucléiques et des protéines. (B) Différence d’absorption entre l’ADN simple-brin et l’ADN double-brin. 2. Dénaturation et renaturation de l’ADN Lorsque l’on dénature une molécule d’ADN double-brin, les liaisons hydrogène entre les deux brins sont rompues, les deux chaînes se déroulent et les deux brins se séparent. C’est le phénomène de dénaturation. Pendant la séparation des brins, induite par la chaleur ou par des produits chimiques, la viscosité de l’ADN diminue et la densité optique augmente (l’absorption des UV augmente). L’appariement G≡C est plus stable à la chaleur que l’appariement A=T, car il possède une liaison hydrogène supplémentaire. L’ADN riche en G≡C requiert donc une température plus élevée pour être totalement dénaturé. Lorsque l’absorption à 260 nm (DO260) est mesurée en fonction de la température, on obtient un profil de fusion de la molécule d’ADN. Il est important de noter que l’ADN sous sa forme doublebrin a une densité optique minimale. Le point médium de ce profil (courbe) est appelé température de fusion (Tm pour melting temperature) et correspond à la température à 6 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 laquelle 50% de l’ADN est dénaturé (Figure 2A). Lorsque le plateau de la courbe est atteint (densité optique maximale), la dénaturation est complète et la solution ne contient que de l’ADN simple-brin (Figure 2B). A B Figure : (A) Profil de dénaturation de l’ADN sous l’effet de la chaleur. (B) Absorption de la lumière UV d’un ADN double-brin en fonction de la température. Si la molécule d’ADN ayant été dénaturée par la chaleur est doucement refroidie, les brins d’ADN complémentaires se réassocient pour reformer la molécule d’ADN double-brin. A une certaine température, les liaisons hydrogène se reforment, stabilisant ainsi les appariements et la structure double-brin de l’ADN. C’est le phénomène de renaturation ou d’hybridation. Si la molécule d’ADN ayant été dénaturée par la chaleur est brusquement refroidie, les deux brins complémentaires n’auront pas assez de temps pour se réassocier correctement, ils forment alors des appariements intra et intermoléculaires aboutissant à la formation d’agrégats. Remarque : La propriété de dénaturation-renaturation des acides nucléiques est à la base de nombreuses techniques de génétique moléculaire telles que la réaction de polymérisation en chaine (PCR pour polymerase chain reaction), hybridation in situ, Southern blot, Northern blot… Par exemple, si deux molécules d’ADN issues d’organismes différents sont dénaturées, et si le degré de bases complémentaires est suffisant, il est possible d’obtenir des molécules d’ADN double-brin hybrides après renaturation. De plus, une molécule d’ADN simple-brin dénaturée peut s’hybrider avec une molécule d’ARN. 3. La taille et le poids moléculaire (PM) Le poids moléculaire d’un nucléotide est de 330 Da et la distance entre deux nucléotides est de 3,4Å (avec 1 Å = 10-10 m). Le poids moléculaire d’une molécule d’ADN est relatif à la longueur de celle-ci. Les acides nucléiques peuvent être séparés les uns des autres par plusieurs types de centrifugation (par exemple une centrifugation sur gradient de densité). Si certaines propriétés physico-chimiques d’une solution sont connues dans certaines conditions, le poids moléculaire (PM) peut être calculé sur la base de la vitesse de sédimentation. Les acides nucléiques peuvent, aussi, être séparés selon leur taille par une technique nommé électrophorèse sur gel d’agarose ou de polyacrylamide. Les molécules d’ADN étant chargées négativement vont migrer vers le pôle positif. 7 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 Série d’exercices : Structure et composition chimique de l’ADN Exercice 1 Soit les séquences nucléotidiques suivantes : A : 5’ATCCTTGCGTTAC 3’ et B : 5’TCTTGTTGCTCCAG 3’ 1- Donnez la séquence complémentaire pour chacun des brins proposés. 2- Calculez le nombre de liaisons hydrogène et le nombre de liaisons phosphodiester pour chacune des deux molécules d’ADN double-brin obtenues. Exercice 2 La séquence 5’ATCGTTCG 3’ se rapporte à l’un des brins de l’ADN bicaténaire X. 1- A quoi correspondent les valeurs et symboles 5’ et 3’ et quelle est leur signification ? 2- Entre les oligonucléotides (A), (B) et (C) déterminez celui qui correspond au brin complémentaire de l’ADN X. Justifiez votre réponse. A : 5’TAGCAAGC 3’ B : 5’CGAACGAT 3’ C : 3’CGAACGAT 5’ Exercice 3 On a déterminé la composition en bases du matériel génétique de deux organismes A et B. Bases Organismes A B A T C G U A+G/T+C 0,50 0,52 0,66 / 0,84 0,88 0,60 0,62 / 0,68 0,73 / 1- Quelle conclusion pouvez-vous tirer de ces résultats ? 2- A quels type d’organismes peuvent appartenir les organismes A et B ? Exercice 4 La composition en bases d’un ADN monocaténaire étant : A=25 ; T=33 ; G=24 ; C=18 1- Quelle serait, la composition en bases du brin d’ADN complémentaire. 2- Quelle serait, en pourcentage, la composition en bases de l’ADN double-brin. Exercice 5 La composition en bases d’un ADN A d’origine virale et d’un ADN B d’origine inconnue a été mesurée à 1% près. ADN A ADN B A 21 25 G 29 24 C 28 18 1- Que vous suggère la composition en bases de ces deux ADN ? Pourquoi ? 8 T 22 33 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 Des solutions d’ADN A et d’ADN B ont été soumises à un chauffage progressif et l’absorption à 260 nm a été mesurée tout au long du processus de chauffage (Figure 1). Ces même solutions ont ensuite étaient soumises à un refroidissement progressif et l’absorption a été mesurée (Figure 2). A260nm A260nm ADN B ADN A ADN B ADN A T (°C) 0 10 20 40 60 80 90 100 T (°C) 100 90 80 60 40 20 10 Figure 1 Figure 2 2- Interprétez les profils d’absorption de l’ADN A et de l’ADN B. 3- Le profil d’absorption de l’ADN B peut-il vous aider à interpréter les résultats relatifs à la composition en bases de l’ADN B ? Commentez. Exercice 6 L’analyse en bases azotées de trois ADN à donné les résultats suivants : ADN A ADN B ADN C A 15 5 48 G 36 10 2 T 16 25 48 C 34 60 2 1- Classez ces différents ADN par ordre décroissant des Tm prévisibles et justifiez votre réponse. 2- Indiquez la structure prévisible des différents ADN. 3- Le traitement de ces différents ADN par les exonucléases révèle que l’ADN A et B sont hydrolysés par ces enzymes tandis que l’ADN C est résistant. Après avoir précisé le mode d’action des exonucléases expliquez la résistance de l’ADN C à ce type de nucléases. Exercice 7 Le nombre de nucléotides dans le génome humain est de 6x 109 pb. 1- Donnez la structure d’un nucléotide sous forme de monomère de l’ADN. 2- Déterminez en daltons le poids de cet ADN. 3- Donnez en mètre la longueur de cet ADN, s’il était supposé être mis bout à bout dans la cellule. 4- Quelle conclusion vous inspire ce résultat par rapport à l’organisation du génome humain ? Exercice 8 Le poids moléculaire d’un ADN double-brin a été estimé à 3,8 x 106 Da. Diverses caractéristiques de cet ADN ont également été déterminées : Rapport A/T ; rapport G/C, 9 TD de Génétique Moléculaire L3 BD FSB-USTHB 2017-2018 rapport A+G / T+C, le rapport A+T / C+G, le nombre de paires de bases par tour de spires et la température de fusion (Tm). 1- Calculez le nombre de paires de bases comprises dans cet ADN. 2- En cas de comparaison des paramètres analysés ci-dessus avec ceux d’ADN d’espèces différentes, donnez les résultats prévisibles en termes de stabilité ou de variabilité. Exercice 9 La centrifugation sur gradient de chlorure de césium (ClCs) d’un mélange de deux ADN préalablement chauffés et refroidis lentement a conduit à la figure 1. On précise que la Tm de l’ADN A est de 95°C et celle de l’ADN B est de 100°C. 1- Quelle conclusion vous suggèrent les valeurs de la Tm de ces deux ADN concernant la composition en bases ? 2- Commentez la figure 1 et précisez à quoi correspond vraisemblablement l’ADN X. ADN A ADN X ADN B Figure 1 Documentation 1- Ammar-Khodja F. (2013). Exercices et problèmes de génétique. Ed. Office des Publications Universitaires. 2- Garrett R.H. et Grisham C.M. (2000). Biochimie. Ed. De Boeck Université (2ème édition) : 1264p. 3- Griffiths A. et al. (2010). Introduction à l’analyse génétique. Ed. De Boeck (5ème édition) : 831p. 4- Klug W., Cummings M. et Spencer C. (2006). Génétique. Ed. Pearson Education France (8ème édition) : 704p. 5- Prescott L.M. et al. (2010). Microbiologie. Ed. De Boeck Université ( 3ème édition) : 1088p. 10
