Année universitaire 2006-2007 CORRIGE ET BAREME DU CONTROLE DE TP LV203 L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires" CONTROLE DE TRAVAUX PRATIQUES samedi 9 décembre 2006 • Indiquez dans la case ci-dessus vos nom et prénom, votre section et votre n° de groupe précis de TP. • Lisez très attentivement le sujet. • N'écrivez lisiblement que dans les cases réponses prévues à cet effet. L'utilisation de documents, de calculatrice et de téléphone portable est strictement interdite. Durée de l'épreuve : 1 heure Note sur 15 ****************** I. Une expérience de mutagenèse a été réalisée sur une culture liquide d'une souche T de levure Saccharomyces cerevisiae, auxotrophe pour l'adénine et donnant des colonies rouge-orangé sur un milieu supplémenté avec cet acide nucléique : phénotype [ade-, rouge]. Ce phénotype est dû à une mutation dans le gène h, intervenant dans la chaîne de biosynthèse de l'adénine. A l'état sauvage de référence, ce gène code une enzyme permettant la transformation de l'amino-imidazole ribotide (AIR), pigment rougeorangé, en 5-amino-4-carboxyimidazole ribotide (CAIR), métabolite incolore. Cette expérience de mutagenèse a été réalisée par irradiation aux rayons UV, à la longueur d'ondes de 254 nm, d'une suspension liquide de la souche T, à la concentration initiale de 108 cellules/ml, selon un protocole expérimental identique à celui employé lors des TP. Après une irradiation de 30 secondes, des étalements de 0,2 ml de la suspension irradiée ont été effectués sur des boîtes de Pétri contenant soit, un milieu complet (boîte A), soit un milieu dépourvu d'adénine (boîte B). Les conditions d'étalements et les résultats observés sont présentés ci-dessous : (NB : les colonies rouge-orangé apparaissent en grisé sur ces schémas) boîte A milieu complet dilution 8.104 avant étalement volume déposé : 0,2 ml boîte B milieu sans adénine pas de dilution avant étalement volume déposé : 0,2 ml A partir de ces résultats expérimentaux, calculer, en détaillant votre calcul : L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires" Contrôle de travaux pratiques (9 décembre 2006) page 1/4 1) la concentration en cellules survivantes après mutagenèse Q. 1 40 x 8.104/0,2 ou 40 x 8.104 x 5 = 1,6.107 cellules/ml 2) le taux de survie après mutagenèse Q. 2 1,6.107 x 100/108 = 16% 3) la concentration en cellules de phénotype [ade+] obtenues Q. 3 32/0,2 ou 32 x 5 = 160 cellules/ml ou 1,6.102 cellules/ml 4) la fréquence de mutants (révertants) vers le phénotype [ade+] Q. 4 1,6.102/1,6.107 = 10-5 II. Les colonies blanches obtenues sur boîte A sont ensuite testées pour leur phénotype [ade+] ou [ade-], en utilisant un crible approprié. A la suite de ce test, la plupart de ces colonies apparaissent constituées de levures de phénotype [ade-]. Cependant, certaines d'entre elles sont constituées de levures de phénoytpe [ade+]. 5) Schématisez un protocole expérimental (avec légendes précises) permettant de discriminer les deux types de colonies recherchées. Q. 5 1. boîte d'étalement initiale 2. boîte de réplique 1 réplique sur velours milieu complet Poussent sur ce milieu : • les colonies [ade-, rouge] • les colonies [ade-, blanc] • les colonies [ade+, blanc] 3. boîte de réplique 2 : témoin réplique sur velours milieu sans adénine milieu complet Poussent sur ce milieu : • les colonies [ade+, blanc] Poussent sur ce milieu les mêmes colonies aux mêmes endroits que sur la boîte 1 : c'est le contrôle de la réplique Les colonies blanches pour lesquelles l'empreinte ne donne pas de croissance sur la boîte de réplique 1 sans adénine, alors que l'on observe une croissance sur le témoin de réplique correspondent à des levures de phénotype [ade+, blanc]. Les autres colonies blanches de la boîte 1 correspondent donc à des levures de phénotype [ade-, blanc]. NB : le témoin de réplique (boîte 3) n'était pas demandé dans la réponse. L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires" Contrôle de travaux pratiques (9 décembre 2006) page 2/4 6) Expliquez comment peuvent-être obtenus l'un et l'autre de ces deux phénotypes. Q. 6 • Phénotype [ade-, colonies blanches] : le gène h est toujours muté, mais le pigment rougeorangé, substrat de l'enzyme codée par le gène h, n’est plus fabriqué en raison de l’inactivation de l’un des gènes intervenant antérieurement dans la chaîne de biosynthèse de l’adénine, avant l’étape h. • Phénotype [ade+, colonies blanches] : le gène h n’est plus muté, en raison d’un nouvel événement mutationnel dans ce gène (réversion), ayant permis de redonner un allèle h+ codant une enzyme fonctionnelle. (La possibilité de mutations "suppresseur" dans d’autres gènes permettant de supprimer le phénotype mutant peut être évoquée mais n’a pas été abordée pour tous les groupes). III. Par ailleurs, on dispose d'une souche haploïde de levure (souche A), dont on cherche à déterminer le signe sexuel. Cette souche présente un phénotype mutant [his-], récessif devant le phénotype sauvage de référence [his+] et dû à une mutation dans le gène p, codant une enzyme intervenant dans la biosynthèse de l'histidine. La souche A possède l'allèle muté p1 de ce gène. On se propose de déterminer le signe sexuel de la souche A en utilisant un protocole identique à celui des TP. Dans ce but, on dispose de 6 souches testrices différentes, de signe sexuel a ou α et de génotypes connus : • souche B (génotype a, m1) et souche B' (génotype α, m1) (m1 est un allèle muté du gène m, impliqué dans la biosynthèse de l'histidine) • souche C (génotype a, p2) et souche C' (génotype α, p2) (p2 est un autre allèle muté du gène p, déjà mentionné et impliqué dans la biosynthèse de l'histidine) • souche D (génotype a, k1) et souche D' (génotype α, k1) (k1 est un allèle muté du gène k, impliqué dans la biosynthèse du tryptophane) Dans tous les cas, les différents allèles mutés confèrent un phénotype mutant récessif par rapport au phénotype sauvage de référence, dominant. 7) Sur quel principe général est basé le test de détermination du signe sexuel? Q. 7 La détermination du signe sexuel est basé sur le principe général de la complémentation fonctionnelle entre 2 génotypes haploïdes : • les deux souches haploïdes ne doivent pas pouvoir pousser sur le milieu utilisé pour le test (contre-sélection des souches parentales). • seules les cellules diploïdes formées entre les cellules haploïdes doivent être capable de pousser sur ce milieu de culture (sélection des diploïdes). L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires" Contrôle de travaux pratiques (9 décembre 2006) page 3/4 8) Quelles souches testrices, parmi celles proposées, sont utilisables pour cette expérience? Q. 8 - La souche A est mutée dans le gène p et de phénotype [his ] Quatre souches sont utilisables pour ce test car permettant l'application du principe général présenté précédemment : - souche B : a, mutée dans le gène m - souche B’ : α, mutée dans le gène m - souche D : a, mutée dans le gène k - souche D' : α, mutée dans le gène k (NB : les justifications ne sont pas demandées) 9) En prenant un exemple de votre choix parmi les souches utilisables, schématisez et légendez précisément le protocole expérimental utilisé et les résultats obtenus. Q. 9 Expérience réalisée avec les souches B et B' boîte de croissance des souches B et B' (milieu complet) B B B' B' réplique sur velours boîte-test : milieu sans histidine A réplique sur velours croissance de cellules A boîte de croissance de la souches A (milieu complet) Résultats obtenus : • croissance avec la souche B' α • pas de croissance avec la souche B a La souche A est donc de signe sexuel a NB : dans le cas où le choix se porte vers les souches C et C', la boîte-test sera un milieu sans histidine et sans tryptophane. L2 - UE LV203 "Génétique et ses bases moléculaires" Contrôle de travaux pratiques (9 décembre 2006) page 4/4