Biochimie (Le BP Brevet Professionnel de Préparateur en

Biochimie (Le BP Brevet Professionnel de Préparateur en Pharmacie)
ORGANISATION MOLECULAIRE DE LA MATIERE
I.COMPOSITION ELEMENTAIRE DE LA MATIERE VIVANTE
1.PRINCIPAUX ELEMENTS CONSTITUTIFS
On trouve 11 éléments qui sont le carbone, l'hydrogène, l'oxygène, l'azote, le soufre, le
phosphore, le chlore, le sodium, le potassium, le calcium et le magnésium. Tout ceci constitue
99% des organismes. Ce sont des éléments plastiques car ils participent à la construction des
êtres vivants.
Les autres éléments sont à l'état de trace dans la matière : ce sont des oligoéléments qui ont
principalement un rôle de catalyseur.
1.1.ELEMENTS MAJEURS OU MACROELEMENTS
1.1.1.CARBONE
Il est tétravalent ce qui lui permet de former des chaines, des cycles et des groupes
fonctionnels. Le dioxyde de carbone est le produit de dégradation des composés organiques et
il est présent dans l'atmosphère.
1.1.2.HYDROGENE
C'est l'élément le plus représenté dans la matière vivante.
Il participe aux réactions d'oxydoréduction en tant que réducteur.
1.1.3.OXYGENE
Il est combiné à l'hydrogène dans l'eau et l'hydrogène et l'oxygène se trouvent dans de
nombreux composés organiques.
1.1.4.AZOTE
Il est plus abondant dans les tissus animaux que végétaux et il va former des dérivés
organiques (amines et amides) et des hétérocycles (imidazole) qui sont importants en
biochimie.
1.1.5.PHOSPHORE
Il se trouve sous forme de phosphate de calcium dans les os et de nombreux composés
phosphorés interviennent en biochimie comme les phosphates et les poly-phosphates.
1.1.6. SOUFRE
Il se présente à l'état de soufre minéral souvent sous forme combiné comme le sulfure, le
sulfate et le thiosulfate et peut se présenter sous forme organique avec les sulfures, les
disulfures et les esters sulfuriques.
1.2.ELEMENTS SOUS FORME IONIQUE
5 des 11 principaux éléments à savoir le sodium, le magnésium, le potassium, le calcium et le
chlore se retrouvent souvent sous forme ionique principalement dans 3 types de composés :
Les ions qui sont en solution dans le sang, le liquide céphalorachidien et le liquide interstitiel
de la lympheLes sels minéraux cristallisés ou amorphes qui sont présents dans les dents et les
osLes ions formant des complexes avec les molécules organiques comme les protéines
1.3.OLIGOELEMENTS
Ce sont des éléments nécessaires qui existent à l'état de trace dans la matière vivante où ils
jouent un rôle de catalyseurs avec surtout présents le fer, l'iode, le zinc, le cuivre, le cobalt et
le manganèse.
II.CONSTITUTIFS MINERAUX
1.EAU
1.1.IMPORTANCE ET ETAT DE L'EAU
Elle représente 75% de la masse totale du corps humain.
Sa proportion est très élevée dans le sang, on en trouve 78% dans le cerveau, 70% dans le
cœur et 25% dans les os.
Elle se trouve sous 2 formes dans l'organisme :
L'eau libre présente dans le sang, la lymphe, les sucs digestifs et les vacuoles des
cellulesL'eau liée à la matière soit par des phénomènes physiques comme l'imbibition soit
chimiques comme la formation de complexesD'autre part, la molécule d'eau est
électriquement neutre mais présente un excès d'électrons sur l'oxygène qui entraine une forte
électronégativité compensée par un déficit d'électrons sur les deux atomes d'hydrogène : la
molécule est dite dipolaire.
1.2.ROLE DE L'EAU
Elle va jouer un rôle primordial de solvant biologique, de véhicule pour les éléments figurés,
dans la régulation thermique et dans les équilibres acido-basiques par sa légère ionisation en
ions hydronium (H3O+) et hydroxyde (OH-).
2.IONS MINERAUX
La teneur moyenne de l'organisme en sels minéraux est de l'ordre de 1g pour 100. Les plus
importants sont des cations comme le sodium, le calcium et le magnésium et des anions
chlorures, sulfates, carbonates et phosphates.
2.1.CHLORURE DE SODIUM
C'est un sel liquidien qui est abondant dans le liquide extracellulaire et peu abondant dans le
liquide intracellulaire.
Il va jouer un rôle important dans l'équilibre hydrique.
2.2.CHLORURE DE POTASSIUM
Il est abondant dans le liquide intracellulaire et peu abondant dans le liquide extracellulaire.
Une partie du potassium intracellulaire est liée aux protéines et joue un rôle dans la nutrition
cellulaire et divers phénomènes métaboliques.
2.3.CALCIUM ET MAGNESIUM
Le calcium se présente sous 2 états :
Le calcium soluble dans les humeursLe calcium ionisé sous forme complexéeIl va intervenir
dans la perméabilité et l'excitabilité cellulaire.
Le magnésium est surtout un constituant des tissus au niveau du rein, des tissus osseux, des
tissus nerveux et des muscles.
STRUCTURE ET PROPRIETES DES BIOMOLECULES
I.GLUCIDES
1.GENERALITES
Les glucides sont des composés organiques comportant des fonctions carbonylées (aldéhyde
ou cétone) et des fonctions alcools. Les glucides sont apportés par les végétaux qui les
élaborent par la vie de la photosynthèse.
1.1.ROLES
1.1.1.RESERVE ENERGETIQUE
Soit les glucides sont immédiatement utilisables (c'est le cas du glucose) et on va trouver des
formes libres solubles qui sont des formes circulantes transitoires (glucose sanguin), soit ils
sont sous forme de réserve (c'est le cas de l'amidon et du glycogène).
En cas de jeun glucidique, divers précurseurs comme les acides aminés sont convertis en
glucose par la néoglucogenèse.
En cas d'apport excessif, l'organisme va transformer le glucose en triglycérols qui seront
déposés dans le tissu adipeux.
1.1.2.ELEMENTS DE SOUTIEN
Ils participent à la structure des végétaux (cellulose), des arthropodes et du tissu conjonctif
des animaux supérieurs.
1.1.3.ROLE BIOLOGIQUE
Ce sont les constituants des nucléosides, des acides nucléiques et du coenzyme.
1.1.4.ROLE ECONOMIQUE
Ils sont utilisés dans l'industrie du papier, du textile, dans les matières plastiques et les
explosifs.
1.2.CONSTITUTION DES GLUCIDES
Ce sont des composés organiques ternaires formés de 3 éléments : le carbone, l'hydrogène et
l'oxygène.
Leur formule brute est généralement CnH2nOn.
Les glucides sont des composés polyhydroxylés possédant plusieurs fonctions alcools
généralement associées à des fonctions aldéhyde ou cétone.
2.OSES
2.1.DEFINITION
Les oses ou sucres simples sont des molécules comportant à la fois plusieurs fonctions alcools
et une fonction réductrice soit aldéhydique soit cétonique.
Ils possèdent entre 3 et 8 atomes de carbone.
Ils entrent dans la composition de glucides plus complexes : les osides.
Leur classification repose sur le nombre d'atomes de carbone et sur la nature de la fonction
réductrice :
Si la fonction réductrice est aldéhyde, ce sont des aldosesSi la fonction réductrice est cétone,
ce sont des cétosesDe sorte que si on veut indiquer à la fois la nature de la fonction
carbonylée ainsi que le nombre de carbone, on pourra dire aldopentose, cétopentose,
aldohéxose etc.
2.2.GLUCOSE
2.2.1.STRUCTURE LINEAIRE DU GLUCOSE
C'est un aldohexose.
HOH2C-CHOH-CHOH-CHOH-CHOH-CH=O
Il comporte 4 carbones asymétriques donc 24 = 16 stéréo-isomères.
Tous les isomères de cette série ont la même configuration que le C5. Le groupement OH est
vers la droite : on dit qu'il appartient à la série Ddextrogyne.
Si OH est vers la gauche, il appartient à la série Llévogyne.
Les isomères de la série D sont les images des isomères de la série L dans un miroir : ce sont
des isomères optiques ou énantiomères.
Ils possèdent des propriétés chimiques et physiques identiques à l'exception du pouvoir
rotatoire. Le pouvoir rotatoire est le sens dans lequel la molécule fait dévier la lumière
polarisée. On l'écrit par + ou par -.
Dans la nature, on trouve surtout du glucose naturel D(+)glucose qui fait dévier la lumière
polarisée vers la droite.
Seuls 2 autres aldohéxoses existent à l'état naturel : le D(+)mannose et le D(+)galactose. Ils se
différencient par la position d'un seul hydroxyle : ce sont des épimères.
2.2.2.STRUCTURE CYCLIQUE DU GLUCOSE (cf. document)
Certaines propriétés chimiques des aldohéxoses et donc du glucose ne correspondent pas à la
formule aldéhydique.
En ce qui concerne le glucose, il réagit avec une seule molécule de méthanol en donnant 2
isomères de la forme hémi-acétalique du glucose. En effet, un hémi-acétal est un groupement
fonctionnel formé par la réaction d'un aldéhyde et d'un alcool ou alors un composé chimique
contenant ce groupement fonctionnel.
Ces faits s'expliquent par l'existence de formes tautomères qui sont des isomères de
constitution qui peuvent se transformer de façon réversible l'une en l'autre.
La forme ouverte aldéhydique est la forme cyclique dans laquelle il existe une liaison entre la
fonction aldéhyde du C1 et la fonction alcool du C4 ou C5 qui se fait par l'intermédiaire d'un
atome d'oxygène = pont oxydique.
Ces cycles sont des hétérocycles dont le sommet est occupé par l'oxygène.
Il y a 2 types de cycle : le cycle hexagonal qui est le pyrane d'où le nom forme pyranose et le
cycle pentagonal qui est le furane d'où le nom forme furanose.
Le carbone C1 est devenu asymétrique et il existe donc 2 isomères α et β. Les isomères d'un
même ose sont des anomères.
Le pont oxydique permet de comprendre pourquoi l'aldéhyde ne peut former qu'un hémiacétal et permet d'expliquer le pouvoir rotatoire élevé des oses.
2.2.3.PROPRIETES CHIMIQUES
Les oses sont solubles dans l'eau grâce à leurs nombreux groupements hydroxydes.
OXYDATION
L'oxydation du glucose peut porter sur ses différentes fonctions. En effet, son oxydation par le
brome de la fonction aldéhyde va le transformer en acide aldonique ou acide gluconique.
Si la fonction aldéhyde est protégée, l'oxydation va porter sur une fonction alcool et on va
obtenir un acide uronique ou acide glucuronique.
Son oxydation avec l'acide nitrique porte sur les 2 fonctions terminales et le transforme en un
diacide ou l'acide glucanique
REDUCTION
Le glucose est réducteur car il est susceptible d'être oxydé. Les propriétés des oses vont se
manifester vis-à-vis des complexes métalliques et des composés organiques
Réduction des complexes métalliquesRéduction des complexes cuivriquesCette propriété est
utilisée pour détecter la présence de sucre dans un milieu et en doser la quantité présente. On
va utiliser la liqueur de Fehling qui est un sel cuivrique maintenu en solution grâce à un
tartrate double de sodium et de potassium. Cette liqueur de couleur bleue foncée en présence
de réducteur va se décolorer puis il va apparaitre un précipité rouge brique d'oxyde de cuivre.
Cette propriété permet l'analyse des sucres et on l'utilisait pour doser le sucre dans le sang et
les urines des patients diabétiques. Aujourd'hui, on utilise une enzyme : la glucose-oxydase
qui permet d'oxyder le sucre par l'eau oxygénée
Réduction du nitrate d'argent ammoniacalEn présence d'un réducteur, il y a formation d'un
dépôt d'argent : c'est le procédé d'argenture
Réduction des composés organiquesLes oses vont réduire des composés organiques comme le
bleu de méthylène, l'acide picrique et toutes ces réactions sont utilisées dans les analyses de
laboratoires
ESTERIFICATION
Les esters phosphoriques des oses ont une grande importance dans le métabolisme des
glucides. Le plus souvent, c'est la fonction alcool primaire qui est estérifiée
FERMENTATION
Une solution de glucose abandonnée à l'air subit une réaction de fermentation provoquée par
le développement de micro-organismes produisant une enzyme. Ceci aboutit à la formation
d'alcool éthylique et d'anhydride carbonique
FORMATION D'OSAZONES
On fait agir la phénylhydrazine et il se produit avec le glucose une réaction complexe qui
conduit à une cétose. Cette réaction se fait en plusieurs étapes avec la coopération de la
fonction alcool secondaire voisine
3.OSIDES
Certains oses existent à l'état libre dans la nature (glucose et fructose) mais, beaucoup plus
fréquemment, les structures glucidiques correspondantes se trouvent associées dans les
produits naturels soit entre elles (holosides), soit avec des substances diverses de nature non
glucidique (hétérosides).
3.1.LIAISON OSIDIQUE
Cette expression est utilisée pour désigner la jonction entre 2 motifs dans un oside qu'il
s'agisse d'un holoside ou d'un hétéroside.
Suivant le type de liaison osidique, on va distinguer des osides non réducteurs dans lesquels la
liaison osidique se fait entre les groupes réducteurs des oses et des osides réducteurs dans
lesquels la liaison osidique se fait entre le groupe réducteur d'un ose et un hydroxyle
alcoolique d'un autre.
3.2.CLASSIFICATION DES OSIDES
Elle va se faire selon la nature des oses qui les constituent, selon la nature des cycles
(pyranose ou furanose), selon la configuration de la liaison osidique (α ou β) et selon la
position de la liaison osidique.
La classification va se faire selon la constitution de l'oside c'est-à-dire holoside et hétéroside.
3.2.1.HOLOSIDES
Ce sont des composés dont l'hydrolyse acide ne libère que des oses et chez lesquels on va
distinguer :
OligosaccharidesIls sont constitués par la combinaison de 2 à 10 oses. On parle alors de
diholosides ou de disaccharides
PolysaccharidesIls sont constitués par plus de 10 oses combinés par des liaisons osidiques. On
les appelle également polyholosides
3.2.2.HETEROSIDES
On les appelle aussi glycosides.
Ce sont des osides formés d'un ose et d'une partie non osidique ou aglycone.
3.3.PRINCIPAUX DIHOLOSIDES
3.3.1.SACCHAROSE
C'est le plus abondant des produits organiques purs préparé en grande quantité (environ 90
millions de tonnes par an). Il résulte de l'association du Dglucose et du Dfructose. Ces 2 oses
se trouvent sous forme cyclique à savoir le glucopyranose et le fructofuranose.
Par hydrolyse, il va donner un mélange de glucose et de fructose. Le pouvoir rotatoire du
mélange est lévogyre et on parle alors de sucre inverti.
Le saccharose est un oside non réducteur car les 2 carbones anomères sont engagés dans la
liaison glycosidique.
3.3.2.LACTOSE
C'est un disaccharide réducteur constitué de galactose et de glucose.
3.3.3.MALTOSE
Il est formé de 2 glucoses et la liaison se faisant entre le carbone 1 d'une molécule et le
carbone 4 de l'autre.
Le maltose est réducteur. C'est un intermédiaire des formes de réserve du glucose que sont le
glycogène et l'amidon.
3.4.PRINCIPAUX POLYHOLOSIDES
3.4.1.AMIDON
Il est constitué d'amylose et d'amylopectine.
SOLUBILITE
L'amidon est insoluble dans les solvants organiques et l'eau froide et par agitation dans l'eau il
forme une suspension instable appelée lait d'amidon qui devient visqueuse et translucide
lorsqu'elle est chauffée vers 70°C et dans l'eau chaude il se forme un gel qui est l'empois
d'amidon
HYDROLYSE
L'hydrolyse chimique et l'hydrolyse enzymatique, sous l'influence d'amylase, vont aboutir au
glucose
3.4.2.GLYCOGENE
C'est la forme de réserve du glucose chez les animaux qui est surtout localisée au niveau du
foie et du muscle.
3.4.3.CELLULOSE
C'est un polysaccharide linéaire constitué par l'enchainement ne n cycles de Dglucopyranose
reliés par des liaisons osidiques du carbone 1 au carbone 4.
C'est le composant le plus abondant dans la nature et sa forme la plus pure est la fibre de
coton et, associée à de nombreuses substances organiques, elle entre dans la composition des
molécules des cellules végétales.
Elle n'est pas assimilable par l'Homme mais les ruminants peuvent l'utiliser car ils possèdent
dans leur tube digestif des micro-organismes dont les enzymes hydrolysent ce polyholoside.
AGAR-AGAR
C'est l'extrait d'une algue riche en vitamine D et en Lgalactose. C'est un substitut de la
gélatine
ALGINATE
On l'utilise dans la fabrication des glaces comme stabilisateur des colloïdes pour augmenter la
texture des crèmes
CARRHAGENATES
Ce sont des dérivés d'algue qui sont des stabilisants et des émulsionnants
PECTINE
Elle est présente dans les parois des cellules de toutes les plantes et les fruits. Elle est
responsable du phénomène de prise en gelée
3.5.HETEROSIDES
Selon le type de liaison entre un ose et l'aglycone on va distinguer les Ohétérosides dans
lesquels l'aglycone se lie à l'ose par un atome d'oxygène, les Nhétérosides dans lesquels
l'aglycone se lie par un atome d'azote, les Chétérosides où il y a une liaison directe entre un
carbone de l'ose et un carbone de l'aglycone et les Shétérosides qui mettent en jeu un groupe
soufré de l'aglycone.
4.METHODES D'IDENTIFICATION ET DE DOSAGE DES GLUCIDES
Les glucides étant solubles dans l'eau, leur extraction se fait à partir d'une solution aqueuse en
milieu neutre pour éviter l'hydrolyse en milieu acide et l'isomérisation en milieu alcalin.
4.1.METHODES PHYSIQUES
Elles font appel à la chromatographie, à la densité, à la viscosité ou à la réfraction.
4.2.METHODES CHIMIQUES
On va utiliser les propriétés réductrices dans les dosages ou dans la recherche anormale d'un
sucre réducteur, dans la formation de dérivés colorés caractéristiques, ou dans la formation de
dérivés insolubles comme les osazones.
4.3.METHODES BIOLOGIQUES
On va utiliser la réaction à la glucose-oxydase ou les méthodes enzymatiques utilisées pour le
dosage du glucose.
II.PROTIDES
1.COMPOSITION ET CLASSIFICATION
Ce sont des corps organiques formés de carbone, d'hydrogène, d'oxygène et d'azote auxquels
s'ajoutent soufre et phosphore.
Ils comprennent les acides aminés naturels puis les peptides qui sont des composés dont
l'hydrolyse totale ou partielle conduit à des amino-acides parmi lesquels on distingue les
oligopeptides qui ont moins de 10 acides aminés et les polypeptides qui ont entre 10 et 100
acides aminés, ou à des protéines dont le poids moléculaire dépasse 10000 parmi lesquelles on
distingue les holoprotéines composées uniquement d'acides aminés et les hétéroprotéines
composées d'acides aminés et de molécules non protéiques appelées groupements
prosthétiques comme les lipides, les glucides et les acides nucléiques.
2.ACIDES AMINES NATURELS
2.1.STRUCTURE
Le terme d'acides aminés ou amino-acides désigne des composés dont la molécule réunit une
fonction amine et une fonction acide carboxylique.
La position des 2 fonctions peut varier et la fonction amine peut être primaire, secondaire ou
tertiaire.
2.1.1.FORMULE GENERALE
Tous les acides α aminés sauf la glycine possèdent un carbone asymétrique en α de la fonction
acide que l'on appelle un centre chiral.
Les acides aminés sont donc optiquement actifs avec une forme dextrogyre et une forme
lévogyre.
2.1.2.CLASSIFICATION EN FONCTION DE LA NATURE DU RADICAL
On peut classer les acides aminés en acides aminés neutres lorsque leur molécule a autant de
fonctions acides que de fonctions amines, en acides basiques lorsque leur molécule a moins de
fonctions acides que de fonctions amines, ou en acides aminés acides lorsque leur molécule a
plus de fonctions acides que de fonctions amines.
2.1.3.IONS MIXTES ET PH ISOELECTRIQUE
Un acide aminé va pouvoir se comporter comme un acide (donneur de protons) par son
groupement COOH et se comporter comme une base (accepteur de protons) par son
groupement NH3+. De ce fait, les acides aminés sont des amphotères.
En solution, un acide aminé se présente comme électriquement neutre bien que totalement
chargé puisqu'il se trouve sous la forme d'un ion dipolaire. Cet ion s'appelle un sel interne ou
un zwitterion. Cette structure ionique va expliquer leur solubilité dans l'eau, leur point de
fusion élevé et leur insolubilisation dans l'éther.
La molécule peut réagir comme une base ou comme un acide. Les pH pour lesquels on va
observer soit la réaction acide soit la réaction basique sont mis en évidence par des courbes.
En effet, en milieu fortement basique, la formation de la base conjuguée (anion) est favorable
et celle de l'acide conjugué (cation) l'est en milieu acide.
La valeur du pH pour laquelle la concentration en cations et en anions est la même va définir
le pH isoélectrique de l'acide aminé. Ce pH est le pH pour lequel la charge nette de
l'aminoacide est nulle. Lors d'une électrolyse :
En milieu acide, l'acide aminé va migrer vers la cathodeEn milieu basique, l'acide aminé va
migrer vers l'anodeAu pH isoélectrique, il n'y aura aucune migration2.2.PROPRIETES
GENERALES
2.2.1.DOUBLE IONISATION
Les acides aminés possèdent au moins 2 groupements ionisés qui sont NH3+ et COO-. Leur
ionisation va varier avec le pH.
Au pH isoélectrique, on a un ion mixte qui ne migre pas s'il est placé dans un champ
électrique.
Le pHi des acides aminés neutres est compris entre 5,5 et 6,3. Cette propriété va permettre de
titrer un acide aminé.
2.2.2.REACTION A LA NINHYDRINE
Cette substance va désaminer et décarboxyler l'acide aminé grâce à son pouvoir oxydant.
On va obtenir une coloration rouge tirant sur le violet. Cette réaction colorée est utilisée pour
l'identification et le dosage des acides aminés.
3.PROTEINES
3.1.LIAISON PEPTIDIQUE ET PEPTIDES D'INTERET BIOLOGIQUE
3.1.1.LIAISON PEPTIDIQUE
Les peptides résultent de la condensation d'acides aminés entre eux par des liaisons
peptidiques. En effet, une fonction acide d'un acide aminé réagit avec une fonction amine d'un
autre acide aminé avec élimination d'eau.
3.1.2.PEPTIDES D'INTERET BIOLOGIQUE
On va trouver des protéines de structure (muscles, tendons, cartilages, os), des enzymes qui
catalysent les réactions biochimiques, des protéines hormonales (insuline), des protéines de
transport, des récepteurs d'hormones et de neuromédiateurs, des protéines de défense
(immunoglobulines), des endomorphines (composées d'au moins 30 acides aminés),
l'angiotensine (libérée par une protéase rénale) et les antibiotiques peptidiques.
3.2.STRUCTURE SPATIALE DES PEPTIDES ET DES PROTEINES
3.2.1.STRUCTURE PRIMAIRE
Ce terme représente la séquence linéaire des acides aminés dans les chaines protéiques. En
effet, les protéines peuvent être formées de plusieurs chaines protéiques reliées entre elles par
des liaisons hydrogène et des ponts disulfures qui provoquent des distorsions de chaine (ex :
insuline).
Dans une espèce, une même protéine va posséder toujours la même structure primaire car elle
est contrôlée génétiquement. Cependant, des mutations peuvent entrainer des erreurs dans
cette biosynthèse.
3.2.2.STRUCTURE SECONDAIRE
La chaine polypeptidique n'est pas plate et la structure secondaire va désigner son
arrangement spatial qui a un aspect régulier grâce à des liaisons qui stabilisent la chaine :
La liaison hydrogène : elle se forme entre un hydrogène lié par une liaison covalente et un
atome voisin possédant une charge négativeLa liaison électrovalente : c'est une liaison par
attraction entre 2 groupes polaires de charges opposéesLes forces hydrophobes ou de Van der
Waals
3.2.3.STRUCTURE TERTIAIRE
Cette structure représente toutes les régions de la protéine. Elle est stabilisée par des liaisons
de faible énergie et des liaisons disulfures.
3.2.4.STRUCTURE QUATERNAIRE
De nombreuses protéines sont formées de sous-unités qui ont chacune des structures
secondaires et tertiaires propres et qui sont unis par des liaisons non covalentes.
L'assemblage de plusieurs protéines (protomères) pour former un oligomère forme la structure
quaternaire.
L'assemblage des protomères se fait par des liaisons ioniques hydrophobes, des liaisons
hydrogène et des forces de Van der Waals.
3.2.5.DEUX DIFFERENTS TYPES DE MOLECULE
PROTEINES GLOBULAIRES
Les molécules des protéines globulaires sont de forme sphérique ou ellipsoïde peu allongée.
On va trouver les albumines, les globulines et la ferritine.
PROTEINES FIBREUSES OU FIBRILAIRES
Elles sont très allongées. Certaines sont solubles dans les solutions salines concentrées comme
la plasmine qui intervient dans la coagulation sanguine et la myosine qui est la protéine des
myofibrilles du muscle. Certaines sont insolubles comme les scléroprotéines avec le collagène
qui est la protéine la plus abondante des organiques des mammifères et l'élastine qui est le
constituant majeur des fibres élastiques.
3.3.DENATURATION DES PROTEINES
C'est la désorganisation de leur structure interne.
Les structures secondaires et tertiaires sont fragiles et sont maintenues par des liaisons faibles.
Si ces liaisons sont rompues, ces structures disparaissent et les protéines sont dénaturées.
La dénaturation va conduire à une diminution ou à la perte des propriétés des protéines, à des
changements dans les propriétés optiques, à des disparitions ou des apparitions de propriétés
chimiques, à une diminution de la solubilité, à une augmentation de l'action des enzymes
protéolytiques...
Les agents dénaturant peuvent être des températures élevées, des solvants organiques, des
acides et des bases, des rayons UV, des ultrasons, l'urée, la guanidine et les détergents.
3.4.PROPRIETES DES PROTEINES AYANT UN INTERET ANALYTIQUE
3.4.1.SOLUBILITE
Cette solubilité peut être modifiée par différents facteurs :
La température : la solubilité va augmenter quand la température augmente mais une
augmentation va favoriser une dénaturation suivie d'une précipitationLe pH : plus le pH va
s'éloigner du pHi, plus la charge globale va augmenter et plus les protéines vont avoir
tendance à se repousserL'addition de solvant : elle va entrainer une modification de la
constante diélectrique qui étant faible va augmenter les forces d'attraction entre les protéines
et va faciliter l'agrégationLes électrolytes : les électrolytes dilués ont un rôle solubilisant.
L'extraction des protéines d'un broyat sera favorisée par l'utilisation d'une solution de chlorure
de sodium à faible concentration. L'utilisation d'électrolytes concentrés entraine une
insolubilisation nommée relargage
3.4.2.ABSORPTION DE LA LUMIERE
Quand on projette un faisceau lumineux très fin sur une solution, une partie de la lumière est
diffusée dans toutes les directions.
Le rapport de l'intensité de la lumière diffusée sur celle de la lumière incidente est d'autant
plus grand que les particules dissoutes sont plus nombreuses, plus volumineuses et on pourra
ainsi calculer le poids moléculaire d'une protéine en solution.
Dans les UV, les peptides ont une bande d'absorption située entre 180 et 230 nm qui est
spécifique de la liaison peptidique.
3.4.3.IONISATION
Les protéines sont des amphotères et on va pouvoir séparer les molécules par
chromatographie sur échangeur d'ions et par déplacement dans un champ électrique.
3.4.4.REACTION DITE DU BIURET
Si on ajoute à une solution de peptides de la soude et un peu de sulfate de cuivre, on obtient
une coloration violette.
En effet, les liaisons peptidiques forment avec les ions cuivriques en milieu alcalin un
complexe de coloration violette. Cette coloration est due à la présence d'au moins 2
groupements peptidiques. Cette réaction est franchement positive avec les tripeptides.
On pourra faire des dosages calorimétriques et spectro-photométriques des protéines.
3.4.5.PROPRIETES IMMUNOGENES
Les protéines sont des antigènes et si on injecte à l'animal une protéine qu'il ne possède pas,
elle va induire la formation par les plasmocytes d'anticorps spécifiques qui vont se combiner à
l'antigène et supprimer ses effets éventuels.
La partie de la protéine qui va se fixer avec l'anticorps est appelé déterminant antigénique ou
épitope.
3.5.CLASSIFICATION DES PROTEINES
3.5.1.HOLOPROTEINES
Ce sont des protéines qui par hydrolyse donnent uniquement des acides aminés.
Les protéines globulaires constituent de nombreuses hormones et des neurotransmetteurs
comme la calcitonine, l'insuline, les endorphines, la GH, l'ocytocine, l'ACTH, les albumines,
les globulines et les immunoglobulinesLes protéines fibrillaires sont des protéines de structure
comme la myosine, la kératine et le collagène3.5.2.HETEROPROTEINES
Elles sont formées d'une partie non protéique appelée groupement prosthétique et d'une partie
protéique appelée apoprotéine. On va les classer en fonction du groupement prosthétique :
Glycoprotéines : elles possèdent une partie glucidique liée à la protéine par une liaison
covalente (ex : hormones hypophysaires)Chromoprotéines : elles sont colorées (ex :
hémoglobines, enzymes, caroténo-protéines comme le pourpre rétinien)Lipoprotéines : elles
sont composées de lipides et de protéines. On les trouve dans le plasma sanguin, les
mitochondries et le réticulum endoplasmiquePhosphoprotéines : elles contiennent de l'acide
phosphorique qui peut estérifier un acide aminé alcool (ex : caséine du lait)Nucléoprotéines :
le groupement prosthétique est un acide nucléique et on les trouve dans les noyaux des
cellulesMétalloprotéines : elles renferment du fer, du cuivre ou du zinc3.6.METHODES
D'IDENTIFICATION ET DE DOSAGE DES PROTEINES
3.6.1.PREPARATION
v EXTRACTION
Elle est basée sur la solubilité.
En effet, l'élimination des petites molécules s'effectue par ultrafiltration ou dialyse et la
séparation des grosses par électrophorèse, chromatographie ou précipitation fractionnée
v VERIFICATION DE LA PURETE
Elle se fait par des réactions biochimiques, physico-chimiques, physiologiques et
immunologiques
3.6.2.METHODES PHYSIQUES
v LA PESEE
On va insolubiliser les protéines et le précipité sera pesé après avoir été lavé
v LA REFRACTOMETRIE
Elle est basée sur la variation de l'indice de réfraction en fonction de la concentration
v LA SPECTROPHOTOMETRIE
On l'utilise dans l'UV mais on ne peut l'utiliser pour des mélanges
3.6.3.METHODES CHIMIQUES
On pratique un dosage de l'azote par acidimétrie ou colorimétrie. On va donc transformer
l'azote protéique en ammoniac dosable.
3.6.4.METHODES IMMUNOLOGIQUES
Elles mettent en jeu la réaction antigène/anticorps.
On va agir par migration ou par déplacement électro-phorétique de la protéine dans un gel
d'agar-agar où a été incorporé un acide correspondant.
III.ACIDES NUCLEIQUES
1.GENERALITES
L'ADN porte l'information génétique de l'individu. Il détermine la séquence des protéines
synthétisées dans les ribosomes des cellules c'est-à-dire l'ordre dans lequel s'effectue la
polymérisation des acides aminés.
La synthèse de l'ADN est appelée réplication et elle permet la transmission de l'information
génétique de la cellule mère aux cellules filles.
L'assemblage des acides aminés s'effectue grâce à un intermédiaire qui est l'ARNm qui est
synthétisé au contact de l'ADN dont il copie l'information et la transporte sur le ribosome.
La synthèse des protéines sur la matrice d'ARNm s'appelle la traduction.
Il existe aussi des ARN de transfert qui servent d'intermédiaire entre les acides aminés et
l'ARNm, des ARN ribosomaux qui jouent un rôle dans le maintien de la structure des
ribosomes et la synthèse des protéines et de petits ARN nucléaires qui interviennent dans la
maturation des ARNm.
La synthèse des ARN qui utilisent l'ADN comme matrice s'appelle la transcription.
2.STRUCTURE GENERALE DES ACIDES NUCLEIQUES
2.1.HYDROLYSE TOTALE
Par hydrolyse totale, on obtient un acide phosphorique, des bases azotées non protéiques et
des pentoses.
2.2.HYDROLYSE PARTIELLE
Un nucléoside est formé d'une base azotée (cytosine, thymine, adénine, guanine ou uracile) et
d'un pentose. Parmi ces 5 bases azotées, 2 sont des bases puriques (A et G) et 3 sont des bases
pyrimidiques (U, T et C).
Un nucléotide est formé par l'association d'une base azotée, d'un pentose et d'un acide
phosphorique.
En bref : nucléotide = nucléoside + acide phosphorique
3.ACIDE DESOXYRIBONUCLEIQUE OU ADN
3.1.COMPOSITION DE L'ADN
C'est un polymère de 4 nucléotides composés d'un pentose (le désoxyribose) et d'une des
bases azotées dont l'association est toujours la même : adénine-thymine et cytosine-guanine.
L'ADN est aussi constitué d'un groupe phosphoryle qui estérifie le désoxyribose.
3.2.STRUCTURE DE L'ADN
La molécule est formée de 2 chaines hélicoïdales de poly-nucléotides réunies entre elles par
des liaisons hydrogène entre les bases azotées qui sont disposées comme des barreaux
d'échelle.
L'hélice est formée d'une succession de désoxyriboses, de groupes phosphoryles et de bases
combinées aux oses qui sont perpendiculaires.
En face de chacune des bases d'une hélice, il y a l'autre hélice avec la base complémentaire.
3.3.REPARTITION
3.3.1.ADN CELLULAIRE
Il se trouve surtout dans le noyau, porté par les chromosomes. Une petite partie est dans les
chromosomes et une petite partie est dans les mitochondries.
L'ADN du noyau est lié à des protéines et il forme une association nucléoprotéique
appelée chromatine.
Les protéines de cette association sont de faible masse moléculaire et sont appelées
des histones.
Le filament de chromatine a une structure semblable à un collier de perles et les petites
sphères que l'on appelle des nucléosomes sont reliées les unes aux autres par de l'ADN lien.
3.3.2.ADN DES BACTERIES, DES PLASMIDES ET DES VIRUS
L'ADN des bactéries n'est pas lié à des histones mais il forme un complexe dans lequel il est
associé à des ARN et des protéines.
Les plasmides sont des molécules d'ADN pouvant exister dans le cytoplasme de certaines
bactéries. Ils sont porteurs des gènes et sont capables d'autoreproduction.
L'ADN viral présent dans les virus à ADN est souvent bicaténaire et circulaire.
4.ACIDE RIBONUCLEIQUE OU ARN
4.1.COMPOSITION DE L'ARN
L'ARN est formé de nucléotides dont un pentose (le ribose), de bases azotées et d'un groupe
phosphoryle.
4.2.STRUCTURE DE L'ARN
La structure primaire est voisine de l'ADN mais ne présente pas une structure secondaire en
double hélice. L'ARN a une structure monocaténaire c'est-à-dire qu'il est formé d'une chaine
unique dans laquelle il existe des replis conduisant à la formation de liaisons hydrogène entre
les bases complémentaires. Ces types de structure sont dits en épingle à cheveux.
4.3.REPARTITION
Les virus contiennent soit de l'ADN soit de l'ARN.
De nombreux virus animaux et végétaux renferment un ARN et les cellules eucaryotes et
procaryotes contiennent 4 types d'ARN.
4.3.1.ARN RIBOSOMIQUES
Ils représentent 80% de l'ARN cellulaire. Ils ont une structure monocaténaire avec quelques
zones hélicoïdales. Ils sont combinés aux protéines et forment des ribonucléoprotéines et ils
vont jouer un rôle dans le maintien de la structure des ribosomes et dans la synthèse des
protéines.
4.3.2.ARN MESSAGERS
Ce sont des matrices sur lesquelles sont synthétisées les protéines.
La séquence de leurs bases est complémentaire de celle d'un fragment d'ADN.
4.3.3.ARN DE TRANSFERT
Ils jouent un rôle important dans la synthèse des protéines. Leurs chaines possèdent environ
80 nucléotides. Ils ont une structure en feuille de trèfle repliée.
4.3.4.PETITS ARN NUCLEAIRES
On a isolé un groupe à partir du noyau qui s'appelle les ARNsn (small nuclear).
Ils font partis de complexes intervenant dans la maturation des ARNm.
IV.LIPIDES
1.DEFINITION ET CLASSIFICATION
1.1.DEFINITION ET COMPOSITION
Les lipides forment un groupe hétérogène dont les structures sont très différentes et que l'on
réunit en fonction de leur insolubilité dans l'eau et de leur solubilité dans les solvants
organiques.
On peut les définir comme des molécules possédant au moins un acide acyclique à longue
chaine aliphatique linéaire appelé acide gras.
On va définir les lipides comme résultant de la combinaison d'un acide gras et d'un alcool qui
est souvent le glycérol qui possède 3 fonctions alcool ou bien un stérol ou encore un alcool
gras.
Les lipides peuvent également résulter de l'association entre un acide gras et une amine.
Les acides de l'association sont des acides gras qui peuvent être saturés comme l'acide
palmitique (16 carbones), l'acide stéarique (18 carbones) et l'acide arachidique (20 carbones)
ou insaturés comme l'acide oléique (18 carbones + 1 double liaison), l'acide linoléique (18
carbones + 2 doubles liaisons), l'acide linolénique (18 carbones + 3 doubles liaisons) et l'acide
arachidonique (20 carbones + 4 doubles liaisons).
Les propriétés du radical R serviront de base à la classification des acides gras.
1.2.CLASSIFICATION
1.2.1.LIPIDES SIMPLES OU HOMOLIPIDES
Acides gras : ce sont des composés formés de carbone, d'hydrogène et d'oxygèneGlycérolipides : ce sont des esters du glycérol et on va y trouver les glycérides ou acylglycérols qui
sont des esters d'acides gras et de glycérol et les glycéro-phospholipides qui sont des glycérolipides phosphorésSphingo-lipidesCérides : ce sont des esters d'acides gras et d'alcools
grasStérides : ce sont des esters d'acides gras et de stérolLipides isopréniques : ils
comprennent les hydrocarbures isopréniques comme les caroténoïdes et vitamine A, les
stérols et les stéroïdes comme le cholestérol et ses dérivés et les quinones comme le
tocophérol et la vitamine K1.2.2.LIPIDES COMPLEXES OU HETEROLIPIDES
Ce sont des associations de lipides et de protéines que l'on trouve dans les membranes
cellulaires et dans les couches lipidiques.
Il en existe 2 types :
LipoprotéinesLipolipides
1.3.FONCTIONS BIOLOGIQUES
1.3.1.LIPIDES DE RESERVE
On les trouve dans les tissus adipeux et ils sont capables de fournir de l'énergie en se
dégradant puisque l'oxydation d'1 gramme de lipides libère 9 kcal.
1.3.2.LIPIDES DE STRUCTURE
Ce sont les constituants essentiels. On les trouve dans les membranes cellulaires et dans toutes
les membranes biologiques.
1.3.3.LIPIDES FONCTIONNELS
On les trouve au niveau d'hormones comme les prostaglandines et au niveau des vitamines A,
D, E et C.
2.CONSTITUANTS DES LIPIDES
2.1.ACIDES GRAS NATURELS
2.1.1.STRUCTURE ET EXEMPLE
On les trouve en petite quantité à l'état libre mais en grande quantité engagés dans des liaisons
esters ou amides.
En règle générale, ils sont mono-carboxyliques à chaine linéaire non ramifiée avec un nombre
paire d'atomes de carbone. Ils peuvent être saturés ou insaturés c'est-à-dire posséder une ou
plusieurs doubles liaisons qui sont parfois hydroxylées ou ramifiées.
ACIDES GRAS SATURES
Ils sont désignés soit sous leur nom usuel en rapport avec leur origine soit par la nomenclature
officielle des acides carboxyliques.
Ils se rencontrent préférentiellement dans les graisses animales qui contiennent aussi du
cholestérol. On va trouver les acides gras mono-insaturés qui augmentent de manière
significative l'agrégabilité des plaquettes et contribuent à la formation d'un thrombus à
l'origine de la plaque d'athérome.
ACIDES GRAS INSATURES
Les doubles liaisons sont en général cis ce qui limite l'encombrement et ces acides gras ont un
point de fusion beaucoup plus bas que les saturés.
ACIDES GRAS HYDROXYLES
Les végétaux sont capables de synthétiser toute une série d'acides gras hydroxylés comme
l'acide ricinoléique.
D'autre part, des lipides des cellules de l'épiderme ont des acides gras hydroxylés à très longue
chaine et jouent un rôle dans la structure de ce tissu.
Dans le système nerveux, on va trouver l'acide cérébronique qui possède 24 atomes de
carbone.
ACIDES GRAS RAMIFIES
Ils existent dans de nombreuses bactéries (ex : bacille de Koch, riche en acides méthylés dont
un s'appelle l'acide tuberculostéarique qui possède 18 carbones).
ACIDES GRAS CYCLIQUES
Dans les cellules des mammifères, des acides gras polyinsaturés à 20 carbones vont être
transformés en leurs dérivés (ex : prostaglandines qui possèdent une activité biologique).
2.1.2.PROPRIETES
POINT DE FUSION
Il est d'autant plus bas que le nombre de doubles liaisons est élevé et il augmente avec la
longueur de la chaine. En effet, à température ordinaire, les acides gras sont liquides jusqu'à
10 carbones.
POINT D'EBULLITION
Il augmente avec la longueur de la chaine et les doubles liaisons l'influencent peu.
DENSITE
Les acides gras et les lipides possèdent un grand nombre d'atomes légers qui sont le carbone
et l'hydrogène. Les molécules sont volumineuses mais peu denses, c'est pourquoi la masse
volumique des acides gras est inférieure à celle de l'eau.
SOLUBILITE
Les acides gras sont insolubles dans l'eau sauf les premiers de la série.
C'est donc la conséquence de la constitution des acides gras en 2 zones :
Une chaine carbonée, comparable à celle des hydrocarbures et donc hydrophobeUn
groupement carboxylique terminal hydrophile
SALIFICATION
Lorsqu'ils sont traités par des bases, les acides gras forment des sels (savons).
Les sels alcalins sont solubles dans l'eau et les savons sont tensioactifs.
Les acides gras peuvent être dosés dans un solvant convenable à l'aide d'une solution de
potasse alcoolique en présence de phénolphtaléine et ce dosage permet d'évaluer la quantité
d'acides gras libres.
Le résultat est appelé indice d'acide IA qui est le nombre de mg de potasse nécessaire pour
neutraliser l'acidité libre dans 1g de matière grasse.
2.2.GLYCEROL
C'est l'alcool principal des lipides. C'est un trialcool qui peut être estérifié par 3 acides gras ou
par 2 acides gras et un phosphate.
Le glycérol peut former des esters avec 1, 2 ou 3 molécules d'acides gras. Dans ce-dernier cas,
ce sont des lipides qu'on appelle des glycérides.
Le glycérol est soluble dans l'eau et l'éthanol, insoluble ou peu soluble dans les solvants
organiques. Son oxydation donne des dérivés qui sont le glycéraldéhyde, la dihydroxyacétone
et l'acide glycérique.
3.PRINCIPAUX GROUPES DE LIPIDES
3.1.ACIDES GRAS
Les prostaglandines (un des plus importants) qui jouent un rôle e modulateur hormonal et qui
contiennent 20 carbones sont synthétisées à partir de l'acide arachidonique et leurs principales
actions sont la stimulation des muscles lisses, l'augmentation des inflammations, la
modulation de l'irrigation sanguine de certains organes, le contrôle de la transmission
synaptique et le contrôle du passage des ions à travers les membranes cellulaires.
3.2.GLYCEROLIPIDES : GLYCERIDES
Ils sont présents dans la quasi-totalité des tissus mais particulièrement abondant dans les tissus
adipeux. Ils représentent une réserve d'énergie utilisable.
3.2.1.STRUCTURE
Ils sont obtenus par estérification des fonctions alcool du glycérol par des acides gras. On
distinguera des mono, des di et des triacylglycérols appelés triglycérides.
Ils vont différer par la nature et la position des acides gras estérifiés.
La plupart des triglycérides sont hétérogènes c'est-à-dire qu'il est exceptionnel que les 3
groupements hydroxyles du glycérol soient estérifiés par le même acide.
3.2.2.PROPRIETES PHYSIQUES
POINT DE FUSION
Il dépend de la longueur de la chaine hydrocarbonée et de son degré d'insaturation.
SOLUBILITE
Ils sont très peu solubles dans l'eau et la solubilité est d'autant plus faible que la chaine
hydrocarbonée est longue et que le nombre de doubles liaisons est élevé. Ils sont solubles
dans l'éther de pétrole, l'éther, le benzène, le chloroforme et l'acétone.
3.2.3.PROPRIETES CHIMIQUES DUES A LA PRESENCE DE LA FONCTION ESTER
HYDROLYSE ET SAPONIFICATION EN MILIEU ALCALIN
Les triglycérides sont saponifiables.
Ils sont insolubles dans l'eau mais on va solubiliser les constituants avec de la soude ou de la
potasse à chaud et on obtient par hydrolyse du glycérol et des sels d'acides gras de sodium ou
de potassium appelés savons : c'est la saponification.
L'indice de saponification IS est la masse de potasse exprimée en mg nécessaire pour
saponifier 1g du corps gras.
On va également définir un indice d'ester IE qui est le nombre de mg de potasse nécessaire
pour saponifier les esters contenus dans 1g de substance.
Il en résulte une réaction et on met en œuvre une relation qui est : IS = IA + IE
TRANSESTERIFICATION
On va l'utiliser quand on traitera par le méthanol ou l'éthanol.
Cette réaction est utilisée dans le traitement du beurre de cacao et des margarines.
3.2.4.PROPRIETES CHIMIQUES DUES A LA PRESENCE DE DOUBLES LIAISONS
HYDROGENATION CATALYTIQUE
On va obtenir un acide gras saturé, le point de fusion va augmenter et les huiles vont devenir
solides.
L'hydrogénation va viser à obtenir à partir d'huiles liquides des graisses solides comme la
margarine. Cependant, cette hydrogénation va diminuer les qualités nutritionnelles car elle va
affecter les acides gras polyinsaturés et va produire des acides gras trans.
ADDITION D'HALOGENES
Les halogènes (iode, brome et chlore) vont se fixer sur les doubles liaisons éthyléniques et la
mesure de la quantité d'iode fixée sur les doubles liaisons des corps gras va constituer l'indice
d'iode qui est la masse d'iode exprimée en g que peuvent fixer 100g de lipides.
RANCISSEMENT
Les huiles riches en acides polyinsaturés rancissent en vieillissant.
Le rancissement est dû à une oxydation à l'air d'autant plus aisée qu'il y a des doubles liaisons
conjuguées. Il y a formation de peroxydes qui se partagent ensuite en aldéhydes malodorants.
SICCATIVITE
Elle correspond à une fixation plus importante d'oxygène.
Elle s'accompagne de substances volatiles et de la polymérisation de l'huile qui devient dure et
qui forme un vernis insoluble, imperméable et protecteur.
La siccativité est favorisée par la présence d'activateurs (magnésium, plomb et cobalt) appelés
des siccatifs. Cette propriété est utilisée en peinture.
3.3.CERIDES
Ce sont des esters d'acides gras et d'alcool à longue chaine qui se rencontrent chez les
animaux (cire d'abeille, blanc de baleine) et chez les végétaux (enduit de feuilles de choux et
de fruits).
Les cires sont souvent solides mais il en existe une liquide : l'huile de jojoba.
Les cires sont solubles dans le benzène, le chloroforme et l'eau et leur rôle est celui de
protecteur des tissus animaux ou végétaux par imperméabilisation.
3.4.STERIDES
Ce sont des esters d'acides gras et de stérols (ex : lanoline).
3.5.LIPIDES ISOPRENIQUES
3.5.1.HYDROCARBURES ISOPRENIQUES
Le nom vient du fait qu'ils contiennent souvent une combinaison d'unités appelées isoprènes :
Carotènes : ils sont abondants dans la carotte, le jaune d'œuf, la peau, le lait et le sérum
sanguinVitamine A1 ou rétinol 1 ou vitamine antixérophtalmique : sa formule est C6H30O et
sa carence provoque des troubles visuels des liaisons épithéliales et un arrêt de croissance
3.5.2.STEROLS ET STEROIDES
CHOLESTEROL
Il peut être élaboré par tous les tissus mais le foie et les glandes endocrines sécrétrices
d'hormones stéroïdes le synthétisent plus activement.
Il n'existe pas d'organe de stockage de cette molécule si bien que toute synthèse excessive
ainsi qu'une mauvaise élimination sont dangereuses car génératrices de dépôts tissulaires
provoquant des athéromes.
On le retrouve dans de nombreux aliments.
C'est le précurseur des hormones du sang : les HDL qui le transportent des tissus vers le foie
et les LDL qui le transportent du foie aux tissus.
C'est un constituant des lipoprotéines membranaires.
ACIDES BILIAIRES
La bile est un milieu complexe renfermant des protéines, des acides gras estérifiés ou salifiés,
des phospholipides, du cholestérol, des pigments (bilirubine et biliverdine) et en proportion
importante des sels d'acides biliaires.
Ces acides biliaires sont des dérivés stéroliques formés à partir du cholestérol.
On y trouve l'acide cholique et l'acide chénodésoxycholique qui sont synthétisés par le foie.
Leur rôle est de maintenir en solution des graisses et du cholestérol biliaire et l'émulsification
des graisses est nécessaire soit à leur hydrolyse lipasique soit à leur absorption directe au
niveau du duodénum. Ils facilitent la résorption du calcium au niveau de l'intestin ainsi que
celle des vitamines liposolubles.
VITAMINE D
Elle contrôle le métabolisme phosphocalcique et sa carence va contribuer au développement
du rachitisme.
Par ailleurs, l'hypervitaminose D provoque de la diarrhée, l'amaigrissement et un excès
d'ossification.
4.METHODES DE PREPARATION ET D'ANALYSE DES LIPIDES
4.1.EXTRACTION
Elle se réalise sur de la matière déshydratée lyophilisée, réduite en fines particules à l'aide de
plusieurs solvants comme l'acétone et l'éthanol qui ont une action dissolvante et avec le
chloroforme et l'éther qui ont une action solvante.
On réalise ensuite une purification par dissolution extractive pour éliminer les composants
non lipidiques comme les oses, les acides aminés et les minéraux.
4.2.FRACTIONNEMENT
4.2.1.PAR DIFFERENCE DE SOLUBILITE
Des lipides sont solubles dans l'éther et l'éthanol (c'est le cas de la lécithine), dans l'acétone
(c'est le cas des glycérides, des stérides, des cérides, des acides gras et des stérols) et d'autres
sont insolubles dans l'éther (c'est le cas des cérébrosides et des sphingomyélines).
4.2.2.PAR CHROMATOGRAPHIE
On peut pratiquer une chromatographie sur papier, sur couche mince ou sur colonne de gel de
silice.
4.3.ANALYSE
Pour les glycérides, elle est réalisée en déterminant les différents indices d'iode, de
saponification et d'acide.
Pour un extrait lipidique, la saponification va séparer l'insaponifiable des acides gras. Puis,
l'insaponifiable est insoluble dans l'eau en milieu alcalin mais soluble dans l'éther alors que
les acides gras sont solubles en milieu alcalin.
La fraction hydrosoluble peut contenir du glycérol, des amino-alcools et de l'acide
phosphorique.
On pourra faire un fractionnement des acides gras par chromatographie et une
chromatographie en phase gazeuse permettra d'analyser quantitativement des mélanges
complexes.
ENZYMOLOGIE
I.CATALYSE ENZYMATIQUE
Dans les systèmes biologiques, les réactions chimiques du métabolisme se produisent
spontanément. Elles sont le plus souvent catalysées par des protéines particulières : les
enzymes.
Les enzymes sont donc des catalyseurs qui :
Ne sont pas modifiées en fin de réactionAgissent en petite quantitéAugmentent la vitesse
d'une réaction réversible sans déplacer l'équilibre ni modifier les produits de cette
réactionAgissent sur un seul substrat et catalysent un seul type de réaction
II.NATURE BIOCHIMIQUE ET STRUCTURE DES ENZYMES
1.STRUCTURE
En fonction de leur structure, on divise les enzymes en 2 catégories : les enzymes entièrement
protéiques et celles formées de 2 parties, une protéique appelée apoenzyme et une non
protéique appelée coenzyme.
1.1.APOENZYME
Il intervient dans la fixation du substrat, dans la spécificité et la nature de la réaction qui se
produit au niveau du coenzyme.
1.2.COENZYME
C'est le support de la réaction.
Il est thermostable. Il participe à la réaction et, en fonction de sa nature chimique, on le classe
en 3 groupes :
Les coenzymes tétrapyroliques qui contiennent des ions métalliques et interviennent dans les
transferts d'électronsLes coenzymes métalliques parmi lesquels on trouve le zinc dans les
protéases et dans l'anhydrase carbonique, le manganèse dans l'arginase et le magnésium dans
la phosphataseLes coenzymes dérivés de vitamines hydrosolubles : après une transformation
importante, la vitamine va devenir un coenzyme
2.SITE ACTIF
Pour que l'enzyme agisse, elle doit se combiner à son substrat.
Dans les enzymes sans coenzyme, c'est une partir de la protéine qui va agir dans la réaction
enzymatique. Cette partie est le site actif.
Le site actif possède une forme telle que le substrat spécifique peut se fixer sur l'enzyme et il
possède des groupements catalytiques qui agissent sur le substrat pour lui faire subir sa
transformation.
Dans le site actif, on distingue le site de fixation qui se combine au substrat par des liaisons
faibles et le site catalytique sui agit sur le substrat pour qu'il subisse la réaction.
III.ACTIVITE ENZYMATIQUE
1.REACTION ENZYMATIQUE
1.1.SPECIFICITE
Les enzymes possèdent 2 propriétés importantes :
Leur spécificité = elles sont capables de fixer spécifiquement les substrats de la réaction et
elles ne catalysent qu'un type de réactionLeur pouvoir catalytique = elles peuvent multiplier
par 106 la vitesse d'une réaction (ex : l'uréase a comme seul substrat l'urée)A partir d'un même
substrat plusieurs réactions peuvent être catalysées par des enzymes différentes (cf.
polycopié).
1.2.ENERGIE D'ACTIVATION
Certaines réactions vont libérer de l'énergie mais nécessitent cependant un apport d'énergie
pour que le substrat se transforme en produit. Il doit donc passer par un état d'activité = état de
transition à partir duquel la réaction se fait.
Ce passage à l'état de transition nécessite de l'énergie dite énergie d'activation qui sera ensuite
restituée.
2.INFLUENCE DES FACTEURS PHYSIQUES
2.1.TEMPERATURE
Une augmentation de la température augmente la vitesse des réactions chimiques catalysées
qui chute ensuite du fait que les enzymes, étant des protéines, sont dénaturées par des
températures élevées.
La température optimale se situe vers 38°C pour la majorité des enzymes.
2.2.PH
Il joue un rôle important dans les réactions enzymatiques car il peut modifier l'ionisation du
substrat.
Les réactions enzymatiques sont très sensibles au pH et on définit un pH optimal d'action pour
chaque enzyme dans des conditions déterminées.
Ce pH varie entre 1 pour la pepsine et 10 pour l'arginase et la plupart des enzymes se situent
entre 5 et 8.
IV.COENZYMES ET VITAMINES
Les coenzymes participent à la réaction catalytique en se combinant au substrat ou à un
radical détachable du substrat jouant le rôle de transporteur.
Cf. polycopié
METABOLISME ENERGETIQUE
Les aliments sont des mélanges complexes de composés à poids moléculaire élevé.
La digestion est constituée en général de réactions d'hydrolyse qui vont couper les composés
avec fixation des éléments de l'eau.
Les aliments devenus assimilables passent dans le sang et la lymphe et gagnent d'autres
organes comme le foie où ils sont transformés et utilisés.
Ces composés biochimiques simples sont des métabolites car ils subissent un métabolisme ce
qui signifie qu'ils vont être transformés par une réaction enzymatique.
On classe les composés simples en 4 groupes :
Les glucides qui sont d'importants donneurs d'énergieLes acides gras, les glycérides et les
lipides qui sont d'importants donneurs d'énergie et des constituants des membranes
cellulairesLes acides aminés qui sont des constituants des protéinesLes nucléotides qui sont
des constituants des acides nucléiques
I.DIFFERENTS TYPES TROPHIQUES
1.AUTOTROPHIE
Les organismes autotrophes comme les végétaux à chlorophylle et certaines bactéries ont une
nutrition inorganique et utilisent l'anhydride carbonique de l'air comme seule source de
carbone.
2.HETEROTROPHIE
Les organismes hétérotrophes ne peuvent pas synthétiser la substance organique et utilisent
comme source de carbone les matières organiques produites par d'autres organismes.
3.PHOTOTROPHIE
Les organismes comme les plantes et certaines bactéries utilisent l'énergie lumineuse solaire.
4.CHIMIOTROPHIE
Ces organismes utilisent l'énergie provenant de la dégradation des molécules organiques.
II.DIFFERENTES DIRECTIONS DU METABOLISME
1.ANABOLISME
C'est la transformation de composés simples en composés plus complexes : c'est donc la
synthèse des macromolécules.
Ces réactions nécessitent de l'énergie qui doit être apportée par des réactions qui en produisent
et qui sont dites réactions endergoniques.
2.CATABOLISME
L'organisme a besoin d'énergie et, pour la produire, il va détruire au niveau cellulaire des
composés biologiques.
Cette dégradation de molécules, libératrice d'énergie, porte le nom de catabolisme.
Ces réactions qui produisent de l'énergie sont dites exergoniques.
Ces réactions cataboliques sont surtout des combustions qui correspondent en grande partie à
des oxydations.
Dans les réactions d'oxydoréduction les plus courantes, 2 types de molécules vont intervenir :
les coenzymes pyrimidiques et les coenzymes flaviniques.
3.MISE EN RESERVE
Les composés susceptibles de produire de l'énergie par leur dégradation catabolique peuvent
être provisoirement mis en réserve sous forme :
De glycogène pour les glucidesDe globules graisseux pour les lipidesIls seront ensuite utilisés
au fur et à mesure des besoins.
III.COUPLAGE ENERGETIQUE
1.NOTION DE COUPLAGE
Les transformations des molécules simples au niveau des cellules sont des oxydations
progressives qui passent par des réactions chimiques successives catalysées par des enzymes.
Toutes ces transformations nécessitent une dépense d'énergie et ne peuvent avoir lieu que si
elles sont couplées avec des réactions libérant de l'énergie.
METHODES D'ETUDE ET D'ANALYSE DES BIOMOLECULES
I.ECHANTILLON
1.PRELEVEMENT
Le matériel utilisé en biochimie peut être constitué soit par des prélèvements de liquide
biologique (sang, urine, liquide de ponction...) soit par des prélèvements tissulaires (biopsie
du foie, muscles et peau).
Il est indispensable de connaitre l'origine de l'échantillon qui doit être authentique et
représentatif c'est-à-dire qu'il doit donner une image valable de l'ensemble du tissu et du
liquide que l'on étudie.
2.CONSERVATION
2.1.GENERALITES
L'analyse biochimique peut être effectuée immédiatement après le prélèvement et dans la
plupart des cas aucune précaution de conservation n'est nécessaire.
2.2.CONSERVATION PAR LE FROID
2.2.1.REFRIGERATION ET CONGELATION
Le procédé des appareils utilisés consiste à évaporer un gaz liquéfié comme du fréon dans un
serpentin. Le passage à l'état gazeux va provoquer une réfrigération et celle-ci consiste à
abaisser la température de l'échantillon à +4°C puis la congélation abaissera la température de
-1 à -70°C.
2.2.2.NEIGE CARBONIQUE ET AZOTE LIQUIDE
La neige carbonique ou gaz carbonique solide est utilisé pour réaliser certains mélanges
réfrigérant avec de l'alcool ou de l'acétone à une température d'environ -70°C.
L'azote liquide a une température de -195°C et il est utilisé dans des appareils calorifugés où
sont mis des récipients en verre ou en plastique.
2.3.LYOPHILISATION
Elle consiste en la congélation de l'échantillon puis au passage dans un vide poussé qui
évapore l'eau par sublimation.
Par contre, la déshydratation peut entrainer la perte de produits volatiles.
2.4.STERILISATION
La valeur stérilisatrice correspond au temps nécessaire et à une température donnée pour
réduire de 105 (100000) à 100 (1) le nombre de spores par mL de préparation.
Elle permet de comparer les différents types de méthodes de stérilisation par la chaleur et par
la chaleur humide.
2.5.INCINERATION
L'échantillon est réduit à l'état de cendres à partir desquelles il est possible de doser certains
éléments minéraux comme les oligo-éléments.
2.6.DESHYDRATATION
Elle sert à éliminer l'eau contenue dans un corps non volatile et à assurer ainsi une meilleure
conservation.
Elle va stopper les réactions chimiques qui pourraient transformer les composants du
prélèvement.
2.7.ADDITION DE COMPOSES CHIMIQUES
Du fait de la fragilité de certains constituants, il est parfois nécessaire d'ajouter au
prélèvement certains composés chimiques :
Des conservateurs antiseptiquesDes anticoagulants
II.METHODES D'EXTRACTION
1.PREPARATION DE L'ECHANTILLON
1.1.BROYAGE
Il s'effectue par le passage du prélèvement dans un broyeur type mixeur qui va assurer la
destruction des cellules et libérer leurs constituants.
1.2.HOMOGENEISATION
Elle s'effectue dans un homogénéiseur de Potter formé d'un tube dans lequel pénètre un piston
qui tourne grâce à un moteur électrique.
La plupart des cellules sont détruites sauf les éléments subcellulaires qui subsistent et on
obtient une homogénéisation qui a gardé une activité biochimique importante.
1.3.ECLATEMENT CELLULAIRE
La libération des constituants cellulaires peut être assurée par une congélation et une
décongélation successives ou alors par sonication qui est l'utilisation des ultrasons ou encore
par action d'agents tensioactifs comme la saponine.
1.4.TRAITEMENT ENZYMATIQUE
On va utiliser un traitement enzymatique en vue d'une analyse surtout sur la préparation des
acides aminés.
2.EXTRACTION DU TYPE SOLIDE/LIQUIDE
On va extraire un solide d'un échantillon en le faisant passer en solution dans un liquide dans
lequel il est soluble.
3.EXTRACTION DU TYPE LIQUIDE/LIQUIDE
Cette extraction consiste à faire passer une substance dissoute d'une phase liquide dite phase à
extraire dans une phase extractive non miscible à la précédente et dans laquelle la substance
est plus soluble que dans la phase à extraire. Les 2 phases sont non miscibles.
On pratique d'abord une agitation pour réaliser une plus grande surface d'échange puis une
décantation et une séparation.
La substance à extraire va se répartir ou se partager entre les 2 solvants et l'intensité de ce
partage appelé coefficient de partage K va dépendre de différents facteurs dont le pH et la
température.
Par définition, K est égal au rapport de la concentration de x (substance) dans la phase
extractive par celle de x (substance) dans la phase à extraire.
On utilise 3 méthodes :
Extraction par simple contact (cf. polycopié)Dans une ampoule à décanter on pratique une
agitation, une décantation et une séparation
Extraction par contact multipleL'opération consiste à répéter les extractions en renouvelant
chaque fois la phase extractive et il est démontré mathématiquement que la quantité de
produit à extraire est maximale si la phase extractive est fractionnée en volumes égaux
Extraction à contre-courantOn va faire passer dans un appareil complexe les 2 phases en sens
contraire. Cette méthode permet de séparer 2 ou plusieurs substances dont les coefficients de
partage respectifs entre 2 solvants sont différents
4.APPLICATION DES EXTRACTIONS
Elles sont utilisées pour des dosages particuliers.
En effet, l'extraction à contre-courant sert pour des concentrations, des purifications ou des
identifications comme pour les antibiotiques et les peptides.
Ces séparations peuvent permettre d'isoler les isomères d'une substance ou les homologues
d'une même série.
III.METHODES DE FRACTIONNEMENT ET DE PURIFICATION
1.PRECIPITATION
1.1.PRECIPITATION SIMPLE
C'est le phénomène par lequel il se forme un corps insoluble dans un liquide qui se dépose au
fond du récipient.
Cette méthode est souvent une méthode analytique pour les protéines.
1.2.PRECIPITATION FRACTIONNEE
C'est une précipitation sélective souvent utilisée pour purifier partiellement ou totalement une
substance ou pour fractionner un mélange.
2.DECANTATION-CENTRIFUGATION-ULTRACENTRIFUGATION
2.1.DECANTATION
C'est une méthode de séparation des solides des liquides lorsque la différence de densité est
suffisante pour séparer les 2 phases.
2.2.CENTRIFUGATION
C'est une méthode qui utilise la force centrifuge et qui permet de séparer les particules d'un
solvant.
En biologie, les particules sont généralement des cellules, des organites ou des
macromolécules.
Ces particules vont se distinguer par leur dimension, leur masse et leur densité.
2.3.ULTRACENTRIFUGATION
C'est une centrifugation à très grande accélération et, pour éviter tout échauffement, le rotor
va fonctionner dans une chambre dans laquelle on fait le vide et qui est réfrigérée.
3.DIALYSE
3.1.DEFINITION
C'est une technique permettant de séparer des substances en utilisant leur capacité à franchir
les pores d'une membrane.
On peut utiliser la dialyse circulaire, la dialyse sur grand volume, la dialyse sur petit volume
et l'électrodialyse qui permet l'élimination de sels minéraux.
3.2.APPLICATION
L'électrodialyse permet de retirer le sel des échantillons avant la chromatographie.
Elle permet aussi d'éliminer des produits diffusibles des solutions protéiques.
4.CHROMATOGRAPHIES
4.1.DEFINITION ET PRINCIPE
C'est une méthode de fractionnement utilisée pour séparer différentes macromolécules d'un
mélange complexe ainsi que les petites molécules d'une même famille chimique.
Cette séparation peut être destinée soit à analyser un mélange soit à isoler les constituants à
étudier. Ainsi, les molécules à séparer sont dissoutes dans un solvant convenable et la solution
obtenue circule entre les particules d'un support.
On va classer les différents types de chromatographie en fonction de la nature des phases, des
principes physicochimiques ou des techniques opératoires.
4.2.EN FONCTION DE LA NATURE DES PHASES
Chromatographie liquide/solideSa phase stationnaire est un solide et sa phase mobile est un
liquide
Chromatographie liquide/liquideSa phase stationnaire est un liquide immobilisé par
imprégnation d'un solide
Chromatographie en phase vapeur ou chromatographie gaz/liquide L'échantillon à analyser est
transformé en vapeur par chauffage et va traverser la phase liquide stationnaire
4.3.EN FONCTION DES PRINCIPES PHYSICOCHIMIQUES
Il existe 5 mécanismes de chromatographie :
Chromatographie d'absorptionElle va utiliser un support qui fixe les molécules à séparer par
des liaisons hydrophobes
Chromatographie d'échange ionique sur résine échangeuse d'ionsQuand le support est chargé
positivement, il va échanger des anions et, quand il est chargé négativement, il va échanger
des cations. Les ions fixés vont être retenus avec plus ou moins de force selon leur nombre de
charge et leur nature chimique
Chromatographie de filtration en gel ou chromatographie d'exclusionLe support poreux va
laisser pénétrer les petites molécules et va exclure les grosses qui restent à l'extérieur et qui
peuvent ainsi être séparées des petites qui sortiront du gel plus tard
Chromatographie de partageElle utilise un support qui retient un premier solvant et qui est
traversé par un solvant non miscible au premier. Les substances à séparer vont donc se
partager entre les 2 solvants
Chromatographie d'affinitéElle va utiliser des interactions spécifiques comme la réaction
enzyme/substrat ou comme la réaction antigène/anticorps. Elle va donc permettre de purifier
une protéine en fixant l'anticorps spécifique
4.4.EN FONCTION DES TECHNIQUES OPERATOIRES
La chromatographie pourra être analytique c'est-à-dire utilisée pour caractériser certaines
substances ou préparative et servir à préparer certaines substances.
4.4.1.CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE
Dans une colonne cylindrique remplie de poudre ou de gel, on verse le mélange à fractionner
et ses constituants vont rester fixés.
On verse un liquide appelé éluant qui déplace l'un après l'autre les constituants du mélange
qui vont descendre séparément le long de la colonne. On recueille le liquide par petites
fractions dans lesquelles se trouvent les constituants du mélange qui pourront être ensuite
analysés ou dosés.
On utilise cette technique pour doser les mélanges d'acides aminés. En effet, les acides aminés
sont déposés sur une colonne échangeuse d'ions. L'éluant est une solution tampon de pH
variable avec le temps. Le liquide sortant de la colonne est mélangé avec de la ninhydrine et
chauffé pour que la colonie se développe, puis un spectrophotomètre va lire l'absorption pour
l'ensemble des acides aminés. Cette lecture sera enregistrée sur un papier millimétré.
4.4.2.CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER
Elle utilise des feuilles de papier filtre maintenues verticales dans une cuve qui est une
enceinte fermée.
Il existe une phase stationnaire constituée par l'humidité du papier et une phase mobile qui est
un solvant organique ou un mélange.
Cette phase mobile va être disposée au fond de la cuve à la base du papier de telle sorte
qu'elle monte par capillarité = chromatographie ascendante.
Si elle est disposée près du bord supérieur du papier dans un petit récipient qui permet au
solvant de couler lentement de haut en bas de la feuille = chromatographie descendante.
Avant le passage du solvant, on va déposer sur le papier une goutte de l'échantillon à analyser
et le solvant va séparer les substances contenues dans l'échantillon.
Une fois le passage du solvant terminé, on va recueillir la feuille de papier ou
chromatogramme, on va la sécher et on va la révéler. On va donc faire apparaitre les
différentes molécules qui ont été séparées sous forme de tache à l'aide d'un procédé approprié.
4.4.3.CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE
Le principe est le même que pour la précédente mais elle est beaucoup plus utilisée car elle est
plus rapide, moins encombrante, de conservation plus facile et d'application plus vaste.
En effet, la feuille de papier est remplacée par une couche de support qui peut être un gel et
qui est étalée sur une plaque en verre ou en plastique.
4.4.4.CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE A HAUTE PERFORMANCE
Elle utilise des particules très fines et très résistantes ce qui va augmenter la surface d'échange
entre la colonne, les molécules à fractionner et les éluants.
Cette chromatographie va être considérablement plus rapide et on doit opérer en circuit fermé
et à pression relativement élevée.
5.ELECTROPHORESE
On appelle électrophorèse le déplacement de particules chargées dans un champ électrique
continu.
On l'utilise sur milieu solide et on peut utiliser le papier comme support mais aussi d'autres
supports permettant une meilleure résolution.
IV.METHODES DE DOSAGE
1.GRAVIMETRIE ET VOLUMETRIE
1.1.GRAVIMETRIE
Une substance d'un milieu biologique peut être dosée par gravimétrie après précipitation sous
forme de produit insoluble qui est recueilli par filtration ou centrifugation puis séché et pesé.
Du poids du précipité formé, on pourra déduire la concentration de la substance : on utilisera
des balances.
1.2.VOLUMETRIE
On réalise une réaction entre une solution s contenant la substance à tirer et un volume
nécessaire de réactif r de concentration connue.
Le dosage le plus courant est le dosage acide/base et on va déterminer le point d'équivalence
c'est-à-dire lorsque la solution contient autant de OH- que de H3O+ ceci à l'aide d'un indicatif
coloré ou par potentiométrie.
Grâce à cette dernière, on va mesurer la variation de potentiel au cours d'une réaction en
fonction de la concentration de la substance à doser avec un potentiomètre qui possède des
électrodes sensibles aux ions.
2.METHODES OPTIQUES
2.1.PHOTOMETRIE ET SPECTROPHOTOMETRIE D'ABSORPTION
2.1.1.PRINCIPE
La spectrophotométrie d'absorption est utilisée pour l'identification et le dosage de molécules
biochimiques.
Lorsque l'on fait passer de la lumière à travers une solution colorée, celle-ci absorbe de la
couleur complémentaire. Si on utilise un rayon monochrome correspondant à cette couleur, il
sera absorbé au moins en partie.
2.1.2.APPAREILS UTILISES
On utilise les photomètres si seules certaines longueurs d'onde sont utilisables et les
spectrophotomètres si toutes sont disponibles.
2.1.3.DOSAGE
La densité optique étant proportionnelle à la concentration d'une solution.
On peut doser cette dernière en lisant sa densité optique dans un appareil étalonné avec la
même substance à différentes concentrations connues.
2.2.PHOTOMETRIE DES MILIEUX TROUBLES
2.2.1.OPACIMETRIE
On utilise une mesure de la lumière qui a traversé le milieu étudié dans la direction de la
lumière incidente à l'aide de spectrophotomètre avec une longueur d'onde entre 620 et 670 nm
et on va l'utiliser pour mesurer les concentrations des suspensions cellulaires en bactériologie.
2.2.2.NEPHELEMETRIE
Elle mesure la lumière diffusée à 90° par rapport à la direction de la lumière incidente. Elle
est utilisée pour mesurer les concentrations de certaines protéines sériques par immunoprécipitation.
2.3.SPECTROPHOTOMETRIE D'ABSORPTION ATOMIQUE
Elle consiste à mesurer l'absorption de radiations de photons spécifiques par des atomes de
vapeur.
En biologie clinique, on l'utilise pour le dosage sérique du calcium, du magnésium, du fer, du
cuivre...
En toxicologie et en pharmacologie, on l'utilise pour doser des métaux.
2.4.PHOTOMETRIE D'EMISSION ATOMIQUE
Par chauffage apparaissent dans une solution des ions à l'état excité grâce à l'énergie apportée
par la flamme.
En revenant à l'état normal, les atomes émettent une énergie lumineuse dont la longueur
d'onde est caractéristique de l'élément à doser et dont l'intensité est proportionnelle à sa
concentration.
2.5.FLUORIMETRIE
Cette méthode repose sur le fait que les molécules sous l'action d'un rayon X ou UV ou visible
passent à l'état excité c'est-à-dire un niveau d'énergie supérieur puis reviennent à l'état normal
en émettant une lumière fluorescente.
3.METHODES ENZYMATIQUES
3.1.GENERALITES
Les enzymes sont des catalyseurs protéiques possédant une spécificité vis-à-vis d'un substrat
et elles catalysent un seul type de réaction.
L'activité des enzymes varie selon les conditions expérimentales comme le pH, la température
et la concentration des substrats.
En réalité, pour chaque enzyme donnée, chaque laboratoire possède ses propres valeurs de
référence.
3.2.PRINCIPALES METHODES UTILISEES
3.2.1.DOSAGES PHOTOMETRIQUES
On peut mesurer la vitesse d'une réaction enzymatiques en appréciant dans un temps donné
soit la quantité du substrat disparu soit la quantité de produit apparu (ex : on peut doser les
transaminases sériques grâce à l'acide alphacétoglutarique).
3.2.2.DOSAGES FLUORIMETRIQUES
On va suivre la variation de fluorescence du produit formé au cours de la réaction
enzymatique.
Ces mesures peuvent être faussées par la fluorescence propre des réactifs et la pureté
insuffisante de certaines enzymes.
3.2.3.DOSAGES ISOTOPIQUES
On va utiliser un substrat radioactif et on va mesurer la radioactivité du produit formé pour
obtenir la vitesse de sa formation qui sera représentative de l'activité enzymatique.
4.METHODES IMMUNOLOGIQUES
Ces méthodes vont utiliser soit des anticorps spécifiques pour identifier et éventuellement
mesurer les antigènes soit des antigènes pour déterminer un taux d'anticorps.
4.1.DIFFERENTES METHODES
On les classe en 3 groupes :
Les méthodes qui permettent l'observation directe de la réaction antigène/anticorps =
méthodes de précipitation et d'agglutinationLes méthodes qui utilisent un réactif marqué. On
marque soit l'antigène soit l'anticorps par une substance susceptible d'émettre un signal
identifiable par l'œil ou un appareil spécialiséLes méthodes fondées sur l'observation d'un
effet biologique de la réaction immunitaire
4.2.EXEMPLE D'UNE TECHNIQUE IMMUNOCHIMIQUE
Il s'agit de la méthode Elisa.
Elle est basée sur le principe suivant : l'antigène ou l'anticorps fixé sur la phase solide peut
être détecté grâce à l'utilisation d'un anticorps ou d'un antigène complémentaire marqué par
une enzyme elle-même capable d'agir sur un substrat.
Quand le substrat est mis en présence l'antigène, la présence de l'antigène de l'anticorps peut
être révélée par l'apparition d'une coloration.
On l'utilise surtout pour détecter les anticorps dirigés contre les virus HIV1 et/ou HIV2 dans
le cadre du dépistage, lors du diagnostic ou de don du sang.
Ce test se déroule en 3 étapes et on a pour support réactionnel des micro-puits recouverts d'un
mélange de 4 antigènes recombinants de type HIV1 ou HIV2.
1ère étape : l'échantillon est dilué dans un diluant échantillon de couleur verte. Cette addition
entraine une modification de la couleur qui peut être contrôlée visuellement ou par
spectrophotométrie à 610 nm. L'échantillon est incubé dans un micro-puits pendant un temps
précis et si les anticorps anti-HIV1 et anti-HIV2 sont présents dans le prélèvement, des
complexes antigène/anticorps vont se former à la surface du puits2ème étape : un mélange de
4 antigènes recombinants (le conjugué) marqués par la peroxydase est ajouté au micro-puits.
Le conjugué se lie de façon spécifique aux immunoglobulines humaines anti-HIV1 et antiHIV2 des complexes antigène/anticorps3ème étape : le substrat composé
d'ophényléthylènediamine ou OPD et de peroxyde d'hydrogène est ajouté et si le conjugué lié
est présent, l'OPD sera oxydé entrainant l'apparition d'une coloration orange. Puis, on ajoute
de l'acide chlorhydrique pour stopper la réaction et l'intensité de la coloration va dépendre de
la quantité de conjugué liée donc de la concentration en anticorps anti-HIV1 et/ou anti-HIV2
dans l'échantillon. L'intensité de la coloration sera lue grâce à un spectrophotomètre qui
mesurera la densité optique dans chaque micro-puits