BOURABAH Akila - Université de Mascara

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE MUSTAPHA STAMBOULI MASCARA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE VIE
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
THESE
En vue de l’obtention du diplôme de doctorat en sciences
biologiques
Option : Microbiologie Médicale
LES MAMMITES D’ORIGINE BACTERIENNES ET
MYCOSIQUES CHEZ LA CHEVRE LOCALE à
TIARET (TRAITMENT ALTERNATIF PAR LE MIEL
ET L’HUILE DE THYMUS FONTANESII).
Présentée Par: Mme BOURABAH AKILA
Soutenue publiquement le 11/03/2015
Devant la Commission d’examen :
NOM et PRENOM
Mr Meddah Boumediene
Mr Benbarek Hama
Mr Hammoudi si Mohamed
Mme Meddah Aicha
Mr Hammoudi Abdelhammid
Mme Ghazi kheira
Grade
Pr.
Pr.
MCB
Pr.
MCA
MCA
Qualité
Président
Promoteur
Co-promoteur
Examinateur
Examinateur
Examinateur
Structure de rattachement
Université de Mascara
Université de Mascara
Université de Tiaret
Université de Mascara
Université de Tiaret
Université de Tiaret
Année universitaire 2014-2015
1
Remerciements
Mes remerciements s’adressent à ce qui m’a dirigé et m’a orientée
dans ce travail, au Professeur Hama Benbarek et le Docteur Si
Mohammed Hammoudi.
Mes remerciements au Professeur Meddah Boumediene de
l’université de Mascara qui a accepté la présidence de notre jury de
thèse.
Mes remerciements à Docteur Hammoudi Abdelhammid, Professeur
Meddah Aicha , Docteur Ghazi kheira qui ont fait l’honneur de juger
ce travail.
Remerciement Dr Boukraa L, Ayad H, Belbelik Y, Belhamiti T, Ait
amrane A, Selles M, Moussa A, Meliani S, Abdellah F et Kouidri M.
Mes remerciements à tous les enseignants et les travailleurs de
l’institut vétérinaire de Tiaret.
Mes remerciements au staff du laboratoire.
2
Dédicace.
A mon père et ma mère pour leur encouragement et soutien.
A mon mari et ma petite famille qu’Allah les bénisse.
A mes frères et mes sœurs.
A toute la famille.
A mes amies
3
SOMMAIRE
SOMMAIRE ........................................................................................................................ 04
TABLE DES ILLUSTRATIONS ......................................................................................... 08
LISTE DES ABREVIATIONS ............................................................................................. 10
RÉSUMÉ (Français) ............................................................................................................. 11
RÉSUMÉ (Anglais) .............................................................................................................. 12
RÉSUMÉ (Arabe) ................................................................................................................. 13
INTRODUCTION ............................................................................................................... 15
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
CHAPITRE I :
Anatomie de la mamelle……………………………………………………………………19
MECANISMES DE DEFENSE ET REPONSES INFLAMMATOIRES DE LA
GLANDE MAMMAIRE ................................................................................................... 19
1. DEFENSE PASSIVE (anatomique) .............................................................................. 19
1.1. Sphincter musculaire
................................. 19
1.2. Canal du trayon ....................................................................................................... 19
1.3. Rosette de Fürstenberg ............................................................................................ 20
2. LA DEFENSE CELLULAIRE ...................................................................................... 21
2. 1. Les polymorphonucléaires neutrophiles ............................................................ 21
2. 1. 1. Rôle des PMN sur le site de l’infection.................................................. 21
2. 2. Rôle des macrophages dans le lait ..................................................................... 24
2. 3. Les lymphocytes ................................................................................................... 24
3. LES DEFENSES SOLUBLES ....................................................................................... 24
3.1. Facteurs non spécifiques ........................................................................................ 24
3.2. La lactoferrine ......................................................................................................... 25
3.3. Le complément ........................................................................................................ 25
3.4. Le lysozyme ........................................................................................................... 25
3.5. L'enzyme lactoperoxidase ...................................................................................... 25
4. IMMUNITE HUMORALE ............................................................................................ 26
CHAPITRE II: LES MAMMITES ................................................................................. 28
1. CLASSIFICATION ET DEFINITION DES MAMMITES ...................................... 28
1.1. Mammites cliniques ................................................................................................. 28
1.2. Mammites subcliniques: .......................................................................................... 28
2. ETIOLOGIE DES MAMMITES CAPRINES ............................................................. 28
2.1. Classification des agents pathogènes ..................................................................... 28
2.1.1. Les pathogènes majeurs............................................................................ 28
2.1.2. Les pathogènes mineurs .......................................................................... 29
2.2. Etiologie des mammites cliniques........................................................................... 29
2.2.1. Cas de mammites sporadiques ................................................................. 29
2.2.2. Cas de mammites enzootiques ou épizootiques ....................................... 29
2.3. Etiologie des mammites subcliniques..................................................................... 29
3. LA PREVALENCE ......................................................................................................... 30
4
4. CLASSIFICATION DES MAMMITES SELON LES L'ETIOLOGIES .................. 30
4.1. Mammites staphylococciques ................................................................................ 30
4.1.1. Staphylococcus aureus .................................................................................. 30
4.1.2. Staphylocoques à Coagulase Négative ......................................................... 31
4.2. Mammites à mycoplasmes ...................................................................................... 31
4.3. Mammites à corynébactéries .................................................................................. 31
4.4. Mammites à bacilles gram négatifs ........................................................................ 31
4.5. Autres germes .......................................................................................................... 31
4.6. Virus de l'arthrite encéphalite caprine: CAEV .................................................... 31
4.7. Champignons ........................................................................................................... 32
5. PATHOGENIE ................................................................................................................ 32
6. DIAGNOSTIC ................................................................................................................. 33
6.1. Diagnostic clinique.................................................................................................. 33
6.1.1. Examen clinique de la mamelle .................................................................... 33
6.2. COMPTAGE DES CELLULES SOMATIQUES DU LAIT .............................. 33
6.2.1. Caractéristiques des cellules du lait ............................................................. 33
6.2.2. Utilisation du CCS dans le diagnostic des mammites.................................. 34
6.2.3. Méthodes de comptage des cellules somatiques .......................................... 35
6.2.3.1. Méthodes directes ........................................................................... 35
 Comptage microscopique direct ............................................................... 35
 Coulter-counter ......................................................................................... 35
 Fossomatic ................................................................................................ 35
6.2.3.2. Méthode indirecte : Californian Mastitis Test............................... 35
6.3. ANALYSE BACTERIOLOGIQUE....................................................................... 36
7. TRAITEMENT ............................................................................................................... 37
7.1. Mammites cliniques ................................................................................................. 37
 Traitement intra-mammaire ............................................................................. 37
 Traitement par voie générale ........................................................................... 37
7.2. Mammites subcliniques .......................................................................................... 37
5
CHAPITRE III : LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES ..................................... 40
1. LES ANTIBIOTIQUES .................................................................................................. 40
2. LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES................................................................ 40
2.1. La résistance naturelle ............................................................................................... 40
2.2. La résistance acquise ................................................................................................. 41
2.3. Les mécanismes de résistance ................................................................................... 42
3. L’ANTIBIOGRAMME .................................................................................................. 44
3.1. Définition ................................................................................................................... 44
3.2. Le but de l’antibiogramme ........................................................................................ 44
3.3. Principe ..................................................................................................................... 44
4. LES TECHNIQUES D’ANTIBIOGRAMME .............................................................. 44
4.1. Techniques classiques .............................................................................................. 44
 Méthodes de dilution ............................................................................................... 44
 En milieu liquide ..................................................................................................... 45
5. CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE(CMI) .......................................... 45
 En milieu solide……………………………………………………………….……..45
 Méthodes de diffusion (Antibiogramme standard) ................................................ 46
6. AUTRES TECHNIQUES .............................................................................................. 48
6.1. Techniques en milieu liquide .................................................................................... 48
6.2. Le système ATB VET .............................................................................................. 48
6.3. Technique en milieu gélosé : le Etest® .................................................................... 50
6.3.1. Principe de l’Etest® ...................................................................................... 50
CHAPITRE IV : LES HUILES ESSENTIELLES ......................................................... 53
1. DEFINITION................................................................................................................... 53
2. LES ACTIVITES BIOLOGIQUES DES HUILES ESSENTIELLES ....................... 53
3. LES ACTIVITES ANTIBACTERIENNES DES HUILES ESSENTIELLES……..54
4. METHODES D’EXTRACTION .................................................................................. 55
4.1. Enfleurage et macération......................................................................................... 55
4.2. Expression ............................................................................................................... 55
4.3. Distillation (Hydrodistillation ................................................................................. 55
4.4. L'entraînement à la vapeur sèche ............................................................................ 55
4.5. Extraction aux solvants volatils ............................................................................. 56
4.6. L'extraction au CO2 supercription .......................................................................... 56
5. LA COMPOSITION DES HUILES ESSENTIELLES ............................................... 56
5.1. Composition chimique .......................................................................................... 56
6
CHAPITRE IV : LE MIEL ................................................................................................ 59
1. COMPOSITION DU MIEL ........................................................................................... 59
1.1. Eau ............................................................................................................................. 60
1.2. Glucides ..................................................................................................................... 60
1.3. 5-hydroxy-2-méthylfurfural (HMF ........................................................................... 61
1.4. Acides ........................................................................................................................ 61
1.5. Protides ...................................................................................................................... 61
1.6. Sels minéraux ............................................................................................................ 61
1.7. Vitamines .................................................................................................................. 62
1.8. Enzymes .................................................................................................................... 62
1.9. Colloïdes .................................................................................................................... 62
2. SUBSTANCES AROMATIQUES ET COMPOSES PHENOLIQUES ..................... 63
3. PARAMETRES PHYSIQUES ...................................................................................... 64
3.1. Coloration ................................................................................................................. 64
3.2. Turbidité ................................................................................................................... 64
3.3. Consistance ............................................................................................................... 64
3.4. Saveur ....................................................................................................................... 64
3.5. PH ............................................................................................................................. 64
4. PROPRIETES DU MIEL ............................................................................................... 65
4.1. Propriétés thérapeutiques........................................................................................... 65
5. LE MIEL COMME UN AGENT ANTIBACTERIEN ................................................ 65
5.1. L’acidité .................................................................................................................... 65
5.2. Hydrogène pyroxide ................................................................................................. 66
6. VARIATION DE L'EFFET ANTIBACTERIEN ....................................................... 66
PARTIE EXPERIMENTALE
MATERIELS ET METHODES ........................................................................................ 69
RESULTATS ....................................................................................................................... 82
DISCUSSION ..................................................................................................................... 92
CONCLUSION ET RECOMMANDATIONS…………………………………………..100
ANNEXE …………………………………………………………………………………..103
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES………………………………………………..106
7
TABLE DES ILLUSTRATIONS
LISTE DES FIGURES
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE :
Figure n°01: Diagramme illustrant le phénomene de l'explosion respiratoire au cours d'une
mammite ....................................................................................................................................... 22
Figure n°02 : les mécanismes de destruction des bactéries par les protéines et les peptides
antimicrobiens (PPA) des PMN .................................................................................................. 23
Figure N°03 : Les différents modes d’acquisition des gènes de résistance (R) aux antibiotiques
chez les bactéries ......................................................................................................................... 42
Figure n°04 : L’efflux, la destruction et la modification des antibiotiques comme modes de
résistance ..................................................................................................................................... 43
Figure n°05 : Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide ...................................... 45
Figure n°06 : Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé ....................................... 46
Figure n°07 : Illustration d’un antibiogramme standard ............................................................. 48
Figure n°08 : Illustration de système ATB VET ........................................................................ 49
Figure n°09 : Illustration d’un E-test .......................................................................................... 50
PARTIE EXPERIMENTALE
Figure n°01 : les différentes régions d’étude .............................................................................. 69
Figure n°02 : Photo de la plante « Thymus fontanesii ............................................................... 77
Figure n°03 : Montage de hydrodistillation ................................................................................ 78
Figure n°04 : Illustration d’un appareil de l’hydrodistilation ..................................................... 78
Figure n°05 : Les taux de CMT (positif et négatif ...................................................................... 82
Figure n°06 : prévalences des champignons ............................................................................... 85
Figure n°07 : Figure du Pourcentage de l'antibiorésistance de souches bactériennes isolées des
mammites sub cliniques des chèvres ............................................................................................ 88
8
LISTE DES TABLEAUX
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau n° 01 : Grille de notation du CMT ............................................................................... 36
PARTIE EXPERIMENTALE
Tableau n° 01: La relation entre le CMT de lait de chèvre et la culture bactériologique ........... 83
Tableau n° 02 : Tableaux de Chi2 (Etude statistique). ............................................................. 83
Tableau n° 03: Prévalence et étiologie des mammites sub-cliniques des chèvres ...................... 84
Tableau n°04 a. La sensibilité des E coli, Enterobacter sp et Corynébacterium isolées des
mammites sub cliniques des chèvres aux antibiotiques ............................................................ 86
Tableau n°04 b: Sensibilité de Streptococcus aureus et Bacillus sp et SNC isolées des mammites
sub-cliniques des chèvres aux antibiotiques................................................................................. 87
Tableau n°04 c: Sensibilité de Micrococcus spp et Klebsielle spp isolées des mammites subcliniques des chèvres aux antibiotiques ....................................................................................... 87
Tableau n°04 d: Sensibilité de Streptococcus D et Pseudomonas aeruginosa isolées des mammites
sub-cliniques des chèvres aux antibiotiques................................................................................. 88
Tableau n°05 : La CMI déterminée par l'huile de Thum des souches qui ont une CMI la plus élevée
de miel .......................................................................................................................................... 90
9
LISTE DES ABREVIATIONS
cel/mL : cellules par millilitre
CNS : coagulase negative Staphylococcus (Staphylococcus à coagulase négative)
Ig: immunoglobuline
IL : interleukine
v/v : volume / volume
PMN : polymorphonucléaire neutrophile
PA : plasminogen activator (activateur de plasminogène)
CMI: concentration minimale inhibitrice.
CMB : Concentration minimale bactéricide.
DF: Degré de liberté
P: prévalence
HE : Huile essentielle
10
Résumé
Les mammites constituent une entité pathologique très importante, car, elles entrainent
des pertes économiques lourdes ainsi que des risques sur la santé humaine étand donné que le
lait peut étre une source d’antibiorésistance.
L’étude des mammites sub-cliniques des chèvres locales de Tiaret a révélée un pourcentage
de 33.9% par la méthode de CMT (Californian Mastitis Test).
Dans notre recherche, la bactériologie a montré que les Staphylocoques à coagulase négative
et les entérobactéries, étaient la majorité des bactéries isolées avec une prévalence respective
de 15,54% et 54,02%. Les Staphylococcus aureus, Bacillus spp, Corynébactérium spp,
Pseudomonas aeruginosa sont aussi isolés.
Des différentes souches bactériennes isolées des mammites sub -cliniques de la chèvre ont
subi des tests de sensibilité aux antibiotiques ; les entérobactéries et les Staphylococcus spp
sont résistants à la pénicilline ; D’autre part les Staphylocoques sp sont sensibles aux
Tétracycline, Erythromycine, Ampicilline.
La réponse des Staphylococcus spp aux antibiotiques est différente et cela est dû aux
différentes espèces des Staphylocoques. Par contre S. aureus sont sensibles à tous les
antibiotiques testés.
Le traitement alternatif par le miel in vitro a montré une CMB qui varie de 11-14% contre
tous les germes isolés des mammites sub- cliniques.
Le deuxième traitement par l’huile de thymus fontanesii sur les bactéries qui ont une CMI la
plus élevée dans le traitement de miel in vitro a donnée une CMI qui varie entre 1/3001/100%.
11
Summary
Mastitis are considered a major phatology since they are causing wide lose factor in the
economic point of view and can be risks on humain health. Knowing that, milk might not
response to different antibiotics.
The study on sub-clinical mastitis of goats of T iaret area revealed a 33.9 % percentage by the
method of CMT (Californian Mastitis Test).
In our research, bacteriology showed that Staphylococci in coagulase negative and
entérobactéries were the majority of the bacteria isolated with a respective prevalence of
15.54 % and 54.02 %.The Staphylococcus
aureus,
Bacillus spp,
Corynébactérium,
Pseudomonas aeruginosa are also isolated.
Various isolated bacterial strains from the sub clinical mastitis of goat underwent tests of
sensitivity in antibiotics; entérobactéries and Staphylococcus spp are resistant to the penicillin;
on the other hand Staphylococci sp are sensitive in Tetracycline, Erythromycin, Ampicillin.
The response of Staphylococcus spp to antibiotics differs according t to the different kinds of
Staphylococci. On the contrary S. aureus is sensitive to all tested antibiotics.
The alternative treatment by honey in vitro showed CMB which varies 11-14 % against all
germs isolated from the sub- clinical mastitis.
The second treatment by thymus fontanesii oil on bacteria which have the highest CMI of
honey in vitro has revealed CMI which varies between 1/300-1/100 %
12
‫ملخَــــــــص‬
‫يعتبر َااللتهابات َالضرع َمرض َبالغ َاالهمية َمن َحيث َما َيترتب َعنه َمن َخسائر َمن َالناحيةَ‬
‫االقتصاديةَوَكذلكَالشأنَمنَحيث َاالخطارَعلىَصحةَاالنسان‪َ.‬كماَتجدرَاالشارةَانَالحليب َمصدرَ‬
‫لعدمَاالستجابةََلمختلقفَالمضاداتَالحيوية‪.‬‬
‫كشفت َالدراسة َعلى َالتهاب َالضرع َ َتحت َالسريري َللماعز َفي َمن َمنطقة َتيارت َنسبةََ‬
‫‪َ%33.9‬منَاالصابةََحسبََكتشفَاختبارَالضرعَالكاليفــــــــورني‪َ .‬‬
‫فيَبحثنا َهذ‪َ،‬أظهرتَالدراسةَالبكتيريةَأنَالنوعَالبكتيري َستافيلوكوكسَكواجيالزَسلبيَوَ‬
‫االنتروبكتيري َ َكانت َاألغلبية َفي َمجموع َالبكتيرية َالمعزولة َبنسب َتتراوح َبين َ‪َ 15.54‬بالمئة َالىَ‬
‫‪َ 54.02‬بالمئة‪َ .‬البكتيريــــــا َستافيلوكوكس َأوريوس َ‪َ ،‬باسيلوس‪َ ،‬كوريني َباكتيريوم َ َبسودوموناسََ‬
‫أيروجينوزاَكانتَأيضاَموجـــــــودة‪َ .‬‬
‫مختلفَالعيناتَمنَالبكتيريةَالمعزولةَمنَالتهابَالضرعَتحتَالسريريَللماعزَتلقتَإختباراتَ‬
‫للتحسس َتجاه َالمضادات َالحيوية‪َ .‬االنتروبكتيري َ َاالنتروبكتيري َ َو َستافيلوكوكس َكانت َمقاومةَ‬
‫للبنيسيلينَبينماَأظهرتََتيتراميسينَوَإيريتروميسينَفاعليةَضدَنوعَستافيلوكوكس‪َ .‬‬
‫إستعمالَالعسلَكعالجَبديلَأظهرَنسبَتركيزَمثبطَللبكتيرياَتتراوحَبينََ‪َ،%11%- 14‬بينماَاستعمالَ‬
‫مستخلصَزيتَالزعترَ(َنوعَالقنتنيزيا)َعلىَالبكتيرياَاألقلَاستجابةَللعالجَبالعسلَأظهرَنسبَتركيزَ‬
‫تتراوحَبينَ‪َ300/1‬الىَ‪َ .100/1‬‬
‫‪13‬‬
INTRODUCTION
14
En Algérie, l’élevage caprin fait partie des projets de développement du territoire,
notamment en milieu rural, en raison de son adaptation aux milieux difficiles, est pratiqué
surtout dans les zones montagneuses, les steppes et les oasis. Le lait de chèvre, par sa valeur
nutritionnelle et son aptitude à la transformation notamment en fromage de qualité, est très
recherché (Park, 2012). Quand à la viande caprine, elle véhicule l’image d’un produit
biologique et constitue une source de protéines animales mais aussi des revenu pour les
populations rurales surtout dans les pays en voix de développement (Escareno et al ; 2013).
Dans notre pays, l’élevage caprin est présent dans toutes les zones ; au nord il est
cantonné aux zones montagneuses, mais le gros de l’effectif est reparti dans les zones
steppiques et subdésertiques. Le cheptel caprin a atteint en 2012 un effectif de 4544000 têtes
et occupe la troisième place après l’ovin et le bovin (FAO, 2012).
En effet, dans la plupart des pays, les mammites constituent une entité pathologique
préoccupante. Bien que la production laitière a connu une évolution spectaculaire durant la
dernière décennie, et malgré cet effort remarquable, l’Algérie demeure en de ça de se suffire
en lait, En plus il reste à assurer la qualité hygiénique du lait qui est elle- même tributaire de
l’état sanitaire de la glande mammaire.
Dans le monde, les recherches sur les mammites bovines ont pris une part importante
contrairement aux petits ruminants. Cette tendance pourrait s’expliquer par des considérations
économiques. Néanmoins dans certains pays, de multiples recherches se sont orientées dans
ce sens. A titre d’exemple ; au Maroc, les mammites sub- cliniques ont touché 25,59% du
cheptel (Zardoune, 1992) ; 11,7% à Damas (Gokhan Dogruer, 2010) ; 76,7% en Tanzanie
(Nbilu, 2007) ; 80,7% en Italie (Moroni ; 2005).
Ces mammites entrainent des pertes
économiques (lait jeté, traitement
antibiotiques…..) ainsi que des risques sur la santé humaine étant donné que le lait peut être
une source d’antibiorésistance.
L’utilisation d’antibiotique nécessitant de langue période de traitement ou à large
spectre d’action est un facteur de risque pour la propagation des résistances. (Saribas et al
2010, pal et al 2010). La dissémination des gènes de résistances aux antibiotiques peut
s’effectuer au sein d’une même espèce mais aussi d’une espèce à l’autre (Oliver et Murinda,
2012).
15
Pour faire face à ce problème, les recherches se multiplient dans le monde entier et
s’attachent à mieux connaitre les effets thérapeutiques des traitements alternatifs tels que les
produits de la ruche (Hegazi, 2011), extrait de plantes, les huiles essentielles (Chamaud,
2010 ; Tohidpour, 2010).
C’est dans cette perspective, que s’inscrit notre étude qui a pour objectifs de :

Connaitre la prévalence et l’étiologie des mammites sub-cliniques afin de contribuer
à la mise en place d’une banque d’information dans ce domaine et aussi de participer
aux choix des programmes de maitrise de la pathologie mammaire et d’éviter
d’éventuelles contaminations humaines.

Etudier la sensibilité des souches isolées des mammites sub-cliniques caprines aux
antibiotiques testés.

Evaluer l’action du miel et de l’huile de Thymus fontanesii in vitro sur les germes
impliqués dans les mammites comme un traitement alternatif.
16
17
CHAPITRE I
18
CHAPITRE I :
ANATOMIE DE LA MAMELLE
La mamelle de chèvre est située en région inguinale. Elle est constituée de deux
quartiers indépendants. Sa forme générale est globuleuse, mais il existe de grandes variations
individuelles de conformation. Les quartiers sont séparés par un sillon intermédiaire large.
Les trayons sont orientés cranio-ventralement (BARONE, 2001).
Chacune des deux glandes mammaires est organisée en trois parties :
• Une partie supérieure constituée principalement de cellules sécrétrices organisées en
alvéoles (unités sécrétrices) qui s’assemblent en lobules, euxmêmes regroupés en lobes ;
• Une partie intermédiaire comprenant les canaux galactophores ;
• Une partie basse dans laquelle se connectent les canaux pour former la citerne ou sinus
lactifère qui se prolonge dans le trayon et s’ouvre sur l’extérieur par le conduit papillaire dont
l’étanchéité est assurée par un sphincter.
MECANISMES DE DEFENSE ET REPONSES INFLAMMATOIRES DE
LA GLANDE MAMMAIRE.
La mamelle dispose de plusieurs systèmes de protection vis-à-vis des agents pathogènes
pénétrant par le canal du trayon ou par voie hématogène:
1. DEFENSE PASSIVE (anatomique) :
Grâce au canal du trayon, la voie d'accès possible pour les agents pathogène. Pour le
franchir, l'agent pathogène devra traverser plusieurs barrières:
1.1 Sphincter musculaire:
Maintient le trayon étanchement fermé et empêche la pénétration des bactéries.
1.2 Canal du trayon:
Tapissé de cellules squameuses formant un épithélium stratifié recouvert de kératine. La
kératine emprisonne les bactéries et empêche leur migration vers le pis en plus de favoriser
l'expulsion des bactéries à la traite. Les substances bactériostatiques contenues dans la
kératine sont: L'acide myristique, acide gras estérifiés et non estérifiés, acide palmitoléique et
linoléique et les protéines cationiques qui forment des liens électrostatiques avec les agents
19
pathogènes, ce qui modifient la membrane bactérienne et diminuent sa résistance aux
différences de pression osmotique. (Paape et Capeco, 1997).
1.3. Rosette de Fürstenberg:
Repliement muqueux, situé à l'extrémité supérieure interne du canal du trayon. Il sert de
point d'entrée majeur des leucocytes vers la glande. Ainsi, la concentration des leucocytes est
très élevée dans le trayon (Lacasse, 2003).
20
2. LA DEFENSE CELLULAIRE
Les cellules somatiques du lait sont constituées de différents types cellulaires qui sont en
très grande majorité des leucocytes, et notamment des granulocytes neutrophiles, des
macrophages et des lymphocytes. Après que les bactéries ont pénétré le canal de trayon, les
cellules résidentes et les cellules nouvellement recrutées dans la mamelle vont jouer un rôle
pivot dans le contrôle de l’infection. Les bactéries agissent sur le recrutement des leucocytes
directement ou indirectement par l’intermédiaire de facteurs chimiotactiques, tels que les
entérotoxines ou les composés de la paroi bactérienne. Si les bactéries sont capables de
résister à la première réponse leucocytaire, alors l’inflammation de la glande mammaire
continue avec la migration des cellules somatiques à travers les cellules épithéliales
sécrétrices. Différentes études ont montré que la sévérité et la persistance d’une mammite sont
liées à la rapidité de la réponse migratoire des leucocytes et à l’activité bactéricide des cellules
sur le site de l’infection (Sordillo et al., 1997 ; Wellnitz et Brukmaier, 2012 ; Georgios et al.,
2013).
2.1 Les polymorphonucléaires neutrophiles
Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMN) constituent la première ligne de
défense contre les pathogènes, après leur pénétration dans la mamelle, en les ingérant et en les
détruisant par phagocytose. Dans le lait d’un quartier non infecté, les PMN représentent 3 à 25
% des cellules somatiques ; en cas d’infection, ils deviennent majoritaires et peuvent dépasser
90 % (Sordillo et al., 1997 ; Paape et al., 2003 ; Chiang et al., 2010).
2. 1.1. Rôle des PMN sur le site de l’infection
Les PMN constituent une des premières lignes de défense contre les agents
pathogènes. Le PMN joue notamment un rôle critique dans la défense de l’organisme contre
les infections bactériennes et fongiques. Le PMN pourrait également jouer un rôle protecteur
dans certaines infections virales. Les propriétés antivirales des défensines expliquent peut être
l’activité virulicide des PMN (Paape et al., 2003). Les étapes conduisant à la destruction des
bactéries par les PMN sont très souvent imbriquées. Ces étapes font intervenir l’adhérence du
PMN à la cellule endothéliale, le déplacement vers le site infectieux, le contact avec la
21
bactérie suivie de phagocytose ou de bactéricidie par des mécanismes dépendants ou
indépendants de l’oxygène (Gougerot-Pocidalo, 2002).
Sur le site de l’infection, le rôle des PMN est de phagocyter et de tuer les bactéries
pathogènes. L’aptitude à la phagocytose des PMN du sang est augmentée par la mise en
présence avec l’interféron-γ, le facteur α de nécrose des tumeurs (TNF- α) et l’interleukine-1
α (Semnani et al., 1993).
FIGURE N° 01: Diagramme illustrant le phénomène de la flambée respiratoire au cours
d'une mammite
22
FIGURE N° 02 : les mécanismes de destruction des bactéries par les protéines et les
peptides antimicrobiens (PPA) des PMN (Levy, 2004).
1° : dégranulation des neutrophiles dans le phagolysosome
2° : dégranulation des neutrophiles dans l’espace extracellulaire ainsi que dans le
phagolysosome
A : Action extracellulaire des PPA.
B : Clivage et libération des PPA.
C : Attaque synergétique des PPA tel que BPI, défensines sur la membrane bactérienne.
D : Réduction du la NADPH, passage des ions K+, de l’élastase et de la Cathepsine G à
travers la membrane du phagolysosome causant l’attaque protéolytique de la cible
bactérienne.
BPI: Bactericidal permeability increasing protein.
23
Le principal mécanisme de destruction des bactéries est oxygène dépendant via le
phénomène de "la flambée respiratoire" ou " Resperatory Burst " (augmentation du
métabolisme oxydatif), qui produit les radicaux libres. Après leur ingestion, les bactéries sont
tuées par l’action des anions superoxyde (O2.-) et du peroxyde d’hydrogène (H2O2). (Sordillo
et al., 1997; Dosogne et al., 2001 ; Wellntz et Bruckmaier, 2012).
2. 2. Rôle des macrophages dans le lait
Les macrophages jouent un rôle dans les défenses non spécifiques précoces par la
phagocytose en ingérant des bactéries et des débris cellulaires. La destruction des
microorganismes par la libération des radicaux oxygénés libres est probablement minoritaire,
du fait de la faible pression en oxygène du lait. D’autres mécanismes pourraient intervenir, la
simple adhésion des germes aux macrophages déclenchant la sécrétion d’un grand nombre de
composés (Lagrange, 1987).
La phagocytose par les macrophages sensibilisés du lait peut être augmentée par la
présence d’anticorps opsonisants spécifiques des pathogènes. Comme les neutrophiles,
l’ingestion de globules gras et de caséines diminue l’aptitude à la phagocytose par rapport aux
cellules du sang. Les activités phagocytaires et bactéricides sont particulièrement diminuées
lors de la période entourant la mise bas (Sordillo et al., 1997 ; Burvenich et al., 2007).
2. 3. Les lymphocytes
Les cellules B et les cellules T sont les deux principaux types de lymphocytes capables
de reconnaître les antigènes grâce à des récepteurs membranaires spécifiques. Dans le lait des
quartiers non infectés, les lymphocytes constituent 10 à 25 % des cellules somatiques. Un
déficit des lymphocytes B serait observé dans le sang des ruminants avec une mammite
(Paape et al., 1991).
3. LES DEFENSES SOLUBLES:
Les réponses immunitaires innées et acquises produisent des facteurs solubles
importants dans la défense de la glande mammaire. (Lacasse, 2003)
3.1. Facteurs non spécifiques:
La glande mammaire possède plusieurs facteurs bactériostatiques qui fonctionnent
avec ou indépendamment des immunoglobulines.
24
3.2. La lactoferrine:
Est la principale protéine du colostrum maternel. Sa concentration augmente pendant
la période sèche et pendant une mammite. Cette dernière a un rôle antibactérien et antiinflammatoire.
L'effet le plus connu de la lactoferrine est d'immobiliser le fer, élément essentiel à la
croissance microbienne. Le fer est donc peu disponible et la croissance bactérienne dans le lait
est ralentie. Au départ, le caractère antimicrobien de la lactoferrine était attribué
exclusivement à sa capacité d'immobiliser le fer. (Spik, 2004).
Toutefois un fragment de la lactoferrine, qui ne peut à lui seul s'attacher au fer, s'est
récemment avéré être un antimicrobien plus puissant (de 10-100 fois) que la lactoferrine ellemême. Ce peptide, appelé lactoferricine, est produit naturellement dans le système digestif des
mammifères lors de la digestion de la lactoferrine du lait.(Fetherson et al., 2001).
3.3. Le complément:
Est une série de protéines présentes dans le sang et le lait pouvant affecter les
immunités innée et acquise. Les protéines du complément sont principalement synthétisées
par les cellules du foie, mais d'autres sources existent (macrophages). Le complément
fonctionne comme une cascade enzymatique menant ultimement à des destructions de la
cellule ou du pathogène. Le complément fonctionne aussi de concert avec les
immunoglobulines afin d'opsoniser un pathogène et promouvoir sa phagocytose. La
concentration du complément est relativement faible pendant la lactation mais est plus élevée
dans le colostrum et les sécrétions mammaires pendant la période sèche. (Lacasse, 2003).
3.4. Le lysozyme:
Est une proteine bactéricide pouvant clivéele peptidoglycane de la membrane des
bactéries gram-négatif. (Larpent, 1996).
3.5. L'enzyme lactoperoxidase:
En présence de thiocyanate et de peroxyde d'hydrogéne, produit de l'hypothiocynate,
un radical libre bactériostatique pour les bactéries gram + et bactéricide pour les bactéries
gram -. Le thiocynate provient de l'alimentation de la femelle alors que le pyroxyde est généré
par certains enzymes et, si présent, par certains streptocoques (Lacasse, 2003).
25
4. IMMUNITE HUMORALE:
Les anticorps sont secrétés en réponse à une infection. Ils sont présents dans le sérum
et dans le lait à des concentrations variables selon le statut physiologique de la glande
mammaire. Sur le plan physiologique, la concentration des immunoglobulines dans le lait
diminue dés la deuxième semaine de la lactation (<1mg/ml), atteint un minimum en milieu de
lactation (<0.5mg/ml) puis augmente à nouveau en fin de lactation. En cours d'infection, on
assiste à une augmentation relative du taux d'anticorps spécifiques des germes surtout
présentées par des IgG et des IgA (Lacasse, 2003).
26
CHAPITRE II
27
LES MAMMITES
1. CLASSIFICATION DES MAMMITES:
On distingue deux catégories de mammites:
1.1. Mammites cliniques:
Il s'agit d'inflammations visibles de la mamelle. Elles sont caractérisées par des
symptômes directement observables lors de l'examen du quartier: douleur, induration, chaleur,
aspect du lait modifié. Des signes généraux peuvent également être présents, notamment sous
forme de syndrome fébrile. Le mode d'évolution peut être suraigu (aboutissant fréquemment à
la mort de l'animal), aigu, ou chronique.
1.2.Mammites sub-cliniques:
Ce sont des inflammations inapparentes de la mamelle. Elles se traduisent par des
modifications de la composition du lait et par une baisse de production.
2.
ETIOLOGIE DES MAMMITES CAPRINES:
Les mammites de la chèvre sont principalement d'origine bactérienne. En plus de l'implication
des mycoplasmes et des virus.(Doğruer et al., 2010; Geberwahid et al., 2012; Islam et al.,
2011 ).
2.1.1. Les pathogènes majeurs: sont potentiellement à l'origine de mammites cliniques:
Staphylococcus aureus est le plus fréquent. On trouve également des mycoplasmes ( M
agalactiae, M mycoides ……), Corynebacterium pseudotuberculosis, Arcanobacterium
pyogenes, Streptococcus, Brucella, Pseudomenas, Pasteurella, Aspergillus, Nocardia
asteroides, Escherichia coli, Pseudomenas aeruginosa.
28
2.1.2. Les pathogènes mineurs: ne provoquent de mammites cliniques que exceptionnelle: il
s'agit principalement des staphylocoques à coagulase négative( SNC), mais cette
classification est plus en plus considérée comme des pathogènes majeurs (Maisi et
Riipinen, 1991; Contreras et al., 1995; Bergonier et al., 1997; Contreras et al., 2003;
Bergonier et al., 2003).
2.2. Etiologie des mammites cliniques:
Les agents pathogènes impliqués dans les mammites cliniques n'ont pas tous le même
impact à l'échelle du troupeau. On distingue deux cas de figures:
2.2.1. Cas de mammites sporadiques: Staphylococcus aureus est l'agent le plus
fréquemment isolé, puis on trouve les staphylocoques à coagulase négative (SNC), les
streptocoques, les entérobactéries, Arcanobacterium pyogenes, les corynébactéries, les
pasteurelles (Manheymmia haemolytica), Pseudomenas spp; Nocardia asteroides …
2.2.2. .Cas de mammites enzootiques ou épizootiques: La majorité sont due au S.aureus,
puis des streptocoques (S.uderis, S.agalactiae, S.suis) ou des germesopportunistes tels
que Aspergillus fumigatus et Pseudomonas aeruginosa, et plus rarement Serratia
marcescens. Les mycoplasmes font également partie des pathogènes majeurs (M.
capricolum, M.mycoides, M.putrefaciens, M. agalctiae): ils sont responsables de
l'agalxie contagieuse.
Il existe de plus des mammites virales dues au lentivirus du CAEV (Virus de l'Arthrite
Encéphalite Caprine) (Maisi et Riipinen, 1991; Le Guillou, 1993; Bassam et Hasso, 1997;
Contreras et al., 2003; Bergonier et al., 2003).
2.3. Etiologie des mammites sub-cliniques:
Les agents pathogènes les plus isolés lors des mammites sub-cliniques sont les SNC.
Les principales espèces sont:S. caprea, S epidermidis, S.xylosus, S. chromogenes et S.
stimulans. En deuxiéme position, on trouve S. aureus. Les streptocoques et les entérobactéries
sont les plus rares (Bergonier et al., 1997; White et Hincley , 1999; Contreras et al., 2003 ;
Islam et al., 2011 ; Geberwahid et al., 2012).
29
3.
LA PREVALENCE:
La prévalence des mammites subcliniques est très variable d'un troupeau à autre ou
d'une région à l'autre. En se basant sur le diagnostic bactériologique, la proportion de chèvres
infectées peut aller de 22%-62% (Bergonier et al., 1997; Menzies, 2001; Bergonier et al.,
2003)
Bochev et Russenova, 2005 ; ont trouvé sur un effectif de 478 chèvres de la Bulgarie
(80,2% ; 19,8%) des prélevements SNC et staphylocoque aureus respectivement.
En Espagne, une étude présentée par (Contreras et al., 1995) montre que la majorité des SNC
isolés sont S. caprea, 22% ; S. epidermidis, 20%)
Les mammites subcliniques causées par SNC (S. caprea ; S. epidermidis) rapporté par
(Moroni et al., 2005) avec un taux de (43%, 48%) respectivement dans deux élevages caprins
en Italie est comparable à celle de (Bergonier et al., 2003 ) avec des dommages provoqués au
niveau des tissus de la glandes mammaires.
S.aureus cause les mammites non seulement subcliniques mais aussi cliniques et
gongréneuses avec d’autres agents bactériens (Escherichia coli, Clostridium perferengens,
Streptococcus, Pseudomenas et Nocardia genera) rapporté par (Bergonier et al., 2003 ).
Selon (C.Lerondelle et B. Poutrel, 1984 ; les plus part des infections des mammites
subcliniques sont d’origine S. aureus 75% et SNC, 24,1% ( Doğruer et al., 2010; Geberwahid
et al., 2012;; Islam et al., 2011 ) ont confirmé cette étiologie.
4.
CLASSIFICATION DES MAMMITES SELON LES AGENTS PATHOGENES
4.1. Mammites staphylococciques:
4.1.1. Staphylococcus aureus:
S. aureus est le principal agent responsable de mammites cliniques chez la chèvre. Il
se manifeste souvent d'une simple mammite avec grumeaux dans le lait et parfois sous la
forme d'une mammite gongréneuse qui apparaît au cours de la lactation. L'évolution a lieu de
manière aigue ou suraiguë. L'animal peut mourir. (Devillechaise, 1996; Matthews, 1999).
30
4.1.2. Staphylocoques à Coagulase Négative:
Les SNC sont la plus part du temps à l'origine de mammites subcliniques, mais ils
peuvent néanmoins s'exprimer de manière clinique.
La mammite peut évoluer vers la
chronicité. (Contreras, 2003 ; Beheshti et al., 2010).
4.2. Mammites à mycoplasmes:
Chez la chèvre, plusieurs espèces de mycoplasmes peuvent provoquer des mammites.
La contamination se fait par voie digestive, puis, après quelques mois d'incubation, la
dissémination vers de multiples organes cibles se fait par septicémie (Contreras, 2003).
4.3. Mammites à corynébactéries:
Les corynébacteries sont des pathogènes mineurs qui provoquent rarement des
mammites cliniques. Ils peuvent entraîner l'abcédation des nœuds lymphatiques
rétromammaires, mais ils sont rarement à l'origine d'une vraie mammite (Hirsh et al., 2004).
4.4. Mammites à bacilles gram négatifs:
Chez la chèvre, les bacilles gram négatifs responsables de mammites sont
principalement Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa. Les mammites provoquées sont
aigues et sévères.
4.5. Autres germes:
D'autres
germes
comme
Streptococcus,
Brucella,
Pseudomonas,
Pasteurella,
Aspergillus, Nocardia astreoides,…peuvent être à l'origine des mammites. L'analyse
bactériologique est un recours très important. (Contreras, 2003)
4.6. Virus de l'arthrite encéphalite caprine: CAEV.
Le CAEV est un lentivirus responsable d'un syndrome très polymorphe. Les formes
cliniques de la maladie sont très variées (nerveuse, articulaire, pulmonaire, et mammaire)
cette dernière peut prendre deux formes:

Mammite chronique évolutive, unilatérale le plus souvent.

Mammite aigue ou "pis de bois". La mamelle devient dure puis s'atrophie
(Sanders, 1997).
31
4.7. Champignons:
Les mammites mycosiques sont rares, elles interviennent en début de lactation souvent
après un traitement antibiotique au tarissement mal conduit (injection septique). Les agents
responsables sont Candida albicans, Aspergillus fumigatus, Cryptococcus spp … (Blain et al.,
1996; Bergonier, 2003).
On assiste à des mammites cliniques avec des symptômes généraux marqués et une mamelle
volumineuse.
5.
PATHOGENIE
Le processus infectieux se déroule en trois temps :

Adhésion des germes à l’épithélium du sinus lactifère au moyen de leurs adhésines de
surface. Leur élimination par le flux de lait lors de la traite est ainsi limitée.

Prolifération des germes pathogènes et lésion des cellules épithéliales : on observe des
microvésicules et des ulcères diffus de l’épithélium des canaux lactifères.

Réponse inflammatoire : des polynucléaires neutrophiles et des protéines sériques
affluent vers l’épithélium puis vers la lumière des acini et des canaux.

La fibrine produite à ce stade est à l’origine des caillots ou des grumeaux observables
dans le lait (Paape et Capuco, 1997 ; Fetherson et al., 2001).
En fonction de l’efficacité de la réponse immunitaire, trois évolutions sont possibles :

Guérison suite à l’élimination totale des germes.

Extension de l’infection : la réaction inflammatoire s’étend à l’ensemble de la glande
ce qui aboutit à une mammite clinique.

Fluctuations : les germes persistent dans la mamelle et reprennent leur développement
après diminution de l’inflammation ce qui conduit à des formes subcliniques ou
chroniques (Paape et Capuco, 1997 ; Fetherson et al., 2001).
32
6. DIAGNOSTIC
6.1. DIAGNOSTIC CLINIQUE
6.1.1. Examen clinique de la mamelle
Après avoir réalisé l’examen général de l’animal, on effectue un examen minutieux de
la mamelle. Cet examen comprend une inspection à distance de la mamelle, une palpation
superficielle puis profonde (avec notamment une palpation des noeuds lymphatiques
rétromammaires) de la glande et des trayons. On réalise également un examen du lait en
trayant les premiers jets dans un bol à fond noir (Matthews, 1999 ; David et De Cremoux,
2000 ; Winkelmann, 2005).
L’examen clinique ne permet pas d’établir un diagnostic étiologique, cependant certains
agents sont responsables de signes cliniques spécifiques permettant d’orienter le diagnostic (la
confirmation nécessite une analyse bactériologique).
6.2. COMPTAGE DES CELLULES SOMATIQUES DU LAIT
6.2.1. Caractéristiques des cellules du lait
Le lait de chèvre contient des leucocytes ainsi que des particules cytoplasmiques dont
la production est liée au mode de sécrétion laitière apocrine. La taille de ces particules est
semblable à celle des cellules somatiques et elles peuvent contenir des fragments de noyaux
ou de l’ARN, ce qui peut amener à les comptabiliser comme des leucocytes. Il est donc
recommandé d’utiliser des techniques mettant en évidence l’ADN pour le comptage des
cellules somatiques (CCS). La concentration moyenne en particules cytoplasmiques est de
150 000 par ml (Bergonier et al., 2003). Parmi les leucocytes du lait, les plus nombreux sont
les polynucléaires neutrophiles (PNN).
On trouve également des macrophages et des lymphocytes. La proportion de PNN
dans un quartier sain est variable : elle peut aller de 45% en début de lactation, jusqu’à 7480% en fin de lactation. Le nombre total de cellules somatiques du lait de quartier sain est
beaucoup plus élevé chez la chèvre (jusqu’à 106 000 cellules/ml) que chez la brebis et la
vache (moins de 100 000 cellules/ml)
33
Le CCS peut donc être utilisé pour détecter l’inflammation, à condition de tenir
compte de sa variabilité pour l’interpréter (De Cremoux, 1995 ; Menzies et Ramanoon, 2001 ;
Bergonier et al., 2003).
6.2.2. Utilisation du CCS dans le diagnostic des mammites.
Les modalités d’utilisation du CCS pour le diagnostic des mammites sont très
discutées. Au niveau individuel, deux approches sont proposées pour déterminer le statut d’un
quartier :

Utilisation de seuils ponctuels permettant de définir deux ou trois catégories suite à
une mesure de CCS:

Distinction entre quartier sain et quartier infecté au moyen d’un seuil unique allant de
500 000 à 1 million de cellules/ml (Kalogridouvassiliadou et al., 1992 ; Contreras et
al., 1996).

Distinction entre quartier sain, quartier infecté par un pathogène mineur et quartier
infecté par un pathogène majeur, avec deux seuils: 750 000 et 1750 000 cellules/ml
(De Cremoux, 1995).

Utilisation de seuils dynamiques : on calcule la moyenne géométrique des 6 dernières
valeurs de CCS (dans le cas où le troupeau est soumis à un contrôle laitier par mois),
et on compare cette valeur avec le seuil établi préalablement (l’effet « stade de
lactation » est ainsi pris en compte). Une autre possibilité est de considérer comme
infecté un quartier dont le CCS dépasse deux (ou trois) fois le seuil fixé sur six
mesures successives (De Cremoux, 1995 ; Menzies et Ramanoon, 2001 ; Bergonier et
al, 2003).
Il est également possible de se baser sur l’écart entre les CCS des deux quartiers d’une
même chèvre, ce qui permet de supprimer l’influence des facteurs de variation non
inflammatoires.
À l’échelle du troupeau, le CCS du lait de mélange permet d’évaluer l’état sanitaire
global des mamelles. Cela intervient dans l’établissement d’un diagnostic épidémiologique,
préalable indispensable à la mise en place d’un plan de lutte contre les mammites. Le CCS du
lait de mélange est corrélé positivement à la proportion d’infections intramammaires, mais il
faut également tenir compte de nombreux facteurs ayant trait à la structure du troupeau :
34
proportion de primipares et de chèvre âgées, répartition saisonnière des mises bas
(Decremoux, 1995 ; Menzies et Ramanoon, 2001 ; Bergonier et al, 2003).
6.2.3. Méthodes de comptage des cellules somatiques
6.2.3.1. Méthodes directes

Comptage microscopique direct : Les cellules sont comptées au microscope optique
après étalement sur lame et coloration de l’ADN au pyronine Y - vert de méthyle
(Beronier et al ,2003).

« Coulter-counter » : Dénombrement des particules du lait en fonction de la taille. Le
lait subit d’abord une fixation chimique des cellules somatiques au formol puis une
dispersion des globules gras. Toutes les particules, avec ou sans noyau, de diamètre
supérieur ou égal à 4,4 micromètres sont dénombrables. Cette technique prend donc en
compte les particules cytoplasmiques, ce qui diminue sa fiabilité.

« Fossomatic » : Comptage électronique de noyaux cellulaires rendus fluorescents par
fixation de l’ADN cellulaire au bromure d’éthidium après centrifugation du lait.
Ce test a l’avantage de ne prendre en compte que les éléments nucléés. Le comptage peut
être différé de 2 ou 3 jours si les échantillons sont stockés à 4°C, après adjonction d’un
conservateur (bichromate de potassium par exemple). Il s’agit de la méthode de référence
pour le comptage des cellules somatiques du lait de chèvre (Rives, 1997 ; Bergonier et al.,
2003 ; Perrin et al., 1997).
6.2.3.2. Méthode indirecte : Californian Mastitis Test
Pour ce test on mélange du lait avec un détergent tensioactif (alkyl aryl-sulfate de sodium) qui
induit une lyse de la membrane cellulaire et la précipitation de l’ADN nucléaire : il se forme
alors un gel. Cette réaction est rendue facilement observable par l’ajout d’un colorant
(indicateur de pH : pourpre de bromocrésol). (David et al., 2000). Ce test est rapide, simple et
peu coûteux.
35
TABLEAU N°01 : Grille de notation du CMT (David et al., 2000)
Pas de précipité
0
Précipité trouble, qui disparaît
1
Léger gel persistant avec filaments grumeleux
2
Épaississement immédiat, gel de type "blanc d'oeuf",
3
se détachant du fond en filament lors des rotations du
plateau
Gel bombé, glissant en masse sur le fond du plateau lors
de ses rotations
4
Le CMT a une valeur prédictive négative supérieure à 75%, et une valeur prédictive
positive inférieure à 38% : il est donc plus fiable pour repérer les quartiers sains. Il existe une
corrélation positive (coefficient de corrélation allant de 0,4 à 0,8) entre les résultats de CMT
et ceux fournis par les méthodes directes de comptage cellulaire (Perrin et al., 1997).
En effectuant un regroupement des notes 0, 1 et 2 d’une part et 3 et 4 d’autre part, on
peut arriver à la discrimination d’un niveau de 750 000 cellules/ml avec une sensibilité de
87,6% et une spécificité de 92,7% (Perrin et al., 1997). L’interprétation du résultat est donc
moins évidente que chez la vache mais reste satisfaisante.
L’utilisation du CMT en élevage caprin constitue une bonne alternative au CCS,
notamment pour l’utilisation en routine dans les élevages, ainsi que dans les régions où
l’automate n’est pas disponible du fait de son coût élevé (Rives, 1997 ; David et al., 2000 ;
Perrin et al.,1997 ).
6.3. ANALYSE BACTERIOLOGIQUE
Après prélèvement de lait de manière aseptique, on réalise une culture pour isolement
et identification d’éventuelles bactéries. En cas de mammite, on obtient un seul type de
colonies bactériennes. Si deux types sont isolés, c’est soit qu’il y a une mammite, soit que le
prélèvement est contaminé.
36
C’est une méthode fiable, qui fournit un diagnostic de certitude, mais elle est coûteuse, longue
et nécessite une bonne technicité : elle n’est pas utilisable en routine à grande échelle. Par
contre, la bactériologie est incontournable en cas d’épizootie dans un élevage, afin de
déterminer le germe en cause et de mettre en place les mesures adaptées (on peut y associer
l’antibiogramme pour choisir au mieux l’antibiotique à utiliser) (Bergonier et al.,1997 ;
Corrales et al., 1997, Islam et al., 2011,Geberwahid et al., 2012).
7. TRAITEMENT
7.1. Mammites cliniques
Dans le cas d’une mammite aiguë ou suraiguë, l’objectif du traitement est de sauver
l’animal afin d’en permettre la réforme dans de bonnes conditions. Pour les mammites
subaiguës, la récupération fonctionnelle du quartier peut être obtenue mais ce n’est pas le cas
le plus fréquent. Le traitement se fait par voie locale et/ou générale :

Traitement intra-mammaire : notons tout d’abord que les préparations antibiotiques
intra-mammaires faisant l’objet d’une AMM (Autorisation de Mise sur le Marché)
pour les petits ruminants sont très rares. On utilise donc des produits pour bovins. De
plus, il n’existe pas d’essai contrôlé 38 pouvant montrer l’effet de ces antibiotiques en
termes de guérison clinique et bactériologique : seules des observations cliniques
témoignent de leur efficacité présumée.

Traitement par voie générale : il repose sur l’antibiothérapie. Des traites fréquentes
sont conseillées afin d’éliminer au maximum les germes présents dans le quartier.
Elles peuvent être précédées d’une injection d’ocytocine afin de favoriser l’éjection du
lait. En complément, on peut employer des anti-inflammatoires et mettre en place une
perfusion pour les cas graves (Bergonier et al., 1997 ; Matthews, 1999 ; Bergonier et
al., 2003).
7.2. Mammites sub-cliniques
Dans le cas des mammites sub-cliniques, le but est la guérison bactériologique du
quartier. Pour cela, on met en oeuvre un traitement antibiotique intramammaire au moment du
tarissement. Le taux de guérison bactériologique chez la chèvre est de 50 à 90% (Fox et al.,
1992 ; Matthews, 1999). Ce traitement permet également de prévenir les nouvelles infections.
37
La conséquence de cette pratique est qu’en diminuant l’incidence des mammites subcliniques,
on limite les baisses de production qui leur sont dues : ceci n’est pas négligeable pour
l’éleveur puisque les pertes en lait estimées sont de 7 à 17% chez les chèvres atteintes
(Baudry et al., 1997). Une alternative au traitement intra-mammaire serait l’administration
d’antibiotiques par voie intramusculaire lors du tarissement : cela permet d’éviter les
problèmes de contamination iatrogène des mamelles. De plus, l’injection intramusculaire est
bien mieux adaptée au traitement de grands effectifs. Cependant, on manque de protocoles
ayant fait l’objet d’essais contrôlés (Bergonier et al., 1997 ; Bergonier et al., 2003).
38
CHAPITRE III
39
LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES
1. LES ANTIBIOTIQUES
Les antibiotiques sont, par définition, « des produits microbiens, ou leurs dérivés,
capables de tuer les micro-organismes sensibles ou d’inhiber leur croissance » (Prescott et al.,
1995). Leur action étant spécifique et dirigée contre les micro-organismes, ils ne sont pas
toxiques pour les cellules eucaryotes.
Les antibiotiques sont majoritairement représentés par des molécules d’origine
naturelle et leurs dérivés. Ils peuvent aussi être d’origine synthétique ou semi-synthétique
(Newman et al., 2003 ; Singh et Barett, 2006). Les antibiotiques synthétiques sont obtenus,
soit à partir de dérivés totalement artificiels, soit en recréant des substances initialement
extraites de microorganismes.
Les antibiotiques semi-synthétiques sont issus de la modification, en laboratoire, de
substances produites par des micro-organismes.
2. LA RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES
2.1. La résistance naturelle
On parle de résistance naturelle lorsque toutes les souches d’une même espèce sont
résistantes à un antibiotique. L’expression d’un caractère inné, partagé par l’ensemble de la
communauté bactérienne, rend inappropriée l’utilisation de certains antibiotiques. Des
particularités structurales de la paroi cellulaire, empêchant les antibiotiques d’accéder à leur
cible, ou l’absence de cible sont autant de facteurs, qui conditionnent la résistance naturelle.
Les bactéries du genre Mycoplasma sp illustrent ce dernier exemple. Le composant principal
de la paroi des bactéries est le peptidoglycane, un réseau tridimensionnel d’acides aminés et
de chaînes polysaccharidiques, constituées de N-acétylglucosamine (NAG) et d’acide
N-acétylmuramique (NAM). Dépourvus de cet élément constitutif, les mycoplasmes
présentent une résistance intrinsèque aux β-lactames, dont le mode d’action consiste en une
inhibition de la synthèse du peptidoglycane (Normak et Normak, 2002).
40
2.2.La résistance acquise
La résistance acquise survient lorsque, seules, quelques souches d’une même espèce,
normalement sensibles à un antibiotique, deviennent résistantes. Cette résistance peut être
acquise par mutation ou par transfert de gènes.
La résistance acquise par mutation est aussi qualifiée de résistance chromosomique.
Le phénomène de mutation est conditionné par l’utilisation des antibiotiques. Ces derniers ne
sont pas des agents mutagènes mais ils contribuent à sélectionner, de manière spontanée, des
mutants résistants au sein d’une population bactérienne. En éliminant les bactéries sensibles,
les antibiotiques permettent aux mutants résistants de se multiplier plus facilement. La cause
principale de l’évolution et de l’extension des résistances aux antibiotiques est leur
prescription à grande échelle en thérapeutique humaine (Goossens et al., 2006).
L’utilisation d’antibiotiques, nécessitant de longues périodes de traitement ou à large
spectre d’action, est aussi un facteur de risque pour la propagation des résistances (Yagupsky,
2006 ; Saribas et al., 2010; Pal et al., 2010). La transmission d’éléments génétiques mobiles,
comme les plasmides et les transposons, favorise également l’acquisition des résistances par
les bactéries. Elle peut s’effectuer par transduction, conjugaison ou transformation.
La dissémination des gènes de résistance aux antibiotiques peut s’effectuer au sein
d’une même espèce mais aussi d’une espèce bactérienne à l’autre (Oliver et Murinda, 2012).
41
FIGURE N°3 : Les différents modes d’acquisition des gènes de résistance (R) aux antibiotiques
chez les bactéries (Levy et Marshall, 2004).
2.3. Les mécanismes de résistance
Pour lutter contre l’action des antibiotiques, les bactéries ont élaboré plusieurs
stratégies.
Certaines ciblent directement les antibiotiques tandis que d’autres sont dirigées contre les
mécanismes cellulaires, impliqués dans le transport de ces substances (fig. 03).
42
Aux niveaux physiologique et moléculaire, la résistance bactérienne est la résultante
de trois phénomènes : la diminution de la concentration intracellulaire en antibiotique par
diminution de la perméabilité membranaire et/ou sur-activation de l’efflux bactérien (fig. 4),
l’inactivation des antibiotiques par dégradation ou modification enzymatique (fig. 04) et
l’altération de leurs cibles cellulaires.
FIGURE N°4 : L’efflux, la destruction et la modification des antibiotiques comme modes de
résistance (Levy et Marshall, 2004)
43
3. L’ANTIBIOGRAMME:
3.1. Définition
Un antibiogramme est une technique de laboratoire visant à tester la sensibilité d'une
souche bactérienne vis-à-vis d'un ou plusieurs antibiotiques supposés ou connus. (Martine
Beljean-Leymarieet).
3.2. Le but de l’antibiogramme
Le choix de l’antibiotique est réalisé de manière très empirique dans la plupart des
infections banales débutantes : le médecin prescrit, en fonction de l’examen clinique, la
molécule dont l’efficacité lui paraît la plus probable (antibiothérapie dite probabiliste). Ce
n’est que dans les infections graves, récidivantes ou les échecs thérapeutiques que l’on fait
appel
au
laboratoire
qui
réalisera
une
culture
et
un
antibiogramme.
(Bactériologie/Antibiogramme, 2013).
Un antibiogramme permet de tester sur milieu de culture, l’action de molécules antibiotiques
sur une souche bactérienne. Il donnera donc des indications sur l’efficacité IN VITRO de ces
antibiotiques.
3.3. Principe :
Le principe consiste à placer la culture de bactéries en présence du ou des
antibiotiques et à observer les conséquences sur le développement et la survie de celle-ci. On
peut par exemple placer plusieurs pastilles imbibées d'antibiotiques sur une souche
bactérienne déposée dans une boîte de Petri.
4. LES TECHNIQUES D’ANTIBIOGRAMME
4.1. Techniques classiques :

Méthodes de dilution
Les méthodes de dilution sont effectuées en milieu liquide ou en milieu solide. Elles
consistent à mettre un inoculum bactérien standardisé au contact de concentrations croissantes
d'antibiotiques selon une progression géométrique de raison 2 :
44

En milieu liquide
L’inoculum bactérien est distribué dans une série de tubes (méthode de macrodilution
schéma A-1) ou de cupules (méthode de microdilution) contenant l'antibiotique. Après
incubation, la CMI est indiquée par le tube ou la cupule qui contient la plus faible
concentration d'antibiotique et où aucune croissance n'est visible (fig. 5).
5. CONCENTRATION MINIMALE INHIBITRICE(CMI)
CMI est la plus petite quantité d'antibiotique (ATB) capable d'inhiber une croissance
visible à l'œil nu. La CMI d'un germe donné peut être mesurée par différents procédés de
laboratoire
Cette technique utilise des disques de papier buvard imprégnés d'une concentration
donnée d'antibiotique déposé à la surface d'une gélose spécifique (Muller Hinton) coulée en
boîte de pétri uniformément ensemencée d'une suspension (100 bactéries/ml) de la bactérie
étudiée. (Bactériologie/Antibiogramme, 2013).
FIGURE N°05 : Détermination de la CMI par dilution en milieu liquide.
45

En milieu solide
FIGURE N °06 : Détermination de la CMI par dilution en milieu gélosé.
Une boîte de Pétri permet de tester jusqu’à 30 souches différentes. Dans l'exemple
présenté ci-dessus, le nombre de souches est limité à quatre.
La CMI de la souche 3 vis-à-vis de l'antibiotique incorporé à la gélose est de 1µg/ml.
La CMI de la souche 2 est de 2 µg/ml. Les déterminations des CMI des souches 1 et 4
nécessiteraient de tester des concentrations plus fortes en antibiotique.
L’antibiotique est incorporé dans un milieu gélosé coulé en boîtes de Pétri. La
surface de la gélose est ensemencée avec un inoculum des souches à étudier (un inoculateur à
têtes multiples, appareil de Steers, permet d'ensemencer de 20 à 30 souches différentes par
boîte). Après incubation, la CMI de chaque souche est déterminée par l'inhibition de la
croissance
sur
le
milieu
contenant
la
plus
faible
concentration
d'antibiotique.
La méthode de dilution en milieu gélosé, réalisée avec une gamme de concentrations en
progression géométrique de raison 2 (ou de raison 1,25), est la méthode de référence.

Méthodes de diffusion (Antibiogramme standard) :
Pour réaliser l’antibiogramme par la méthode des disques, la culture bactérienne est
ensemencée à la surface d’une gélose spécialement étudiée, la gélose de Mueller-Hinton,
éventuellement additionnée de sang. Des disques pré-imprégnés d’une dose connue
d’antibiotique sont déposés à la surface de la gélose. L’antibiotique diffuse à partir du disque
en créant un gradient de concentration.
46
La détermination du diamètre de la zone d’inhibition permet une estimation de la
concentration minimale inhibitrice. Les caractères de sensibilité ou de résistance de la souche
bactérienne en seront déduits.

la bactérie est sensible à l'antibiotique quand la CMI est inférieure à la concentration
critique inférieure. Concrètement, ceci signifie qu'il suffit d'une faible concentration
d'antibiotique pour tuer les bactéries et que cette dose nécessaire est encore plus faible
que la plus faible des doses qu'on peut administrer chez l'homme. Donc en clair, si on
traite quelqu'un avec l'antibiotique, la concentration de celui-ci dans l'organisme sera
toujours suffisante pour tuer les bactéries.

la bactérie est résistante à l'antibiotique quand la CMI est supérieure à la
concentration critique supérieure. Concrètement, la dose nécessaire pour tuer les
bactéries est bien trop élevée pour être supportée chez l'homme sans effets secondaires
importants. Cet antibiotique ne peut pas être utilisé pour traiter une infection.

la bactérie est intermédiaire à l'antibiotique quand la CMI est comprise entre les
deux concentrations critiques. En pratique, ça correspond à une situation où la
concentration est tantôt suffisante pour tuer les bactéries, tantôt insuffisante. Il faut
considérer que la bactérie sera résistante in vivo et il ne faut pas utiliser cet
antibiotique.
Les méthodes de diffusion ou antibiogrammes standards sont les plus utilisées par les
laboratoires de diagnostic.
Des disques de papier buvard, imprégnés des antibiotiques à tester, sont déposés à la
surface d'un milieu gélosé, préalablement ensemencé avec une culture pure de la souche à
étudier. Dès l'application des disques, les antibiotiques diffusent de manière uniforme si bien
que leurs concentrations sont inversement proportionnelles à la distance du disque. Après
incubation, les disques s'entourent de zones d'inhibition circulaires correspondant à une
absence de culture. Lorsque la technique est parfaitement standardisée, les diamètres des
zones
d'inhibition
dépendent
uniquement
de
la
sensibilité
du
germe.
(Bactériologie/Antibiogramme, 2013).
47
Antibiogramme standard
FIGURE N °07 : Illustration d’un antibiogramme standard.
6. AUTRES TECHNIQUES
6.1. Techniques en milieu liquide
La détermination de la sensibilité peut se réaliser en milieu liquide en testant la
sensibilité de la souche bactérienne vis-à-vis des concentrations critiques supérieures et
inférieures des différents antibiotiques ou uniquement vis-à-vis des concentrations critiques
inférieures.
6.2. Le système ATB VET
Le système ATB VET est constitué d'une galerie comprenant 32 cupules. Deux
cupules servent de témoin pour vérifier la bonne croissance bactérienne, deux cupules
permettent au laboratoire de rajouter les antibiotiques de son choix et 28 cupules comprennent
28 antibiotiques différents.
48
FIGURE N°08 : Illustration de système ATB VET.
Le système ATB VET permet de tester : la pénicilline (PEN), l'amoxicilline (AMO),
l'association amoxicilline-acide clavulanique (AMC), l'oxacilline (OXA), la céfalotine (CFT),
la céfopérazone (CFP), la streptomycine (STR), la spectinomycine (SPE), la kanamycine
(KAN), la gentamicine (GEN), l'apramycine (APR), le chloramphénicol (CMP), la
tétracycline (TET), la doxycycline (DOT), l'érythromycine (ERY), la lincomycine (LIN), la
pristinamycine (PRI), la tylosine (TYL), la colistine (COL), le cotrimoxazole (TSU), le
sulfaméthizol (SUL), la fluméquine (FLU), l'acide oxolinique (OXO), l'enrofloxacine (ENR),
la nitrofurantoïne (FUR), l'acide fusidique (FUC), la rifampicine (RFA) et le métronidazole
(MTR).
Le système ATB VET rassemble les principales molécules utilisables en médecine
vétérinaire.
Les concentrations en antibiotiques correspondent généralement aux concentrations
critiques inférieures établies pour l'homme. Après ensemencement avec un inoculum
standardisé, la lecture est basée sur l'observation de la croissance dans chacune des cupules.
Une absence de croissance correspond à une bactérie sensible et une croissance correspond à
une bactérie résistante. Dans ce système, les bactéries de sensibilité intermédiaire sont
considérées comme résistantes. (Bactériologie/Antibiogramme, 2013).
49
6.3. Technique en milieu gélosé : le Etest®
La détermination précise de la CMI par la méthode de référence est difficilement
utilisable en pratique quotidienne. La commercialisation d'une technique rapide et simple, le
Etest (AB Biodisk), permet à un laboratoire de diagnostic de mesurer la CMI.
6.3.1. Principe de l’Etest®
Le Etest® est appliqué sur la surface d'un milieu gélosé préalablement innoculé. Après
incubation, on observe une ellipse d'inhibition. Au point d'intersection entre la zone
d'inhibition et la bandelette, la concentration en antibiotique correspond à la CMI de la souche
étudiée.
FIGURE N°09 : Illustration d’un E-test.
50
Le Etest® permet de déterminer la CMI grâce à l'utilisation de bandelettes imprégnées
d'un gradient exponentiel continu de l'antibiotique à tester. Ce gradient couvre une zone qui,
en fonction des molécules, va de 0,016 à 256 mg/L ou de 0,002 à 32 mg/L. Le Etest associe
les caractéristiques des méthodes de diffusion et de dilution en milieu solide.
Les bandelettes (supports inertes, hydrophobes, de 5 mm de largeur et de 50 mm de
longueur) sont appliquées sur la surface d'un milieu gélosé préalablement ensemencé avec un
inoculum de la souche à étudier. Après incubation, l'inhibition de la croissance se traduit par
une ellipse d'inhibition dont les points d'intersection avec la bandelette définissent la CMI.
Une échelle de lecture, imprimé sur la bandelette, permet une interprétation rapide
(Bactériologie/Antibiogramme, 2013).
51
CHAPITRE IV
52
LES HUILES ESSENTIELLES
1. DEFINITION
Les huiles essentielles sont des mélanges naturels complexes de métabolites
secondaires volatiles, isolées des plantes par hydrodistillation ou par expression mécanique
(Kalemba et Kunicka, 2003). Elles sont obtenues à partir de feuilles, de graines, de bourgeons,
de fleurs, de brindilles, d’herbes, d’écorces, de bois, de racines ou de fruits (Burt, 2004), mais
également à partir des gommes qui s’écoulent du tronc des arbres. L’hydrodistillation reste le
moyen le plus employé pour produire les huiles essentielles, en particulier à des fins
commerciales (Burt, 2004). Les métabolites secondaires sont extraits des plantes par un
entraînement à la vapeur d’eau. Le volume d’huile essentielle récupéré dépend du rendement
de distillation, qui est variable, chez une même plante, en fonction de la saison (Gonny et al.,
2004). Les huiles essentielles peuvent aussi être obtenues par expression à froid, comme pour
les agrumes.
2. LES ACTIVITES BIOLOGIQUES DES HUILES ESSENTIELLES
La diversité moléculaire des métabolites des huiles essentiels, leur confère des rôles et
des propriétés biologiques très variés.
De nombreuses huiles essentielles, comme les huiles de cannelle, de piment, de laurier
et d’origan, présentent un pouvoir anti-oxydant (Mantle et al., 1998 ; Karioti et al., 2006).
Un effet anti-inflammatoire a été décrit pour les huiles essentielles de Protium strumosum,
Protium lewellyni, Protium grandifolium (Siani et al., 1999), ou, plus récemment, pour l’huile
essentielle des racines de Carlina acanthifolia (Dordevic et al., 2007), qui est capable
d’inhiber l’inflammation induite par une injection de carraghénane chez le rat.
Les activités antifongiques de nombreuses huiles essentielles, incluant les huiles de thym, de
citronnelle, de cannelle et de l’arbre à thé (Burt, 2004) ont été décrites. L’efficacité des huiles
extraites des achilées, Achillea fragrantissima (Barel et al., 1991), A. setacea, A. teretifolia
(Unlu et al., 2002) et A. milefolium (Candan et al., 2003), contre la levure pathogène Candida
albicans, a également été mise en évidence.
Certaines huiles essentielles présentent des activités anti-tumorales et sont utilisées
dans le traitement préventif de certains types de cancers.
53
L’huile essentielle, isolée des graines de Nigella sativa L., démontre une activité
cytotoxique in vitro contre différentes lignées cellulaires tumorales. In vivo, elle limite la
prolifération de métastases hépatiques et retarde la mort des souris ayant développé la tumeur
P815 (Mbarek et al., 2007). L’huile essentielle de Melissa officinalis s’est, quant à elle,
révélée efficace contre des cellules de lignées cancéreuses humaines, incluant les cellules
leucémiques (De Sousa et al., 2004).
D’autres applications médicales sont étudiées. Les travaux de ( Jafri et al., 2001) ont
prouvé la capacité de l’huile essentielle de cardamome à limiter la formation d’ulcères
gastriques induits par l’éthanol (Jafri et al., 2001). Il a également été démontré que les huiles
essentielles facilitent la pénétration transdermique de substances médicamenteuses lipophiles,
comme l’oestradiol (Monti et al., 2002). Des travaux tentent également d’analyser les effets
des huiles essentielles sur le comportement (Umezu, 1999) ou d’évaluer la possibilité de les
utiliser dans la lutte contre l’addictio*n à certaines drogues, comme la nicotine (Zhao et
al.,2005).
3. LES ACTIVITES ANTIBACTERIENNES DES HUILES ESSENTIELLES:
La première mise en évidence de l’action des huiles essentielles contre les bactéries a
été réalisée en 1881 par Delacroix (Boyle, 1955). Depuis, de nombreuses huiles ont été
définies comme antibactériennes (Burt, 2004).
Leur spectre d’action est très étendu, car elles agissent contre un large éventail de
bactéries, y compris celles qui développent des résistances aux antibiotiques. Cette activité est
par ailleurs variable d’une huile essentielle à l’autre et d’une souche bactérienne à l’autre
(Kalemba et Kunicka, 2003). Les huiles essentielles agissent aussi bien sur les bactéries Gram
positives que sur les bactéries Gram négatives. Toutefois, les bactéries Gram négatives
paraissent moins sensibles à leur action et ceci est directement lié à la structure de leur paroi
cellulaire (Burt, 2004). Il existe cependant quelques exceptions. Les bactéries Gram négatives
Aeromonas hydrophila et Campylobacter jejuni (Wannissorn et al., 2005) ont été décrites
comme particulièrement sensibles à l’action des huiles essentielles. La bactérie reconnue
comme la moins sensible à leurs effets reste néanmoins la bactérie Gram négative
Pseudomonas. aeruginosa (Dorman et Deans, 2000).
La croissance des bactéries, résistantes et multi-résistantes aux antibiotiques, peut être
inhibée par certaines huiles essentielles.
54
Les huiles d’agrumes, de lavande, de menthe, de genévrier, de l’arbre à thé, de thym et
d’eucalyptus se révèlent particulièrement efficaces contre les staphylocoques dorés résistants
à la méthicilline (SARM) (May et al., 2000 ; Tohidpour et al., 2010) et les entérocoques
résistants à la vancomycine (ERV) (Fisher et Phillips, 2009). Les huiles essentielles, isolées
de deux espèces de thym de Corée, Thymus magnus et Thymus quinquecostatus, sont
également capables d’inhiber la croissance de bactéries résistantes comme Streptococcus
pneumoniae, Samonella typhimurium, Salmonella entereditis et S. aureus (Shin et Kim,
2005).
4. METHODES D’EXTRACTION :
4.1. Enfleurage et macération:
C'est la plus ancienne technique, coûteuse et peu employée. Les fleurs sensibles sont
mises à macérer dans la graisse ou des huiles chauffées (bain mari ou soleil) et étalées sur des
châssis en bois pendant plusieurs jours. Une fois gorgés de parfu, les corps gras sont filtrés au
travers des tissus de lin ou de coton. Les huiles sont lavées à l'alcool pur, filtrées et évaporées.
(Sousa et al., 2002; Adio, 2005).
4.2. Expression:
Les écorces des agrumes sont pressées à froid pour extraire leurs huiles.
4.3. Distillation (Hydrodistillation):
Les extraits végétaux sont chauffés jusqu'à l’ébulution; L’huile essentielle (HE)
s'évapore alors avec les vapeurs dégagées puis est condensée après refroidissement et séparée
de l'eau. (Sousa et al., 2002; Adio, 2005)
4.4. L'entraînement à la vapeur sèche:
La masse végétale repose sur une grille vers laquelle la vapeur sèche est pulsée. Les
cellules se distendent et les particules d'huiles se libèrent, puis elles sont vaporisées et
condensées dans un serpentin réfrigéré et la suite comme la technique de distillation. (Sousa et
al., 2002; Adio, 2005).
55
4.5. Extraction aux solvants volatils :
Elle est utilisée sur des fleurs sensibles à la chaleur, la distillation ne convient que pour
végétaux dont le rendement en HE est important; Les solvants très volatils s'évaporent
rapidement sont employées. Le solvant lave la matière première qui subira après décantation
et concentration une distillation partielle. Ce solvant est séparé de la concrète par filtrage, puis
glaçage de 12 °C -15°C . La substance obtenue est filtrée et concentrée à faible pression.
(Sousa et al., 2002; Adio, 2005)
4.6. L'extraction au CO2 supercription:
Le CO2 sous-pression et à température supérieure à 31°C, le gaz carbonique se trouve
dans un état supercriptique, la matière végétale est chargée dans l'extracteur puis le CO2 est
introduit sous pression et réfrigéré. Le mélange est recueilli dans un vase d'expansion ; La
pression y étant réduite, le CO2 reprend sa forme gazeuse et est complètement éliminé.
L'extrait végétal est isolé. (Sousa et al., 2002; Adio, 2005)
5. LA COMPOSITION DES HUILES ESSENTIELLES:
5.1. Composition chimique :
La composition chimique d’une HE est assez complexe, on y trouve généralement de
nombreux constituants appartenant principalement à deux grandes familles chimiques: les
composés terpéniques et les composés aromatiques, dérivés du phénylpropane.
Les composés terpéniques sont formés d’unités isopréniques (en C5) et comprennent
les monoterpènes (C10), les sesquiterpènes (C15), les diterpènes (C20) et les tri terpènes
(C30).
Ces composés ont tous la même origine métabolique. (Santoyo , 2005 ; Kimbaris, 2006).
Les composés aromatiques dérivés du phénylpropane ont une biogenèse différente de
celle des terpènes. On peut citer l’acide et l’aldéhyde cinnamique (HE de cannelle), l’eugenol
(HE de girofle), le carvacrol (HE d’origan), l’anéthol et l’aldéhyde anisi que (HE de badiane,
d’anis et de fenouil) qui sont les principaux membres de cette famille. (Santoyo , 2005 ;
Kimbaris, 2006).
Les acides organiques, les cétones de faible poids moléculaire et les coumarines
volatiles entrent également en faible proportion dans la constitution des HE. Cependant, cette
complexité de la composition chimique des HE suscite plusieurs remarques:
56
Parmi les nombreux constituants d’une HE, l’un domine généralement, on l’appelle
composé majoritaire.
À l’intérieur d’une même espèce végétale, on observe des variations chimiques
(qualitatives et quantitatives) importantes, ce qui conduit à admettre l’existence de
chémotypes chimiques (exemple: Thyms à thymol, à géraniol, à carvacrol, à linalool).
La composition chimique des HE varie avec le milieu et l’époque de la végétation. Elle peut
aussi se modifier au cours de l’extraction et durant la conservation. (Santoyo , 2005 ;
Kimbaris, 2006).
57
CHAPITRE V
58
LE MIEL
Le miel est une substance sucrée naturelle produite par les abeilles de l'espèce Apis
mellifera à partir du nectar de plantes ou des sécrétions provenant de parties vivantes des
plantes ou des excrétions laissées sur celles-ci par des insectes suceurs, qu'elles butinent,
transforment, en les combinant avec des matières spécifiques propres, déposent, déshydratent
entreposent et laissent mûrir dans les rayons de la ruche. A l'exception du miel filtré, aucun
pollen ou constituant propre au miel ne doit être retiré, sauf si cela est inévitable lors de
l'élimination de matières organiques et inorganiques étrangères. » (Joshi et al., 2000).
Le miel est donc, par définition, un produit 100% naturel, l’homme n’intervenant
absolument pas dans sa fabrication proprement dite. Le travail de l’apiculteur consiste à
fournir aux abeilles des conditions favorables, puis à récolter le miel, à s’assurer qu’il soit de
bonne qualité et qu’il se conserve correctement .
1. COMPOSITION DU MIEL
Le nectar à l’origine du miel possède une composition différente pour chaque plante
(Wykes, 1952 cité par Vear et al., 1990). Cette différence, aussi infime soit-elle, se retrouve
dans les miels, ce qui leur donne une saveur, une couleur ainsi qu’une évolution propre.
Les récoltes de miels sont différentes selon les régions, mais aussi selon les conditions
climatiques de l’année. On n’obtient donc jamais le même miel d’une année sur l’autre.
Les principaux constituants chimiques du miel sont proches de ceux du nectar : l’eau,
les glucides (monosaccharides tels que le glucose et le fructose ou polysaccharides tels que le
maltose, le saccharose, le mélézitose, l’erlose), les acides organiques (libres ou combinés sous
formes de lactones), les protides et les matières minérales.
Le miel contient également les enzymes provenant des sécrétions salivaires de
l’abeille : la diastase ou amylase et l’invertase.
On y trouve aussi des vitamines, des arômes, des lipides, du glycérol (résultat d’une
fermentation), des grains de pollens, des levures, des grains d’amidon, des spores de
champignons, des algues.
Enfin,
le
5-hydroxy-2-méthylfurfural
(HMF)
est
un
composant
retrouvé
systématiquement à l’état de traces dans le miel. Il provient de la dégradation du fructose et
est un excellent indicateur de qualité.
59
1.1. Eau :
La teneur en eau varie entre 14 et 25% selon les miels. L’humidité du miel favorisant sa
fermentation.
1.2. Glucides :
Selon les miels, les glucides représentent 90 à 99% de la matière sèche. Les principaux
sucres constitutifs du miel sont le fructose et le glucose. De nombreux autres sucres sont
également présents dans le miel, en plus faible quantité. Certains sont d’origine purement
végétale (ils entrent dans la composition du nectar ou du miellat) : le glucose, le fructose, le
saccharose, le kestose, le mélézitose et le raffinose. D’autres, tels que le maltose, l’isomaltose,
l’erlose et le dextrantriose, apparaissent seulement comme des produits secondaires après
transformation par les enzymes de l’abeille.
La proportion des différents sucres présents dans un miel est très aléatoire. Elle dépend, en
effet, directement du type de fleurs butinées par les abeilles (Louveaux .,1968). Les nectars de
ces fleurs sont caractérisés par leur ratio saccharose / (glucose + fructose), qui est constant au
sein d’une espèce mais varie grandement d’une espèce à l’autre (Adler., 2000). Il est par
conséquent impossible d’obtenir deux fois le même miel sur le même site, lors de deux
récoltes différentes de la même année ou d’une année sur l’autre.
La teneur totale en fructose et glucose ne doit pas être inférieure à 60g pour 100g d’un miel
de fleurs et 45g pour 100g d’un miel de miellat ou mélange de miel de miellat avec du miel de
fleurs.
En ce qui concerne le saccharose, on ne doit pas en trouver plus de 5g dans 100g de
miel. Quelques particularités sont à détailler pour certains miels :

Pour le miel d’acacia (Robinia pseudoacacia), de luzerne (Medicago sativa),
d’agrumes et de quelques autres plantes exotiques, ce seuil est de 10g / 100g.

En ce qui concerne le miel de lavande (Lavandula spp.) et de bourrache (Borago
officinalis), on ne peut dépasser 15g / 100g.
Enfin, le miel ne contient que très peu d’amidon, car une enzyme de l’abeille, la
diastase ou amylase, provoque la dégradation de l’amidon du nectar en dextrine puis en
maltose.
60
1.3.
5-hydroxy-2-méthylfurfural (HMF)
L’HMF est un composé organique dérivé de la déshydratation du fructose. Ni les
nectars ou miellats, ni les miels frais n’en contiennent.
Cette molécule apparait au cours du processus de vieillissement naturel du miel. Ce
processus est accéléré si les miels sont chauffés ou s’ils sont très acides. L’analyse de la
quantité d’HMF est donc une excellente méthode pour apprécier la qualité d’un miel : son
vieillissement et son chauffage (Gonnet, 1963 ; Dustmann et al., 1985 ; Bogdanov et al., 1997
et Deschamps, 1998).
A une température de stockage de 4°C, en fonction de son acidité, un miel mettra 20 à
80 ans pour atteindre le seuil légal de 40mg/kg. A température ambiante de 20°C (température
de stockage chez la plupart des consommateurs), cette durée sera de 2 à 4 ans. Si le miel est
porté à température plus élevée, même pendant un court moment, la teneur en HMF
augmentera plus vite.
1.4. Acides
Les miels contiennent des acides organiques (dont certains sont volatils), ainsi que des
lactones. Leur provenance est diverse : certains sont issus du nectar directement, d’autres sont
le fruit de réactions enzymatiques et de fermentations.
Les acides identifiés dans le miel sont : l’acide gluconique (constituant acide majoritaire, issu
du glucose), les acides butyriques, l’acide acétique, l’acide formique, l’acide lactique, l’acide
succinique, l’acide proglutamique, l’acide malique et l’acide citrique. (Bogdanov et al., 1997
et Deschamps, 1998).
1.5. Protides
Les miels convenablement récoltés sont pauvres en protéines, la source de protéine
dans la ruche étant le pollen. Quelques traces de pollen sont cependant inévitables et
participent d’ailleurs à son identification florale. Seul le miel de bruyère Calluna contient une
protéine particulière, responsable de l’évolution de sa viscosité au cours du temps. (Bogdanov
et al., 1997 et Deschamps, 1998).
1.6. Sels minéraux
La teneur en sels minéraux d’un miel est en général faible, avec d’importantes
variations : les miels foncés en contiennent plus que les miels clairs.
61
1.7. Vitamines :
Le miel contient une quantité infime de vitamines, probablement issues des quelques
grains de pollen qu’il renferme. Le miel de menthe (Mentha aquatica) a la particularité de
contenir de la vitamine C 2(ou acide ascorbique). ( Bogdanov et al., 1997 et Deschamps,
1998)
1.8. Enzymes
Les enzymes contenues dans le miel sont de deux origines : végétale et animale. Le
nectar contient des enzymes produites par les nectaires de la plante. Les abeilles y ajoutent
des enzymes provenant de leurs glandes salivaires.
Deux enzymes sont étudiées plus particulièrement : l’invertase, qui provoque la scission du
saccharose en fructose et en glucose, et l’amylase (couramment appelée diastase), qui
provoque la dégradation de l’amidon en dextrine puis en maltose.
On trouve également une catalase, une phosphatase et une glucose-oxydase. Cette
dernière transforme le glucose en acide gluconique, principal acide du miel. L’activité
enzymatique du miel est utilisée comme indicateur de chauffage du miel. (Bogdanov et al.,
1997 et Deschamps, 1998)
1.9. Colloïdes
La teneur en colloïdes varie entre 0,1 et 1%. Ils sont constitués principalement par des
protéines, des substances cireuses, des pigments, des pentosanes et diverses autres substances.
Les colloïdes sont responsables de la turbidité lorsque l’on dilue un miel dans l’eau.
((Bogdanov et al., 1997 et Deschamps, 1998)
62
2. SUBSTANCES AROMATIQUES ET COMPOSES PHENOLIQUES
Les substances aromatiques sont, comme leur nom l’indique, à l’origine de l’arôme
du miel. Seules quelques unes ont été identifiées, notamment l’anthranilate de méthyle, le
diacétyl, le formaldéhyde, l’acétaldéhyde, l’acétone et l’isobutyraldéhyde.
Depuis quelques années, plusieurs auteurs s’efforcent de trouver des marqueurs de
l’origine florale des miels. Dans la publication de ( Sesta et al., 2008) a étudié l’anthranilate
de méthyle, comme possible facteur caractéristique des miels des plantes du genre Citrus
(oranger, citronnier, mandarinier, pamplemoussier, clémentinier, etc.). Ses résultats montrent
qu’en réalité cette substance aromatique ne peut pas servir de marqueur pour ces miels
unifloraux (Sesta et al., 2008).
Les composés phénoliques sont retrouvés principalement dans la propolis, car ils
proviennent souvent des sécrétions de bourgeons et autres exsudats des plantes.
On en distingue trois familles : les acides benzoïques, les acides cinnamiques et les
flavonoïdes. Leur composition dans le miel varie elle aussi avec l’origine florale (Amiot et al.,
1989).
Certains phénols participent à l’arôme au même titre que les substances terpéniques
(caractéristiques de la lavande ou du sapin) ou d’autres composés à noyau aromatique
d’origine naturelle, tels les acides phénylacétique et benzoïque (abondants dans les miels de
bruyère). Certains composés phénoliques sont impliqués dans les qualités organoleptiques du
miel. Les substances phénoliques interviennent également sur la couleur du miel : la couleur
jaune, par exemple, est liée aux flavonoïdes (Hegazi, 2011).
Ces substances phénoliques possèdent certaines activités biologiques intéressantes :
germicide, bactériostatique et anti-inflammatoire (Amiot et al., 1989).
Soler a également cherché à évaluer si les flavonoïdes pouvaient être utilisés comme
marqueurs de l’origine florale des miels. Il a déterminé que le miel de bruyère Erica renferme
de la myricétine, celui de bruyère Calluna de l’acide ellagique et celui d’oranger de la
flavanone hespérétine. Selon lui, l’utilité des flavonoïdes en tant que marqueurs de l’origine
botanique reste donc à explorer (Soler et al., 1995).
63
3. PARAMETRES PHYSIQUES
3.1. Coloration
La coloration est une caractéristique physique importante des miels car elle est en
rapport avec leur origine florale ainsi qu’avec leur composition. La couleur du miel peut aller
d’une teinte presque incolore au brun sombre. Le chauffage, le vieillissement ainsi que la
lumière provoquent une intensification de la coloration du miel (Louveaux, 1968).
3.2. Turbidité
Ils contiennent cependant des éléments en suspension qui leur confèrent une certaine
turbidité (levures, poussières, grains de pollen, colloïdes, etc.) (Louveaux, 1968).
La néphélométrie est une des techniques de mesure de la teneur en particules en suspension
ou de la turbidité d'un milieu (respectivement gazeux ou liquide). Elle fait partie de la
photométrie des milieux troubles.
3.3. Consistance
En fonction de sa composition et de ses conditions de conservation, le miel peut avoir
une consistance fluide, épaisse ou cristallisée.
3.4. Saveur
Le goût et l’arôme varient et dépendent de l’origine végétale, mais le miel ne doit pas
présenter de goût étranger ou d’odeur étrangère ni avoir commencé à fermenter.
3.5. PH
Le pH d’un miel est fonction de la quantité d’acides ionisables qu’il renferme ainsi
que de sa composition minérale. Les phénomènes de dégradations spontanées du miel lors de
son vieillissement naturel ou d’un chauffage sont largement dépendants du pH au moment de
la mise en pot et font eux-mêmes évoluer le pH (le miel s’acidifie en vieillissant) (Louveaux,
1968).
64
4. PROPRIETES DU MIEL
Ces nombreux composants du miel lui confèrent plusieurs propriétés intéressantes. Les
hommes ont depuis toujours utilisé le miel non seulement comme nourriture mais aussi pour
ses propriétés antiseptiques, comme médicament, comme substance servant à la conservation
des fruits et des graines, et également dans les embaumements humains, du temps des
Pharaons égyptiens.
4.1. Propriétés thérapeutiques
Certaines personnes paraissent sensibilisées au miel, qui déclenche chez elles des
malaises.
Cependant on attribue au miel un très grand nombre de propriétés thérapeutiques
(propriétés antiseptiques, antianémiques et antitussives par exemple) (Guarch, 2008 et
Chanaud ,2010).
Le miel est doué d’un pouvoir bactériostatique important, de par sa haute teneur en
sucres (plus de 95% de la matière sèche), sa faible teneur en eau libre (0,50 à 0,62%) et en
humidité (14 à 20%), son acidité et la présence de substances à activité antibactérienne
(peroxyde d’hydrogène libre et inhibine). Il est régulièrement utilisé dans le traitement des
plaies (Lavie, 1968 ; Tomczak, 2010 ; Lusby et al., 2005; Wilikinson et al., 2005; French et al.,
2005, Hegazi, 2011).
5. LE MIEL COMME UN AGENT ANTIBACTERIEN:
Le miel est utilisé dans la médecine depuis longtemps, son utilisation comme un effet
thérapeutique (Majno, 1975). Il est saturé en sucre surtout le fructose 84% et l'eau 15-20%
(Molan, 1992a; Molan, 1992b). La grande interaction entre l'eau et les sucres laisse une faible
quantité d'eau libre pour les micro-organismes ce qu'on appelle AW (water activity) se qui
inhibe la croissance bactérienne.
5.1. L’acidité :
L'acidité du miel est entre un PH 3.2- 4.5 qui est un inhibiteur de plusieurs agents
pathogènes. Le PH optimal de la croissance des bactéries varie entre 7.2-7.4 dans la majorité
des cas .Dans quelques espèces bactériennes poussent à des PH acide dans les infections de la
peau comme:
65
E. Coli 4.3; Salmonella sp 4.0; Pseudomonas aeruginosa 4.4. Avec ce PH, l'acidité du miel
est très favorable à la croissance par contre, elle est défavorable si on utilise la dilution.
(Molan, 1992a; Molan, 1992b).
5.2. Hydrogène pyroxide :
La majorité de l'effet antibactérien est due à l'hydrogène pyroxide. La glucose oxydase
sécrétée par les abeilles et l'acidité provoque la réaction suivante:
Glucose+H2O+ O2- Acide gluconique+ H2O2. La dilution du miel provoque une
augmentation de l'effet antibactérien par augmentation de cette réaction. En plus de ces
facteurs, les enzymes et d'autres molécules participent dans l'activité antibactérienne comme:
les terpènes, acide hydroxybenzoique, acide 2-hydroxy-3-phenylpropionique et l'acide
dihydroxybenzene. (Molan, 1992a; Molan, 1992b).
6. VARIATION DE L'EFFET ANTIBACTERIEN
L'effet antibactérien du miel est variable selon la région et la saison. La CMI varie de
5%-50% selon la composition du miel par rapport au pourcentage de l'hydrogène pyroxide, le
nectar, les enzymes (Molan et al., 1991a; Molan et al., 1991b) . La variation en teneur en
sucre influent sur la CMI et l'effet antibactérien. ( Bulman, 1955; Bose, 1982; Green, 1988).
66
67
MATERIELS ET METHODES
68
Notre étude a pour objectifs de :
-
Connaitre la prévalence et l’étiologie des mammites sub-cliniques.
-
Etudier la sensibilité des souches isolées des mammites sub-cliniques caprines aux
antibiotiques testés.
-
Evaluer l’action du miel et de l’huile de Thymus Fontanesii sur les germes impliqués
dans les mammites caprines comme un traitement alternatif.
1. LIEU DE L’ETUDE :
Notre étude s’est déroulée pendant une période allant de Mars 2009 au Septembres de
2012. Elle a été faite dans différentes régions de la wilaya de TIARET : Les régions de
Tiaret : Zaâroura, Ain Mesbah, Karman, Sidi Hosni, Dahmouni, Medroussa, M’ghuila, Ksar
Chellala, Sebt, Sougueur, Oued Lili et Mellakou (fig n°01).
FIGURE N°01 : Carte representant les différentes régions d’étude
69
2. LES ANIMAUX :
Notre cheptel d’expérimentation est représenté par les chèvres locales. Le lait est prélevé
(N°= 298) pour être examiné pour une éventuelle infection, sachant bien que toutes les
chèvres étudiées dépassaient la 3ème semaine de lactation.
3. EXAMEN MACROSCOPIQUE DU LAIT ET CMT(CALIFORNIEN
MASTITIS TEST) :
Le lait est prélevé dans un godet de la palette à CMT afin d'examiner ses caractéristiques
physiques : couleur, consistance, présence de grumeaux et odeur.
Le même échantillon de lait est, ensuite, utilisé pour réaliser le CMT (Bergonier 2003) de la
manière suivante:

l'excédent de lait est vidé afin de ne conserver que 2 ml dans chaque coupelle (volume
indiqué par un trait au fond de coupelle).

2 ml de réactif « Leucocytest » sont ajoutés au prélèvement au moyen d'une pompe
doseuse.

le mélange est agité par des mouvements circulaires pendant quelques secondes.

en fonction de la gélification obtenue du mélange, une note de 0 à 4 est attribuée pour
chaque prélèvement.
4. ANALYSE MICROBIOLOGIQUE DU LAIT
Tous les quartiers ayant un CMT "positif", c'est-à-dire avec une note 3 ou 4, font
l'objet d'un nouveau prélèvement stérile en vue d'une analyse microbiologique. Ce dernier est
effectué de la manière suivante :

La désinfection de l'extrémité du trayon avec une solution de permanganate de
potassium (préparée extemporanément, à une concentration d'environ 1g/l) appliquée
avec un linge propre.

Le prélèvement de (05 ml) de lait dans des tubes stériles en verre, en prenant soin de
ne pas contaminer l'intérieur du tube et le bouchon, La fermeture immédiate
70
4.2. Conservation et transferts
Les prélèvements réalisés dans les élevages sont transportés dans des glacières à
(+4°C) jusqu'au laboratoire.
4.3. Analyse microbiologique
L’isolement des germes a été réalisé par l’ensemencement des gouttes du lait sur
gélose nutritive (pour les germes non exigeants), milieu de Chapman (pour les
staphylocoques), milieu de Mac Conkey (Pour les entérobactéries), Saboureau (Pour les
champignons), Gélose au sang pour les bactéries hémolytiques, et l’incubation pendant 24h à
37°c. La coloration de GRAM et le test d’oxydase sont réalisés sur tous les germes isolés.
D’autres tests complémentaires ont été réalisés :

Coagulase en tube et galerie API20 staph pour les staphylocoques.

Galeries API20E pour les entérobactéries.
5. TESTS BIOCHIMIQUES
Les tests biochimiques effectués permettent de définir les caractéristiques
métaboliques et l’identification des bactéries. En fonction des tests réalisables, on parvint à
une identification plus ou moins précise (famille, genre ou espèce). En effet, certains tests
sont très coûteux ou très complexes donc, on s’est limité aux tests suivant :
5.1. Test de la Catalase :
Ce test permet, notamment, de différencier les streptocoques catalase (-) des
staphylocoques et des microcoques catalase (+).
Il s'agit de mettre en évidence la présence de cette enzyme dans les bactéries. Pour
cela, une goutte d'eau oxygénée est déposée sur une colonie. La catalase catalyse cette
réaction : 2 H2O2 → O2 + 2 H2O.
Si la bactérie possède une catalase, il se produit un dégagement d'oxygène et on observe une
effervescence. Dans le cas contraire, aucune réaction ne se produit.
5.2. Test de la Coagulase libre :
Ce test permet de faire la distinction entre les staphylocoques à coagulase négative
(SCN) et les staphylocoques à coagulase positive (SCP : S. aureus).
On réalise une suspension bactérienne dans environ 300 μl d'un milieu nutritif
(bouillon staphylocoagulase) dans un tube à hémolyse stérile bouché par du coton. On laisse
71
incuber 18 à 24 h à 37°C, puis on ajoute le même volume de plasma humain, et on laisse
incuber à nouveau à 37°C pendant 12 h.
La coagulase induit une coagulation du plasma humain et on observe un caillot qui se
forme en quelques minutes à quelques heures pour les bactéries à coagulase positive, alors
que le milieu reste liquide pour les bactéries à coagulase négative.
5.3. Test d'utilisation de l'esculine :
Ce test permet de distinguer Enterococcus spp, anciens streptocoques du groupe D,
constituants physiologiques de la flore digestive, considéré comme esculine (+)
On réalise une culture de la bactérie étudiée sur une gélose à l'esculine (couleur initiale
est jaune). Si l'esculine est catabolisée, une fonction phénol est libérée et réagit avec le sel
ferrique et le milieu devient noir.
6. PRINCIPE DE GALERIE API:
La galerie API 20 est constituée de 20 micro-tubes permettant l'étude de la
fermentation des substrats. Durant la période d'incubation, cette dernière se traduit par un
changement de couleur et /ou dégagement gazeux.
7.1. Préparation des galeries:

Préparer une boite d'incubation (fond de couvercle).
- Inscrire la référence de la souche.

Répartir environ 10 ml d'eau distillée stérile dans les alvéoles du fond pour créer une
atmosphère humide.

Sortir les bandes de leur emballage et les déposer dans le fond de la boite d'incubation.
7.2. Préparation de l'inoculum et interprétation:

Cultiver ou revivifier les souches bactériennes.

Vérifier la pureté des souches.

Préparer l'inoculum dans le médium approprié ou dans l'eau distillée stérile.

Standardiser l'inoculum à 0.5 McFarland.

Inoculation des galeries:

Repartir la suspension bactérienne à l'aide d'une pipette stérile dans les tubes des
galeries.
72

Incliner légèrement vers l'avant la boite d'incubation.

Eviter la formation des bulles en posant la pointe de la pipette sur le coté de la cupule.

Ne pas dépasser la limite supérieure du tube.

Ajouter une goutte d’huile de paraffine dans certains tubes afin de conserver une
anaérobiose.

Incuber les galeries à 37° C pendant 24 heures.

Interpréter chaque test comme +/- ou douteux suite au changement de couleur et les
noter sur la fiche des résultats, le profil biochimique ainsi constitué sert à
l'identification des souches.
Pour les champignons : On utilise le Bleu de Méthyléne pour la coloration, puis le voir
sous microscope, en suite, on détermine est ce qu’il est filamenteux ou non.
73
7.L’ANTIBIOGRAMME
Cette technique de laboratoire est utilisée pour tester la sensibilité des souches
bactériennes isolées des mammites sub-cliniques des chèvres locales vis-à-vis les
antibiotiques
suivants: Ampicilline AM, Amoxicilline A, Tétracycline T, Pénicilline P,
Erytromycine E, Streptomycine S.
Le principe consiste à mettre en incubation la culture de bactéries en présence de ces
antibiotiques et à observer les conséquences sur le développement de la souche bactérienne. Il
existe trois types d'interprétation selon le diamètre du cercle qui entoure le disque
d'antibiotique : souche ou bactérie sensible, intermédiaire ou résistante.
Pour réliser l’antibiogramme, il faut suivre les étapes suivantes :

Prendre des colonies fraîches après qu'on revivifie les souches isolées et conservées au
Glycérol à (+4°c).

Mettre, stérilement, de l'eau physiologique dans un tube à essai.

Prélever les colonies pures et les mettre en suspension jusqu'à obtenir la même opacité
que l'étalon Mac Farland 0.5 ; (108 UFC/ml) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm.

Ensemencer la gélose par la suspension;

Verser la suspension, puis écouvillonner régulièrement la gélose par un ecouvillon ou
pipette pasteur en tournant la plaque de 60° jusqu'à ensemencement de la totalité de la
surface. Laisser sécher de 3 à 5 minutes.

Déposer les disques d'antibiotiques; ils seront positionnés sur le fond de la boîte au
minimum de 01 mm du bord de la boite de pétri, Incuber 24 h, à 37°C.

Mesurer les zones d’inhibitions et l’interprétation est faite par normes donnés par des
laboratoires de microbiologies.
74
II/ Evaluation de l’activité antimicrobienne de l’huile essentielle et du miel
et sur les souches isolées des mammites.
A. /Le miel :
Le miel utilisé dans cette expérimentation est d'origine botanique Multifloral. Il
provient de la région de Malaab, wilaya de Tiaret. Récolté en 2011, celui-ci était conservé à
l'abri de la lumière à une température de 25°C pour étre utiliser comme un traitement
alternatif sur les souches isolées à partir du lait de chèvres locales de Tiaret afin d’essayer
de déterminer son CMI vis-à-vis de ces germes. Les différentes espèces sont: Pseudomonas
aeruginosa, Micrococcus spp, Klebsiella spp , E. coli, Staphylococcus aureus, SNC, Bacillus
spp, Streptococcus type D, Enterobacter spp, Pontea et Corynébacterium spp.
1. DETERMINATION DE LA CONCENTRATION MINIMALE BACTERICIDE
(CMB) :
1.1. Principe
Nous avons déterminé l'effet antibactérien du miel, par l’estimation de la
concentration minimale bactéricide (CMB) qui est la concentration du miel la plus faible qui
empêche, d’une façon complète, la croissance des différentes souches bactériennes.
1.2. Méthodologie :
Cette méthode consiste à incorporer des volumes croissants du miel au milieu de
culture de telle manière à obtenir, pour chaque mélange, un volume de 5ml.
Le calcul des volumes des miels est fait comme suit :
5 ml (volume total)
100 % (miel + gélose)
Y ml du miel
X % du miel
5ml : le volume total du mélange (miel+milieu de culture)
X % : le pourcentage en miel.
Y
: le volume du miel considéré.
 Le volume de milieu de culture est :
V milieu = V mélange – V miel
75
Le milieu de culture (gélose Mueller Hinton) doit être liquéfié et maintenu dans un
bain-marie à 50° C pour éviter leur solidification et la destruction des enzymes du miel.
Dans des conditions d’asepsie, à l’aide d’une seringue, une quantité précise du miel
(calculer selon la méthode précédante) à tester est mise dans un tube à essai, maintenue
pendant 1minute dans le bain marie réglé à 50°c, puis additionner à la gélose Mueller Hinton.
L’homogénéisation du mélange se fait à l’aide d’un vortex, ensuite, on va couler ce
mélange dans des boites de pétri stériles et on les laisses solidifier sur une surface froide.
1.3. Préparation de l’inoculum :
A partir d’une culture pure de 18h sur milieu d’isolement, racler, à l’aide d’une anse
de platine, quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques.
o Décharger l’anse dans 5 à 10ml d’eau physiologique stérile à 0,9%.
o Bien homogénéiser la suspension, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc
Farland (108 UFC/ml) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm.
o La suspension peut être ajustée en ajoutant, soit de la culture si elle est moins
concentrée, ou bien de l’eau physiologique stérile si elle est trop concentrée.
o L’ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suit la préparation de
l’inoculum.
o L’incubation pendant 24 heures à 37°C.
1.4. Lecture :
Quand il existe des colonies bactériennes qui poussent sur la boite dans un cercle de
5mm de diamètre ; on dit que la CMB n’est pas déterminé ; au contraire, s'il y a une absence
des colonies bactériennes ; on dit que le milieu est stérile.
La CMB est la plus faible concentration du miel inhibant toute croissance visible après
un temps d’incubation de quarante-huit heures pour la bactérie testée. La CMB permet de
définir la sensibilité des souches bactériennes à notre miel.Il faut déterminer la concentration
où il y a inhibition des souches bactériennes visibles à l’œil.
76
B./ HUILE ESSENTIELLE DE THYMUS FONTANESII :
1. PRESENTATION DE LA PLANTE
Thymus fontanesii est un sous arbrisseau à tiges dressées et robustes, à feuilles oblongueslancéolées, entières et glabres, de 10 à 12 mm de long et à fleurs blanches ou pales à peine
plus longues que le calice.
FIGURE N°02 : Photo de la plante « Thymus fontanesii »
La plante est cueillie au mois de Mars 2011 dans la région de Malaab Wilaya de
Tiaret. Elle est séchée à l’ombre et à température ambiante entre 10 et 15 jours. Seules les
feuilles sont utilisées pour l’extraction des huiles essentielles.
2. EXTRACTION DE L’HUILE ESSENTIELLE DU THYMUS FONTANESII
Les huiles essentielles sont obtenues par Hydrodistillation : 100 g de plante sèche
imprégné d'eau distillée, est introduite dans un ballon, l'ensemble est porté à l'ébullition
pendant 2-3 heures. Les vapeurs dégagées d'huile; en traversant un réfrigérant se condensent
et chutent dans une ampoule à décanter. L'eau et l'huile se séparent par différence de densité.
Les huiles essentielles sont conservées à 4°C et à l’abri de la lumière.
77
FIGURE N° 03 : Montage de hydrodistillation
FIGURE N ° 04 : Illustration d’un appareil de l’hydrodistilation.
78
3. SOUCHES BACTERIENNES:
Dix souches bactériennes isolées des mammites sub-cliniques des chèvres de
différente région de Tiaret. Ces bactéries ont des CMI de miel très élevés de chaque
famille.Ces germes ont une réponse variable vis-à-vis les antibiotiques testés. (Staphylococcus
xylosus, E coli, Micrococcus spp, klebsiella spp, Streptococcus type D, Pseudomonas
aeruginosa, Stahylococcus aureus, Bacillus spp, Corynébactérium spp, et finalement
Enterobacter cloacea.
3.1. Inoculums
Les préparations des Inoculums sont faites selon les méthodes conventionnelles.
- A partir d’une culture pure de 18h sur milieu d’isolement, racler à l’aide d’une anse de
platine quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques.
- Décharger l’anse dans 5 à 10ml d’eau physiologique stérile à 0,9%.
- Bien homogénéiser la suspension, son opacité doit être équivalente à 0,5 Mc Farland
(108 UFC/ml) ou à une D.O de 0,08 à 0,10 lue à 625nm.
3.2. Détermination de l’activité antibactérienne de Thymus fontaneisii:
Un volume final de 1 ml est préparé dans des tubes stériles contenant Tween 80.
Le volume de 50μl d’HE diluée au 1/10ème puis, 1/20ème 1/30ème , 1/40ème, 1/50ème.
3.2.1. Détermination de la CMI:
Les CMI de 1/10ème ( HE diluées dans le Tween 80) sont déterminées en duplicate dans un
milieu de Mulluer Hinton par contact direct de l’huile essentielle dont les concentrations sont
0,1%, 0,05%, 0,033% , 0,02%, 0,025%,0,016%, 0.014%, 0.012%, 0.011%, 0.01% (v/v) qui
correspond, respectivement, aux dilutions totales de: 1/100ème, 1/200ème, 1/300ème , 1/400ème ,
1/500ème , 1/600ème , 1/700ème , 1/800ème et 1/900ème .
On a utilisé un temoin négatif par essai avec tween 80 seule, et un temoin positif par
ensemensement de la souche bactérienne.
3.2.2. Méthodologie :
Cette méthode consiste à incorporer des volumes croissants de dilution au milieu de
culture de telle manière à obtenir, pour chaque mélange, un volume de 5ml.et la dilution soit
1/10ème.
Le calcul des volumes de dilution de l'huile est fait comme suit :
79
5 ml (volume total)
100 % (dilution+ gélose)
Y ml du mélange
X % du mélange
Dilution : huile + Tween 80
5ml
: le volume total du mélange (dilution+milieu de culture)
X%
: le pourcentage en dilution.
Y
: le volume de dilution considéré.
 Le volume de milieu de culture est :
V milieu = V mélange – V dilution
Le milieu de culture (gélose Mueller Hinton) doit être liquéfié et dans des conditions
d’asepsie, on prélève à l’aide d’une micropipette, une quantité précise du mélange d'HE à
tester mise dans un tube à essai, additionné de la gélose de Mueller Hinton.
L’homogénéisation du contenu (HE-gélose) se fait à l’aide d’un vortex, ensuite, on va
couler le mélange dans les boites de pétri stériles et on les laisse solidifie sur une surface
froide.
- L’ensemencement doit se faire dans les 15mn qui suivent la préparation de l’inoculum et
l'incubation à 37°C pendant 24 heures.
III./ Analyses statistiques :
Pour l’étude statistique, on a utilisé : Le calcul de la fréquence par le calcul du taux de CMT
(Taux des mammites sub-cliniques) ; Le calcul de la prévalence des germes impliquées dans
ces mammites caprines, et le test de Chi2 pour voir l’efficacité du test duCMT.
80
RESULTATS
81
IDENTIFICATION DES GERMES IMPLIQUES DANS LES MAMMIES
SUBCLINIQUES CAPRINES
1. LE CMT
Le test de CMT (n°= 298) de lait a révélé 101(33,9%) ca positifs et 197 (66,1%) cas
négatif, d’où un taux de mammites sub-cliniques (cas positifs) de 33.9% (fig N°06).
Fréquence%
25.00%
20.00%
15.00%
10.00%
5.00%
0.00%
Aspergillus niger
Aspergillus
nidulens
Test du CMT
FIGURE N° 05 : Les taux de CMT (positif et négatif).
Sur les 101 cas positif au test de CMT, ont révélé positivement dans les analyses
microbiologiques seulement, un cas négatif. Au contraire, pour les 197 cas négatif au test de
CMT, 6 prélèvements ont été positifs lors des analyses microbiologiques. (Tableau N° 01).
82
TABLEAU N° 01: La relation entre le CMT de lait de chèvre et l’analyse microbiologique.
Analyse
microbiologique
CMT
+
–
Total
+
100
1
101
–
6
191
197
106
192
298
Total
La spécificité est de 96% et une sensibilité de 99%.
TABLEAU N° 02 : Tableaux de Chi2 (Etude statistique ).
Tableau n°02 a : de Chi2 pour le test de CMT positif.
Test Statistique
Valeur
Df
Valeur de P
Chi-2
97,040
1,000
0,000
Tableau n°02 b : de Chi2 pour le test de CMT négatif.
Test Statistique
Valeur Df
Valeur de P
Chi-2
83,358 1,000 0,000
83
2.
Analyses microbiologiques :
Les anlyses microbiologiques ont révélé ce qui est porté dans le tableau suivant pour les
prévalences des bactéries puis une figure qui montre la prévalence des champignons dans les
mammites caprines :
TABLEAU N° 03: Prévalenceet étiologie des mammites sub-cliniques des chèvres.
La famille
Enterobacteriaceae
Genre
%
54,02
E coli and pontoea
spp 23,40
Klebsiella spp 55,31
Enterobacter spp 17,02
Micrococcaceae
SNC 15,54
S aureus 2,75
Micrococcus spp 10,09
Pseudomonaceae
Autres germes
Pseudomonas
aeruginosa 27,58
Streptococcus D 2,75
Bacillus spp 2,75
Corynebacterium
spp 0,91
84
En plus des bactéries, les analyses ont révélé la présence de champignons avec une
prévalence de
23,76% et 03,96% pour Asperegillus niger et Aspergillus nidulens,
respectivement (Fig N°06).
25.00%
Prévalenc e %
20.00%
15.00%
10.00%
5.00%
0.00%
Aspergillus niger
Aspergillus nidulens
Champigons
FIGURE N °06 : Figure de prévalences des champignons
85
3. Antibiogramme.
Dans cette partie, la sensibilité des souches
bactériennes isolées à partir des
mammites sub-cliniques est évaluée vis-à-vis certains antibiotiques à savoir, Ampicilline 10
μg, Amoxicilline 25 μg, Sterptomycine 10 μg, Penicilline 10 μg, Erytromycine 15 μg et
Tétracycline 30 μg.
Les tests ont montré que Micrococcus spp et Klebsiella spp sont sensibles à la
Streptomycine et la Tétracycline, par contre, Pseudomonas aeruginosa, E coli, Enterobacter
spp, Bacillus spp et SNC sont sensibles uniquement à la Streptomycine.
A noter que les Streptocoques, au contraire des S aureus, sont plus résistantes à tous
les antibiotiques testés (Tableau N° 04 a,b ,c,d).
Les résultats ainsi obtenus sont représentés par la (fig N°07).
TABLEAU N°04 a. La sensibilité des E coli, Enterobacter sp et Corynébacterium isolées des
mammites sub cliniques des chèvres aux antibiotiques testés.
E.coli
Enterobacter sp.
Corynebaterium
(n=9)
(n=8)
(n=1)
Sensible Resistant Sensible Resistant Sensible Resistant
n
N
%
N
%
N
%
n
%
Streptomycine 8 88,88 1 11,11
7
87,5
1
12,5
0
0
1
100
1 11,11 8 88,88
1
12,5
7
87,5
0
0
1
100
Erytromycine 3 33,33 6 66,66
2
25
8
75
0
0
1
100
Tétracycline
4 44,44 5 55,55
6
75
2
25
1
Ampicilline
2 22,22 7 77,77
1
87,5
7
12,5
0
0
1
100
Amoxiciline
6 66,66 3 33,33
2
25
6
75
0
0
1
100
Penicilline
%
n
%
100 0
0
86
TABLEAU N°04 b: Sensibilité de Streptococcus aureus et Bacillus spp et SNC
isolées des mammites sub-cliniques des chèvres aux antibiotiques testés
Bacillus sp.
(n=3)
Sensible
S. aureus
(n=4)
Resistant
Sensible
SNC
(n=20)
Resistant
Sensible
Resistant
N
%
n
%
N
%
N
%
N
%
n
%
Streptomycine
3
100
0
0
4
100
0
0
17
85
3
15
Penicilline
0
0
3
100
2
50
2
50
3
15
17
85
Erytromycine
0
0
3
100
4
100
0
0
16
80
4
20
Tétracycline
1
33,33
2
66,66
3
75
1
25
13
65
7
35
Ampicilline
0
0
3
100
3
57
1
25
7
35
13
65
Amoxiciline
0
0
3
100
4
100
0
0
16
80
4
20
TABLEAU N°04 c: Sensibilité de Micrococcus spp et Klebsielle spp isolées des mammites
sub-cliniques des chèvres aux antibiotiques testés
Micrococcus sp.
(n=12)
Sensible
Klebsiella sp.
(n=26)
Resistant
Sensible
Resistant
N
%
n
%
N
%
N
%
Streptomycin
e
10
83,33
2
16,66
23
88,46
3
11,53
Penicilline
9
75
3
25
1
3,84
25
26,15
Erytromycine
7
58,33
5
41,66
11
42,3
15
57,69
Tétracycline
9
75
3
25
15
57,69
11
42,34
Ampicilline
6
50
6
50
3
11,53
23
88,46
Amoxiciline
6
50
6
50
15
57,69
11
42,3
87
TABLEAU N°04 d: Sensibilité de Streptococcus D et Pseudomonas aeruginosa isolées des
mammites sub-cliniques des chèvres aux antibiotiques testés.
Streptococcus D
(n=3)
Sensible
Pseudomenas aeruginosa
(n=24)
Resistant
Sensible
Resistant
N
%
N
%
N
%
n
%
Streptomycin
e
0
0
3
100
18
75
6
25
Penicilline
0
0
3
100
0
0
24
100
Erytromycine
1
33,33
2
66,66
11
45,83
13
48,14
Tétracycline
1
33,33
2
66,66
14
58,33
10
41,66
Ampicilline
0
0
3
100
0
0
24
100
Amoxiciline
2
66,66
1
33,33
16
66,66
8
33,33
pourcentage %
.
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
sensible
résistant
Les antibiotiques testés
FIGURE N°07 : Pourcentage de l'antibiorésistance de souches bactériennes isolées des
mammites sub cliniques des chèvres.
88
II/ Activité antimicrobienne de l’huile essentielle et le miel sur les souches isolées des
mammites caprines.
A/ LE MIEL
Les résultats du miel multi-floral utilisé dans notre expérimentation ont montré une
concentration minimale bactéricide (CMB) variante de 11 à 14 %. Cette concentration est de
l’ordre 11,96± 0,00% pour Corynebacterium spp, les SNC ont une CMB de 12,66 ± 4,27%.
Pour les souches suivantes : Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp, Micrococcus spp,
Enterobacter spp, E. coli, S. aureus, Bacillus spp ont une CMB de (13 ± 3,13 ; 13,37 ± 2,63 ;
13,55 ± 2,06 ; 13,09 ± 0,84 ; 13,53±3,95 ; 13,25 ± 0,95 ; 13 ± 4,24) % respectivement et
finalement, pour Streptococcus D a une CMB 14 ± 1,22%.
B/ HUILE ESSENTIELLE DE THYMUS FONTANESII :
Les souches de chaque famille de bactéries ayant une CMB élevée pour le miel ont
subi un traitement par l'huile de Thymus Fontanesii. La CMI de cette dernière varie entre les
dilutions suivantes: 1/100-1/300. Elle est de 1/100 pour E coli, Micrococcus spp,
Streptococcus D, Staphylococcus aureus, et Bacillus spp, 1/200 pour Corynebacterium spp,
Enterobacter cloacea, et pour Staphylococcus Xylosus, Klebsiella spp et Pseudomonas
aeruginosa, la CMI est de 1/300 (Tableau N°06).
89
TABLEAU N°05 : La CMI déterminée par l'huile de Thum des souches qui ont une CMB la
plus élevée de miel.
Bacteries
CMB du miel%
CMI d'huile
Staphylococcus xylosus
25
1/300
E coli
19
1/100
Micrococcus spp
16
1/100
Klebsiella spp
16
1/300
Streptococcus D
15
1/100
Pseudomonas aeruginosa
15
1/300
Staphylococcus aureus
14
1/100
Bacillus spp
16
1/100
Corynébacrterium spp
13
1/200
Enterobacter cloacea
14
1/200
90
DISCUSSION
91
Cette étude prospective sur les mammites sub-cliniques des chèvres locales dans la région
de Tiaret a permis de caractériser la prévalence et l’étiologie de quelques souches
bactériennes et fongiques.
I. / IDENTIFICATION DES GERMES IMPLIQUES DANS LES MAMMIES
SUBCLINIQUES CAPRINES
1. CMT:
Les résultats obtenus pour les variations de CMT reflètent une réalité de terrain. On
considère un CMT négatif si le regroupement des notes est entre 0-2, et un CMT positif entre
3-4. Nous pouvons considérer un quartier infecté dont le CCS dépasse (2-3) le seuil fixé
(750000 à 1 million des cellules par ml) (De Cremaux, 1995 ; Menzies et Ramanoon, 2001 ;
Bergonier et al., 2003). On peut arriver à la discrimination d’un niveau de 750000 cellules/ml
du CMT.
Le taux élevé des mammites sub-cliniques peut être due au manque d’hygiène
(Blowey et Edmondson, 2000). Ces auteurs affirment que la plus part des cas des mammites
cliniques et sub-cliniques sont d’origines hygiéniques. Cela correspond parfaitement à la
situation de nos élevages.
D’ordre général, les mammites sub-cliniques varie entre 06-47% ; ces valeurs sont
rapportées par (Poutrel et al., 1997 ; Sanchez et al., 1999 ; While et Hickley, 1999 ; Hall et
Rycroft, 2007).
Mdegela et al., ( 2004) ont démontré que 74,5% des chèvres de Tanzanie sont atteintes
de mammites sub-cliniques.
Chez les brebis de la région d’Iran, un taux très faible (18,3%) de mammites subcliniques a été rapporté par Rahim Beheshti et son équipe en 2010.
Le diagnostic des mammites sub-cliniques n’est ni simple ni directement relié au CMT
seule. Cependant, d’autres tests biochimiques (NAGase, Scc…) ou bactériologiques sont
92
recommandés. Il faut ajouter d’autres tests (Poutrel et Lerondelle, 1983 ; Maisi et Riipinen,
1988 ; Fthenakis, 1995 ; Gonzalez-Rodriguez Carmenes, 1996).
Dans notre étude, La sensibilité et la spécificité du test de CMT étaient de 96% et
99%, respectivement. Perrin et al (1997) et Beheshti et al (2010) ont montré une sensibilité
et une spécificité de 87,6% et 92%, et 75% et 94,02%, respectivement.
2. Prévalence et étiologie des mammites sub-cliniques:
Dans cette étude, les entérobactéries et CNS (Staphylocoques à coagulase négative)
sont les agents les plus isolées, avec une prévalence de 65.13% et 15.59%, respectivement.
Staphylococcus aureus, Bacillus spp, Corynébactérium spp sont, également, présent mais
avec une faible prévalence.
La plupart des infections des mammites subcliniques ont pour origine S. aureus (75%)
et SNC (24,1%) (Lerondelle et Poutrel, 1984).
Bochev et Russenova, (2005) ; ont trouvé, sur un effectif de 478 chèvres de Bulgarie
des taux de 80,2% et 19,8% pour SNC et Staphylocoque aureus, respectivement.
En Espagne, une étude présentée par (Contreras et al., 1995) montre que la majorité
des SNC isolés sont S. caprea, 22% ; S. epidermidis, 20%) cela est comparable à nos
résultats ; en plus d’autres genres tels que (S. caprea ; S. lentus ; S. seuiuri ; S.xylosus) sont
isolés.
En Italie dans deux élevages caprins le taux des mammites subcliniques causées par
SNC (S. caprea ; S. epidermidis) est de 43% et 48%, respectivement (Moroni et al., 2005).
En Croatie, les caprins de race Alpine ont un taux élevé de S. aureus 72% (Kostelic et
al., 2009) contrairement à notre étude. Par contre un taux de16% pour les SNC ; Streptocoque
type D (06%) et Bacillus spp 02% qui sont proche de nos résultats.
Chez les ovins, les mêmes agents sont responsables des mammites sub-cliniques, avec
des pourcentages variables SNC : 69,2% ; S. aureus : 19,2% ; E coli et Corynébacterium
bovis (Beheshti et al., 2010).
93
3. La sensibilité des souches bactériennes isolées des mammites sub-cliniques des
chèvres vis-à-vis des antibiotiques testés:
L'étude de la sensibilité ou la résistance des germes impliqués dans les mammites aux
antibiotiques a une grande importance du point de vue clinique et économique. Cette
résistance peut être due au mauvais ou à un traitement incomplet par les antibiotiques (Tras
et al., 2007).
La résistance des souches bactériennes peut avoir une origine génénitique (Jensen et
al., 1999) ; le gène erm(C) est le gène codant de la résistance des staphylocoques aux
macrolides (Jensen et Aarestrup, 2005).
Les antibiotiques de Lactame sont utilisés dans le traitement des mammites de
chèvres (Moroni et al., 2004). Dans notre étude, la majorité des souches bactériennes
montrent une résistance vis-à-vis de ces antibiotiques.
Les souches isolées des mammites caprines, ainsi que dans les mammites bovines,
montrent une résistance contre la Penicilline G (Da Silva et al., 2004 ; Turutoglu et al., 2006).
Les résultats de notre travail montrent que S aureus, Bacillus spp, Enterobacter spp,
Klebsiella spp et Micrococcus spp sont sensibles à la majorité des antibiotiques testés.
Moroni et al., (2005) et Tras et al., (2007) ont démontré cette sensibilité des germes
responsables des mammites de chèvres aux antibiotiques.
La sensibilité des germes vis-à-vis des lactames et les fluroquinolones ont été reporté
chez les ovins par (Fthenakis, 1994; Pengov and Ceru, 2003) et les bovins par (Turutoglu et
al., 2006).
Dans notre étude, Streptococcus D et
Pseudomonas aeroginosa se sont
avérés
résistants à presque tous les antibiotiques testés. Par contre, Aydin et al., (2009), ont trouvé
une sensibilité des
Streptococcus spp à différents antribiotiques à savoir,
Lactames,
Erythromycine, Oxytétracycline et florfenicol.
94
II/ Activité antimicrobienne de l’huile essentielle et le miel sur les souches isolées des
mammites caprines.
A/ LE MIEL
Les résultats de la CMB ont montré que le miel utilisé dans notre étude, à des
concentrations variant entre 10-14%, était efficace contre les bactéries isolées des mammites
sub-cliniques des chèvres locales.
Cette activité antibactérienne varie selon les régions et la composition des plantes où
pâtures les abeilles (Bradshaw, 2011 ; Hegazi, 2011).
Selcuk et Nevin (2002) ont détecté que le miel de la Turquie a un effet antibactérien
vis-à-vis de tous les germes isolés cliniquement. Ainsi, Mullai et Menon (2007) ont démontré
que les différents miels (miel de
MANUKA et le miel Indien) ont une activité
antimicrobienne contre Pseudomonas aeruginosa, E coli et S aureus.
Beaucoup d'études ont révélé que les miels de différentes régions ont une large
variabilité dans leur activité antimicrobienne. Cette dernière peut avoir des concentrations
inférieures à 3% et supérieures à 50% (French et al., 2005 ; Lusby and al., 2005; Wilikinson
et al., 2005; Hegazi, 2011).
Nicolaas J et al., ( 2008) ont trouvé une concentration d’inhibition de leur miel entre
25 et 50 %. De même, certains miels ont une concentration inhibitrice minimale envers
plusieurs espèces bactériennes inférieure à 11% (1.8-11%) (Willis et al., 1992 ; Wilikinson et
al., 2005).
Jeddar et al., (1985) ont trouvé que la plupart des germes (Gram+ et Gram-) ne
poussent pas sur des concentrations d’environ 40%.
L'activité antimicrobienne de notre miel est très importante .Cette inhibition peut être
dû à plusieurs facteurs tels que :

L'action osmotique qui est la quantité d'eau libre : les valeurs moyennes d'activité de
l'eau du miel varie entre 0.562-0.62, valeurs suffisamment basses pour inhiber la
croissance de la majorité des bactéries (Listner, 1975; Chirife et al.,1982; Molan,
1992).
95
Cependant, certaines bactéries dites osmotolérantes supportent des valeurs d'eau
beaucoup plus basses. Ainsi, la croissance de Staphylococcus aureus n'est inhibée que
pour des valeurs d'eau inférieures à 0.86, ce qui correspond à un miel standard à une
concentration de 29% (Molan, 1992)
Or, de nombreux auteurs rapportent une inhibition de croissance de cette bactérie pour des
concentrations de miel beaucoup plus faible (George et al., 2007 ; Cooper et Jenkins,2009).
Ceci est comparable à nos résultats (CMB pour les Staphylococcus aureus : 13.25 ± 0.95).

L'enzyme glucose oxydase : elle catalyse la réaction permettant d'obtenir du peroxyde
d'hydrogène et de l'acide gluconique à partir de glucose, d'oxygène et d'eau. Cette
enzyme n'est active qu'une fois le miel est dilué. Le taux de production de peroxyde
d'hydrogène dans le miel varie de façon non proportionnelle à sa dilution. Bang et al,
(2003) ont constaté que des concentrations en miel comprises entre 30-50% permettent
l'accumulation d’un taux de peroxyde d'hydrogène maximal.
Le taux de glucose oxydase pouvant varier d'un miel à l'autre, même d'origine florale
similaire (White, 1966 ; Van den berg et al., 2008).

Les facteurs non peroxyde et les composés phénoliques et flavonoiques sont des
molécules dotées de propriétés antibactériennes trouvées dans le miel et la propolis
(Radwan et al., 1984 ; Hegazi et al., 1996 ; Weston et al., 2000 ; Cushinie et Lamb,
2005; Estevinho et al., 2008).
B./ Pouvoir antibactérien de l'huile essentielle de Thymus fontanesii:
La CMI de l'huile de Thymus fontanesii a montré une inhibition des bactéries avec des
dilutions variant entre 1/100 et 1/300. E coli, Micrococcus spp, Streptococcus D,
Staphylococcus aureus, Bacillus
spp sont inhibés à une dilution de 1/100 ; pour
Corynebacterium spp et Entrobacter cloacea, la dilution d’inhibition est de 1/200 par contre,
pour Staphylococcus Xylosus, Klebsiella spp et Pseudomonas aeruginosa, celle-ci est de
1/300.
Les huiles essentielles, produites à partir des plantes, semblent d’ailleurs être plus
actives que les extraits isolés des mêmes plantes (Demetzos et al., 2002).
96
Le thymol, composé majoritaire de l’HE de thym est une substance naturelle ayant un
effet antibactérien, antifongique et antioxydant (Rastogi et al., 1983 ; Manou et al., 1998).
Dob et al., (2006) ont mis en évidence des composés de Thymol et de monoterpénes
dans les huiles essentielles de Thymus fontanesii de Djelfa, la même chose est rapportée par
Ghannadi et al., (2004).
Les concentrations minimales inhibitrices sont de l'ordre de quelques μg/ml, avec une
bonne efficacité antibactérienne manifestée par l'huile essentielle de Thymus fontanesii. Cette
activité puissante de Thymus fontanesii est en relation avec la teneur élevée en Thymol, un
composé phénolique connu pour ses propriétés antibactériennes (Ettayebi et al., 2000). Plus
les teneurs en phénols sont élevées, plus l'efficacité antimicrobienne des huiles essentielles est
grande ( Cosentino et al.,1999).
Beaucoup de travaux ont souligné l'efficacité antifongique du Thymol. Cette molécule
possède un très large spectre d'activité antimicrobien et elle est naturellement présente dans
les essences de la plupart des espèces de thym (Bounatirou et al., 2007).
Selon les travaux menés par Ultée, (1999), le traitement de Bacillus cereus par le
carvacol, un isomère de position du thymol, conduit à une perte immédiate du potassium
cellulaire, de la dépolarisation de la membrane cytoplasmique et de l’efflux de l’ATP
cellulaire.
Le mode et le mécanisme d'action des huiles essentielles et de leurs composés ne sont
pas totalement compris et les recherches se poursuivent. Mais quelques auteurs ont donné
plusieurs suppositions selon leurs observations:
- Une action sur le métabolisme énergétique (Gill et Holley, 2004).
- Interruption de la force proton motrice de la membrane cellulaire.
97
- Dénaturation non spécifique du cytoplasme de la paroi et de la membrane cellulaire (
Manou et al., 1998) et dénaturation des protéines par les composés phénoliques (Madigan et
al., 1997).
D'autres auteurs mentionnent une relation entre la structure et l'activité
antibactérienne des molécules qui constituent les huiles essentielles par la présence de certains
groupes fonctionnels: les composés aldéhydiques et phénoliques sont très actifs dans certains
essais bien déterminés (Friedman et al., 2002). Les structures phénoliques sont les plus
actives sur des microorganismes, par la présence du groupe hydroxyle et sa position. Les
aldéhydes ont, aussi, une activité antimicrobienne puissante ; la présence de l'oxygène dans
les cétones augmente les propriétés antimicrobienne des terpènes (Dorman et Deans, 2000).
La présence des liaisons sulfures, est un facteur important dans l'activité
antimicrobienne de l'huile essentielle de l'ail et des autres alliums, par ordre décroissant on a :
diallyl tetrasulfure > diallyl trisulfure > diallyl disulfure > diallyl monosulfure (Tsao et Yin
2001).
L’organisation architecturale de la paroi cellulaire des bactéries Gram positives est
moins complexe que celle des bactéries Gram négatives. Cette différence structurale les rend
plus sensibles à l’action des huiles essentielles et autres extraits de plantes (Kalemba et
Kunicka, 2003). Toutefois, certaines bactéries Gram négatives, comme C. jejuni, sont
reconnues pour être particulièrement sensibles à l’action des huiles essentielles (Wannissorn
et al., 2005, Rossi et al., 2007).
Nos résultats sont en accord avec ceux de Haddouchi et al., (2009). Ce dernier, malgré
ce qui est connu à propos de la résistance des bactéries Gram négatif aux huiles essentielles
(Cosentino et al., 1999 ), il apparaît dans notre étude, que l'huile essentielle de Thymus
fontanesii a un effet sur les bactéries Gram négatif et positif.
98
Conclusion et recommandations
99
Le lait de notre étude présente l’intérêt de pouvoir étre valorisé de maniére
économique intéressante. Ce produit contribue à l’autoconsommation ; notre expérimentation
a élucidé un statut infectieux important, mais les éleveurs ne sont pas conscients de
l’existance des mammites sub-cliniques, ni la résistance élevée des germes impliqués dans ces
mammites vis-à-vis des antibiotiques utilisés sur terrain.
Dans notre étude, les résultats ont montré une prévalence des mammites sub-cliniques
élevée qui est de l’ordre de 33,9%.
La bactériologie a montré que les entérobactéries représentent 54,02% dont E.coli et
Pontea spp avec un taux de 23,40% ; Klebsiella spp 55,31% ; Enterbacter spp 17,02% et les
staphylocoques à coagulase négative ont une prévalence de 15,54% ;
Pseudomonas
aeruginosa 27,58%, alors que Staphylococcus aureus, Micrococcus spp, Streptococcus type
D, Bacillus spp, Corynebacterium spp ont une prévalence de (02,75% ; 10,09% ; 02,75% ;
0,91%) respectivement.
Notre étude a montré aussi la présence des champignons, avec un taux recensé est de
23,76% pour Aspergillus niger et 03,96% pour Aspergillus nidulens.
Concernant la sensibilité aux antibiotiques, la majourité des souches bactériennes ont
montré une résistance vis-à-vis de la
pénicilline et de l’ampicilline (90,90% ; 80,19%)
respectivement alors qu’elles sont sensibles à la Streptomycine à un taux de (66,66%).
Aussi, cette étude a montré que les entérobactéries et les SNC sont sensibles aux
Tétracycline, Erythromycine par contre S aureus est sensible à tous les antibiotiques.
La connaissance de l’étiologie des mammites est impérative, pour le choix du
traitement médical adéquat ou le remplacement par un traitement alternatif en cas de
résistance aux antibiotiques et leur prévention révélent une importance à la fois économique et
sanitaire.
Dans notre recherche, les traitements alternatifs, sur des tests in vitro, le miel a
montré une efficacité conséquente sur tous les germes isolés des mammites sub-cliniques
avec une CMB située entre 11-14% alors que l’huile de Thymus fontanesii est actif à des
CMI de 1/300-1/100%.
100
A la lumière de ce travail nous recommandons ce qui suit :

Poursuivre cette étude par des essais in vivo pour confirmer les résultats obtenus in
vitro.

Approfondir les recherches sur les produits naturels comme alternative aux
antibiotiques.
101
Annexes
102
FIGURE N ° 01 : Photo de la galerie API 20 E.
FIGURE N° 02: Photo de la partie des sucres dans la galerie Api 20 E
103
FIGURE N°03: Identification des souches par la production d'esculine et la production de
gaz.
FIGURE N°04: Utilisation des galeries Api Staph 20.
104
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