Année 2012-2013 - Demande d`allocation doctorale ED Santé
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Année 2012-2013 - Demande d’allocation doctorale ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549 1. Informations administratives : Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Sébastien ROGER Unité : UMR INSERM U1069 – « Nutrition, Croissance et Cancer » Equipe : unité mono-équipe dirigée par Pr Stéphan Chevalier Email de l’encadrant : [email protected] 2. Titre de la thèse : Nature des interactions fonctionnelles entre le canal sodique NaV1.5 et l'échangeur NHE1 dans les invadopodes des cellules cancéreuses mammaires. Conséquence sur l’invasivité et le développement métastatique. 3. Résumé : (1 page maximum, en times 11) Le cancer du sein est le cancer féminin le plus fréquent et représente la première cause de mortalité des femmes par cancer dans le monde. La forte mortalité associée à ce cancer dépend essentiellement du développement des métastases, pour lesquelles il n’existe à ce jour aucun marqueur ni traitement spécifique. Le microenvironnement tumoral est un élément clé dans la progression cancéreuse. En particulier il a été montré que le milieu extracellulaire des tumeurs était plus acide que celui des tissus normaux, avec un pH compris entre 6,2 et 6,8 au lieu de pH 7,2-7,4 et que ceci favorisait la dissémination métastatique des cellules cancéreuses (Cardone et al., 2005). Ce phénomène est associé à l’« Effet Warburg », qui correspond à la sélection de cellules cancéreuses ayant une préférence métabolique pour la production d’ATP par la glycolyse (Kroemer and Pouyssegur, 2008). Une étape clé dans le développement métastatique est l’invasion de la matrice extracellulaire par les cellules cancéreuses. Le canal sodique dépendant du voltage NaV1.5 est exprimé dans des biopsies de tissu cancéreux mammaire, et non dans les tissus sains, et son niveau d’expression est corrélé au développement métastatique (Fraser et al., 2005; Yang et al., 2012). Nous avons montré que l’activité de ce canal potentialise l'invasion de la matrice extracellulaire par les cellules cancéreuses mammaires (Roger et al., 2003). La fonctionnalité du canal NaV1.5 est associée à une acidification extracellulaire, qui potentialise l’activité protéolytique des cathepsines B et S extracellulaires (Gillet et al., 2009). Le canal NaV1.5 est co-localisé avec l’échangeur Na+/H+ de type 1 (NHE1), dans les radeaux lipidiques riches en cavéoline-1 (cavéoles), et augmente son activité d’efflux de protons, conduisant à l’acidification du pH périmembranaire (Brisson et al., 2011). Notre étude récente tend à montrer que le canal NaV1.5 est responsable d’une modulation allostérique de l’activité de NHE-1. Par ailleurs NaV1.5 et NHE1 sont co-localisés dans les invadopodes des cellules cancéreuses mammaires, qui sont des structures protrusives impliquées dans la dégradation de la matrice extracellulaire (Brisson et al., en révision dans J Cell Science). L’hypothèse que nous formulons est que, dans les cellules cancéreuses mammaires, l’activité des complexes protéiques contenant le canal NaV1.5 (associé à ses sous-unités auxiliaires β) et l’échangeur NHE1 (complexe NaV), pourrait accroître le risque de développer des métastases. Ce projet de thèse consiste par conséquent à 1) comprendre in vitro la nature des interactions fonctionnelles entre ces deux transporteurs ioniques membranaires et déterminer les mécanismes moléculaires de l’invasivité cancéreuse mammaire (formation et activité des invadopodes) et 2) déterminer, in vivo, l’implication des protéines du complexe NaV dans la croissance tumorale et le développement des métastases dans un modèle murin de xénogreffe de lignées de cellules cancéreuses mammaires humaines. Principales techniques utilisées (déjà validées): - Culture cellulaire (dont les techniques d’évaluation de l’invasivité cellulaire : inserts d’invasion, invasion de matrices tridimensionnelles de matrigel) - Biologie moléculaire et cellulaire (extraction ARNm, RT-PCR, amplification et purification de plasmides, transfection cellulaire, isolement de radeaux lipidiques sur gradients de saccharose, western blotting, co-immunoprécipitation, cross-linking) - Electrophysiologie cellulaire (patch clamp configuration cellule entière) pour la mesure de l’activité des canaux sodiques NaV1.5 et du potentiel de membrane cellulaire - Spectrofluorimétrie (sondes pH : BCECF-AM et SNARF-1, fluoresceine-DHPE, sonde sodium : SBFI-AM, sondes de potentiel de membrane) - Microscopie de fluorescence (mesure de la protéolyse grâce à l’utilisation de substrats fluorogéniques des protéases extracellulaires de type z-FR-AMC, DQ-gelatin®, MagicRed®, immunocytofluorescence - Etude des invadopodes par épifluorescence (U1069), microscopie confocale et SIM (Plateforme Nikon Imaging Center- Institut Curie) et par enrichissement de fractions invadopodiales issues de cellules cultivées sur couche de gélatine. - Xénogreffes de cellules cancéreuses mammaires humaines chez la souris immunodéprimée (plateforme In Vivo du Cancéropôle Grand-Ouest). Originalité du projet: L’unité U1069 « Nutrition, Croissance et Cancer » est un groupe leader sur le plan mondial travaillant sur l’implication des canaux ioniques et en particulier des canaux sodiques NaV dans les propriétés d’invasivité des cellules cancéreuses. Le projet exposé ici est un projet original qui tente de déterminer la nature des interactions entre NaV1.5 et NHE1, deux protéines membranaires surpexprimées dans les cancers du sein et associées à la progression métastatique. Ceci permettra de mieux caractériser les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans l’invasivité des cellules cancéreuses et le développement des métastases. Références bibliographiques : Brisson, L., Gillet, L., Calaghan, S., Besson, P., Le Guennec, J. Y., Roger, S. and Gore, J. (2011). Na(V)1.5 enhances breast cancer cell invasiveness by increasing NHE1-dependent H(+) efflux in caveolae. Oncogene 30, 2070-6. Cardone, R. A., Casavola, V. and Reshkin, S. J. (2005). The role of disturbed pH dynamics and the Na+/H+ exchanger in metastasis. Nat Rev Cancer 5, 786-95. Fraser, S. P., Diss, J. K., Chioni, A. M., Mycielska, M. E., Pan, H., Yamaci, R. F., Pani, F., Siwy, Z., Krasowska, M., Grzywna, Z. et al. (2005). Voltage-gated sodium channel expression and potentiation of human breast cancer metastasis. Clin Cancer Res 11, 5381-9. Gillet, L., Roger, S., Besson, P., Lecaille, F., Gore, J., Bougnoux, P., Lalmanach, G. and Le Guennec, J. Y. (2009). Voltage-gated Sodium Channel Activity Promotes Cysteine Cathepsindependent Invasiveness and Colony Growth of Human Cancer Cells. J Biol Chem 284, 8680-91. Kroemer, G. and Pouyssegur, J. (2008). Tumor cell metabolism: cancer's Achilles' heel. Cancer Cell 13, 472-82. Roger, S., Besson, P. and Le Guennec, J. Y. (2003). Involvement of a novel fast inward sodium current in the invasion capacity of a breast cancer cell line. Biochim Biophys Acta 1616, 107-11. Yang, M., Kozminski, D. J., Wold, L. A., Modak, R., Calhoun, J. D., Isom, L. L. and Brackenbury, W. J. (2012). Therapeutic potential for phenytoin: targeting Na(v)1.5 sodium channels to reduce migration and invasion in metastatic breast cancer. Breast Cancer Res Treat.
