PROCESSUS D`EVALUATION DES PROJETS DE THESE
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Année 2015-2016 - Demande d’allocation doctorale ED Santé, Sciences Biologiques et Chimie du Vivant (SSBCV) n°549 1. Informations administratives : Nom de l’encadrant responsable de la thèse : Dr Driffa Moussata Unité : INSERM UMR 1069 Equipe (si unité multi-équipes): Email de l’encadrant : [email protected] Co-encadrant éventuel : Dr P Besson 2. Titre de la thèse : Implication des canaux sodiques dépendants du voltage dans la carcinogénèse colorectale 3. Résumé : Parmi les cancers colorectaux (CCR), on distingue plusieurs catégories telles que les cancers sporadiques et les cancers sur maladie inflammatoire chronique de l’intestin (MICI, incluant la rectocolite hémorragique et la maladie de Crohn), se distinguant par leur voie de cancérogénèse (1). Parmi les facteurs impliqués dans les cancers sporadiques, on trouve les canaux ioniques qui ont été identifiés comme étant pro-oncogènes avec une action sur le contrôle de la prolifération cellulaire et l'apoptose, le contrôle de la migration/invasion et la propagation métastatique. Parmi eux, on trouve les canaux sodiques dépendants du voltage (Nav) qui sont sur-exprimés dans le tissu tumoral colique des cancers sporadiques. Dans les lignées de cellules cancéreuses humaines de colon SW620, SW480, et HT29, il a récemment été identifié l’expression d’ARNm pour plusieurs isoformes de NaV, les transcrits les plus abondants étant ceux encodant le canal Nav1.5. La présence des protéines Nav1.5 a été confirmée par immunocytochimie et leur activité par patch clamp (2). La présence des protéines NaV1.5 à la membrane plasmique de la surface luminale des cellules cancéreuses a également été confirmée par immunohistochimie sur un panel de biopsies humaines de cancer du côlon sporadique, tandis qu’il n’existait aucun marquage au niveau du tissu colique noncancéreux (2). Il a été montré que le milieu extracellulaire des tumeurs est plus acide que celui des tissus normaux et que ceci favorise la dissémination métastatique des cellules cancéreuses. Ce phénomène est associé à l’« Effet Warburg », qui correspond à la sélection de cellules cancéreuses qui relarguent une quantité importante de protons issus de leur métabolisme glycolytique afin de conserver un pH intracellulaire (pHi) compatible avec leur survie (3). Parmi les régulateurs du pH intracellulaire, l’échangeur Na+/H+ de type 1 (NHE1), pourtant ubiquitaire, a attiré l’attention car il est surexprimé dans les cellules cancéreuses et son activité est associée à la survie des cellules cancéreuses et à la progression tumorale. Il est connu que l’expression de NHE1 est augmentée dans le cas de rectocolite hémorragique en réponse à une variété de signaux inflammatoires tels que l’interleukin-1 (IL-1), le TNF-alpha ou l’interféron gamma (4). Dans les cellules cancéreuses mammaires, nous avons récemment montré que les effets pro-invasifs et pro-métastatiques des canaux Nav1.5 sont liés à une stimulation de l’efflux de protons par les échangeurs NHE1 (5) dans les invadopodes (6), et que leur inhibition pharmacologique par l’utilisation d’un antiangoreux utilisé en clinique, la ranolazine, permet de réduire la colonisation métastatique des tissus (7). Ainsi, nous nous proposons d’étudier et de comparer l’expression et activité des canaux ioniques de type Nav, de leur sous-unités auxilaires β et de l’échangeur NHE1 à partir de prélèvements humains de cancers colo-rectaux sporadiques et sur MICI, en parallèle d’une étude mécanistique sur lignées cellulaires de cancer colorectal comparés à des lignées non cancéreuses, et d’étudier les régulations du pH intra et extracellulaire en relation avec les canaux NaV afin de mieux comprendre les mécanismes de cancérogénèse colique. Comme les voies de cancérogénèse colique sont différentes en cas de CCR sporadique et sur colite et que les lignées cellulaires disponibles ne font pas la différence, nous prévoyons de mettre en culture des explants issus de biopsies de CCR sporadique et de CCR issu de colite (cultures organotypiques) (8). Cette technique est maitrisée au sein de l’unité. Ce projet a pour but de renforcer la connaissance des mécanismes cellulaires conduisant au développement du cancer colique sur MICI et permettra d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques qui pourront être utilisés dans la détection endoscopiques. En effet, la détection des lésions pré-néoplasiques est rendue difficile par le fait qu’elles apparaissent en muqueuse plane. Parmi les techniques endoscopiques aidant au diagnostic des lésions néoplasiques, on compte l’endomicroscopie confocale qui permet de réaliser un examen histologique in vivo grâce à l’utilisation de fluorescéine injectée par voie intra-veineuse (9). En EMC, les cellules cancéreuses apparaîssent noires et de grande taille. Or il est bien connu que la diffusion de la fluoroscéine est pH-dépendante et que les canaux NaV participent à la régulation du pH, ce qui en fait une cible potentielle de marquage de cancer. Il a été publié récemment qu’il était possible d’utiliser des marqueurs tels que des anticorps marqués à la fluorescéine ciblant des lésions néoplasiques (10). Sur un modèle de CCR sur colite murin au DSS (Dextran Sulfate Sodium) traité à l’azoxyméthane, il est possible d’explorer in vivo les lésions aux différents stades de cancérogénèse (inflammation-dysplasie-cancer) en endoscopie conventionnelle et en endomicroscopie confocale. Ce matériel pour animal et ce modèle murin sont disponibles dans l’unité de recherche CREATIS avec qui le Dr Moussata collabore. Il est donc possible d’envisager d’explorer in vivo les canaux ioniques cibles sur colite avec dégénérescence colique. Puis, à partir des prélèvements murins, il est envisagé de réaliser un examen histologique avec microscope à fluorescence pour confirmer les résultats obtenus en endomicroscopie confocale.Ce travail permettra à terme d’améliorer la détection des lésions néoplasiques sur MICI qui ont la particularité d’être difficile à détecter en endoscopie. Principales techniques utilisées: - Culture cellulaire (dont les techniques d’évaluation de la survie, de la prolifération de la migration et de l’invasivité cellulaire) - Mise en culture d’explants issus de biopsies (cultures organotypiques) - Biologie moléculaire et cellulaire (extraction ARNm, RT-PCR, extraction de protéines, western blotting, co-immunoprécipitation) - Electrophysiologie cellulaire (patch clamp configuration cellule entière) - Spectrofluorimétrie (sondes pH : BCECF-AM et SNARF-1, fluoresceine-DHPE ; sondes sensibles au Na+ : sodium green, SBFI) - Microscopie d’épifluorescence (immuno-cytofluorescence, microscopie time-lapse) - Marquages immunohistochimique Références : 1. Yashiro M. Molecular Alterations of Colorectal Cancer with Inflammatory Bowel Disease. Dig Dis Sci. 2015; 60: 251-63. 2. House CD, Vaske, CJ, Schwartz, AM, et al. Voltage-gated Na+ channel SCN5A is a key regulator of a gene transcriptional network that controls colon cancer invasion. Cancer Res 2010; 70, 6957-6967. 3. Lemasters JJ, Holmuhamedov EL, Czerny C, et al. Regulation of mitochondrial function by voltage dependent anion channels in ethanol metabolism and the Warburg effect. Biochim Biophys Acta. 2012; 1818:1536-44. 4. Farkas K, Yeruva S, Rakonczay Z Jr, et al. New therapeutic targets in ulcerative colitis: the importance of ion transporters in the human colon. Inflamm Bowel Dis. 2011;17:884-98. 5. Brisson L, Gillet L, Calaghan S, et al. Na(V)1.5 enhances breast cancer cell invasiveness by increasing NHE1-dependent H(+) efflux in caveolae. Oncogene 2011 ; 30 : 2070-6. 6. Brisson L, Driffort V, Benoist L, et al.. NaV1.5 Na⁺ channels allosterically regulate the NHE-1 exchanger and promote the activity of breast cancer cell invadopodia. J Cell Sci. 2013;126 :4835-42. 7. Driffort V, Gillet L, Bon E, et al.. Ranolazine inhibits NaV1.5-mediated breast cancer cell invasiveness and lung colonization. Mol Cancer. 2014;13:264. 8. Rajcevic U, Knol JC, Piersma S et al. Colorectal cancer derived organotypic spheroids maintain essential tissue characteristics but adapt their metabolism in culture. Proteome Sci. 2014 ; 11;12-39. 9. Moussata D, Goetz M, Gloeckner A et al. Confocal laser endomicroscopy is a new imaging modality for recognition of intramucosal bacteria in inflammatory bowel disease in vivo. Gut. 2011; 60: 26-33. 10. Atreya R, Neumann H, Neufert C et al. In vivo imaging using fluorescent antibodies to tumor necrosis factor predicts therapeutic response in Crohn's disease. Nat Med. 2014; 20: 313-8.
