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PROJET DE THESE: Subversion de l'activité des cellules dendritiques par Toxoplasma gondii
Identification des mécanismes régulant le recrutement du réticulum endoplasmique de la cellule
hôte à la vacuole parasitophore après infection par Toxoplasma gondii et impact sur l’activité de
présentation antigénique des cellules dendritiques.
Introduction
Toxoplasma gondii est un protozoaire qui appartient au phylum des Apicomplexes. Ce phylum
regroupe de nombreux agents pathogènes d’incidence majeure sur les plans médicaux et vétérinaires,
comme Plasmodium responsable du paludisme ou Eimeria responsable des coccidioses aviaires. T.
gondii peut infecter les homéothermes, dont l’Homme, chez lequel il provoque la toxoplasmose, une
des parasitoses les plus répandues dans le monde. Parasite intracellulaire obligatoire, le tachyzoïte
forme réplicative de T. gondii se multiplie rapidement à l’intérieur de la cellule hôte, au sein d’une
vacuole parasitophore (VP). Sous la pression du système immunitaire, les tachyzoïtes évoluent en
kystes, qui perdurent pendant toute la vie de l’individu au sein des muscles, des yeux et du système
nerveux central. Asymptomatique chez les sujets sains, l’infection par T. gondii est fréquemment
associée au développement d’encéphalites ou de choriorétinites chez les individus immuno-déprimés
(SIDA, chimiothérapie, greffe d’organes). De plus, une primo-infection chez la femme enceinte peut
causer la mort in utero du fœtus ou des malformations néonatales graves (1).
Les Apicomplexes sont caractérisés par la présence d’organites de sécrétion spécialisés: les rhoptries,
les micronèmes, et les granules denses (GD) qui assurent l’entrée et la survie du parasite au sein de la
VP. Les protéines des micronèmes (MIC) sont sécrétées de manière précoce dès l’adhésion du parasite
à la surface de la cellule hôte et assurent la formation de la jonction mobile, structure transitoire par
laquelle le parasite s’ancre de manière ferme à la surface de la cellule hôte et pénètre activement par
motilité ATP-dépendante. Les protéines des rhoptries (ROP) sont libérées dans le cytoplasme de la
cellule dès la formation de la jonction mobile, mais également plus tardivement au sein de la VP en
formation, permettant sa maturation. Les protéines ROP ciblées vers la membrane de la VP ou dans le
cytoplasme de la cellule hôte jouent un rôle crucial dans la modulation de la réponse immunitaire et
métabolique de la cellule infectée, assurant ainsi la survie du parasite (2). Par exemple, ROP18 stimule
la dégradation par la voie du protéasome du facteur de transcription ATF6 impliqué dans la réponse
au stress, ainsi que de la sous-unité p65 du complexe NFB, bloquant ainsi la réponse proinflammatoire et la clairance du parasite (3). Les protéines des granules denses (GRA) sont sécrétées
massivement au sein de la VP dès l’entrée du parasite et contribuent à la formation d’un réseau
membranaire nano-tubulaire présent au sein de l’espace vacuolaire optimisant l’échange de nutriments
avec la cellule hôte et la synchronisation des divisions cellulaires. De plus, certaines protéines GRA
sont ancrées à la membrane de la VP (MVP) et pourraient activer le recrutement des organites de
l’hôte tels que le réticulum endoplasmique (RE), le Golgi et les mitochondries.
Durant la division du parasite, ces protéines sont synthétisées de novo par un mécanisme de
bourgeonnement) vésiculaire depuis l’appareil de Golgi vers les compartiments endosomaux puis vers
les organelles de sécrétion apicaux. Des études préalablement menées dans le laboratoire ont permis
d’identifier des molécules parasitaires régulant le triage et le transport différentiel des protéines ROP,
MIC et GRA depuis le Trans-Golgi-Network (TGN) vers leurs organites respectifs de destination
durant la réplication parasitaire (r4). Ainsi, nous avons pu démontrer que le complexe adapteur AP1,
qui assure le triage et le transport de cargos au sein de vésicules à clathrine entre le TGN et les
compartiments endosomaux chez les autres Eucaryotes, régule chez T. gondii, la biogénèse des
rhoptries matures et d’une sous-population de micronèmes (5). De manière distincte, la petite GTPase
Rab11A active l’exocytose des granules denses durant l’invasion et la réplication parasitaire mais n’est
pas impliquée dans la biogénèse des ROP et MIC ou leur sécrétion.
D’autre part, une étude du laboratoire a permis de démontrer que la perturbation du trafic
intracellulaire et ainsi le mode de sécrétion des protéines ROP et MIC entraîne l’absence de
l’établissement d’une réponse mémoire protective corrélée à une inhibition de la mise en place d’une
immunité adaptive dépendante de la réponse T-helper1 chez la souris infectée (6). Les mécanismes
cellulaires et/ou moléculaires responsables de cette inhibition n’ont pas été étudiés mais ces résultats
indiquent que la sécrétion régulée des protéines ROP sous leur forme mature (active) est indispensable
1
à la mise en place d’une immunité stérile contre la Toxoplasmose. Les cellules dendritiques (DCs)
représentent des cellules essentielles à l’induction précoce de la réponse pro-inflammatoire et au
contrôle de la dissémination du parasite (revue:7). En effet, d’une part, les DCs infectées sécrètent
massivement la cytokine pro-inflammatoire IL-12 qui active les cellules NK et les lymphocytes TCD4+ et T-CD8+, sources de la sécrétion de l’interféron  (IFN) qui stimule la réponse cytotoxique et
permet l’élimination du parasite ou son maintien sous forme latente. Par ailleurs, les cellules
dendritiques sont des cellules présentatrices d’antigènes capables de charger des peptides dérivés de
protéines endogènes et exogènes sur les molécules du Complexe Majeur d’Histocomptabilité I et II
(CMHI et II) pour les présenter respectivement aux lymphocytes T CD4+ et CD8+. L’infection aigüe
ou latente de T. gondii est efficacement contrôlée par l’activation des LT CD8+, suggérant
l’intervention du mécanisme de présentation des antigènes parasitaires par les molécules du CMHI.
Dans cette voie, les protéines exogènes sont protéolysées par le protéasome puis les peptides sont
dirigés dans la lumière du RE via le système de transport TAP puis chargés sur les molécules CMHI
avant que le complexe ne soit ciblé vers la membrane plasmique par transport vésiculaire. De manière
générale, le mécanisme de présentation antigénique pour les pathogènes qui résident dans des vacuoles
intracellulaires reste peu connu, en particulier le mécanisme permettant aux protéines des microorganismes internalisés d’être libérées dans le cytoplasme pour être protéolysées par le protéasome.
Certaines études ont montré que la présentation des antigènes de T. gondii aux LT CD8+ dépend de
l’activité de la machinerie de présentation du CMHI, du système de transport TAP (8), et du système
de rétro-translocation ERAD (9, 10) qui permet aux protéines mal repliées de sortir dans le cytosol
pour leur protéolyse. De manière intéressante, il a été montré que le RE est activement recruté à la
vacuole parasitophore et fusionne partiellement avec sa membrane. Cependant les effecteurs
parasitaires responsables de ce recrutement ne sont pas encore identifiés. Aussi l’hypothèse a été
formulée que le recrutement du RE à la MVP permet à certaines protéines de T. gondii d’utiliser le
système de retro-translocation ERAD afin d’accéder au cytosol avant d’être protéolysées en peptides
par le protéasome. Les peptides générés sont ensuite transportés à nouveau par le système TAP dans la
lumière du RE pour être chargés sur les molécules CMHI (Figure 1). Cette hypothèse reste à être
confirmée et en particulier, d’autres études proposent que le recrutement et la fusion du RE, du Golgi
et des mitochondries avec la MVP permettent au parasite d’importer une source essentielle de lipides
pour la biogénèse des membranes durant la réplication parasitaire. Il reste donc primordial de
démontrer que le contact entre le RE et la VP est requis pour la régulation du processus de
présentation antigénique ainsi que d’élucider les mécanismes moléculaires permettant la fusion des
deux organites.
Nos résultats préliminaires ont montré que l’infection des cellules dendritiques murines primaires
dérivées de la moelle osseuse (BMDCs) par des parasites de type I et de type II entraîne dans les deux
cas, l’activation de l’expression des molécules de co-stimulation (CD40, CD80, CD86, CMHI et
CMHII) nécessaires à la stimulation des lymphocytes T lors du processus de présentation antigénique.
Cependant, comme auparavant démontré dans les macrophages et les fibroblastes, l’activation de la
réponse inflammatoire dépendante du facteur de transcription NFB, notamment responsable de la
sécrétion de l’IL-12, est détectée seulement après infection par les souches de Type II. Ce résultat
suggère que le parasite peut réguler de manière différentielle l’activité de présentation antigénique des
DCs et leur rôle d’immuno-modulateurs via la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires.
D’autre part, nous avons pu détecter, par des études en immunofluorescence, le recrutement du RE à la
VP formée après l’infection de fibroblastes humains et des BMDC murines par des parasites de type I
et de type II. Cependant, les parasites de type II, en plus de l’inhibition de la réponse proinflammatoire, sont plus efficaces à recruter le RE au sein des BMDCs, ce qui n’est pas le cas lors de
l’infection des fibroblastes, suggérant un mécanisme de régulation spécifique aux cellules
présentatrices d’antigènes.
Finalement, nous avons observé que le recrutement et la fusion du Golgi avec la MVP, est détecté
tardivement après l’étape d’invasion et requière la réplication du parasite au sein de la vacuole. Cette
observation suggère que ce recrutement requière la sécrétion de facteurs parasitaires de manière dosedépendante. Au contraire, le recrutement du RE à la VPM est un phénomène très précoce, qui peut
s’observer avant l’initiation du premier cycle de réplication parasitaire, suggérant un rôle des protéines
ROP sécrétés précocement durant l’étape d’invasion. Cette observation pourrait être corrélée au fait
qu’un temps précoce d’invasion (4 heures) est suffisant pour activer la présentation antigénique
2
médiée par le CMHI.
But du projet de recherche:
Au cours de ce stage de thèse, nous proposons d’une part, d’identifier les mécanismes moléculaires
régulant le recrutement du RE à la VPM dans les DCs infectées par Toxoplasma gondii. D’autre part,
nous examinerons l’impact du recrutement du RE sur l’activité de présentation antigénique médiée par
le CMHI. Pour cela, nous examinerons la contribution putative de facteurs parasitaires sécrétés à la
VPM dans le recrutement du RE en utilisant des souches parasitaires présentant des défauts sélectifs
de sécrétion, soit des protéines ROP, soit des protéines GRA. D’autre part, nous adresserons la
contribution de la cellule hôte dans ce processus, en identifiant les molécules clés nécessaires à la
fusion du RE et de la MPV par une approche de criblage basé sur l’ARN interférence (siRNA).
Finalement, l’impact de la fusion entre le RE et la MVP sur la biologie de la cellule dendritique sera
examiné et en particulier, l’activité de présentation antigénique. Cette étude permettra la genèse de
données originales sur la manipulation de la cellule dendritique par T. gondii et devrait aider au
développement d’outils pour la recherche vaccinale contre la toxoplasmose.
Figure 1 : Schéma présentant le mécanisme
hypothétique de la présentation antigénique dans les
cellules dendritiques infectées par T. gondii. Les
protéines parasitaires sécrétées dans l’espace
vacuolaire ont accès à la lumière du RE après fusion
de celui-ci avec la membrane de la VP. Les
protéines parasitaires sont transférées dans le
cytosol par le système ERAD (sec61) et dégradées
par le protéasome en peptides. Ces peptides sont
transportés dans le RE par le système de transport
TAP et ensuite chargés sur les molécules du CMHI
avant leur sécrétion à la membrane plasmique de la
cellule hôte. D’après Goldszmid et al., 2009 (8)
Programme du projet et échéancier:
Génération des souches déficientes pour la sécrétion des protéines ROP et GRA
Nous disposons de souches parentales de type I (RH) et type II (Pru) exprimant la GFP et la
luciférase, ainsi que de souches sécrétant de manière constitutive l’antigène modèle ovalbumine
(RH-SAG-Ova et Pru-SAG-Ova). Dans un premier temps, nous génèrerons les souches parasitaires
nécessaires à notre étude déficientes pour la sécrétion sélective soit des protéines ROP, soit des
protéines GRA. Pour cela, la transfection de parasites avec des plasmides permettant la surexpression inductible et rapide de la protéine APmu1 ou de la protéine Rab11A sous leur forme
sauvage ou mutée sera réalisée. En effet, nous avons préalablement démontré dans les fibroblastes
humains que la sur-expression des formes mutées de Rab11A (Rab11ADN) ou de APmu1
(AP1DN) entraîne un défaut de sécrétion des protéines GRA et ROP, respectivement (5). Des
souches parasitaires transgéniques stables et clonales exprimant ces différentes protéines sauvages
et mutées seront isolées afin d’infecter les BMDCs primaires de souris.
I-
Impact des protéines parasitaires ROP et GRA sur l’activation des cellules
dendritiques primaires.
L’activation des cellules dendritiques infectées par les souches parasitaires déficientes dans la
sécrétion des protéines ROP ou GRA sera examinée par cytométrie en flux en suivant l’expression
des molécules de co-stimulation des DCs : CD40, CD80, CD86, CMHI, CMHII. L’induction de la
réponse pro-inflammatoire sera examinée, d’une part, par la mesure de la sécrétion de
l’interleukine 12. D’autre part, nous examinerons par western blot la modulation de certaines voies
de signalisation régulant la réponse pro-inflammatoire précoce, et notamment les facteurs de
II-
3
transcription NFB et STAT3, tous les deux activement modulés par le parasite lors de l’infection.
III-
Caractérisation des mécanismes régulant
endoplasmique à la vacuole parasitophore:
III-1-
le
recrutement
du
réticulum
Contribution des effecteurs parasitaires ROP et GRA :
Les effecteurs parasitaires impliqués dans le recrutement du RE à la VP ne sont pas identifiés. Des
données préliminaires ont suggéré que les protéines GRA3 et GRA5 présents à la MVP pourraient
interagir avec la protéine CALMG présente à la membrane du RE (11). Cependant des études
menées dans notre laboratoire ont montré que la déplétion de GRA3 (parasite knock-out) n’a pas
d’impact sur le recrutement du RE. De plus, la délétion de GRA5 ne permet pas non plus d’abolir
ce recrutement (communication personnelle avec C. Mercier, Grenoble). Ces résultats suggèrent
que plusieurs effecteurs parasitaires GRA pourraient intervenir simultanément dans ce phénomène
de recrutement ou que ce dernier fasse intervenir les protéines ROP. Afin d’adresser ces
hypothèses, dans un premier temps, nous utiliserons les souches déficientes pour la sécrétion
sélective des protéines ROP ou des protéines GRA, et examinerons par immunofluorescence si le
recrutement du RE dépend d’une de ces deux familles d’effecteurs parasitaires. Nous étudierons
avec précision le mode d’interaction du RE et de la VPM, ainsi que la co-localisation éventuelle
entre certaines protéines parasitaires présentes à la membrane de la VP (GRA et ROPs) et des
protéines du RE de l’hôte, par microscopie à super-résolution. En particulier, nous nous
intéresserons aux protéines localisées dans le RE et impliquées dans la machinerie de présentation
antigénique tels que, TAP2, Sec61 et CMHI.
Cette étude en microscopie à fluorescence sera complétée par une visualisation de l’interaction REVP en microscopie électronique 3D-View effectuée par la plateforme d’imagerie BiCel de l’institut
Pasteur de Lille (Collaboration avec Nicolas Barois). Ces techniques de microscopie sont établies
au laboratoire. Après identification de la famille des effecteurs parasitaires impliqués dans le
recrutement du RE à la MVP (ROP ou GRA), l’identification précise de certains facteurs pourra
être envisagée en utilisant un criblage ciblé basé sur la technologie du CRISPR/Cas 9 en cours
d’optimisation dans notre laboratoire.
III-2-
Identification des protéines de l’hôte impliquées dans le recrutement du RE à la VPM
Afin de caractériser la contribution de la cellule hôte dans le mécanisme de recrutement du RE à la
VP, nous avons entrepris une collaboration avec la plateforme HCS (High content screening) de
l’Institut Pasteur de Lille, dirigée par Priscille Brodin. Notre but consiste à identifier des cibles, par
criblage fonctionnel par extinction de gènes à l’échelle du génome (banques de siRNA), qui
pourraient être directement impliquées dans le recrutement du RE à la VP. Ce système repose sur
l’acquisition automatique haute résolution et haute sensibilité en microscopie confocale de milliers
de cellules suivie de l’analyse quantitative en flux des images. Nous avons d’ores et déjà optimisé
avec l’équipe de P. Brodin les conditions d’infection des fibroblastes humains et des BMDM avec
les souches parentales de type I et type II-GFP et les conditions de transfections des siRNA pour
obtenir une extinction efficace du gène d’intérêt.
Nous nous focaliserons uniquement sur les cibles identifiées régulant la dynamique du trafic intravésiculaire de la cellule hôte, tels que les petites GTPases de la famille Rab et les protéines régulant
les évènements de fusion membranaire (SNARES). Nous confirmerons le rôle fonctionnel d’une
cible d’intérêt par des approches de biologie cellulaire et biochimie. En particulier, par des
expériences de chromatographie d’affinité, nous tenterons d’identifier les protéines parasitaires qui
pourraient interagir avec la molécule identifiée dans la cellule hôte et nous étudierons si l’activité
de cet effecteur de l’hôte est activement modulée par le parasite afin de recruter le RE à la VP.
IV-
Impact de la sécrétion des effecteurs parasitaires et du recrutement du RE sur la
présentation antigénique
Cette partie du projet se fera en collaboration avec le Dr Nicolas Blanchard qui dirige une équipe
de recherche à l’Université de Toulouse et qui possède une longue expertise dans le domaine de la
4
présentation antigénique lors de l’infection par T. gondii. Notamment, le laboratoire de Nicolas
Blanchard a pu obtenir des hybridomes de cellules TCD8+ reconnaissant spécifiquement des
antigènes de T. gondii (12). Après identification des effecteurs parasitaires impliqués dans le
recrutement du RE à la VPM, nous examinerons si un lien direct peut être tracé entre l’absence de
recrutement du RE et la capacité à présenter les antigènes par les BMDCs aux TCD8. Une
approche similaire sera appliquée après inactivation d’une molécule de la cellule dendritique
précédemment identifiée dans le crible siRNA comme essentiel au recrutement du RE. De plus, en
collaboration avec N. Blanchard, la relevance de nos résultats obtenus dans les BMDCs sera
consolidée par une étude similaire dans les DC dites conventionnelles (CD8+) directement isolées
de la rate des souris. La virulence de ces souches parasitaires sera examinée dans un modèle
d’infection de la souris. En particulier, nous examinerons la dissémination parasitaire dans l’animal
par imagerie à bioluminescence (souche exprimant la luciférase) et la capacité à établir la forme
chronique de l’infection par la détection des kystes formés dans le cerveau des souris infectées. Ces
deux techniques sont déjà établies dans le laboratoire.
Mots clés : Toxoplasma gondii, facteurs de virulence, cellules dendritiques, réponse inflammatoire,
présentation antigénique, réticulum endoplasmique
Echéancier
Tâche 1 : Génération des souches déficientes pour la
sécrétion des protéines ROP et GRA
Tâche 2 : Impact de l’infection par T. gondii sur l’activation
des cellules dendritiques primaires.
Tâche 3 : Etude du recrutement du réticulum endoplasmique
(RE) autour de la vacuole parasitophore
Tâche 4 : Identification des mécanismes de recrutement du
RE à la VP
Tâche 5 : Impact de la sécrétion des effecteurs parasitaires et
du recrutement du RE sur la présentation antigénique des DCs
et la virulence du parasite chez la souris
2016-2017
2017-2018
2018-2019







Collaborations
D’une part, l’encadrant (Sabrina Marion) possède une longue expérience dans le domaine de la
phagocytose de pathogènes intracellulaires au sein des macrophages primaires humains ou murins, en
particulier sur l’étude des mécanismes développés par le micro-organisme pathogène pour manipuler
son hôte et la maturation phagosomale (13, 14). Depuis 3 ans, elle s’est focalisée sur la biologie du
parasite intracellulaire Toxoplasma gondii. Le projet sera d’autre part, réalisé en collaboration avec
deux autres laboratoires avec lesquels nous avons d’ores et déjà établis de solides interactions et
débuter nos analyses expérimentales. Au sein du CIIL (Institut Pasteur de Lille), le laboratoire de
Priscille Brodin qui dirige la plateforme effectuera le crible siRNA sur les cellules dendritiques
infectées. Les études sur la présentation antigénique se feront en collaboration avec Nicolas Blanchard
à l’Université de Toulouse. Aussi, ce projet pourra être valorisé par des échanges de savoir et d’outils,
par des communications orales dans les différents instituts de recherche concernés et enfin par
l’écriture de publications ou de demandes de financement jointes.
Profil du candidat
L’étudiant en thèse sélectionné devra faire preuve d’une grande motivation pour le projet et de la
capacité à interagir et travailler avec d’autres équipes. Il devra également faire preuve d’une grande
capacité d’organisation de son travail quotidien (écriture des protocoles, analyse des expériences et
discussion). Une formation préalable comprenant des bases théoriques ou expérimentales en
immunologie et/ou parasitologie représentera un avantage certain.
Références du projet
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6
RESEARCH PROJECT: Subversion of dendritic cell functions by Toxoplasma gondii
Identification of the molecular mechanisms regulating host ER recruitment during infection by
the intracellular parasite Toxoplasma gondii and impact on dendritic cell biology.
Introduction
Eukaryotic parasitic pathogens belonging to the phylum Apicomplexa are responsible for causing
severe mortality in humans and great economic losses in livestock. Toxoplasma gondii is of critical
importance to pregnant women, with primary infections having the potential to cause neonatal
malformations and even death to the developing foetus. In addition, the opportunistic nature of this
obligate intracellular parasite can lead to the development of encephalitis in immuno-suppressed
individuals after reactivation of lifelong persistent cysts in the central nervous system (1). The phylum
Apicomplexa is characterized by the presence of specific secretory organelles: the rhoptries (ROP),
micronemes (MIC) and dense granules (DG) that sequentially release their content into the host cell
enabling parasite invasion and intracellular survival. MIC proteins are first secreted and involved in
parasite attachment and gliding motility required for host cell penetration via the formation of a
transient structure, the moving junction (MJ). ROP proteins, immediately discharged after the MIC
proteins, are contained into club-shaped organelles anchored at the apex of the parasite by their
elongated neck. ROP proteins participate to the formation of the MJ as well as the establishment of the
intracellular parasitophorous vacuole (PV) in which the parasite multiplies intensively. ROP proteins
secreted into the host cell also play a crucial role in the modulation of innate immune responses to
promote parasite survival (2). Dense granule proteins (GRAs) are key virulent effectors exocytozed
during parasite entry into the vacuolar space and contribute to the formation of a nano- tubulovesicular network called the intravacuolar network (IVN). The IVN has been shown to be essential for
host nutrient import, regulation of parasitic antigen exposure at the PVM and synchronicity of parasite
cell division within the vacuole (3). These proteins are also inserted into the PVM and trigger the
recruitment of host cell organelles, such as the Golgi apparatus and the endoplasmic reticulum (ER)
(4). In addition, such as ROP proteins, GRA proteins can be secreted beyond the PVM and actively
modulate host gene expression and immune responses triggered upon infection (2). ROP, MIC and DG
organelles are synthetized de novo at each parasite replication cycle by budding and fusion of vesicles
emerging from the ER and Golgi apparatus. Recent findings of our lab have recently identified factors
that differentially regulate the sorting and transport of ROP, MIC and GRA proteins from the TransGolgi- Network (TGN) towards their final destination (5). In particular, we found that the clathrin
adaptor AP1 regulates the biogenesis of rhoptry organelles and of a sub-population of micronemes (6).
Furthermore, our data indicate that the small GTPase Rab11A activates the exocytosis of dense
granules during both the invasion and replication of parasites, however is not involved in ROP and
MIC biogenesis and secretion.
Furthermore, a recent study from our lab demonstrated that re-routing the trafficking pathway of ROP
proteins, which modified their proteolytic maturation and secretory mode, inhibited the induction of
sterile immunity against parasite reinfection (7). This study revealed an essential role for apical
secretion in promoting T-helper 1–dependent adaptive immunity against T. gondii and provided strong
evidence for rhoptry-regulated discharge of antigens as a key effector for inducing protective
immunity (7). The cellular and molecular mechanisms that could explain this phenomenon were not
examined so far. Dendritic cells (DCs) are the key immune cells that induce the pro-inflammatory
response against the infection thereby controlling parasite dissemination (8). Infected DCs secrete the
pro-inflammatory cytokine IL-12, which triggers NK cells and CD4+ / CD8+ lymphocytes to secrete
IFN, a major cytokine that stimulates the cytotoxic response, promoting parasite clearance or the
establishment of the latent toxoplasmosis. In addition, DCs are known as professional antigen
presenting cells (APCs) that are specialized in loading peptides derived from exogenous and
endogenous sources onto both MHC class I and II molecules for presentation to CD8+ and CD4+ T
cells respectively. Toxoplasma infection is controlled in the acute and chronic phase of infection by
CD8+ T cells, which means that its antigens are effectively presented in the context of MHC class I
(8). During cross-presentation, endocytosed proteins are transported out of endosomes and
phagosomes into the cytoplasm. In the cytosol, proteins are processed by the proteasome into peptides,
which are transported by the TAP transporter into the endoplasmic reticulum, or back into the same
endosomes, where they associate with MHC I molecules. In general, the mechanisms allowing antigen
7
export to the cytosol from intracellular compartments containing pathogenic micro-organisms remain
mostly unknown. During phagocytosis of particulate material, previous studies suggested that the
phagosome fuses with the ER to form an ER-phagosome mix compartment. The TAP transporter of
the phagosomal compartment transports the antigens out to the cytosol for proteasomal degradation
and back into the compartment for loading onto MHC I. Similarly, it has been shown that Toxoplasma
VP recruits and fuses with the ER compartment (10, 11). However, the parasite effectors, likely
anchored at the PVM, that promote ER recruitment are not identified. The role of ER recruitment with
the PVM is still unknown but it has been proposed that it could modulate antigen presentation activity
of DCs (10, 11, 12). It has been proposed that T. gondii proteins use the ERAD machinery present in
the ER, to export proteins out to the host cytosol. These proteins are then processed into peptides
which are translocated back to the ER via the TAP transporter system and loaded on MHCI molecules
before to be targeted to the cell surface (11, Figure 1).
Therefore, it is important to determine whether the contact and fusion between the host ER and the
parasite PV is required to modulate antigen presentation activity in the context of MHC class I and to
identify the mechanisms regulating this process.
The preliminary data we obtained in the lab indicated that infection of primary bone marrow derived
DCs (BMDCs) by type I or type II strains of T. gondii induced in both cases, cell surface expression of
the co-stimulatory molecules (CD80, CD86, CD40, MHCI and MHCII). These molecules are required
to activate antigen presentation to T lymphocytes. However, as shown in previous studies, activation
of the pro-inflammatory pathway dependent on the NFB signaling was only activated after type II
strain infection. This data suggest that T. gondii can differentially modulate the antigen presentation
activity of the BMDCs from their immunomodulatory role (cytokine secretion).
In addition, we detected a clear recruitment of the ER at the PVM both, in human fibroblasts and in
BMDCs. However, while in fibroblasts, type I and II strains equally recruit the ER, this process is
more efficient with type II strain in BMDCs. This result suggests a specific regulation of this process
in BMDCs compared to fibroblasts. Furthermore, we observed that host Golgi recruitment at the PVM
is a late event that requires parasite division, suggesting that dose-dependent secretion of parasitic
factors, likely GRA proteins, are involved in triggering this recruitment. By contrast, ER recruitment is
an early event, detected before the first parasite division cycle has been initiated, suggesting the
involvement of differential molecular mechanisms. In particular, this observation favors the role of the
ROP proteins, which are secreted early at the stage of parasite entry into the host cell. This observation
also correlates with previous data showing that antigen presentation by DCs does not require parasite
division and can be activated early after parasite entry into the host cell.
Goal of the project:
The project aims to identify the molecular mechanisms triggering ER recruitment at the PVM in DCs
upon T. gondii infection and the impact of this process on the antigen presentation activity of DCs in
the context of the MHCI. To do so, we will first examine the potential role of parasitic factors secreted
at the PVM, by using parasite strains deficient in either, ROP protein secretion, or GRA protein
secretion. In addition, we will address the role of the host cell in this process by identifying key
molecules required for the anchoring and fusion of the ER with the PVM using a siRNA-based screen.
Finally, by inhibiting the ER recruitment at the PVM, we will assess the role of this process in DC
biology and in particular in antigen presentation.
8
Figure 1: Scheme showing the putative mechanism
by which host ER recruitment to the PVM
modulates antigen presentation in the context of
MHCI in DCs. See text for detailed description.
From Goldszmid et al., 2009 (8)
Project description
I-
Construction of the parasite strains deficient for ROP or GRA secretion
First, we will generate the parasite strains required for the project. To do so, we will transfect type I
(RH-GFP-Luc) and type II (Pru-GFP-Luc), as well as RH-SAG_Ova and Pru-SAG_Ova (strains
which constitutively secrete the model antigen OVA) with plasmids allowing the inducible and rapid
over-expression of wild type or mutated forms of TgAP1 and TgRab11A. Indeed, we have
demonstrated that the overexpression of these two parasite factors induced the deficient secretion of
ROP (AP1DN) and GRA (Rab11ADN) proteins at the PVM, respectively. Transgenic parasite clonal
lines will be generated to infect BMDCs and fibroblasts.
II-
Impact of the parasite factors ROP and GRA on DC activation
The activation of DCs infected by the parasite strains defective in ROP or GRA secretion will be
monitored by:
1- The surface expression of the co-stimulatory molecules (flow cytometry);
2- The induction of the early pro-inflammatory response. Two aspects will be studied. First, will
monitor IL-12 secretion by infected DCs (Elisa). Next, we will measure the activation of
known signaling pathways modulated during T. gondii infection such as the transcription
factors NFB and STAT3 (Western blot).
III-
Characterization of the molecular mechanisms regulating ER recruitment at the
PVM.
III-1Role of secreted parasite factors
The parasite factors involved in host ER recruitment at the PVM are not identified. Previous
studies suggested that GRA3 and GRA5 proteins, both anchored at the PVM and actively
secreted during parasite division in the vacuole, interact with the ER resident protein CALMG
(4). However, data obtained in our lab showed that parasites depleted for GRA 3 are not defective
in ER recruitment. Similarly, parasites depleted for GRA5 do not display any defect in recruiting
ER at the PVM (Personal communication with C. Mercier, Grenoble). Therefore these data
suggest that either, several GRA effectors act simultaneously and are required for efficient ER
anchoring at the PVM, either ROP proteins are the factors involved in this process. To explore
this aspect and narrow-down the possibilities, we will investigate by fluorescence microscopy
whether ER recruitment depends on one of the two effector families by using our parasite lines
defective for ROP or GRA secretion. We will also characterize in details the physical interaction
between the two host and parasite organelles using super-resolution microscopy and FIB-SEM
9
electron microscopy (collaboration with N. Barois, Platform BiCel, Pasteur Institute-Lille). In
particular, we will investigate whether parasite candidates (ROP and GRA proteins) localise at
ER- PVM contacts and will define the morphology of these contacts at the ultrastructural level.
After identification of the parasite protein family involved in ER recruitment (ROP or GRA), a
limited CRISPR/Cas9 screen will be applied to further identify the precise factors involved in this
process.
III-2.
Identification of the host proteins involved in ER recruitment at the PVM
In order to decipher the host mechanisms regulating ER fusion with the PVM, we have initiated a
collaboration with the HCS (High content screening) platform from Institute Pasteur-Lille,
headed by Priscille Brodin. We aim to identify host cell proteins involved in this process by
performing a genome-wide siRNA-based screen. We have already optimized the experimental
conditions: seeding and siRNA transfection of the primary DCs in 384 well plates, infection
conditions of the DCs for type I and type II parasite strains and imaging parameters.
We will focus our interest in host cell proteins known to be involved in intracellular compartment
dynamics, such as the small GTPases Rabs and the membrane fusion proteins of the SNARES
family. We will confirm the functional role of one selected hit using cellular biology and
biochemistry approaches. In particular, we aim to identify by affinity chromatography followed
by mass spectrometry whether the molecule of interest associates with a parasitic secreted factor
and we will study whether the activity of this host cell protein is actively modulated by the
parasite to regulate ER recruitment at the PVM.
IV-
Impact of secreted parasitic factors and host ER recruitment on antigen presentation
This part of the project will be achieved in collaboration with the lab of Nicolas Blanchard from
the university of Toulouse, who has a long expertise in antigen presentation in primary DCs and
macrophages upon T. gondii infection (12). Notably, the lab of N. Blanchard has generated TCD4+ and T-CD8+ hybridoma specifically recognizing T. gondii antigens. Therefore, after
identification of the parasite secreted effectors as well as host cell molecules involved in ER
recruitment at the PVM, we will address whether this process modulates the antigen presentation
activity of DCs to T-CD8+. Furthermore, the physiological relevance of our data will be
reinforced by performing similar experiments in conventional CD8 splenic DCs isolated from
mice. The virulence of our mutant parasite lines will be examined in vivo in mice, in particular for
their dissemination efficiency (luciferase imaging on whole animal) and the capacity to establish
chronic latent toxoplamosis by monitoring cyst formation in the brain. These techniques are
currently used in our lab.
Key words: Toxoplasma gondii, virulent factors, dendritic cells, inflammatory response, antigen
presentation, endoplasmic reticulum
2016-2017
Echéancier
Task 1: Construction of the parasite strains deficient for
ROP or GRA secretion
Task 2: Impact of the parasite factors ROP and GRA on
DC activation
2017-2018
2018-2019




Task 3: Characterization of the molecular mechanisms
regulating ER recruitment at the PVM.
Task 4: Impact of secreted parasitic factors and host ER
recruitment on antigen presentation
10

Collaborations
On one hand, the main PI (Ph.D supervisor) has a long expertise in phagocytosis of intracellular
pathogens in murine and human primary macrophages, in particular in the study of the
mechanisms developed by pathogens to subvert host cell functions and phagosome maturation
(13, 14). On the other hand, the project will benefit of collaborations with two other labs with
which, we have already established solid interactions to develop experimental procedures. The
HCS platform headed by P. Brodin will perform the siRNA-based screen on infected DCs. The
part of the project that aims to study antigen presentation will be performed with the expertise of
N. Blanchard’s laboratory. Therefore, this project will benefit of fruitful exchanges of knowledge
and will be promoted by oral communications in the different research institutes involved in the
project and joint publications.
Candidate profile
The selected candidate should show a great motivation for the project and a strong skill to interact
and work with other teams. He/she should be able to organize his/her daily tasks in a rigorous
manner (writing precise protocols, data analysis and oral discussion). A previous training in
immunology or parasitology will be a strong advantage. The technics used will range from cell
biology, classical chemistry to basic immunology.
References
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