diapos - Muséum national d`Histoire naturelle
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Berder 2013 : Corrélation, causalité et régulation en biologie Lier un site de liaison d'un facteur de transcription et son gène cible Laurent M. SACHS ([email protected]) Laboratoire Evolution des Régulations Endocriniennes Département Régulation, Développement et Diversité Moléculaire UMR 7221 CNRS Muséum National d’Histoire Naturelle Paris, France. Berder 2103 Groupe : Mécanisme d'action des récepteurs aux hormones thyroïdiennes. Patrice BILESIMO (Doctorant 2006-2010) Alexis GRIMALDI (Doctorant 2010-) Gladys ALFAMA (Technicien) Nicolas BUISINE (MC MNHN) : : MERLION Norin CHAI (Vet MNHN) Jean-Paul CHAUMEIL (Soins aux animaux) Ken Wing Kin SUNG Gérard BENISTI (Soins aux animaux) Xiaoan RUAN Yijun RUAN Ed LIU Berder 2103 Lier un facteur de transcription et son gène cible Définir le premier programme de régulation de la transcription = les gènes cibles directs Stratégie: Transcriptome (RNA-Seq et RNA-PET) FT Position (ChIA-PET) AAAAA AAAAA AAAAA Cible indirecte AAAAA AAAAA AAAAA Cible directe Berder 2103 Régulation par les hormones thyroïdiennes Action génomique 5 3' Cytoplasme 3 5' 3,5,3’ triiodothyronine, T3 Noyau Complexe Corépresseur RXR TR Complexe Coactivateur - + T3 Pas de transcription RXR TR + Transcription Berder 2103 La métamorphose des amphibiens Un modèle pour étudier les effets des hormones thyroïdiennes Effets pléiotropes des hormones thyroïdiennes Il existe une période post embryonnaire de sensibilité aux hormones thyroïdiennes chez les chordés Berder 2103 Autre développement post-embryonnaire chez les amphibiens Autres modèles pour étudier les effets des hormones thyroïdiennes E. coqui Axolotl Necturus Berder 2103 Métamorphose hormones thyroïdiennes dépendantes des poissons plats Turbot Stade larvaire Métamorphose Juvénile Berder 2103 HT et métamorphose : Autre métamorphose - Ciona intestinalis Larve Adulte Berder 2103 HT et métamorphoses : Autre métamorphose - l’oursin Pluteus Adulte Berder 2103 Métamorphose des insectes : toujours une histoire d’hormone Ecdystéroïdes pg/mg Drosophile 600 400 200 0 0 3 12 21 31 38 48 55 60 66 72 79 96 120 144 Larve 3ème instar heures Pupe Berder 2103 HT et période périnatale: chez les oiseaux T3 pg/L plasma Thyroïde fonctionnelle (E10) Poulet 5 4 3 2 1 0 26 1214 16 18 20 Embryon 0 1 Jours Eclosion Berder 2103 HT et période périnatale: chez les rongeurs T3 pg/L plasma Thyroïde fonctionnelle(E16) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Souris 5 10 15 0 2 4 6 10 15 21 Embryon Jours Naissance Berder 2103 HT et période périnatale: chez l’humain TH µg/L plasma Thyroïde fonctionnelle (4ème mois de gestation) 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 3 5 6 8 Gestation 3 6 9 12 Naissance Mois Berder 2103 HT et période périnatale: le crétinisme « Sans un minimum d’hormones thyroïdiennes au bon moment, la grenouille reste un têtard et le bébé humain est un crétin » Berder 2103 Synthèse des hormones thyroïdiennes Vigilance Les Fonctions Développement cérébral Audition Vision Appétit Activité cardiaque Reproduction Métabolisme Croissance Thermogenèse Berder 2103 Objectif: Lier TR à ses gènes cibles Stratégie: Transcriptome (RNA-Seq et RNA-PET) TR Position (ChIA-PET) AAAAA AAAAA AAAAA Cible indirecte AAAAA AAAAA AAAAA Cible directe Où sont les TR et où sont les gènes ? Technologies de Séquençage haut débit (échelle du génome) Berder 2103 Dessin experimental Transcriptome (RNA-Seq et RNA-PET) TR Position (ChIA-PET) AAAAA AAAAA AAAAA Cible indirecte AAAAA AAAAA AAAAA Cible directe Epiderme caudal +/- T3 Berder 2103 Méthodes: analyse du transcriptome AAAAA AAAAA AAAAA Cible indirecte RNA-Seq: Niveau d'expression AAAAA AAAAA AAAAA Coble directe + T3 - T3 RNA-PET: Annotation des transcrits cartographie début (5'end) et fin (3'end) des gènes Berder 2103 RNA-Seq et RNA-PET: nouveaux genes A Ensembl genes RNA-Seq Adult Brain RNA-PET Adult Brain B Ensembl genes RNA-Seq Adult Brain RNA-PET Adult Brain C Ensembl genes RNA-Seq Adult Brain RNA-PET Adult Brain Berder 2103 Nouvelle cartographie des gènes + ~730 kb A Ensembl genes RNA-Seq Adult Brain RNA-PET Adult Brain + ~130 kb B Ensembl genes RNA-Seq Adult Brain RNA-PET Adult Brain Berder 2103 Capture des variants alternatifs Ensembl genes RNA-Seq Adult Brain RNA-PET Adult Brain : L'orthologue humain est connu pour avoir > 30 variants -> des TSS -> des Terminaisons Berder 2103 Méthodes: ChIA-PET chromatin interaction analysis by paired-end tag sequencing TR Position ChIA-PET) AAAAA AAAAA AAAAA Indirect target AAAAA AAAAA AAAAA Direct target ChIA-PET: ChIP-Seq et 3C simultanément - Sites de liaison à l'ADN (~ ChIP-Seq) - Interactions physiques à longue distance - lien entre le site TR et le TSS du gène cible Pourquoi une méthode aussi complexe?: Sites de liaison des facteurs de transcription peuvent être très éloigné de leurs gènes cibles Berder 2103 Cartographie des sites de présence de TR 1 Mb +T3 ~ 2,000 sites -T3 seulement ~ 100 sites Berder 2103 Type de séquence dans les sites TR Recherche DR, IR et ER de AGGTCA avec 0 à 8 bp entre ½ site 70% des sites ont un élément de ce type DR1 (6%) DR2 (4.5%) ER8 (5%) ER6 (12%) IR5 (5%) DR4 (46.7%) AGGTCAnnnnAGGTCA DR (6, 7) IR (3, 6, 7) = 0% ER (0, 2, 3, 5, 7) Berder 2103 Prédiction des sites à partir de la séquence Scaffold_26 Predicted sites TR binding sites DR4 DR4 Au moins 32 DR4, mais seulement 2 lient TR Cause? Accéssibilité: Rôle de la chromatine. Modification des histones : méthylation de H3K4 Berder 2103 Liaison de TR à l'ADN et méthylation de H3K4 Scaffold_26 Gene annotation Predicted sites TR ChIP-Seq H3K4 me1 ChIP-Seq H3K4 me2 ChIP-Seq H3K4 me3 ChIP-Seq H3 ChIP-Seq Input Berder 2103 TR proche du site d'initiation de la transcription Scaffold_448: Locus TH/bZIP RNA-PET TR Position RNA-Seq Tail fin +T3 RNA-Seq Tail fin -T3 Berder 2103 Un nouveau gène cible des hormones thyroïdiennes Scaffold_210 RNA-Seq Tail fin -T3 RNA-Seq Tail fin +T3 ensembl RNA-PET TR Position Berder 2103 Où sont les TR par rapport aux genes A Ensembl TR binding sites B Ensembl TR binding sites C Ensembl TR binding sites D Ensembl TR binding sites E Comment lier TR à son gène cible? ChIAP-PET et Transcriptome Ensembl TR binding sites Berder 2103 Interaction moyen distance pour Klf9 Locus Klf9 RNA-PET TR position Long Range Interaction 33,000 bp 6,000 bp TSS RNA-Seq Tail fin +T3 RNA-Seq Tail fin -T3 Lien entre TR et le TSS Berder 2103 Une organisation 3D plus complexe Scaffold_81 RNA-PET TR positions 330,000 bp 150,000 bp Long range interactions RNA-Seq Tail fin +T3 RNA-Seq Tail fin -T3 Berder 2103 Organisation 3D du locus bcl6 dans le noyau lpp tprg1 bcl6 Berder 2103 Conclusion Où sont les gènes Où sont les sites de fixation des facteurs de transcription Evolution de notre perception du génome d'une lecture linéaire vers une lecture 3D Berder 2103 Merci Les grenouilles sont le lien entre l'obscurité et la lumière (l'inconnu et le connu) Berder 2103
