IAI PADOTEST 4*5®

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IAI PadoTest 4∙5
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IAI PadoTest 4∙5®
1. Description et procédure
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Le IAI PADOTEST 4∙5 est un test de biologie moléculaire qui permet l’identification et la quantification dans les
prélèvements de 4 bactéries indicatrices de la parodontite et du nombre total de bactéries présentes. Les
bactéries recherchées sont: Actinobacillus actinomycetemcomitans (Aa), Tannerella forsythia (Tf, ancien nom
était Bacteroides forsythus), Porphyromonas gingivalis (Pg) et Treponema denticola (Td). Ces bactéries sont
considérées comme des facteurs étiologiques importants de la parodontite. Le choix de ces marqueurs est
discuté dans le sous-chapitre 2 ci-dessous.
L’identification et la quantification bactériennes se fait par hybridation directe (sans amplification de l’échantillon
d’origine) de sondes spécifiques (marquées pour la chemiluminescence) sur l’ARN ribosomal des bactéries. Le
résultat de l’hybridation est subséquemment détectés et mesuré par chemiluminescence. Les sondes sont des
oligonucléotides spécifiques pour les 4 bactéries recherchées et des oligonucléotides ‘universels’ pour le calcul
des bactéries totales. Les séquences des sondes spécifiques ont été choisies sur des alignements de bactéries
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types, validées pour hybridation sur le programme Primer Premier et testées pour la spécificité par BLAST sur
toute la base de données GENBANK pour les bactéries. D’après ces tests, ces sondes sont parfaitement
spécifiques. Chaque sonde est modifiée en 3’ et 5’ pour permettre une mesure quantitative en
chemiluminescence. Avec cette méthode, il est possible de mettre en évidence des quantités de bactéries
relativement faibles.
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Procédure
Figure IV.1 : Procédure du IAI PADOTEST 4∙5
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A Prélèvement (effectué par le dentiste dans son cabinet) :
Une pointe buvard en cellulose est introduite dans le sillon gingival ou la poche parodontale à analyser.
Après 10” la pointe est retirée et placée dans un tube contenant 100 microlitres de tampon de lyse et de
préservation de l’ARN. Le tube est refermé et envoyé à IAI.
B Préparation des échantillons dans le laboratoire :
Les échantillons sont traités de telle sorte que l’ARN puisse être couplé à des membranes de Nylon chargé.
Un standard de quantification est traité en même temps que les tubes comme un échantillon supplémentaire.
C Dépôt sur membrane
Cinq membranes de Nylon chargé sont montées sur des appareils de filtration sous vide.
Des aliquotes de chaque échantillon et du standard sont déposés sur chacune des membranes.
D Après passage complet, les membranes sont démontées et passées aux UV pour fixer les acides nucléiques
au Nylon de façon covalente. Chaque membrane est identifiée afin d’être marquée pour une des 4 bactéries
recherchées et pour les bactéries totales.
E Hybridation avec sondes spécifiques marquées pour la chemiluminescence
Les membranes sont placées dans des tubes à hybridation et les sondes correspondantes sont ajoutées.
F Lavages
Après hybridation, les membranes sont lavées de façon telles que seules les liaisons sonde-ARN cible
parfaitement homologues sont stables.
Par la suite un marquage avec un system de révélation chemiluminescent est exécuté. La chemiluminescence
est mesurée dans un appareil approprié. Une image de chaque membrane est enregistrée et archivée. Les
résultats pour chaque tube sont calculés -au moyen de programmes informatiques spécifiquement écrits pour le
test- par rapport au standard et à une courbe de calibration de l’appareil. Toutes les valeurs, brutes,
intermédiaires et finales sont enregistrées et archivées. Il n’a pas d’intervention ni de transcription de la part de
l’opérateur dans les calculs.
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En plus d’évaluer la population de pathogènes bactériens, le IAI PadoTest 4∙5 permet une classification en 5
types de population bactérienne au sein des poches parodontales. Cette typologie est issue d’une importante
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étude unique en parodontologie. Grâce à cette typologie, le IAI PadoTest 4∙5 est une mesure de soutien
thérapeutique, car sa valeur informative va au delà du diagnostic brut des germes pathogènes parodontaux, en
attribuant à chaque type de poche un traitement approprié. Voir chapitre V.
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La limite de détection du PadoTest 4∙5 est de 5000 individus pour Actinobacillus actinomycetemcomitans, et
10000 pour les autres bactéries. Il faut garder à l’esprit que dès qu’une bactérie est présente et active, elle
devient en quelques heures une colonie de plusieurs dizaines de milliers d’individus.
2. Signification et objectif d’un examen microbiologique en parodontologie
L’évaluation des traitements parodontaux doit permettre de savoir si le traitement a conduit à un état permettant
de transférer le patient dans une phase de maintien ou s’il est nécessaire de poursuivre les mesures
thérapeutiques. En parodontologie classique, cette évaluation est réalisée par comparaison du niveau
d’adhésion, par la profondeur du sondage et éventuellement par la densité osseuse observée sur l’image
radiologique, ces mesures étant effectuées avant et après le traitement. Les difficultés d’interprétation résident
dans le fait de donner aux modifications perceptibles apparues suite au traitement, une valeur pronostique pour
l’évolution future. « Peut-on tolérer un vestige de poche ? », « Est-ce que le résultat obtenu est stable ? » se
demande le praticien. « Le pathogène a-t-il été éliminé ? » ou « Est-ce que les pathogènes potentiels ont été
suffisamment contenus pour que les tissus de l’hôte ne subissent plus aucun dommage ? », telles sont les
questions d’ordre microbiologique (Mombelli A., SMZ, Vol 102:2, 1992) auquel un test doit répondre afin d’aider
le médecin dentiste.
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Le Dr Hubert Jotterand, praticien genevois, souligne les rôles qu’un examen microbiologique doit apporter:
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
Motivation du patient
o
en début de traitement
o
en phase de maintien, en tant que support psychologique auprès des patients à tendance dépressive, comme on en
rencontre souvent dans les cas récidivants ou «réfractaires».
Contrôle de qualité après un traitement parodontal ou une péri-implantite (ces derniers traitements ont souvent une implication
financière importante en raison des réhabilitations prothétiques fixées sur les implants).
Surveillance à long terme des cas traités :
o
Indications pour un nouveau traitement, en phase de maintien, particulièrement pour des piliers stratégiques en
réhabilitation paro/prothétique.
o
Recherche du traitement minimal nécessaire, par exemple chez des personnes âgées ne désirant plus de traitement
«invasif».
Diagnostic différentiel trauma-occlusal/infection parodontale ou péri-implantaire.
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Or le IAI PADOTEST 4∙5 remplit tous ces rôles et apporte des réponses aux praticiens non seulement concernant
la présence et la quantité de pathogènes restant, mais aussi sur le pronostic et le traitement à suivre, grâce à la
typologie des poches.
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De la même manière, le IAI PADOTEST 4∙5 permet:



La mise en évidence rapide et précoce des patients à risque
Une diminution des traitements superflus (antibiotiques)
Une prescription d’antibiotiques dirigée et réalisée sur la base d’une indication.
3. Les 4 marqueurs choisis
Actinobacillus (Aggregatibacter) actinomycetemcomitans (Aa)
Aa est une bactérie en forme de bâtonnet, gram négative et anaérobie facultative. Elle a été phylogénétiquement
reclassée dans le genre Haemophilus, mais ce nom n’est que très peu employé. Elle est connue depuis
longtemps par son rôle pathogène très important dans la parodontite et d’autres infections telles que des
septicémies, méningites, endocardites et abcès pulmonaire et cérébrales.
Aa ne peut être éliminé de façon sûre par curetage/surfaçage radiculaire. Une antibiothérapie complémentaire
est habituellement nécessaire. Les antibiotiques actifs contre Aa sont amoxicilline, minocycline, doxycycline et
ciprofloxacin.
Aa peut migrer dans les tissus environnants et échapper ainsi au diagnostic. En conséquence, il est
recommandé d’analyser la poche la plus profonde de chaque quadrant. Avec 4 analyses, la probabilité de mettre
en évidence Aa est suffisamment grande.
Les études les plus récentes laissent supposer qu’Aa migre également dans les vaisseaux coronaires et peut
causer une endocardite.
Tannerella forsythia (Tf ; plus connue sous son ancien nom Bacteroides forsythus)
Il s’agit d’un anaérobe strict gram-négatif qui se trouve très nettement en plus grande quantité dans les poches
actives que dans les poches inactives. Tf est aussi présent dans les cas de parodontite récidivante. Tf peut être
habituellement éliminé par curetage/surfaçage radiculaire. Si l’introduction d’antibiotiques est nécessaire à
l’élimination de Tf, les antibiotiques à choisir sont le métronidazole et la clindamycine.
Porphyromonas gingivalis (Pg)
Bactérie anaérobe stricte gram négative que l’on retrouve dans les cas de parodontite sévère. On peut
habituellement éliminer Pg par curetage/surfaçage radiculaire. Dans le cas où Pg est encore présent malgré ce
traitement, une nouvelle intervention consistant en un curetage ou un acte chirurgical est indiqué. Des
antibiotiques doivent être prescrits lorsque Pg est présent simultanément avec Aa en grande quantité. Les
antibiotiques à employer sont le métronidazole ou clindamycine + amoxicilline.
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Treponema denticola (Td)
Il s’agit d’un petit spirochète anaérobe strict qui joue un rôle dans la destruction parodontale. Td est utile comme
marqueur dans l’évaluation du succès thérapeutique des poches réfractaires au traitement. Les antibiotiques
actifs contre cette bactérie sont le métronidazole ou la clindamycine.
T. forsythia, P. gingivalis et T. denticola forment le « complexe rouge » d’espèces associées avec les infections
parodontales agressives (Socransky et al., 1998).
Notes sur le choix des bactéries pour le PadoTest 4∙5®
Le nombre d’espèces bactériennes présentes dans la flore sous-gingivale humaine peut être estimé aujourd’hui à plus d’un millier.
Parmi elles, au moins une centaine pourrait être soupçonnée de jouer un rôle dans l’étiologie de la parodontite.
Le but d’un test n’est pas de quantifier les cent bactéries mais de détecter et de permettre de contrôler les lésions parodontales. Le test
doit d’autre part rester dans des limites de coût raisonnables, donc remplir ses objectifs en testant le moins possible de bactéries.
Le panel de bactéries du PadoTest a été choisi après consultation de la littérature disponible et de chercheurs reconnus dans le domaine.
La capacité du test à remplir ses objectifs a été testée sur environ 2000 prélèvements accompagnés d’indications cliniques. Nous avons des
raisons de croire que la détermination de Aa, Tf, Pg et Td nous permet de détecter environ 95% des lésions parodontales et de suivre leur
évolution.
Pour introduire une nouvelle bactérie nous devrons être sûrs non seulement que la nouvelle bactérie joue un rôle dans la parodontite mais
surtout que le test sera amélioré dans le sens, par exemple, que 98% des lésions seront alors détectées.
Or la seule évidence que nous avons dans la majorité des cas (ceci est aussi valable pour les autres bactéries détectées par les autres tests)
pour introduire une nouvelle espèce est qu’elle a été associée par un petit nombre de chercheurs à des lésions parodontales.
Cette évidence souffre de deux défauts majeurs :

L’espèce a été déterminée dans la majorité des cas par culture. Il n’y a aucune certitude sur son identité réelle, que nous devons
cependant connaître pour mettre au point un test spécifique.

Les estimations quantitatives sont basées sur des techniques imprécises, non reproductibles, et sur nombre d’échantillons très
réduit.
Prenons un exemple (réel):
Un chercheur trouve que des fusobactéries sont présentes dans certains types de lésions nécrosantes. Il juge qu’il s’agit de Fusobacterium
necrophorum. Une étude menée avec des techniques imprécises sur un nombre très réduit d’échantillons suggère que cette bactérie est
présente en beaucoup plus grand nombre sur les sujets atteints que sur les sujets sains.
Un test pour la détection/monitoring de ces lésions pourrait incorporer Fusobacterium necrophorum.
En réalité des déterminations et des quantifications par des techniques fiables de biologie moléculaire montrent que :


Il ne s’agissait pas de Fusobacterium necrophorum mais de Fusobacterium nucleatum.
La prévalence de la bactérie est la même dans les lésions que dans les sites sains.
L’inclusion de Fusobacterium necrophorum dans le panel de bactéries aurait été au mieux inutile, au pire nuisible. Sans compter que le prix
aurait augmenté.
Il en va de même pour les autres bactéries. Aucunes réelles évidences ne permettent d’assurer qu’elles augmenteraient significativement
notre détection.
Ainsi, les listes plus longues de bactéries détectées par d’autres tests n’ont pas de réelle valeur et de sens car ces bactéries n’apportent pas
de gain de détection de parodontite et de monitoring par rapport à notre test. Autrement dit, si par exemple Eikenella corrodens est présente
et qu’elle a une réelle incidence sur la parodontite, alors nos 4 germes nous le disent déjà et nous n’avons pas besoin d’elle pour monitorer la
parodontite. Ceci, à nouveau, permet de promouvoir un test très précis, fiable, simple et pas cher.
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4. Les acides nucléiques : ADN et ARN
L’Acide DésoxyriboNucléique (ADN) est une molécule que l'on retrouve dans tous les organismes vivants.
L'ADN est présent dans le noyau des cellules eucaryotes, dans le cytoplasme des cellules procaryotes, dans la
matrice des mitochondries ainsi que dans les chloroplastes.. L'ADN constitue le génome des êtres vivants. C’est
le support de l’information génétique héréditaire
permettant de créer et de maintenir la vie, qui se
transmet de génération en génération lors des
processus de reproduction.
La molécule d'ADN est constituée de deux brins
polynucléotides antiparallèles, associés par des
liaisons hydrogène entre bases puriques et pyrimidiques
autour d’un axe commun. C’est la fameuse double
hélice d’ADN. Déroulés, les molécules d'ADN s'étirent
en un très long fil, constitué par un enchaînement
(séquence) précis d'unités élémentaires que sont les
nucléotides (Adénine « A », Thymine « T », Guanine
« G » et Cytosine « C »). C'est un des constituants des
chromosomes. Les gènes sont des segments d'ADN.
L'appariement spécifique entre les nucléotides, induit
une complémentarité entre les brins. La séquence (ou
code) d'un des brins détermine la séquence du brin
complémentaire et antiparallèle. La structure originale
de l'ADN lui permet de se dupliquer en deux
Figure IV. 2 : ADN
molécules identiques entre elles et identiques à la
molécule mère lors du phénomène de réplication ou duplication.
L’ADN contient le message génétique nécessaire à la synthèse des protéines, éléments assurant l’essentiel des
fonctions cellulaires et de la vie.


Figure IV. 3 : Le dogme de la biologie moléculaire.
L’Acide RiboNucléique (ARN) sont les
vecteurs et médiateurs de l'information
génétique contenue par l’ADN. Ce sont les
intermédiaires entre l’ADN et les protéines.
On distingue plusieurs classes d'ARN qui
diffèrent suivant leur taille, localisation et
fonction, dont les principales sont:
Les ARN messagers (ARNm) sont une copie
(transcription) de la séquence codante d'un
gène (ADN), qui véhiculent l'information
génétique, du lieu de stockage (hélice d'ADN)
vers le lieu d'expression (ribosome), où il sert
de matrice à la synthèse des protéines
(acides aminés).
Les ARN Ribosomaux (ARNr) et les ARN de
Transfert (ARNt) fournissent les structures et
les outils nécessaires à l'expression de l'ARN
messager en protéine (traduction).
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Les Acides RiboNucléiques sont des chaînes polynucléotides qui diffèrent de l'ADN par la présence de bases
de type Uracile (U) remplaçant les Thymines (T) et de sucres de type Ribose, en lieu et place de désoxyriboses
au sein des bases nucléotides.
La présence de sucres ribose est en grande partie responsable des propriétés conformationnelles différentes de
celles des ADN. Le groupe hydroxyle sur le sucre en position 2' est à l'origine de nombreuses interactions
supplémentaires qui tendent à déstabiliser les liaisons 5'-3' phosphodiester et empêchent l'adoption d'une
conformation en double hélice.
Les ARN sont donc des molécules constituées d'un seul brin (monocaténaire). A l'exception de l'ARN messager
qui possède une structure linéaire, les ARNr et ARNt sont fait d'un brin fréquemment replié sur lui-même par
appariement local des bases. Ils adoptent ainsi une conformation faite de boucles et de tiges (dite en épingles à
cheveux ou bourrelets) et sont souvent associés à des protéines spécifiques.
5. Le ribosome et l’ARN ribosomale comme marqueur moléculaire
Les ribosomes, molécules ribonucléoprotéiques, sont présents dans les cellules eucaryotes et procaryotes. Leur
fonction est de synthétiser les protéines en décodant l'information contenue dans l'ARN messager (traduction).
Les ribosomes sont constitués de deux sous-unités, une plus petite qui « lit » l'ARN messager et une plus grosse
qui se charge de la synthèse de la protéine correspondante. Ces deux sous-unités sont constituées d'ARN
ribosomiques, qui portent l'activité catalytique, et de protéines ribosomiques.
Ils se trouvent dans le cytoplasme, libres, ou associés, soit aux membranes du réticulum endoplasmique, soit à
l'enveloppe nucléaire, soit même chez certaines bactéries à leur membrane interne (par exemple chez
Escherichia coli).
Le ribosome est la "machine" assurant la traduction de la molécule d'ARNm dans la synthèse des protéines. Le
code génétique assure la correspondance entre la séquence de l'ARNm et la séquence du polypeptide
synthétisé. Le ribosome utilise les ARN de transfert ou ARNt comme « adaptateurs » entre l'ARN messager et
les acides aminés.
L'ARN messager passe à travers la petite
sous-unité qui contient les sites de fixation
des ARNt. La grande sous-unité contient la
partie catalytique qui effectue la synthèse
de la liaison peptidique entre les acides
aminés consécutifs de la protéine. La
grande sous-unité contient également un
tunnel par lequel sort la chaîne protéique en
cours de synthèse.
Figure IV. 4 : Ribosome et traduction des protéines
A chaque instant de vie d’une bactérie,
jusqu’à 20'000 ribosomes synthétisent les
protéines nécessaires à la vie. Il y a ainsi
une quantité très importante –jusqu’à
20'000 copies - d’ARN ribosomaux (ARNr)
au sein d’une bactérie (ou cellule) vivante.
Les ARNr peuvent représenter jusqu’à 95%
de tout l’ARN présent dans une bactérie et
jusqu’à 15% du poids total de la bactérie.
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Le IAI PadoTest 4∙5 a choisi de travailler avec le gène ARNr « 16S » de la petite sous-unité ribosomale comme
marqueur moléculaire. Les sondes spécifiques pour chaque espèce choisie ont été déterminées sur ce gène. La
quantité très importante et surtout le nombre de copies des ARNr présent à chaque instant dans une bactérie
vivante offre plusieurs avantages essentiels à un test microbiologique les employant:






Quantification directe et absolue sans modification du matériel génétique original ni en quantité, ni en proportion.
Très spécifique et sensible.
Pas d’amplification (PCR, pour Réaction de Polymérisation en Chaîne) du gène marqueur et donc pas de biais ni de problème de
contaminations ou autres artefacts potentiels dus à l’amplification.
Mesure uniquement les bactéries vivantes au moment du prélèvement (car l’ARN se dégrade instantanément lorsque la bactérie
meurt contrairement à l’ADN). Le tampon contenu dans les tubes envoyés du PadoTest 4∙5® fixe immédiatement et ad æternam
les bactéries prélevées vivantes et leur ARN. Ce dernier n’est donc pas dégradé. Ainsi, il n’y a pas de faux positifs (on ne mesure
pas de bactéries mortes et ne jouant plus de rôle dans l’infection).
Robustesse et simplicité du test.
Coût réduit.