Intitulé du sujet : Implication des héparanes 3-O - EDBSL

Intitulé du sujet : Implication des héparanes 3-O-sulfatés dans l’échappement des cellules
cancéreuses au système immunitaire.
Tuteur : Fabrice ALLAIN - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, UMR 8576
CNRS - Université de Lille 1 - 59655 Villeneuve d’Ascq - Tel : 03.20.33.72.39 - Fax
03.20.33.65.55 – [email protected]
Présentation du sujet
Les héparanes sulfates (HS) sont des glycoaminoglycanes sulfatés retrouvés à la surface
de nombreux types cellulaires et dans la matrice extracellulaire. Ils sont formés par la répétition
de glucosamines (GlcN) sulfatées liées à des résidus d'acides glucuroniques (GlcUA) ou
iduroniques (IdoUA). Ces unités disaccharidiques sont regroupées en domaines de taille et de
degré de sulfatation variables, séparés par des domaines peu sulfatés et relativement
uniformes. L’organisation structurale des HS résulte de l'activité d'une machinerie enzymatique
complexe : les N-déacétylases/N-sulfotransférases (NDSTs), les 3-O-sulfotransférases
(HS3STs) et les 6-O-sulfotransférases (HS6STs) sulfatent les groupements amines et
hydroxyles des GlcN, la C5-épimérase transforme les GlcUA en IdoUA, et la 2-Osulfotransférase (HS2ST) sulfate les acides uroniques. Ces enzymes agissent de façon
séquentielle et coordonnée mais non systématique. A cette cascade de modifications
enzymatiques s'ajoute un degré de complexité supplémentaire, lié à l'expression de plusieurs
isoformes des enzymes qui agissent sur les GlcN : quatre NDSTs, trois HS6STs et sept
HS3STs. Ces isoformes possèdent des spécificités de substrats différentes et sont exprimées à
des taux variables suivant le type cellulaire. Ainsi, il est maintenant admis que les variations
d'expression des sulfotransférases dans les différents types cellulaires sont à l'origine de
l'hétérogénéité structurale et fonctionnelle des HS (Esko & Selleck, 2002). Au Laboratoire, nous
étudions le rôle des HS membranaires dans la régulation des réponses inflammatoires et
immunes. Dans ce contexte, nous cherchons à corréler les variations d’expression et d’activité
des enzymes de sulfatation des HS à la biosynthèse de motifs de fixation pour des ligands
inflammatoires et par conséquent à leurs fonctions biologiques.
Il a récemment été démontré par l’Equipe de Eric Gilson (Institut de Recherche sur le
Cancer et le Vieillissement, IRCAN - CNRS UMR 7284 - INSERM U1081, Nice) que la
surexpression de la protéine télomérique TRF2 conduit à l’échappement des cellules
cancéreuses au système immunitaire. Ce phénomène serait lié à une diminution du recrutement
et de l’activation des cellules NK. En outre, cette équipe a montré que la surexpression de TRF2
est associée à une augmentation de l’expression de HS3ST4, et les expériences de
surexpression de cette sulfotransférase dans les cellules cancéreuses ont permis de reproduire
les mêmes effets protecteurs vis-à-vis des cellules NK (Biroccio, Cherfils-Vicini et al. 2013).
Chez l’Homme, HS3ST4 est une enzyme neuronale essentiellement exprimée chez
l’embryon. Elle appartient au groupe des HS3STs de type gD, qui regroupe les cinq isoenzymes
capables de générer in vitro le motif HS de fixation pour la glycoprotéine gD du l’Herpès-virus de
type I (Mochizuki et al., 2008). Contrairement à HS3ST3A et HS3ST6 qui sont peu exprimées
dans les tissus adultes, HS3ST3B est majoritairement retrouvée dans les leucocytes et les
fibroblastes, et son expresion est fortement augmentée en réponse à des stimuli proinflammatoires. Quant à HS3ST2, elle est exprimée en abondance dans les cellules neuronales
et les macrophages en condition anti-inflammatoire. Ces données suggèrent que l’expression
différentielle des HS3STs pourrait influencer les interactions entre les cellules et leur
environnement (Martinez et al. 2015). Par conséquent, même si les relations entre la 3-Osulfatation des HS et l’échappement des cellules cancéreuses au système immunitaire ne sont
pas connues, plusieurs hypothèses peuvent être proposées :
- la 3-O-sulfatation des HS présents à la surface des cellules cancéreuses pourrait bloquer
des signaux activateurs des cellules NK en empêchant l’interaction avec les récepteurs NKp30NKp46 et NKG2D, ou à l’inverse, favoriser des signaux inhibiteurs, notamment via KIR2DL4. En
effet, il a récemment été suggéré que l’activité des cellules NK peut être modulée par les
héparanes 3-O-sulfatés, dont la production est dépendante de l’expression de HS3ST3B dans
les cellules cibles (Brusilovsky et al., 2013).
- l’activité des HS3STs pourrait également avoir un effet direct sur les cellules
cancéreuses en leur conférant une résistance accrue vis-à-vis du système immunitaire. Ainsi,
nos travaux préliminaires montrent que la surexpression des HS3ST2, 3B et 4 dans des cellules
cancéreuses du sein augmentent leur prolifération et leur capacité d’échappement à l’apoptose
in vitro.
Afin de comprendre le rôle des héparanes 3-O-sulfatés dans l’échappement des cellules
cancéreuses, le projet que nous proposons se divise en deux parties :
- dans le premier volet, nous confirmerons le rôle des héparanes 3-O-sulfatés dans la
prolifération et la survie des cellules cancéreuses, et nous envisageons d’en élucider les
mécanismes moléculaires. Nous analyserons les voies de signalisation activées et leur gènes
cibles dans les cellules transfectées, en recherchant notamment les signaux impliqués dans les
mécanismes de survie cellulaire. Les travaux préliminaires avaient été réalisés avec les lignées
cancéreuses MDA-MB-231 et BT-20 transfectées de façon transitoire. Pour ce projet, nous
envisageons de produire des clones de ces deux types cellulaires exprimant stablement
HS3ST2, HS3ST3B et HS3ST4. En complément, la structure des HS sera analysée pour
chaque type cellulaire, de façon à vérifier si les mécanismes observés sont dépendants de la 3O-sulfation en général, ou d’un motif HS particulier.
- le second volet de ce projet sera consacré à l’étude du rôle des héparanes 3-O-sulfatés
dans la résistance aux cellules de l’immunité. En premier lieu, nous poursuivrons nos études in
vitro, en utilisant un modèle dans lequel les cellules cancéreuses transfectées sont mises au
contact des cellules NK. Nous rechercherons si la surexpression des HS3STs dans les cellules
cancéreuses modifie les interactions intercellulaires, en utilisant des anticorps bloquants dirigés
contre les récepteurs des cellules NK, mais également en présence d’oligosaccharides 3-Osulfatés. Ces derniers seront produits par sulfatation in vitro à l’aide d’enzymes recombinantes
disponibles au Laboratoire. Finalement, les résultats seront confirmés par des expériences in
vivo. Nous vérifierons si la surepression des HS3STs, ou d’une isoforme en particulier,
augmente la survie et/ou la croissance des cellules cancéreuses chez la souris, et si cet effet
peut être corrélé à une diminution du recrutement des cellules NK et/ou de leur activation
(collaboration avec Julien Cherfils et Eric Glison, IRCAN).
Dans son ensemble, ce projet devra contribuer à comprendre le rôle des héparanes 3-Osulfatés dans la survie de cellules cancéreuses et dans leur échappement au système
immunitaire, et à vérifier si les mécanismes mis en jeu sont dépendants de la 3-O-sulfation en
général ou d’une HS3ST en particulier.
Références :
Esko J.D. and Selleck S.B. (2002) Order out of chaos: assembly of ligand binding sites in heparan
sulphate, Annu. Rev. Biochem. 71, 435-471
Mochizuki H., Yoshida K., Shibata Y., & Kimata K. (2008) Tetrasulfated disaccharide unit in heparan
sulfate: enzymatic formation and tissue distribution, J. Biol. Chem. 283, 31237-31245
Biroccio A, Cherfils-Vicini J, Augereau A, et al. (2013) TRF2 inhibits a cell-extrinsic pathway through
which natural killer cells eliminate cancer cells. Nat. Cell Biol., 15, 818-828
Martinez P., Denys A., Delos M. and al. (2015) Macrophage polarization alters the expression and
sulfation pattern of glycosaminoglycans. Glycobiology, 25, 502-513
Brusilovsky M., Cordoba M., Rosental B. et al. (2013) Genome-wide siRNA screen reveals a new
cellular partner of NK cell receptor KIR2DL4: heparan sulfate directly modulates KIR2DL4mediated responses. J. Immunol., 191, 5256–526
Mots-clés : héparanes sulfates, sulfotransférases, immunité tumorale.
Techniques : culture cellulaire (lignées cellulaires, isolement des cellules du sang), analyse des
voies de signalisation, cytofluorimétrie en flux, mesures de prolifération et de survie cellulaire,
tests de cytolyse, biologie moléculaire (RT-PCR en temps réel, vecteurs d’expression...),
surexpression en système eucaryote, expérimentation chez la souris, isolement et analyse
structurale des HS.
Title: Role of heparan-3-sulfates in the escape of tumour cells from the immune system
Contact: Fabrice ALLAIN - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, UMR 8576
CNRS - Université de Lille 1 - 59655 Villeneuve d’Ascq - Tel : 03.20.33.72.39 - Fax
03.20.33.65.55 – [email protected]
Presentation
Heparan sulfates (HS) are glycoaminoglycans found at the surface of various cell types or
in the extracellular matrix. They are composed of alternating residues of sulfated glucosamine
(GlcN) linked to glucuronic (GlcUA) or iduronic acid (IdoUA). These disaccharide units are
clustered in regions with variable length and extent of sulfation, separated by less sulfated and
uniform regions. The structural organization of HS chains results from the activity of a complex
enzymatic machinery: amino and hydroxyl groups of GlcNAc can be subjected to sulfation by Ndeacetylases/N-sulfotransferases (NDSTs), 3-O-sulfotransferases (HS3STs) and 6-Osulfotransferases (HS6STs), GlcUA can be epimerised by a C5-epimerase, and uronic acid can
be sulfated by a 2-O-sulfotransferase (HS2ST). These modifications are sequential, coordinated
but non-systematic. This schema of enzymatic reactions is rendered more complex by the
existence of several isoforms of sulfotransferases capable of modifying GlcN residues: four
NDSTs, three HS6STs and seven HS3STs. These isoforms exhibit fine difference in substrate
specificity and are expressed at distinct levels in various cell types. Thus, it is now well
established that cell-type expression of sulfotransferases is responsible for the structural and
functional heterogeneity of HS (Esko & Selleck, 2002).
In our Laboratory, we are studying the role of cell-surface HS in the regulation of
inflammatory and immune responses. In this context, we are investigating the correlation
between the expression and activity of HS sulfotransferases and the biosynthesis of HS motifs
with binding and activating properties for inflammatory factors.
In a recent work, Eric Gilson’s team (Institut de Recherche sur le Cancer et le
Vieillissement, IRCAN - CNRS UMR 7284 - INSERM U1081) reported that over-expression of
the telomeric protein TRF2 was accompanied by an immune escape of tumour cells, which was
related to a decrease in the recruitment and activation of NK cells. Moreover, high of TRF2 was
demonstrated to induce an increase in the expression of HS3ST4, and over-expression of this
sulfotransferase was effective enough to protect tumour cells to NK cell-mediated cytolysis
(Biroccio, Cherfils-Vicini et al. 2013).
Human HS3ST4 is a neuronal HS sulfotransferase mainly found in embryonic tissues. Like
other members of the type gD HS3ST family, it is capable of catalyzing the reaction of 3-Osulfation in HS motifs with binding properties for the gD glycoprotein of type I Herpes-virus
(Mochizuki et al., 2008). In contrast to HS3ST3A and HS3ST6 that are sparsely expressed in
adult tissues, HS3ST3B is mainly found in leukocytes and fibroblasts, and it is strongly overexpressed in response to pro-inflammatory factors. In contrast, HS3ST2 is highly expressed in
neurons and macrophages exposed to anti-inflammatory stimuli. These observations suggest
that the differential expression of HS3STs could modulate the interactions between cells bearing
3-O-sulfated HS and their environment (Martinez et al., 2015). Even though the role of HS 3-Osulfation in the escape of tumour cells from immune system is unknown to date, the following
mechanisms can be hypothesized:
- 3-O-sulfation of HS at the surface of tumor cells could inhibit activating signals in NK cells
via disruption of the interaction with receptors such as NKp30-NKp46 and NKG2D, or, on the
contrary, lead to an enhancement in inhibitory signals in NK cells via the KIR2DL4 receptor.
Indeed, it was recently suggested that the activity of NK cells could be regulated by 3-O-sulfated
HS, for which the reaction of 3-O-sulfation was dependent on the expression de HS3ST3B in
target cells (Brusilovsky et al., 2013).
- HS3STs could have also a direct effect on tumour cells in enhancing their resistance to
the immune system. In this way, we recently demonstrated that over-expression of HS3ST2, 3B
et 4 increased the proliferation and survival of breast cancer cells in vitro.
In an attempt of understanding the role of heparan-3-sulfates in the immune escape of
tumour cells, we propose a project including two parts:
- in the first part, we will confirm the enhancing effect of heparan-3-sulfates in tumour cell
proliferation and survival, and we aim to elucidate the underlying molecular mechanims. We will
analyze the activation of signaling patways in transfected cells, with a special interest in the
mechanisms involved in cell survival. Our preliminary works were conducted with MDA-MB-231
and BT-20 cell lines, which have been transiently transfected with vectors expressing HS3ST2,
HS3ST3B et HS3ST4. Here, we have in project to construct stably transfected clones
expressing each sulfotransferase. In addition, structure of HS moieties will be analyzed for each
cell line, in order to rely changes in cell behaviour either to a general increase in HS 3-Osulfation or to the appearance of a specific HS motif.
- in the second part of this project, we aim to elucidate the mechanims by which heparan3-sulfates induced a resistance to immune cells. First, we will reproduce in vitro experiments, by
using a system in which transfected tumour cells will be incubated with NK cells. We will analyze
the effects of HS3ST over-expression in the communication between both cell types, by using
either blocking antibodies to NK receptors or soluble 3-O-sulfated oligosaccharides. These
inhibitory molecules will be produced by in vitro sulfation of HS-derived oligosaccharides with
recombinant HS3STs, which are already available at home. Finally, we will confirm results
obtained in vitro by in vivo experiments. To this end, transfected cells expressing each HS3ST
isoenzyme will be injected in mice, and we will try to correlate changes in tumour cell
proliferation and survival to the decrease in the recruitment and/or activation of NK cells
(collaboration with Julien Cherfils and Eric Glison, IRCAN).
Altogether, this project will contribute to understand the role of heparan-3-sulfates in the
survival and escape of tumour cells from the immune system, and to know whether the
underlying mechanisms of resistance are dependent either on a general increase in HS 3-Osulfation, or on the expression and activity of a specific HS3ST isoenzyme.
References :
Esko J.D. and Selleck S.B. (2002) Order out of chaos: assembly of ligand binding sites in heparan
sulphate, Annu. Rev. Biochem. 71, 435-471
Biroccio A, Cherfils-Vicini J, Augereau A, et al. (2013) TRF2 inhibits a cell-extrinsic pathway through
which natural killer cells eliminate cancer cells. Nat. Cell Biol., 15, 818-828
Mochizuki H., Yoshida K., Shibata Y., & Kimata K. (2008) Tetrasulfated disaccharide unit in heparan
sulfate: enzymatic formation and tissue distribution, J. Biol. Chem. 283, 31237-31245
Martinez P., Denys A., Delos M. et al. (2015) Macrophage polarization alters the expression and
sulfation pattern of glycosaminoglycans. Glycobiology, 25, 502-513
Brusilovsky M., Cordoba M., Rosental B. et al. (2013) Genome-wide siRNA screen reveals a new
cellular partner of NK cell receptor KIR2DL4: heparan sulfate directly modulates KIR2DL4mediated responses. J. Immunol., 191, 5256–526
Keywords: heparan sulfates, sulfotransferases, tumour immunity.
Techniques : cell culture (cell lines, isolation of blood cells), analysis of signalling pathways,
flow cytofluorimetry, cell proliferation and survival assays, measurement of NK cell mediatedcytolysis, molecular biology (real-time RT-PCR, expression vectors...), over-expression in
human tumour cells, experiment in mice, extraction and structural analysis of HS.