La réplication
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Travaux dirigés de Biologie Moléculaire 3 1 Expérience préliminaire, Meselson et Stahl, 1958 2 3 modèles de réplication réplication conservative réplication dispersive réplication semi-conservative 3 3 générations ADN parental ADN fils : 1ère génération ADN fils : 2nde génération 4 5 Analyses des résultats expérimentaux 6 Analyses des résultats expérimentaux, CONCLUSION ! 7 Réplication de l’ADN d’E. coli Réplication d’un ADN circulaire chez E. coli 1. 2 fourches de réplication forment une structure theta (θ). 2. Lors de la séparation des brins des supertours positifs se forment dans la molécule. 3. Les topoisomérases réduisent les tensions créées, ce qui permet au processus de continuer. 8 La réplication Procaryote Visualisation de la réplication bidirectionnelle de l’ADN chez Escherichia coli. La réplication d’un chromosome circulaire donne une structure ressemblant à la lettre grecque theta (θ). Le marquage par le tritium (3H) montre que les 2 brins sont répliqués en même temps (les brins néo-synthétisés sont en rouge). En haut : représentation schématique En bas : vues de microscopie électronique 9 La réplication eucaryote Vue de microscopie électronique de la réplication de l’ADN chromosomique de la Drosophile. Les yeux correspondent aux régions nouvellement répliquées. 10 Quelques acteurs de la réplication chez E. coli DnaA : initie la réplication en se fixant sur les boîtes de 9 bp de la région ORI. SSB : protéine de liaison aux simples brins DnaB (hélicase) : sépare le double brin d'ADN. DnaC : « véhicule » DnaB DnaG (primase) : synthèse de l’amorce ARN (brin retardé) Gyrase (topo II) : élimination des supertours devant la fourche. ADN polymérase III : polymérisation des nouveaux brins d'ADN. ADN polymérase I : enlève les amorces d'ARN (activité exonucléase 5’-3’) et comble la brèche (pol 5’-3’). Ligase : lie, entre eux, 2 fragments d’Okazaki (brin retardé). 11 Ex. 9 : Vue d’ensemble de la réplication brin avancé ADN polymérase III brin nouvellement synthétisé ADN parental fragment d’Okazaki suivant amorce ARN ADN hélicase primase fragment d’Okazaki SSB brin retardé ADN polymérase III 12 La réplication Film réplication 13 Formation du primosome dnaA dnaB + DnaC dnaG 14 brin avancé brin nouvellement synthétisé ADN polymérase III ADN parental mouvement de la fourche primase SSB ADN hélicase brin retardé amorce ARN ADN polymérase III fragment fragment d’Okazaki d’Okazaki suivant 15 DnaB : structure de l’hélicase du bactériophage T7 AMP-PNP : ATP non hydrolysable 16 Cryomiscrocopie électronique : Structure du primosome de B. subtilis The 3-D reconstruction of the DnaB-DnaC complex from B. subtilis. A total of 548 particles were included in the calculation of the final volume, which has a resolution of 4.22 nm. • a roughly triangle-shaped aspect. • central channel running from face to face and, • at this level of resolution, the DnaB-DnaC complex has internal and external diameters almost indistinguishable from those of DnaB. • The height of the reconstructed complex is 9.1 nm, • In the complex, each one of the six DnaC monomers is interacting with two monomers of DnaB (and viceversa), and DnaC would be sitting on the sixfold symmetry face of DnaB. 17 http://rsc.anu.edu.au/RSC/ChemResearch/AnnualReport/Report97/GC-report.html Ex. 10-1 : rompre les liaisons de faible énergie 18 Exercice n°10-2 19 La DNnaB est une hélicase La DnaB est une ADN hélicase qui sépare les 2 brins d’ADN lors de la réplication (pistes 3-6) Les SSB (”single-strand-binding protein”) empêchent la réassociation des deux brins. La DnaG (RNA primase) stimule l’activité de la DnaB (hélicase). Les SSB sont essentielles et elles stimulent l’ADN polymérase. 20 The Escherichia coli dnaB replication protein is a DNA helicase. LeBowitz JH, McMacken R. J Biol Chem. 1986 261(10):4738-48. 21 The Escherichia coli dnaB replication protein is a DNA helicase. LeBowitz JH, McMacken R. J Biol Chem. 1986 261(10):4738-48. 22 Formation du primosome 23 Activité de l’hélicase : démonstration [d’après A. Kornberg and T. Baker, 1992, DNA Replication, 2d ed., W. H. Freeman and Company, et S. Matson, D. Bean, and J. George, 1994, BioEssays16:13.] 24 Three mechanisms of DNA strand growth that are consistent with semiconservative replication. The third mechanism — bidirectional growth of both strands from a single origin — appears to be the most common in both eukaryotes and prokaryotes. 25 26 Hélicase Fixation de l’ADN hélicase 27 DnaB : structure 28
