Caractérisation de la phase endophyte de Botrytis
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MASSONNAT Lucie Année universitaire 2014-2015 D.U.T. Génie Biologique option Génie de l’Environnement Période du 20 avril au 26 juin 2015 Caractérisation de la phase endophyte de Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum Structure d’accueil : INRA PACA Avignon, unité de Pathologie Végétale Maître de stage : Christel LEYRONAS, Ingénieur de recherche Tuteur universitaire : Laurent VILLERMET Caractérisation de la phase endophyte de Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum de Lucie MASSONNAT est mis à disposition selon les termes de la licence Creative Commons Attribution - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 4.0 International Remerciements Tout d’abord, je tiens à remercier ma maître de stage, Christel LEYRONAS, qui m’a permis de réaliser ce stage dans les meilleures conditions grâce à sa disponibilité, ses conseils et la confiance qu’elle m’a accordée. Merci à Marc BARDIN, directeur de l’unité pour m’avoir permis d’effectuer mon stage de fin d’année au sein de l’INRA d’Avignon. Je remercie également Magali DUFFAUD pour m’avoir aidé dans certaines manipulations et notamment pour la préparation du milieu spécifique. Merci à Claire TROULET et Magali EYGRIER pour leurs conseils ainsi que pour les réponses et les explications qu’elles m’ont apportées. Merci à Michel RIQUEAU pour m’avoir permis d’utiliser les outils informatiques dans de bonnes conditions, et merci à Véronique DECOGNET pour ses explications sur les ressources documentaires. Je tiens à remercier également Claudine LAURENT et Pascale FAVIER pour leur accueil chaleureux. Pour finir, un grand merci à mes collègues de bureau Cécile, Lucile et Julie, pour leur soutien, leurs conseils, leur bonne humeur et tous ces bons moments partagés au cours de ces 10 semaines ! Merci à tous ! Sommaire Liste des abréviations ......................................................................................................................................... Introduction ...................................................................................................................................................... 1 Présentation ...................................................................................................................................................... 2 I. La structure d’accueil : l’INRA .......................................................................................................... 2 II. Botrytis cinerea .................................................................................................................................... 2 1. 2. 3. Problèmes agronomiques ............................................................................................................... 2 Cycle biologique .............................................................................................................................. 3 Moyens de lutte ............................................................................................................................... 4 III. Sclerotinia sclerotiorum ...................................................................................................................... 4 1. 2. 3. Problèmes agronomiques ............................................................................................................... 4 Cycle biologique .............................................................................................................................. 4 Moyens de lutte ............................................................................................................................... 5 IV. Des champignons endophytes ............................................................................................................. 6 1. 2. Définition ......................................................................................................................................... 6 B. cinerea et S. sclerotiorum............................................................................................................ 6 Objectifs du stage................................................................................................................................. 6 V. Matériels et méthodes....................................................................................................................................... 8 Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des lots de semences ............................................. 8 I. 1. 2. 3. Lots de semences ............................................................................................................................. 8 Analyse de la flore épiphyte ........................................................................................................... 8 Analyse de la flore endophyte ........................................................................................................ 9 Analyse de plantes issues de semences inoculées avec B. cinerea et S. sclerotiorum ....................... 9 II. 1. 2. 3. Inoculation de semences ................................................................................................................. 9 Analyse des endives ....................................................................................................................... 10 Analyse des semences inoculées ................................................................................................... 10 III. Inoculation de plantules avec des conidies de B. cinerea à sec ....................................................... 11 1. 2. 3. 4. 5. Les plantules .................................................................................................................................. 11 Les colonies mycéliennes .............................................................................................................. 11 Inoculation à sec ............................................................................................................................ 11 Evaluation de l’inoculum déposé ................................................................................................. 12 Analyse de la flore endophyte des plantules ............................................................................... 12 IV. Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des cultures commerciales ................................. 13 1. 2. 3. Matériel utilisé ............................................................................................................................... 13 Analyse de la flore épiphyte ......................................................................................................... 13 Analyse de la flore endophyte ...................................................................................................... 13 Résultats et discussion .................................................................................................................................... 14 Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des lots de semences ........................................... 14 I. 1. Flore épiphyte ................................................................................................................................ 14 Flore endophyte ............................................................................................................................. 14 2. Analyse de plantes issues de semences inoculées avec B. cinerea et S. sclerotiorum ..................... 15 II. Flore endophyte des semences inoculées ..................................................................................... 16 Effet des champignons sur les semences ..................................................................................... 16 Analyses des parties aériennes et souterraines des endives ....................................................... 16 1. 1. 2. III. Inoculation de plantules avec des conidies de B. cinerea à sec ....................................................... 17 Estimation du nombre de spores ................................................................................................. 17 Analyse des plantules de laitue Gloire du Dauphiné ................................................................... 17 Analyse des plantules de tomate Brenda ..................................................................................... 18 1. 2. 3. IV. Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des cultures commerciales ................................. 19 Flore épiphyte ................................................................................................................................ 19 Tomates du 74 ............................................................................................................................ 19 Tomates du 69 ............................................................................................................................ 19 Fraisiers du 38 ............................................................................................................................ 19 2. Flore endophyte ............................................................................................................................. 20 a) Tomates du 74 ............................................................................................................................ 20 b) Tomates du 69 ............................................................................................................................ 20 c) Fraisiers du 38 ............................................................................................................................ 20 1. a) b) c) Conclusion ....................................................................................................................................................... 21 I. Bilan scientifique ............................................................................................................................... 21 II. Bilan personnel.................................................................................................................................. 22 Liste des abréviations INRA : Institut National de la Recherche Agronomique PDA : Potato Dextrose Agar UFC : Unité Formant Colonie Crédit photo de couverture : B. cinerea (INRA) et S. sclerotiorum (INRA) Introduction Les champignons sont des organismes composés d’une ou plusieurs cellules et peuvent se développer sur tous types de supports, notamment sur les plantes. Certains sont ainsi capables d’envahir des parcelles entières de cultures et sont responsables de la perte de nombreuses récoltes. C’est pourquoi leur impact économique n’est pas négligeable. Deux champignons sont principalement étudiés quant à leurs conséquences sur la vigne et sur des espèces maraîchères comme la laitue ou la tomate. Il s’agit de Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum, respectivement responsables de la « pourriture grise » et de la « pourriture blanche ». Une plante infectée par ces champignons produit des fruits ou des légumes qui ne pourront être commercialisés, et risque de mourir prématurément, ce qui entraine une perte de rendement. Pour limiter la présence de champignons phytopathogènes, les agriculteurs utilisent de nombreux fongicides, ce qui n’est pas sans conséquence pour la santé et l’environnement. Récemment, il a été montré que B. cinerea est également capable d’être présent dans la plante sans qu’il y ait de symptôme. Cette présence asymptomatique correspond à la phase dite endophyte (ou de latence), définie comme étant le stade entre l’infection de la plante, et la production de spores. En ce qui concerne B. cinerea, à l’heure actuelle on ne sait pas si la phase endophyte se traduit systématiquement par la production de spores à un moment ou un autre du cycle de la culture. Puisque S. sclerotiorum est assez proche de B. cinerea d’un point de vue taxonomique, il est intéressant d’étudier cette phase endophyte chez ces deux champignons, afin d’acquérir davantage de connaissances qui pourront permettre de développer de nouvelles méthodes de protection des plantes. Je souhaitais réaliser mon stage de fin d’études dans un laboratoire spécialisé dans la biologie végétale. De plus, la protection des végétaux face aux agents pathogènes étant un thème d’actualité, je tenais à m’orienter dans ce domaine. Ainsi, j’ai eu l’opportunité d’intégrer l’unité de pathologie végétale de l’INRA d’Avignon (84) pour caractériser la phase endophyte de B. cinerea et S. sclerotiorum. Nous verrons donc dans un premier temps, une présentation de ces deux champignons. Puis nous détaillerons le matériel et les méthodes utilisés lors des manipulations. Et enfin nous étudierons les résultats obtenus pour les analyses effectuées. 1 Figure 1 : Situation géographique du domaine Saint-Maurice N Domaine Saint-Maurice Source : INRA Figure 2 : Pourriture grise sur tomate Source : INRA Présentation I. La structure d’accueil : l’INRA L’Institut National de la Recherche Agronomique est un établissement public qui a été fondé en 1946 après la seconde Guerre Mondiale, dans un contexte de pénurie alimentaire afin de développer les techniques de production agricoles. L’INRA de la région Provence-Alpes-Côte-d’Azur a vu le jour en 2010 suite à la fusion des centres d’Avignon (84) et de Sophia-Antipolis (06). Il emploie environ 1 000 personnes parmi lesquelles près de 400 sont des chercheurs et ingénieurs répartis dans les 26 unités de recherche dont 14 se situent à Avignon. L’unité de Pathologie Végétale se trouve sur le domaine de Saint-Maurice, à Avignon (figure 1) et se concentre sur l’étude des maladies des plantes maraîchères. Deux équipes travaillent au sein de cette unité (annexe 1) : l’équipe de Virologie, qui étudie les virus, et l’équipe Mistral qui est tournée vers la recherche sur les bactéries et sur les champignons phytopathogènes. Différents axes de recherches sont étudiés, dont le développement de stratégies de protection des cultures horticoles. Celles-ci s’appuient sur la connaissance de la biologie des agents pathogènes tels que B. cinerea et S. sclerotiorum. Ces stratégies ont également pour objectif de développer les méthodes de luttes non chimiques afin de réduire l’utilisation de pesticides sur les cultures. II. Botrytis cinerea 1. Problèmes agronomiques Botrytis cinerea est un champignon ascomycète phytopathogène de la famille des Sclerotiniaceae (annexe 2), qui est très étudié depuis ces dernières années car il a la capacité de se développer dans toutes les régions tempérées du globe (Elad et al., 2004). Il infecte une très grande diversité de plantes (plus de 200) dont certaines sont des plantes d’intérêt économique telles que les laitues, les tomates ou encore les vignes. Il s’attaque aussi aux cultures horticoles, notamment en se développant sur des Primulaceae (Barnes et Shaw, 2002). Il peut entraîner d’importantes pertes de rendement dans ces deux domaines. Il se reconnait grâce à l’aspect grisâtre de son mycélium, qui lui vaut le nom de « pourriture grise » (figure 2). Il est aussi à l’origine de tâches que l’on peut retrouver 2 Figure 3 : Cycle biologique de Botrytis cinerea Source : Agrios, 2005 sur les feuilles de tomates ou de vignes (Blancard et al., 2013). Les risques d’infection sont similaires en serre ou en plein champ, et augmentent si des plantes déjà infectées sont stockées à proximité des cultures car elles portent l’inoculum. 2. Cycle biologique Avant de mettre en place des moyens de lutte, il faut connaitre le cycle biologique de l’agent pathogène pour pouvoir cibler les actions préventives et curatives. Botrytis cinerea est un champignon à dissémination aérienne. Les lésions présentes sur les tiges où les feuilles des plantes témoignent de la présence du champignon. Lorsque les conditions sont favorables, celui-ci va former de nombreuses spores (conidies) par mitose. En une semaine, 1 g de tissus de tomate comportant des lésions peut produire jusqu’à 20 millions de spores, ce qui explique une propagation rapide du champignon (Nicot et al., 1996). Les courants d’air transportent ces conidies ainsi que des fractions de mycélium et les dispersent plus ou moins loin, vers de nouveaux hôtes. Dans la région d’Avignon, des études ont montré que des conidies de B. cinerea sont présentes dans l’air tout au long de l’année (Leyronas et Nicot, 2013). Lorsqu’une spore arrive sur une plante, quelques heures suffisent pour que la germination ait lieu. Cette germination est favorisée si le pourcentage d’humidité est élevé (Elad et al., 2004). Une fois que B. cinerea est installé, il se développe et forme des conidiophores, qui portent les nouvelles conidies. Ces conidiophores sont ramifiés et se forment à partir du mycélium quand le champignon est suffisamment mature. Les spores se forment 3 jours après l’installation du champignon, et peuvent assurer une nouvelle dissémination aérienne. Ainsi, le cycle de B. cinerea (figure 3) en conditions favorables peut durer 4 jours, ce qui est relativement rapide. A la fin de la saison culturale, B. cinerea peut également former des petits sclérotes dans les débris végétaux. Ce sont des amas mycéliens, ovoïdes et noirs, qui lui assurent une forme de conservation dans le sol pour plusieurs années (Elad et al., 2004). A la saison suivante, les sclérotes forment du mycélium ou des apothécies qui sont capables d’attaquer la nouvelle culture. Les apothécies interviennent dans la reproduction sexuée du champignon. Elles ont été étudiées dans les pays de l’Europe du nord (Norvège) mais sont extrêmement rares en Europe du Sud comme en France ou en Espagne (Raposo et al, 2001). 3 Figure 4 : Cycle biologique de Sclerotinia sclerotiorum Source : Agrios, 2005 3. Moyens de lutte Certaines pratiques culturales permettent de réduire le risque de contamination par B. cinerea. Il est notamment conseillé d’éviter de stocker des débris de végétaux afin de supprimer les sources potentielles d’inoculum et d’aérer les cultures en espaçant les plants pour réduire l’humidité favorable au développement de B. cinerea. Si toutefois le champignon est présent, l’élimination des parties infectées des plantes doit se faire rapidement pour limiter la contamination, et l’utilisation de fongicides peut également être nécessaire. Cette dernière méthode n’est pas toujours efficace à cause de la variabilité génétique de B. cinerea qui entraîne l’apparition de souches résistantes. De plus, elle peut entraîner des risques, aussi bien environnementaux que sanitaires. C’est justement pour limiter cet usage qu’il est intéressant de mieux comprendre l’épidémiologie de B. cinerea, et d’étudier toutes les sources potentielles d’inoculum. La présence du champignon dans les plantes asymptomatiques ainsi que la transmission par les semences sont donc des pistes à approfondir. III. Sclerotinia sclerotiorum 1. Problèmes agronomiques Sclerotinia sclerotiorum fait lui aussi partie des Sclerotiniaceae (annexe 2) et infecte également une large gamme d’espèces (environ 400), telles que le colza, le tournesol, le tabac ainsi que des fruits et légumes (Saharan et Mehta, 2008). Il se différencie de B. cinerea notamment par la couleur blanche de son mycélium qui lui donne le nom de « pourriture blanche », ainsi que par la présence de gros sclérotes noirs qui lui sont caractéristiques. Il est présent dans les zones tempérées, bien que les climats froids et humides lui soient plus favorables. Ce champignon entraîne lui aussi des pertes sur les cultures qui peuvent aller jusqu’à la totalité de la récolte, c’est pourquoi il est lui aussi très étudié. 2. Cycle biologique Sclerotinia sclerotiorum ne produit pas de conidie et donc pas de spore asexuée. La dissémination du champignon se fait par dispersion de fractions de mycélium et surtout grâce aux ascospores (spores formées par méiose) libérées par les apothécies (figure 4). En 48h, les tissus infectés pourrissent et S. sclerotiorum progresse dans la plante (Saharan et Mehta, 2008). Les tissus sont recouverts par le mycélium blanc représentant le premier 4 Figure 5 : Laitue infectée par Sclerotinia sclerotiorum Source : INRA symptôme qui révèle la présence du champignon. Les conditions climatiques influent sur la propagation de l’infection car lorsque le taux d’humidité est élevé, S. sclerotiorum se développe dans toute la plante et celle-ci est recouverte par le mycélium blanc (figure 5). Au contraire, lorsque l’air est plutôt sec, le champignon va tuer la plante en formant des ulcères à l’intérieur de la tige mais sans développer l’aspect « pourriture blanche ». Après plusieurs jours, le mycélium forme des sclérotes à l’extérieur ou à l’intérieur de la plante, qui tombent au sol à cause du vent ou lors de la récolte (Saharan et Mehta, 2008). Ils représentent la principale forme de conservation car ils permettent au champignon de rester enterré dans le sol plusieurs années (de 3 à 5 ans), tout en gardant ses capacités à infecter un hôte le moment venu. Ils se situent environ à 5 cm de la surface du sol. Avant de donner du mycélium, une période de maturation (généralement l’hiver) est nécessaire mais sans qu’il gèle obligatoirement. Les conditions printanières favorables vont ensuite influencer leur germination pour donner du mycélium ou des apothécies. En ce qui concerne la température, S. sclerotiorum est capable de produire des sclérotes de 0°C à 30°C, tout en ayant une croissance ralentie lorsque la température est inférieure à 5°C (Saharan et Mehta, 2008). De même, la lumière est un facteur favorable au développement de ces formes de conservation. D’autres facteurs jouent également un rôle sur la croissance et le développement du champignon tels que la présence de nutriments. Par exemple, le zinc est essentiel pour la formation des sclérotes ainsi que pour la croissance de S. sclerotiorum. D’autres éléments comme le potassium, le phosphore ou le magnésium sont également indispensables. 3. Moyens de lutte Comme pour B. cinerea, il est recommandé d’éliminer les plantes malades car elles sont susceptibles de contenir des sclérotes ou du mycélium qui peuvent infecter la culture suivante. Pour les cultures sous serre, il faut également contrôler l’humidité pour que celle-ci ne soit pas trop élevée, en aérant au maximum. En ce qui concerne l’arrosage des laitues, mieux vaut éviter les aspersions pour qu’il n’y ait pas d’eau stagnante, responsable d’une forte humidité au cœur de la plante. Il y a quelques années, afin de protéger les plantations suivantes en pépinière, une désinfection du sol était réalisée à l’aide de fongicides comme le Bromure de méthyle. A cause de ses effets destructeurs sur la couche d’ozones, il a été interdit en France en 2005 (INRS). Depuis, d’autres méthodes sont utilisées telles que l’utilisation d’engrais vert (plantation de moutarde par exemple) ou la solarisation des sols. Cette dernière permet de diminuer la viabilité des sclérotes présents 5 dans le sol en augmentant sa température pendant une longue période, généralement plusieurs semaines (Mazollier, 2009). Dans l’objectif de protéger l’environnement, il devient important de développer de nouvelles techniques non-chimiques. C’est pourquoi S. sclerotiorum est lui aussi un pathogène intéressant à étudier. IV. Des champignons endophytes 1. Définition Initialement, le terme endophyte, est un adjectif qui permet de déterminer une localisation puisque endo- signifie « à l’intérieur », et -phyte correspond à la plante. Il s’oppose au terme épiphyte, qui signifie « sur la plante ». C’est pourquoi un champignon endophyte est un champignon qui se situe dans les tissus de la plante et non pas en surface. Désormais, il s’emploie aussi pour qualifier l’association entre le champignon et la plante. Il existe un grand nombre d’espèces fongiques capables d’infecter une importante diversité végétale. Ces champignons sont présents chez les graminées, les plantes à fleurs comme les Primulaceae, mais aussi chez les plantes cultivées (laitues, tomates, tabac etc…) et peuvent aussi bien être sous forme endophyte stricto sensu ou être endophyte et épiphyte. 2. B. cinerea et S. sclerotiorum Pour B. cinerea, il a été montré qu’il pouvait être présent dans les semences à l’état endophyte, et être transmis ensuite à la plantule (Barnes et Shaw, 2003). D’autres analyses ont révélé que certaines parties de Primula x polyantha comme les racines, étaient fortement infectées par B. cinerea (Barnes et Shaw, 2003). De même, le champignon a été identifié dans des feuilles asymptomatiques de fraisiers. Il est également capable de rester dans la plante à l’état endophyte, jusqu’à ce que le fruit soit formé ou jusqu’à ce que les feuilles commencent à devenir sénescentes (Barnes et Shaw, 2002). En revanche, la phase endophyte de S. sclerotiorum n’a pas été autant étudiée que celle de B. cinerea. V. Objectifs du stage Les formes de conservation de B. cinerea et S. sclerotiorum dans le sol ainsi que leur dissémination aérienne sont bien connues et sont prises en compte dans les stratégies de protection des parcelles agricoles. Pour améliorer les méthodes de protection des cultures, 6 il est intéressant d’étudier une source d’inoculum potentielle présente sous forme endophyte. Ainsi, au cours du stage nous analyserons dans un premier temps, des lots de semences pour étudier la flore épiphyte et endophyte en recherchant spécifiquement B. cinerea et S. sclerotiorum. Ensuite, pour étudier la capacité de ces champignons à passer des semences aux plantules, des graines d’endive seront inoculées, et les plantes qui en résulteront seront analysées. Puis, une étude sera menée sur la capacité qu’ont les spores de B. cinerea à infecter des plantules, en recherchant la présence endophyte du champignon dans les différentes parties des plantules. Enfin, l’étude de feuilles provenant de serres commerciales permettra d’évaluer la présence endophyte et épiphyte des deux champignons sur les cultures maraîchères. 7 Tableau 1 : Lots de semences analysées Espèces analysées Nombre de variétés Nom des variétés Variété 1 Variété 2 Laitue (Lactuca sativa) 5 Variété 3 Variété 4 Variété 5 Variété 6 Variété 7 Tomate (Solanum lycopersicum) 5 Variété 8 Variété 9 Variété 10 Variété 11 Variété 12 Carotte (Daucus carota) 5 Variété 13 Variété 14 Variété 15 Primevère (Primula) Colza (Brassica Napus) Melon (Cucumis melo) Tournesol (Helianthus annuus) Variété 16 2 Variété 17 Variété 18 2 Variété 19 Variété 20 2 Variété 21 Variété 22 2 Variété 23 Matériels et méthodes I. Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des lots de semences Nous réalisons cette recherche dans le but de savoir si B. cinerea ou S. sclerotiorum peuvent être présents dans les semences en tant qu’endophytes ou présents sur celles-ci en tant qu’épiphytes, et donc susceptibles d’être transmis de la graine à la plantule lors de la germination. 1. Lots de semences Les graines utilisées (tableau 1) sont issues de lots commerciaux et sont stockées au réfrigérateur avant leur analyse. Elles n’ont reçu aucun traitement préalable. Certaines graines (celles de laitues) sont enrobées dans de l’argile. Pour effectuer l’analyse il faut donc les extraire de cet enrobage. Au cours du stage, 23 lots de semences ont été analysés. 2. Analyse de la flore épiphyte Afin de déterminer si B. cinerea ou S. sclerotiorum sont présents à la surface des semences commerciales, nous analysons la flore épiphyte. Cela correspond aux différents micro-organismes présents à la surface de la graine. On effectue une analyse de 100 graines par variété. Dans un premier temps, on les répartit dans 5 sachets, soit 20 graines par sachet. Ensuite il faut décoller les microorganismes présents potentiellement sur les graines. Pour cela, sous une hotte à flux laminaire garantissant des conditions stériles, on introduit 1mL d’eau stérile dans chaque sachet. Puis on effectue un stomachage pendant 2 minutes pour mettre en suspension ce qui se trouve sur les graines. De nouveau en conditions stériles, on prélève 300µL de suspension par sachet que l’on étale sur un milieu PDA + Graneor (annexe 3) à l’aide d’un râteau. Le milieu PDA est un milieu qui permet la croissance des champignons car il contient de la pomme de terre, du sucre (dextrose) et de la gélose (agar). Il s’agit donc d’un milieu très nutritif. Le Graneor est un fongicide spécifique qui va ralentir la croissance de certains champignons non désirés, permettant le développement de B. cinerea et S. sclerotiorum. Il s’inspire d’un milieu utilisé dans plusieurs publications concernant la recherche de champignons endophytes : le BSM (Botrytis Selective Medium) (Edwards et Seddon, 2001). 8 On réalise 3 étalements à partir de chaque sachet. Les boites sont ensuite conservées pendant 3 semaines à température ambiante (≈ 20°C) et à la lumière naturelle. 3. Analyse de la flore endophyte Cette analyse va nous permettre de déterminer si les champignons sont présents à l’intérieur des graines. Ainsi, on retire les semences des sachets et on les place dans une boule à thé, puis on les désinfecte en les plongeant 3 minutes dans une solution de Domestos à 50%, suivies de 3 minutes dans 3 bains d’eau stérile successifs. Ensuite, on les égoutte sur du papier absorbant stérile, puis on dépose 5 graines par boite de Petri. Ces boites sont également stockées 3 semaines à température ambiante (≈20°C) et à la lumière naturelle. Des observations sont effectuées régulièrement afin de surveiller si un développement mycélien ressemblant à B. cinerea ou S. sclerotiorum apparait. Il s’agit pour les deux champignons de mycéliums plutôt clairs, peu denses et sinueux. Si tel est le cas, les colonies mycéliennes sont repiquées sur PDA afin de mettre en évidence les structures caractéristiques des deux champignons (les conidiophores pour B. cinerea, et les sclérotes pour S. sclerotiorum). Si le développement mycélien est contaminé par des bactéries, alors le repiquage se fait sur un milieu contenant de la Tétracycline, un antibiotique qui va ralentir la croissance bactérienne. II. Analyse de plantes issues de semences inoculées avec B. cinerea et S. sclerotiorum Cette analyse va nous permettre de déterminer si les champignons présents dans les semences peuvent se retrouver en tant qu’endophyte dans les parties aériennes (feuilles) ou souterraines (racines) de la plante. 1. Inoculation de semences Des graines d’endives de la variété Vintor ont été préalablement inoculées avec ces deux champignons. Des colonies de B. cinerea et S. sclerotiorum sont produites sur PDA. Les semences d’endives sont désinfectées et posées à la périphérie des colonies âgées de 3 jours. Au bout de 24h, les semences sont collectées puis semées sur un support de laine de roche. Elles sont ensuite stockées dans une chambre climatique à 20°C pendant plusieurs jours, puis les plantules qui se sont développées sont transplantées dans des pots 9 Figure 6 : Analyse d’endives issues de semences inoculées de terreau et stockées sous serre. Au bout de 3 semaines on compte le nombre de plantules témoins et issues de semences inoculées qui se sont développées. Une partie des graines est conservée pour une analyse ultérieure. 2. Analyse des endives Pour réaliser l’analyse nous prélevons 12 endives témoin, 23 endives issues de semences inoculées avec B. cinerea et 8 endives issues de semences inoculées avec S. sclerotiorum car seules 8 plantules se sont développées. Nous réalisons directement l’analyse de la flore endophyte. Pour cela, on coupe la racine pour la séparer des feuilles, et on sélectionne 3 feuilles : de préférence une feuille jeune, une feuille plus ancienne et une intermédiaire. Ensuite, sous hotte à flux laminaire, on les désinfecte en les plongeant 3 minutes dans une solution de Domestos à 50%, suivies de 3 minutes dans chacun des 3 béchers restants, contenant de l’eau stérile pour procéder au rinçage (figure 6). Puis, on les égoutte sur du papier absorbant stérile, on découpe une partie de la feuille à l’aide d’un emporte-pièce, et des rondelles de racine avec un scalpel. On prélève 2 échantillons par feuille, que l’on place ensuite sur une boite de PDA + Graneor. Pour les racines, on place 3 rondelles par boites. Ces dernières sont ensuite stockées à 20°C, à la lumière naturelle pendant 3 semaines. Des observations sont effectuées régulièrement afin de surveiller si un développement mycélien ressemblant à B. cinerea ou S. sclerotiorum apparait, et si tel est le cas il est repiqué. 3. Analyse des semences inoculées Théoriquement, puisque les graines ont été mises en contact avec les champignons, ces derniers doivent se situer à l’intérieur ou en surface des semences. Après 1 mois de conservation au réfrigérateur (4°C), on peut observer un fort développement mycélien à la surface des graines. L’analyse épiphyte n’est donc pas nécessaire et nous procédons directement à une analyse de la flore endophyte, afin de déterminer si les champignons ont pénétré dans les tissus des semences. Pour cela, le protocole est le même que pour les autres analyses de flore endophyte sauf que nous désinfectons les 60 graines de chaque type pendant 5 minutes dans le Domestos au lieu de 3 minutes. Comme les autres boites, elles sont également stockées 3 semaines à température ambiante (20°C) et à la lumière naturelle. 10 Figure 7 : Gloire du Dauphiné inoculées avec des conidies de Botrytis cinerea à sec Source : INRA Figure 8 : Cellules de Malassez et Brenda inoculées Source : INRA III. Inoculation de plantules avec des conidies de B. cinerea à sec Dans le laboratoire de mycologie, des inoculations avec des conidies de B. cinerea en suspension dans l’eau sont effectuées fréquemment. Le champignon s’exprime à travers des lésions qui apparaissent dans les 4 à 7 jours qui suivent la manipulation. Ici, nous réalisons une inoculation à sec car nous voulons déterminer s’il est possible d’infecter des plantules à partir de conidies et si le champignon peut par la suite se développer sous forme endophyte comme l’ont expérimenté Sowley et Shaw (2010). 1. Les plantules Ce sont des tomates (Brenda) et des laitues (Gloire du Dauphiné) issues de semences non traitées. La flore épiphyte et endophyte de ces semences a été analysée dans la partie I. Elles ont été mises en culture sur laine de roche et lors de l’inoculation elles sont âgées de 2 semaines. Il y a 75 plantules de chaque variété réparties sur des plaques de 5 x 5 (figure7). Cinquante sont inoculées et vingt-cinq sont utilisées comme témoin. Ces dernières sont stockées sous serre jusqu’à ce qu’elles soient utilisées pour l’analyse. 2. Les colonies mycéliennes Ce sont des colonies issues d’une souche de B. cinerea (Bc1), utilisée comme souche de référence dans le laboratoire de mycologie. Les colonies sont âgées de 2 semaines et sont recouvertes de spores (conidies) qui se détachent en soufflant ou en tapotant la boite de Petri. Une boite de B. cinerea qui s’est développé sur PDA pendant 15 jours contient en moyenne de 1 à 10 millions de spores. 3. Inoculation à sec Une plaque contenant les plantules est disposée au sol, et deux cellules de Malassez sont réparties de chaque côté de la plaque (figure 8). La tour d’inoculation (1 m de hauteur et 30 cm de diamètre) est positionnée de manière à avoir les plantules ainsi que les cellules de Malassez en son centre. Au sommet de la tour, on tapote une boite de B. cinerea renversée dans le but de faire tomber des spores sur les plantules, puis on place un couvercle sur la tour. Puisque la vitesse de chute des spores est de l’ordre de 0,5 cm / seconde, on laisse sédimenter 30 minutes, pour être sûr que toutes les conidies soient déposées à la base de la tour, au niveau des plantules. On recommence la manipulation 11 pour les 3 autres lots, ce qui correspond à 100 plantules au total, en ayant 50 Brenda et 50 Gloire du Dauphiné. Les 2 plaques restantes constituent les témoins et ne sont donc pas inoculées. Enfin, on récupère les cellules de Malassez pour les observer au microscope et estimer le nombre de spores qui s’est déposé par unité de surface. Les plantules inoculées sont placées à l’obscurité dans une maxi-serre pendant 24h. Ensuite, elles sont placées dans une chambre climatique à 20°C avec une photopériode de 12h et une hygrométrie de 60% en étant arrosées deux fois par jour pendant une semaine. Au bout d’une semaine les plantules sont repiquées dans des pots de terreau et placées en serre. 4. Evaluation de l’inoculum déposé Grâce à une observation microscopique de la cellule de Malassez, nous pouvons compter les spores présentes sur 10 grands rectangles. Ensuite, il nous suffit de rapporter le nombre de spores par rapport à une surface exprimée en mm2. Cela nous donne une indication quant au nombre de spores qui se sont déposées sur les plantules. 5. Analyse de la flore endophyte des plantules Trois semaines après l’inoculation, nous procédons à une première analyse afin de déterminer si B. cinerea est présent. Pour cela, on prélève 3 feuilles et la racine, que l’on désinfecte en les plongeant 3 minutes dans une solution de Domestos à 50%, suivies de 3 minutes dans 3 bains d’eau successifs. Puis, on les égoutte sur du papier absorbant stérile. On découpe une partie de la feuille à l’aide d’un emporte-pièce, et des rondelles de racine grâce au scalpel. On prélève 2 échantillons par feuille, que l’on place ensuite sur une boite de PDA + Graneor (annexe 4). Pour les racines, on place 3 rondelles par boites. Ces dernières sont ensuite stockées dans les mêmes conditions que les boites des autres analyses. Des observations sont effectuées régulièrement afin de surveiller si un développement mycélien ressemblant à B. cinerea apparait, et si tel est le cas il est repiqué. La deuxième analyse se déroule quatre semaines après l’inoculation, en suivant le même protocole. 12 IV. Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des cultures commerciales 1. Matériel utilisé Cette manipulation a pour but d’analyser la flore épiphyte et endophyte présente sur des plantes provenant de cultures maraichères. Nous avons à notre disposition 30 feuilles de tomate hors sol (variété Melice) collectées à Gaillard (74), 30 feuilles de tomate en sol (variété de Syngenta) collectées à Ampuis (69) et 26 feuilles de fraise en sol (variété Cléry) collectées à Salaise sur Sanne (38). Ces échantillons ont été conservés au frais pendant les 48h avant l’analyse. 2. Analyse de la flore épiphyte Pour chaque espèce, on répartit les feuilles dans 3 sachets de Stomacher® (10 par sachet) que l’on pèse, puis dans lesquels ont introduit 30mL d’eau stérile. On effectue un stomachage pendant 2 minutes pour mettre en suspension les micro-organismes qui se trouvent potentiellement sur les feuilles. Sous la hotte à flux laminaire, on prélève 400µL de suspension par sachet que l’on étale sur un milieu PDA + Graneor à l’aide d’un râteau stérile. On effectue cette action 5 fois. 3. Analyse de la flore endophyte En ce qui concerne les feuilles présentes dans le sachet, on les prélève à l’aide d’une pince puis on les désinfecte en les plongeant 3 minutes dans une solution de Domestos à 50%, suivi de 3 minutes dans 3 bains d’eau successifs restants. Ensuite, on les égoutte sur du papier absorbant stérile, puis on découpe une partie de la feuille à l’aide d’un emportepièce. On réalise 2 échantillons par feuille, que l’on place ensuite sur une boite de PDA + Graneor. Les boites sont stockées dans les mêmes conditions que les boites des analyses précédentes. Des observations sont effectuées régulièrement afin de surveiller si un développement mycélien ressemblant à B. cinerea ou S. sclerotiorum apparait, et si tel est le cas il est repiqué. 13 Tableau 2 : Résultats de l’analyse de lots de semences* Flore épiphyte Présence de B. cinerea Laitue Tomate Carotte Colza Primevère Melon Tournesol Variété 1 Variété 2 Variété 3 Variété 4 Variété 5 Variété 6 Variété7 Variété8 Variété 9 Variété 10 Variété 11 Variété 12 Variété13 Variété 14 Variété 15 Variété 16 Variété 17 Variété 18 Variété 19 Variété 20 Variété 21 Variété 22 Variété 23 non non non non non non non non non non non non non non non non non ec ec non non ec non Présence de S. sclerotiorum non non non non non non non non non non non non non non non non non ec ec non non ec non Flore endophyte Présence de B. cinerea non OUI non non non non non non non non non non non ec non non non ec ec non non ec non Présence de S. sclerotiorum non non non non non non non non non non non non non ec non non non ec ec non non ec non Note : ec = en cours d’analyse * confidentialité : le nom des variétés n’est pas communiqué dans la cadre de la diffusion de ce rapport. Résultats et discussion Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des lots de semences I. Après 3 semaines, les observations révèlent si les champignons recherchés sont présents ou non (tableau 2). 1. Flore épiphyte L’analyse de la surface des graines de laitue, tomate, primevère, colza, melon et tournesol ne révèle aucun microorganisme et donc pas de trace de B. cinerea ou S. sclerotiorum. Cela indique qu’une désinfection de la surface des graines (vendues non traitées) est sans doute réalisée avant leur commercialisation. En revanche, la flore épiphyte des graines de carottes contenait une grande diversité de bactéries. Ces dernières n’ont visiblement subit aucun traitement préalable. Cependant, on ne peut pas exclure la présence de B. cinerea et S. Sclerotiorum à la surface des semences car si c’est le cas, il y a doit y avoir moins d’une UFC (unité formant colonie) de B. cinerea ou S. sclerotiorum dans les 900µL de suspension étalés sur PDA et donc moins d’1 UFC par lots de 20 graines. 2. Flore endophyte Toutes les semences désinfectées à l’aide du Domestos ont commencé à germer dans les boites de Petri. Cela signifie que la désinfection ne tue pas la graine et donc qu’elle ne devrait pas tuer le champignon si celui-ci est présent dans la graine. Ainsi, B. cinerea et S. sclerotiorum devraient pouvoir se développer s’ils sont présents à l’intérieur des semences. Le protocole semble adapté pour la mise en évidence des champignons endophytes. Nous avons analysé 100 graines, donc si aucun développement mycélien n’est observé, cela signifie que soit il n’y a pas de champignon endophyte dans le lot de semences, soit que le nombre de graines endophytées est inférieur au seuil de détection qui est de 1%. Aucune graine n’a révélé la présence d’une phase endophyte de S. sclerotiorum. Par contre, nous avons décelé la présence de B. cinerea dans la flore endophyte d’une graine d’un variété de laitue (variété 2) . La flore épiphyte ne comportait aucune croissance mycélienne, ce qui atteste bien que le champignon était situé dans la graine. Ainsi, dans 14 l’échantillon de semences de la variété 2, le nombre de B. cinerea présent à l’état d’endophyte est de 1%. La souche endophyte mise en évidence a été mise en collection pour ensuite être caractérisée (pouvoir pathogène, génotype). Ce résultat est cohérent avec ceux de Sowley et al. (2010) qui ont mis en évidence la présence endophyte de B. cinerea dans des graines de laitue. Ils ont montré que B. cinerea pouvait également être présent dans des graines de Primula x polyantha, mais à l’heure de l’impression de ce rapport nous n’avons pas encore les résultats des analyses que nous avons réalisées sur les semences de primevère. Des analyses de flore endophyte concernant la variété 2 vont être poursuivies afin de préciser le pourcentage de graines infectées par le champignon. Il serait intéressant d’analyser des lots de la variété 2 commercialisés à une période différente, et d’analyser des lots provenant du même fournisseur mais produits sur des sites différents afin de comprendre quels peuvent être les facteurs influençant la présence endophyte de B. cinerea dans les semences commerciales. Les semences restantes des autres variétés de laitue vont également être analysées pour affiner le seuil de détection. Même si le pourcentage de semences endophytées paraît faible (1%), il n’est pas sans conséquence du point de vue agronomique. En effet, en considérant que dans un tunnel de production il y a environ 2 000 laitues, si B. cinerea est présent dans 1% des semences, cela signifie que 20 plantes abritent le champignon dès le début du cycle de la culture. Si les conditions sont favorables, il pourrait s’exprimer, sporuler et infecter les autres plantes, d’où un risque de perte économique important. Les conditions qui permettent l’éventuel passage de la phase endophyte vers la phase épiphyte et pathogène restent encore à élucider. II. Analyse de plantes issues de semences inoculées avec B. cinerea et S. sclerotiorum Des semences d’endive mises en contact avec des colonies de B. cinerea et S. sclerotiorum pendant 24h, ont été semées pour l’obtention de plantules. Une partie des semences a été conservée à 4°C pour analyse de la flore endophyte après inoculation. 15 Figure 9 : Effet des champignons sur la germination des semences Plantules développées 60 50 39 40 30 23 20 8 10 0 Témoin B.cinerea S.sclerotiorum Tableau 3 : Localisation des espèces fongiques observées Témoin B. cinerea S. sclerotiorum 12 23 8 Racines 0 0 0 Feuilles 0 2 0 Racines 0 0 0 Feuilles 0 0 0 Nb de plantes analysées Nb plantes avec B. cinerea Nb plantes avec S. sclerotiorum 1. Flore endophyte des semences inoculées Les semences inoculées sont déposées sur PDA après désinfection et quelques jours plus tard, nous observons une importante croissance mycélienne sur les boites de Petri. Botrytis cinerea et S. sclerotiorum étaient donc présents, soit à l’extérieur, soit à l’intérieur de la graine. Comme la surface des semences a été désinfectée de façon assez poussée (5 minutes au Domestos) il semble donc les champignons étaient présents sous forme endophyte. Les graines témoins ne contenaient que des bactéries ou quelques champignons, mais sans qu’il s’agisse de B. cinerea ou S. sclerotiorum. 1. Effet des champignons sur les semences Les graines témoin qui n’ont reçu aucun traitement, ont un taux de germination de 65% (60 semences ont donné 39 plantules). Concernant les graines inoculées avec B. cinerea, 23 se sont développées c’est-à-dire moins de la moitié (38%). Enfin, seulement 8 plantes issues de semences inoculées avec S. sclerotiorum ont poussé (13%) (figure 9). Les champignons ont donc eu un impact négatif sur la germination des graines. 2. Analyses des parties aériennes et souterraines des endives Aucune endive ne présentait de symptôme de pourriture blanche ou grise. Quelques jours après la mise en culture sur boite de Petri des morceaux de racines et de feuilles, nous pouvons déjà constater un développement mycélien et bactérien sur les boites. Cela nous permet de procéder à des repiquages des colonies qui ressemblent à B. cinerea et S. sclerotiorum. Les repiquages se font sur milieu PDA si le mycélium est suffisamment isolé d’autres bactéries ou champignons. Sinon ils se font sur milieu PDA + Tétracycline pour éliminer les bactéries. Concernant les racines, les développements mycéliens se sont souvent révélés comme étant Penicillium spp. Deux colonies repiquées à partir de feuilles se sont révélées être B. cinerea (tableau 3). Le champignon a donc été transmis des semences à 2 plantules, et s’est localisé dans les feuilles. Par contre, S. sclerotiorum n’a jamais été mis en évidence. Ainsi en considérant les observations de la flore endophyte et de l’effet du champignon sur la croissance des plantules, il se pourrait que S. sclerotiorum tue la graine et qu’il ne puisse donc pas être transmis à la plantule. Il se peut que les 8 plantules obtenues suite à l’inoculation des semences avec S. sclerotiorum soient issues de graines dans et sur lesquelles le champignon ne s’est pas installé. 16 Tableau 4 : Estimation du nombre de spores Lot 1 Lot 2 Lot 3 Lot 4 (Gloire du (Gloire du (Brenda) (Brenda) Dauphiné) Dauphiné) 136 522 194 64 Nombre de spores par mm2 Tableau 5 : Analyses des laitues Gloire du Dauphiné Témoin Lot 1 Lot 2 Date de l’analyse 12/05 20/05 12/05 20/05 12/05 20/05 Nb de plantes analysées 12 13 12 12 12 11 Nb plantes avec B. cinerea 0 0 1 11 0 9 Nb plantes avec S. sclerotiorum 0 0 0 0 0 0 Sowley et al (2010) ont montré que des graines de laitues infectées par B. cinerea donnent dans chaque cas une plante elle-même contaminée par le champignon. L’infection était d’abord localisée dans les racines, puis dans les tiges et enfin, moins fréquemment dans les feuilles. Cela diffère de nos résultats obtenus sur endive puisque les deux colonies de B. cinerea ont été isolées à partir de feuilles. Cependant il se peut que la présence de B. cinerea dans les racines ait été masquée par une forte présence de bactéries dans les boites de Petri même après désinfection. L’expérience sera reconduite en insistant davantage sur la désinfection des racines. III. Inoculation de plantules avec des conidies de B. cinerea à sec 1. Estimation du nombre de spores Grâce aux cellules de Malassez, nous avons pu dénombrer la quantité de spores qui s’est déposée sur les plantules (tableau 4). Leur nombre varient de 64 à 522 spores par mm2 selon les lots, ce qui représente une densité importante. 2. Analyse des plantules de laitue Gloire du Dauphiné Trois semaines après l’inoculation aucune plantule ne présentait de symptôme de pourriture grise. Pour les plantes témoins, les résultats de la première analyse réalisée 3 semaines après l’inoculation montrent un développement bactérien et mycélien (tableau 5). Des repiquages ont donc été effectués afin de déterminer quels champignons étaient présents dans les plantules bien qu’elles n’aient pas été inoculées. Après plusieurs semaines d’incubation, nous avons constaté qu’il s’agissait de Penicillium spp mais jamais de B. cinerea. En ce qui concerne les laitues appartenant au lot 1, aucun développement mycélien n’a été repéré comme pouvant correspondre à B. cinerea. Cependant, sur le lot 2 un mycélium, qui s’est développé à partir d’une racine, ressemblait à celui du champignon étudié et a été repiqué. Après plusieurs semaines, il s’est avéré être B. cinerea. Ainsi, sur les 24 plantules analysées 3 semaines après l’inoculation, seule une contenait le champignon endophyte au niveau des racines. Quatre semaines après l’inoculation, aucune plante ne présentait de symptôme de pourriture grise. Pour les plantes témoin, aucun développement de B. cinerea n’a été mis en évidence sur les racines ou les feuilles. Par contre, pour les plantes inoculées, les résultats sont très différents. Pour les deux lots de laitues, 87% des plantes hébergeaient 17 Figure 10 : Présence de B. cinerea dans les laitues inoculées à sec % Pourcentage de plantes contenant B. cinerea selon la date d'analyse 100 87 90 80 70 60 50 40 30 20 10 4,2 0 le 12/05 le 20/05 B. cinerea (tableau 5). Le mycélium était localisé au niveau des racines uniquement. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence la présence endophyte du champignon dans les laitues asymptomatiques, suite à une inoculation avec des conidies à sec. Ces résultats sont cohérents avec ceux de Sowley et Shaw (2010), puisque suite à une inoculation de plantules de laitues avec des conidies de B. cinerea à sec, ils ont montré que le champignon se développait en tant qu’endophyte majoritairement au niveau des racines. Il est intéressant de voir que le facteur temporel influe sur la détection du champignon. Trois semaines après inoculation, B. cinerea est isolé dans 4% des plantules inoculées alors que 4 semaines après inoculation ce pourcentage monte à 87% (figure 10). L’expérience pourrait être renouvelée d’une part en standardisant la méthode pour libérer une quantité plus précise de spores et d’autre part en incluant le facteur temps afin de voir à partir de combien de temps le champignon est décelable, et si il est possible de suivre sa progression, en observant les différentes parties de la plante. Des analyses pourraient être donc réalisées chaque semaine, et les parties aériennes et souterraines de la plante qui ne sont pas analysées, seraient conservées afin de réaliser des observations microscopiques. Ces dernières pourraient apporter de nouvelles informations sur la localisation de B. cinerea dans les tissus de la laitue. Grâce à ces résultats on peut imaginer une partie du cycle biologique de B. cinerea qui semblait jusque-là peu probable. On sait qu’en présence d’humidité, les spores qui se déposent sur les tissus végétaux germent, le mycélium se multiplie et le champignon entraine l’apparition de symptômes. Son existence au sein de la plante est ainsi décelable et un agriculteur confronté à ces symptômes peut réagir en conséquence. Désormais on peut penser que lorsque l’air est sec et que des spores de B. cinerea se déposent sur des plantes, le champignon peut se développer dans les tissus sans créer de symptôme et rester dans la plante sous forme endophyte. La plante ne montrant aucune tache ou lésion, la présence de B. cinerea est imperceptible. De ce fait il est difficile pour l’agriculteur d’évaluer la présence de cet inoculum potentiel dans ses plantes et donc d’adopter les méthodes de protection de ses cultures qui conviennent. 3. Analyse des plantules de tomate Brenda L’analyse est en cours, nous n’avons pas de résultats définitifs pour le moment. 18 Figure 11 : Flore épiphyte des feuilles de tomate de Gaillard contenant Penicillium spp Source : INRA Figure 12 : Flore épiphyte des feuilles de tomate d’Ampuis Source : INRA Figure 13 : Flore épiphyte des feuilles de fraise de Salaise sur Sanne Source : INRA IV. Recherche de B. cinerea et S. sclerotiorum dans des cultures commerciales 1. Flore épiphyte a) Tomates du 74 Nous avons pu constater un développement de Penicillium spp sur toutes les boites (figure 11). Celui-ci étant très important, nous n’avons pas pu faire de repiquage et par conséquent déterminer la présence éventuelle de B. cinerea ou S. sclerotiorum dans la flore épiphyte. b) Tomates du 69 Il s’agit en grande majorité de bactéries (figure 12), mais nous avons toutefois identifié trois développements mycéliens que l’on a repiqués pour pouvoir déterminer s’ils correspondent ou non à B. cinerea ou S. sclerotiorum. Après plusieurs semaines, il s’agit de B. cinerea. Ce dernier s’est développé en formant des sclérotes et nous aurions pu penser qu’il s’agissait de S. sclerotiorum. Mais l’observation de conidiophores a permis de confirmer la présence de B. cinerea pour deux lots de feuilles. Pour le premier lot, une seule boite était positive. Ce qui signifie qu’il y avait 1 UFC dans les 2 mL étalés au total. Cela correspond à 15 UFC pour 30mL. Sachant qu’il y avait 10 feuilles par sachet, on peut considérer qu’il y avait 1 UFC par feuille. Pour le deuxième lot, 2 boites contenaient B. cinerea. Il y avait donc 2 UFC dans les 2 mL étalés, ce qui correspond à 30 UFC pour 30 mL, et équivaut donc à 3 UFC par feuille. Cela représente un nombre d’UFC potentielles élevé si on le rapporte à un plant de tomate possédant plusieurs dizaines de feuilles. c) Fraisiers du 38 En ce qui concerne les fraisiers, nous avons observé une grande diversité de microorganismes (bactéries ou champignons) présents dans la flore épiphyte (figure 13). Certains champignons ont été repiqués afin de déterminer plus précisément si ce sont ceux que l’on recherche ou non. En effet, après quelques semaines d’incubation, des conidiophores identiques à ceux de B. cinerea ont été mis en évidence. Cela atteste donc de sa présence dans la flore épiphyte. Pour les 3 lots, 3 boites sur 5 étaient positives, ce qui correspond donc à 3 UFC dans 2 mL. Ainsi, pour 30 mL on a 45 UFC, ce qui équivaut environ à 4 UFC par feuille. 19 Figure 14 : Flore endophyte des feuilles de tomate de Gaillard Source : INRA Les fraisiers avaient l’air en bonne santé, sans symptôme. Ainsi, si les conditions deviennent favorables, la maladie peut apparaître ponctuellement et se répandre aux plants qui n’étaient pas encore infectés. 2. Flore endophyte a) Tomates du 74 Comme pour ce qui concerne la flore épiphyte, nous avons pu constater un développement important de Penicillium spp pour toutes les feuilles analysées (figure 13), bien qu’elles aient subit une désinfection dans du Domestos. Cela met donc en évidence la présence de Penicillium spp dans la flore endophyte et non pas celle de B. cinerea ou S. sclerotiorum. b) Tomates du 69 Les feuilles analysées ont quelques développements bactériens mais aucun développement mycélien. Aucun repiquage n’a donc été réalisé. Et nous pouvons supposer que soit B. cinerea et S. sclerotiorum sont absents de la flore endophyte, soit le nombre d’UFC est inférieur au seuil de détection (moins de 1 UFC par feuille). c) Fraisiers du 38 Même après plusieurs semaines, la flore endophyte des feuilles de fraisiers ne comporte pas de trace des champignons recherchés, bien qu’on ait trouvé B. cinerea dans la flore épiphyte. Cela signifie qu’il est présent à la surface de la plante mais que le nombre d’UFC endophytes, est inférieur au seuil de détection soit inférieur à 1 UFC par feuille. Ces résultats montrent que B. cinerea peut être présent de façon épiphyte sur les plants de tomates et de fraisiers sans que les symptômes de pourriture grise soient observés sur les plantes analysées ou les plantes voisines. Si les conditions sont favorables, il est donc susceptible de s’exprimer en engendrant de la pourriture grise. Mais nous pouvons aussi penser qu’il peut coloniser les plantes sous forme endophyte à partir des spores présentes à la surface des tissus. 20 Conclusion I. Bilan scientifique Suite à ces différentes analyses, nous observons que B. cinerea peut se trouver sous forme endophyte au niveau des semences de laitue, c’est-à-dire qu’il peut être présent dès le début de la culture. Cette source potentielle d’inoculum est à étudier davantage afin de préciser au mieux le pourcentage de graines qui hébergent le champignon. Des analyses génotypiques pourront être effectuées afin de caractériser les nouvelles souches décelées. Ce travail de caractérisation dépendra avant tout du nombre de souches trouvées, mais permettra d’acquérir des souches probablement non répertoriées par le laboratoire. Des études sur leur pouvoir pathogène sont aussi intéressantes à mener, pour savoir si ces souches ont une agressivité potentiellement importante ou non, et si elle varie en fonction des conditions environnementales. Botrytis cinerea est également capable de passer de la semence à la plantule et d’y rester tout au long du développement de la plante, pendant plusieurs semaines. Ainsi, pour les agriculteurs il est important que les semences ne contiennent pas l’inoculum. Enfin, lorsqu’il est disséminé au moment où les conditions climatiques sont plutôt sèches (comme en saison estivale), B. cinerea est capable de s’installer dans la plante sans causer de symptôme. Il n’y a donc aucune trace du champignon, ce qui empêche et les agriculteurs de mettre en place des moyens de lutte adaptés et ciblés. Cette présence asymptomatique est problématique car elle n’éveille pas la vigilance de l’agriculteur et si la totalité des débris végétaux n’est pas enlevée à la fin de la récolte, le champignon peut se conserver dans le sol en formant des sclérotes qui se développeront au début de la saison culturale suivante. En ce qui concerne S. sclerotiorum, sa présence endophyte n’a pas été démontrée dans les semences commerciales, ni dans les plantules issues de semences inoculées. Les dix semaines de stages ne nous ont pas permis de traiter tous les résultats pour le moment et il se peut que dans les semaines à venir, sa présence soit finalement révélée. Une inoculation sur plantule pourrait être expérimentée, mais comme S. sclerotiorum ne produit pas de conidie, elle serait plus complexe à mettre en œuvre car il faudrait produire des ascospores et donc des apothécies. 21 Les résultats obtenus permettent d’avancer de nouvelles hypothèses et d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherche. Celles-ci permettront de développer des méthodes de luttes adaptées tout en s’inscrivant dans une démarche écologique et durable. II. Bilan personnel Ce stage a été pour moi une expérience très enrichissante, à la fois d’un point de vue professionnel, et à la fois personnel. En effet, j’ai appris de nouvelles techniques notamment en ce qui concerne la microbiologie telles que la préparation et le coulage des milieux de culture, ou encore la réalisation des ensemencements à partir de végétaux. Les études bibliographiques m’ont permis d’approfondir des notions de biologie végétale portant principalement sur la mycologie. Ce stage a donc été très intéressant car j’ai eu l’opportunité de concilier différents domaines enseignés à l’IUT. Par ailleurs, cette expérience professionnelle me permet également d’appréhender autrement et plus sereinement le monde du travail ainsi que d’agrandir mon cercle de contacts professionnels. Au cours de ces 10 semaines j’ai gagné en autonomie, et j’ai pu mettre en pratique ce que l’IUT nous a enseigné pendant deux ans, c’est-à-dire savoir organiser et préparer son travail à l’avance. Par ailleurs, j’ai remarqué que la communication entre les différents membres du laboratoire est primordiale puisqu’elle permet d’informer l’équipe sur les manipulations prévues par chacun, ainsi que sur le matériel utilisé. Les manipulations réalisées m’ont permis de constater que des ajustements de protocoles sont régulièrement nécessaires, et que les résultats obtenus ne sont pas toujours ceux que l’on attend. Cela implique donc de s’adapter à chaque situation, et d’avoir un esprit critique sur la finalité de l’expérience et sur ce qu’elle nous a permis de mettre en évidence. De même, les articles et les publications scientifiques sont omniprésents et permettent aux chercheurs de s’en inspirer pour la réalisation de nouvelles manipulations ainsi que pour rédiger leurs propres publications. L’anglais est donc utilisé au quotidien lorsque l’on souhaite mettre en place de nouveaux protocoles. Je me suis rendu compte qu’être bilingue est essentiel quand on fait partie d’une équipe qui travaille en laboratoire de recherche. Cela me conforte donc dans mon choix d’effectuer mes études à l’étranger l’an prochain. Grâce à ce stage, j’ai pu voir concrètement les différentes tâches que réalise un technicien, mais aussi celles effectuées par les ingénieurs ou les chercheurs. Je pense donc continuer mes 22 études, en réalisant un master qui puisse coupler l’environnement et l’agronomie. Par ailleurs, j’ai beaucoup apprécié suivre le développement des plantes et lors d’un prochain stage, j’aimerais retrouver cette complémentarité entre le lieu d’où proviennent les échantillons et le laboratoire d’analyses, voire réaliser des analyses en plein champ. 23 Bibliographie Agrios G.N. Plant Pathology, fifth edition. Elsevier Academic Press (2005) Arnold A. E., Maynard Z. Fungal endophytes in dicotyledonous neotropical trees : patterns of abundance and diversity. Mycol Res (2001) p1504-1505 Barnes S.E. and Shaw M.W. Factors affecting symptom production by latent Botrytis cinerea in Primula x polyantha. Plant pathology (2002) p746-754 Barnes S.E. and Shaw M.W. Infection of commercial hybrid primula seed by Botrytis cinerea and latent disease spread through the plants. The American Phytopathological Society (2003) p573-578 Edwards S.G. and Seddon B. Selective media for the specific isolation and enumeration of Botrytis cinerea conidia. Letters in Applied Microbiology (2001) p63-66 Elad Y., Williamson B., Tudzynski P. et Delen N. Botrytis : biology, pathology and control. Kluwer Academic Publishers (2004) Leyronas C., Duffaud M., Parès L., Jeannequin B. and Nicot P. C. Flow of Botrytis cinerea inoculum between lettuce .Plant Pathology (2015) p704-708 Leyronas C., Nicot PC. 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Conidiophore : structure portant les conidies Endophyte : qui se trouve à l’intérieur d’une plante Epiphyte : qui se trouve sur la surface d’une plante Inoculum : désigne la partie vivante d’un champignon (ou d’un parasite) susceptible d’infecter une plante Mycélium : partie végétative du champignon. Phase de latence : phase sans évolution qui suit l’infection d’une plante par un agent pathogène. Phytopathogène : qui entraîne des maladies sur les plantes Sclérote : forme hivernale de conservation de certains champignons. Spore : structure la plus petite assurant la reproduction du champignon. Index des tableaux et figures Figure 1 : Situation géographique du domaine Saint-Maurice Figure 2 : Pourriture grise sur tomate Figure 3 : Cycle biologique de B. cinerea Figure 4 : Cycle biologique de S. sclerotiorum Figure 5 : Laitue infectée par S. sclerotiorum Figure 6 : Analyse d’endives issues de semences inoculées Figure 7 : Gloire du Dauphiné inoculées avec des conidies de B. cinerea à sec Figure 8 : Cellules de Malassez et Brenda inoculées Figure 9 : Effet des champignons sur la germination des semences Figure 10 : Présence de B. cinerea dans les laitues inoculées à sec Figure 11 : Flore épiphyte des feuilles de tomate de Gaillard contenant Penicillium spp Figure 12 : Flore épiphyte des feuilles de tomate d’Ampuis Figure 13 : Flore épiphyte des feuilles de fraise de Salaise sur Sanne Figure 14 : Flore endophyte des feuilles de tomate de Gaillard Tableau 1 : Lots de semences analysées Tableau 2 : Résultats de l’analyse de lots de semences Tableau 3 : Localisation des espèces fongiques observées Tableau 4 : Estimation du nombre de spores Tableau 5 : Analyse des laitues Gloire du Dauphiné Table des annexes Annexe 1 ...................................................................................................................................................... 1 Organigramme de l’unité de Pathologie végétale ....................................................................................1 Annexe 2 ...................................................................................................................................................... 2 Cladogramme de B. cinerea et S. sclerotiorum ........................................................................................2 Annexe 3 ...................................................................................................................................................... 3 Milieux de culture .....................................................................................................................................3 1. 2. PDA (Potato Dextrose Agar) ....................................................................................................3 PDA + Graneor ..........................................................................................................................3 Annexe 4 ...................................................................................................................................................... 4 Disposition des prélèvements de feuille dans une boite de PDA+Graneor (Ø = 9cm) ............................4 Annexe 1 Organigramme de l’unité de Pathologie végétale 1 Annexe 2 Source : BMC Evolutionary Biology Cladogramme de Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum 2 Annexe 3 Milieux de culture 1. PDA (Potato Dextrose Agar) C’est un milieu qui permet la croissance des champignons car il contient de la pomme de terre, du sucre (dextrose) et de la gélose (agar). Il s’agit donc d’un milieu très nutritif et non sélectif. Sa préparation se fait de la manière suivante : - Peser 39g de PDA en poudre - Introduire la poudre dans un flacon de 2L - Ajouter 1L d’eau permutée à l’aide d’une éprouvette - Secouer le flacon pour dissoudre la poudre - Ajouter un barreau aimanté - Autoclaver à 125°C pendant 20min - Conservé à l’étuve (55°C) jusqu’à utilisation - Sous la hotte à flux laminaire, couler le milieu dans des boites de Petri stériles de 90mm de diamètre 2. PDA + Graneor Le Graneor est un fongicide spécifique qui va ralentir la croissance de certains champignons non désirés, permettant le développement de Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum. Il est conservé au réfrigérateur avant utilisation. Sous une sorbonne, le Graneor est ajouté au PDA (1.25mL) puis le milieu est mélangé avant d’être coulé à raison de 17mL par boite. 3 Annexe 4 Source : INRA Disposition des prélèvements de feuille dans une boite de PDA+Graneor (Ø = 9cm) 4 Résumé Botrytis cinerea et Sclerotinia sclerotiorum sont deux champignons phytopathogènes engendrant des maladies (respectivement la pourriture grise et la pourriture blanche) sur une large gamme d’espèces végétales dont certaines ont un intérêt économique important (tomate, laitue, vigne…). Leur dissémination se fait par le vent et ils peuvent se maintenir dans le sol plusieurs années grâce à des formes de conservation que l’on appelle les sclérotes. De récentes études ont montré que B. cinerea peut aussi être présent dans la plante sans induire de symptôme (laitue et primevère), ce qui correspond à la phase endophyte. Au cours du stage nous avons cherché B. cinerea et S. sclerotiorum dans des plantes asymptomatiques et dans des lots de semences. Cette étude a été réalisée dans l’unité de Pathologie Végétale de l’INRA d’Avignon (84). Des analyses de lots de semences commerciales non traitées, de semences et de plantules inoculées et de plantes issues de cultures commerciales ont été réalisées. Les résultats montrent que B. cinerea peut se trouver dans la laitue et l’endive, localisé dans les racines et les feuilles de manière asymptomatique. En revanche la présence de S. sclerotiorum sous forme endophyte n’a pas été mise en évidence. Des recherches seront poursuivies pour évaluer l’importance de la phase endophyte de B. cinerea et caractériser les souches issues de plantes asymptomatiques, d’un point de vue phénotypique et génétique. Les connaissances acquises pourraient permettre d’affiner les stratégies de protection des cultures contre B. cinerea.
