UNIVERSITE PARIS-SUD ÉCOLE DOCTORALE DE CANCEROLOGIE Champs disciplinaires : Cancérologie, Immunologie, Biologie cellulaire, Biochimie tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 THÈSE DE DOCTORAT soutenue le 05/02/2013 par Clément BARJON CARACTERISATION BIOCHIMIQUE ET FONCTIONNELLE DE NOUVEAUX ANTICORPS MONOCLONAUX ANTI-GALECTINE-9 EN VUE D’APPLICATIONS DIAGNOSTIQUES ET THERAPEUTIQUES Directeur de thèse : Dr Pierre BUSSON Co-directeur de thèse : Dr Ming WEI Composition du jury : Président du jury : Pr Christian AUCLAIR Rapporteurs : Dr Frédéric DUCANCEL Dr Michel VIDAL Examinateur : Dr Stéphane DEPIL tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 REMERCIEMENTS Tout d’abord, je remercie les membres du jury qui ont accepté de donner de leur temps pour évaluer ce travail. Un grand merci au Professeur Christian Auclair, président du jury. Je remercie les Docteurs Frédéric Ducancel et Michel Vidal pour leurs rapports très complets et très intéressants. Enfin je remercie le Docteur Stéphane Depil pour sa présence en tant qu’examinateur au sein de ce jury. Un grand merci aux Docteurs Joëlle Wiels et Marc Lipinski qui m’ont accueilli au sein de l’UMR 8126. Je suis très reconnaissant pour votre regard critique et vos remarques toujours constructives au cours des séminaires d’unité qui ont beaucoup fait avancer mon travail. Je remercie tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 aussi Joëlle pour les nombreux gâteaux et autres confiseries distribuées au retour des vacances, il est vrai que nous partageons la même passion pour le chocolat ! Je remercie chaleureusement mes directeurs de thèse, les Docteurs Pierre Busson et Ming Wei. Merci Pierre pour ton immense savoir bibliographique, pour tes conseils et ton aide, et pour la grande liberté que tu m’as laissé durant ma thèse. Tu m’as laissé suivre mes intuitions, les bonnes comme (de manière extrêmement rare !) les mauvaises, et je t’en suis très reconnaissant. J’ai énormément appris. Merci Ming pour ta confiance lorsque tu m’as confié des projets de clients de Cellvax. La réalisation de ces projets m’a permis d’apprendre beaucoup sur le monde de l’entreprise. Je n’oublie pas mon premier maître de stage, le Docteur Philippe Delepelaire. A la suite d’un entretien... moyennement convaincant, vous avez accepté ma candidature et encadré mon stage en faisant preuve d’une grande patience, parfois mise à rude épreuve (bec Bunsen et bécher d’alcool ne font pas bon ménage). Vous m’avez transmis votre goût pour la recherche et je vous en remercie ! Merci à l’ensemble des collaborateurs avec qui j’ai eu l’occasion de travailler au cours de ces années. Merci donc à PX’Therapeutics et en particulier Stéphanie Blanchin pour sa disponibilité et ses conseils. Merci à Paule Opolon et Olivia Bawa pour l’immunohistologie et les commentaires toujours pertinents. Merci à Nadira Delhem, Olivier Moralès et Dhafer Mrizak pour toute l’énergie apportée sur les expériences réalisées avec nos anticorps, et pour les très intéressantes discussions scientifiques. Merci à Gérard Pierron et Sylvie Souquère pour la microscopie électronique, les interprétations et les conseils et aussi leur grande disponibilité. Merci Olivier Dellis pour les expériences sur les flux 2 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 calciques, pour sa motivation, sa disponibilité et sa bonne humeur. Enfin, un grand merci à Toshiro Niki pour tous les réactifs galectine-9, les conseils, les expériences réalisées. Et vive le Japon ! Un énorme merci à mon équipe, aux personnes toujours présentes et à ceux qui l’ont quittée pour voguer vers d’autres horizons. Merci Anne-Sophie Pailhès-Jimenez, présente depuis (presque) le début, j’ai beaucoup appris de toi et avec toi. Tu as toujours été disponible quand j’avais besoin de ton aide, et malgré nos caractères respectifs et quelques périodes un peu délicates ;), on s’entend toujours aussi bien cinq ans après ton arrivée. Probablement en partie grâce à notre passion commune pour l’humour un peu nul. Je te souhaite plein de bonnes choses mais je ne me fais pas trop de soucis pour toi. Merci à Mélanie Gressette, pleine de vie, d’humour, d’histoires à raconter, et toujours très classe ; je te souhaite également plein de bonnes choses, sans me faire trop de soucis non plus. Merci à tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Benjamin Verillaud pour ses anecdotes médicales et sa capacité poussée à rebondir sur les blagues des autres, merci à Aurore Gelin pour sa gentillesse et ses chocolats, merci à François-Régis Ferrand pour son humour déplacé mais drôle, merci à Catherine Durieu pour son aide lors de mes débuts au labo. Enfin, je souhaite bon courage et bonne chance à Claire Lhuillier pour la poursuite des recherches sur la galectine-9 ! Un second énorme merci à l’équipe de Joëlle Wiels, mes colocataires de labo et par extension, mon équipe « d’adoption ». Merci Anaïs Pujals pour ton amitié, ton soutien, ta bonne humeur, pour les pauses thé où on refait le monde. Merci pour les paris débiles qui m’ont permis de découvrir que la gym ce n’est pas trop mon truc, et Twilight non plus. Bien que tu sois plutôt nulle à la plupart des jeux vidéos, je m’incline devant ton inexplicable toute-puissance à Mario Kart. Et crois-moi, en tant que geek, ce n’est pas facile à écrire. Je remercie Aude Robert, pour les discussion autour de séries, films et autres sujets geeks, et aussi pour ses conseils sur le plan scientifique. Merci à Sonia Chelouah et à la nouvelle génération de thésardes : Loëtitia Favre, toujours de bonne humeur et agréable à vivre et Justine Debernardi, imitatrice professionnelle, presque toujours de bonne humeur et tout aussi agréable à vivre. Je vous souhaite un futur radieux dans la recherche en cancérologie. Merci à Sandy Balkaran et Thomas Désille pour les bons moments passés ensemble lors de leurs stages respectifs dans le laboratoire. Je remercie également toute l’unité UMR 8126, Chloé Robin, Alexandra Joubert, Licia Silveri, Andrei Pichugin, Charles-Henry Gattolliat, Romain Algret, Muriel Fuchs et tous les autres membres. Merci aux ex-UMR 8126 : les docteurs de la première heure Emilie Hollville, Xénia Mergui, Luc Friboulet, Jeanne Allinne, les jeunes mariés Claire Gourzones et Pietr Dimitriev, 3 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 et enfin Laëtitia Thomas pour les longues discussions ponctuées de débats très importants comme par exemple « que signifie la fin de Shutter Island ». Merci à tous mes amis du Master 2 de cancérologie et assimilés, en particulier Aurélie Dupuy, Thibault Carré et Loubna Chadli, pour les cours passés ensemble dans la bonne humeur, Saint-Malo, les Roscoffs et autres soirées. Mention spéciale à Aurélie, nous savons tous les deux que les doctorants CIFRE sont les meilleurs !! Merci à Muriel Nicoletti pour sa patience et sa gestion sans faille ! Merci à tous mes amis d’enfance, de l’IUT et de la fac, avec, par ordre d’apparition : Vincent « Laloose » Lamiraux,Anthony « BonBrad » Van Praet, Gary « TDS » Paulini, Cédric « Drixé » Venegas, Anne Dietlin, Cyril « Frodon » Chambellan, Céline « Chun-li » Trang, Pascal Lagès, Ghislain Accault, Romain « Roro » Ducroiset, Mattéo Gagliardi, Hugues « Guehu » Remond, Lieng « Laurent » Taing, tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Romain « surnom politiquement incorrect » Chenu, Thomas « surnom politiquement incorrect #2» Burguière, Soun Banh, Guillaume Arras, Elodie Marquand, Pierre-Arnaud « PA » Comte, Anaïs «Jsuis troooooooooooop conteeennnnte !!!!!! » Bardet, Nadjia Drici et Sarah Bonnin, la globe-trotteuse. La vie sans vous, ça serait nul. C’est dit ! Pour terminer, je remercie toute ma famille, cousins, cousines, oncles, tantes, grands-parents, mon parrain et ma marraine. Dédicasse à Etienne, peut-être futur chercheur ! Merci à mes parents, soutiens sans faille depuis toujours, quoi que je dise, quoi que je fasse, dans les moments agréables et ceux plus difficiles. Merci à mon cousin/filleul et quasi-petit frère Antonin, à Philippe son père, et à Nathalie qui nous manque beaucoup. Et bien sur, merci infiniment, pour tout, à ma sœur Anne-Sophie, Karine ma belle-sœur et Clovis, votre petit bébé qui est également mon filleul et qui apporte beaucoup, beaucoup de joie à notre famille. 4 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 SOMMAIRE REMERCIEMENTS.................................................................................................................. 2 SOMMAIRE.............................................................................................................................. 5 LISTE DES FIGURES ET TABLES........................................................................................... 8 LISTE DES ABREVIATIONS.................................................................................................. 9 RESUME.................................................................................................................................. 11 INTRODUCTION................................................................................................................... 12 I.Cancer et échappement immunitaire....................................................................... 13 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 1) Cancer et réponse immunitaire anti-tumorale........................................... 13 a) Immunosurveillance........................................................................ 13 b) Immunoédition des cancers............................................................ 15 2) Echappement immunitaire.......................................................................... 16 a) Altération de la machinerie de présentation des antigènes........... 16 b) Résistance à la cytotoxicité.............................................................. 17 c) Induction de l’état d’épuisement des lymphocytes T.................... 18 d) Immunosuppression médiée par les lymphocytes T régulateurs 18 e) Immunosuppression médiée par les cellules myéloïdes suppressives......................................................................................... 19 f) Facteurs immunosuppressifs produits par les cellules tumorales 20 3) Exosomes tumoraux immunosuppresseurs................................................ 20 a) Structure et composition des exosomes.......................................... 20 b) Aperçu des fonctions biologiques des exosomes.......................... 21 c) Exosomes tumoraux et immunosuppression.................................. 23 II. La galectine-9, protéine immunomodulatrice....................................................... 24 1) Famille des galectines.................................................................................. 24 a) Structure et propriétés générales des galectines............................ 24 b) Distribution tissulaire et localisation sub-cellulaire des galectines.............................................................................................. 26 5 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 c) Galectines, système immunitaire et cancer.................................... 27 2) Découverte, structure et distribution de la galectine-9.............................. 29 a) Découverte de la galectine-9........................................................... 29 b) Structure du gène LGALS9 et de la protéine galectine-9.............. 29 c) Distribution tissulaire et subcellulaire de la galectine-9............... 31 d) Exosomes et galectine-9................................................................... 32 3) Récepteurs de la galectine-9 et signalisation............................................. 32 a) Récepteur TIM-3.............................................................................. 32 b) Récepteurs alternatifs de la galectine-9.......................................... 34 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 c) Voies de signalisation induites par la galectine-9.......................... 34 4) Galectine-9 et système immunitaire........................................................... 36 a) Galectine-9 et immunosuppression................................................ 36 b) Galectine-9 et inflammation........................................................... 36 c) Galectine-9 et auto-immunité.......................................................... 37 5). Rôle de la galectine-9 dans les infections virales et les cancers associés aux virus........................................................................................................... 38 a) Virus de l’immunodéficience humaine.......................................... 38 b) Virus Herpès Simplex de type 1..................................................... 39 c) Hepatites virales et hépatocarcinomes............................................ 40 d) Virus d’Epstein-Barr et carcinome nasopharyngé......................... 41 III. Anticorps monoclonaux immunomodulateurs.................................................... 42 1) Historique.................................................................................................... 42 2) Aspects techniques de la production d’hybridome................................... 43 3) Structure et ingénierie des anticorps.......................................................... 43 4) Anticorps monoclonaux et cancer............................................................... 45 5) Anticorps monoclonaux immunomodulateurs.......................................... 47 6 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 OBJECTIFS DE LA THESE..................................................................................................... 48 ARTICLE I (BMC Infectious Agents and Cancer) « A novel monoclonal antibody for detection of galectin-9 in tissue sections : application to human tissues infected by oncogenic viruses »............................................ 49 Résumé......................................................................................................................... 50 Article........................................................................................................................... 51 ARTICLE II (En préparation) « Monoclonal antibodies neutralizing human galectin-9 : comparative assessment using various biological assays ».................................................. 62 Résumé......................................................................................................................... 63 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Article........................................................................................................................... 64 DISCUSSION.......................................................................................................................... 87 1) Production et caractérisation des anticorps 1G3 et 2E12....................................... 87 2) Expression de la galectine-9 dans les tissus humains infectés par des virus oncogènes..................................................................................................................... 88 3) Neutralisation de l’apoptose induite par la galectine-9 sur lignées T humaines 90 4) Effets des exosomes porteurs de galectine-9.......................................................... 92 5) Nouveaux tests in vitro de neutralisation des effets de la galectine-9................. 94 6) Modèles in vivo de neutralisation des effets de la galectine-9............................. 95 BIBLIOGRAPHIE.................................................................................................................... 97 7 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 LISTE DES FIGURES Figure 1 : « Hallmarks of cancer » Figure 2 : Immunoédition Figure 3 : Biogenèse des exosomes Figure 4 : Composition chimique des exosomes Figure 5 : Famille des galectines Figure 6 : Structure tridimensionnelle de la galectine-1 Figure 7 : Alignement structurel des galectines Figure 8 : Spécificités de ligation de la galectine-9 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 9 : Structures tridimensionnelles des domaines CRD de la galectine-9 Figure 10 : Famille des protéines TIM Figure 11 : Structure tridimensionnelle du domaine IgV de la protéine TIM-3 murine Figure 12 : Modèles d’interaction entre TIM-3 et la galectine-9 Figure 13 : Principe de production des hybridomes Figure 14 : Structure des anticorps Figure 15 : Amélioration de l’efficacité des anticorps par ingénierie Table 1 : Spécificités de ligation des galectines Table 2 : Nomenclature des anticorps monoclonaux Table 3 : Anticorps monoclonaux actuellement approuvés en oncologie 8 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 LISTE DES ABREVIATIONS 2-APB : 2-Aminoethoxydiphenyl borate ADCC : Antibody-dependant cell-mediated cytotoxicity ADN : Acide désoxyribonucléique AMP : Adénoside monophosphate ARN : Acide ribonucléique ATP : Adénoside triphosphate BCR-ABL : Breakpoint cluster region-Abelson CDC : Complement-dependent cytotoxicity tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 CTL : Cytotoxic T lymphocyte CMH : Complexe majeur d’histocompatibilité CDR : Complementary determining regions CRD : Carbohydrates recognition domain DAMP : Danger-associated molecular pattern EBV : Epstein-Barr Virus EGFR : Epidermal growth factor receptor EpCam : Epithelial cell adhesion molecule ERK : Extracellular signal-regulated kinase FDA : Food and drug administration FoxP3 : Forkhead box P3 GM-CSF : Granulocyte macrophage colony stimulating factor HAT : Hypoxanthine aminopterine thymidine HDAC3 : Histone déacétylase 3 HER : Human epidermal growth factor receptor HGPRT : Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransférase HMGB1 : High mobility group box 1 HSP : Heat shock protein HSV-1 : Herpes simplex virus de type 1 IDO : Indoleamine-pyrrole 2,3 dioxygénase IFN-γ : Interféron-γ 9 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 IL-10 : Interleukine-10 INOS : Inducible nitric oxyde synthase IP3 : Inositol triphosphate NPC : Nasopharyngeal carcinoma MCA : Méthylcholanthrène MDSC : Myeloid-derived suppressor cell MIC : Human MHC class I chain related NK : Natural killer NKG2D : Natural killer group 2, member D PDI : Protein disulfide-isomerase tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 RAG-2 : Recombination activating gene-2 ScFv : Single chain fragment variable SCID : Severe combined immunodeficiency SH2 : Src homology 2 TAA : Tumor-associated antigen TGF-β : Transforming growth factor-β TIM-3 : T cell immunoglobulin mucin-3 TRAIL : TNF-related apoptosis-inducing ligand Treg : Lymphocyte T régulateur TSG-101 : Tumor susceptibility gene 101 ULBP : UL-16 binding protein VEGF : Vascular endothelial growth factor VHB : Virus de l’hépatite B VHC : Virus de l’hépatite C VIH : Virus de l’immunodéficience humaine 10 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 RESUME La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte inflammatoire et possèdant des propriétés à la fois inflammatoires et immunosuppressives. Elle induit la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système immunitaire inné tandis qu’elle induit l’apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise l’expansion des lymphocytes Treg. Les propriétés immunomodulatrices de la galectine-9 dépendent en grande partie de son interaction avec le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux molécules interagissent chacune avec d’autres protéines et dans plusieurs contextes la responsabilité de l’interaction galectine-9/TIM-3 n’a pas été formellement démontrée. Le développement d’un anticorps neutralisant les effets de la galectine-9 permettrait de préciser son rôle exact dans ces contextes. Par ailleurs, le blocage des voies de signalisations tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 inhibitrices du système immunitaire est aujourd’hui un enjeu majeur en oncologie, comme le démontre le succès récent de la neutralisation du récepteur inhibiteur CTLA-4 pour le traitement des mélanomes. Nous avons produits de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine-9 par immunisation de souris avec la partie C-terminale de la protéine. Parmi ces anticorps, 1G3 permet la détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d’une manière très sensible et spécifique en immunohistochimie. Son utilisation nous a permis de confirmer l’expression constante et intense de la galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé et la forte expression de la galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite C. Pour la première fois, nous avons mis en évidence une expression de la galectine-9 dans les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite B. De plus, nous observons une expression de la galectine-9 dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui n’avait pas été démontré jusqu’à présent. Nous avons également caractérisé les capacités fonctionelles de nos anticorps lors de tests in vitro. L’anticorps 2E12 bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire, neutralise l’apoptose induite par la galectine-9 sur cellules de lymphomes T humaines et réduit considérablement l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat. Ces effets de la galectine-9 sont indépendants de TIM-3 dans ce modèle cellulaire. L’anticorps 2E12 constitue un outil puissant pour étudier les fonctions de la galectine-9 à la fois dépendantes et indépendantes de TIM-3. 11 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 INTRODUCTION 12 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 A B Figure 1 : « Hallmarks of cancer ». (Adapté de Hanahan et al, 2000 ; Hanahan et al, 2011). (A) En 2000, Douglas Hanahan et Robert Weinberg présentaient six caractéristiques fondamentales communes à tous les cancers. (B) En 2011, les deux auteurs publient une mise à jour de leur article synthétique en prenant en compte les dix années de recherches écoulées. Dans cette publication, l’échappement immunitaire est considéré comme l’un des « hallmarks » émergents. INTRODUCTION I. Cancer et échappement immunitaire 1) Cancer et réponse immunitaire anti-tumorale a) Immunosurveillance Il est généralement admis que plusieurs propriétés cellulaires intrinsèques caractérisent l’oncogénèse. Ces phénomènes, ou « hallmarks of cancer », furent décrits au tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 nombre de six par Douglas Hanahan et Robert A. Weinberg au début du siècle, dans un essai de synthèse de l’immense quantité de données générées par la recherche sur le cancer durant les trois décennies précédentes [1]. Les six phénomènes caractérisant la cellule cancéreuse décrits dans cette publication sont l’autosuffisance en facteurs de croissance, l’insensibilité aux facteurs inhibiteurs de croissance, la résistance aux mécanismes d’apoptose, une capacité réplicative illimitée, une faculté à favoriser l’angiogénèse et enfin la capacité à envahir les tissus et à générer des métastases (Figure 1). Les auteurs soulignaient également l’importance d’étudier le cancer comme une maladie systèmique et non uniquement du point de vue de la cellule cancéreuse. Les progrès considérables réalisés ces dernières années en oncologie cellulaire et moléculaire ont effectivement démontré l’importance de ne plus considérer la cellule cancéreuse comme une entité unique, mais comme faisant partie d’un tissu complexe composé de cellules tumorales et de cellules de l’hôte telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules du système immunitaire [2]. Parmi les différents aspects des relations entre l’hôte et la tumeur, le rôle du système immunitaire dans l’élimination des cellules tumorales fut longtemps controversé. En 1909, Paul Ehrlich émit l’hypothèse que le système immunitaire devait être capable de reconnaître les tumeurs et de les détruire, car dans le cas contraire les êtres vivants ayant une longue durée de vie seraient atteints plus fréquemment par le cancer. A l’époque, Ehrlich de disposait pas des moyens nécessaires pour prouver son hypothèse. Celle-ci fut reprise un demi-siècle plus tard par Burnet et Thomas, qui posèrent les bases de la « théorie de 13 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 l’immunosurveillance » [3]. En considérant les connaissances récemment acquises en transplantation et en immunité tumorale, ils proposèrent que les lymphocytes devaient éliminer continuellement les cellules normales nouvellement transformées. Cette hypothèse fut mise à mal par les travaux d’Osias Stutman en 1974. Celui-ci montra que le développement tumoral de sarcomes induit par le méthylcholanthrène (MCA) chez la souris n’était pas différent chez les souris athymiques CBA/H par rapport aux souris sauvages [4]. A la publication de ces résultats, l’enthousiasme autour de la théorie de l’immunosurveillance se dissipa et la plupart des recherches dans ce domaine furent abandonnées. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Des années plus tard, l’intérêt pour la théorie de l’immunosurveillance fut ravivé lorsqu’une étude démontra le rôle crucial de l’Interféron-γ (IFN-γ) endogène dans la réponse immunitaire anti-tumorale. Les auteurs de cette étude mirent en évidence une tumorigénécité accrue de cellules tumorales rendues insensibles à l’IFN-γ dans des souris BALB/c immunocompétentes [5]. Par la suite, il fut montré que des souris invalidées pour l’IFN-γ ou pour l’ensemble des membres de la famille Interféron développaient des tumeurs plus rapidement et plus fréquemment lorsqu’elles étaient exposées au MCA [6]. Des résultats similaires furent obtenus avec des souris invalidées pour la perforine, protéine clé de la cytotoxicité médiée par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules Natural Killer (NK) [7]. Quelques année plus tard, il fut démontré que souris invalidées pour le gène Recombination Activating Gene-2 (RAG-2) et ainsi atteintes d’immunodéficience combinée sévère (SCID) (ne produisant pas de lymphocytes B, T et NKT) développaient plus de tumeurs spontanées et plus de sarcomes induits par le MCA [8]. A la lumière de ces résultats, l’existence d’une réponse immune anti-tumorale fut largement acceptée par la communauté scientifique. Les antigènes tumoraux (Tumor-Associated Antigens ou TAA) exprimés par les tumeurs et reconnus par le système immunitaire peuvent être classés en trois catégories : les antigènes du soi, les antigènes du soi modifié et les néo-antigènes. Les antigènes du soi sont des antigènes normaux surexprimés (exemple : HER-2 [9]) ou des antigènes non exprimés par le tissu d’origine de la tumeur (exemple : NY-ESO-1 [10]). Les antigènes du soi 14 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 2 : Immunoédition. (Adapté de Schreiber et al, 2012). L’immunoédition des cancers comporte trois phases séquentielles : élimination, équilibre, échappement. Dans la phase d’élimination, l’immunité innée et l’immunité adaptative coopère pour détruire les tumeurs en développement. Les cellules tumorales non éliminées durant cette étape peuvent entrer en phase d’équilibre. Lors de cette phase, le développement tumoral est limité par la réponse immune. La pression exercée par le système immunitaire favorise la sélection de cellules tumorales peu immunogènes et immunoévasives : c’est la phase d’échappement. Les cellules tumorales échappant au système immunitaire vont se développer de manière incontrôlée et former une tumeur visible. modifié sont les protéines du soi mutées et dont la fonction est altérée (exemple : RAS [11]). Les néo-antigènes sont les protéines de fusions issues de mutations ou de réarrangements chromosomiques aberrants (exemple : BCR-ABL [12]) et les antigènes provenant de virus oncogéniques (exemple : LMP1, LMP2, EBNA1 et BARF1 dans le carcinome nasopharyngé (NPC) associé à l’EBV [13]). b) Immunoédition des cancers En dépit des preuves démontrant l’existence de l’immunosurveillance, il est impossible d’ignorer le fait que des cancers se développent fréquemment chez des individus tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 immunocompétents. Robert D. Schreiber et ses collaborateurs proposent que le système immunitaire de l’hôte « sculpte » la tumeur en éliminant les cellules malignes hautement immunogènes et en favorisant de ce fait le développement de tumeurs peu immunogènes et/ou ayant acquis des propriétés lui permettant d’échapper à la réponse immune [14, 15]. Cette « immunoédition » des cancers se déroulerait en trois phases séquentielles : élimination, équilibre et échappement (Figure 2). La phase d’élimination est une réactualisation de la théorie de l’immunosurveillance. Durant cette phase, le système immunitaire détecte la tumeur en développement grâce à la présence de signaux de « dangers » (Danger-Associated Molecular Pattern, DAMP) tels que les familles de protéines de stress cellulaire MIC et ULBP ou la protéine HMGB1 associée à l’ADN et relarguée par les cellules tumorales nécrotiques. Ces ligands activent les récepteurs des cellules de l’immunité innée qui vont alors produire des cytokines inflammatoires, facilitant le recrutement des cellules de l’immunité adaptative [16-18]. Les antigènes tumoraux exprimés par la cellule permettent la mise en place d’une réponse spécifique des cellules T CD4+ et CD8+ [19, 20]. Les cellules tumorales ayant survécu à la phase d’élimination entrerait alors dans un état d’équilibre avec le système immunitaire. Lors de cette phase, l’immunité adaptative limiterait la croissance tumorale et exercerait une pression de sélection favorisant les cellules les moins immunogènes. Il est possible que cette phase de latence tumorale se déroule sur de 15 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 nombreuses années, voire durant toute la vie de l’hôte. L’existence de cette phase est difficile à prouver chez l’homme. Toutefois, chez des souris traitées par de faibles doses de MCA, il est possible de détecter des cellules malignes sans observer le développement de tumeurs apparentes sur une longue période [21]. De plus, l’élimination des cellules T et de l’IFN-γ chez ces souris provoquent l’apparition de tumeurs au point d’injection du MCA chez la moitié d’entre elles, ce qui tend à prouver l’existence d’un équilibre entre l’immunité adaptative et la tumeur. Les cellules tumorales peuvent parvenir à briser cet équilibre en échappant au système immunitaire de l’hôte, ce qui ce traduit par l’apparition d’une tumeur visible. Cette tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 faculté d’échappement est devenu officiellement l’un des « hallmarks » du cancer dans la liste de Douglas Hanahan et Robert A. Weinberg mise à jour en 2011 (Figure 1) [22]. Comme nous allons le voir maintenant, les moyens mis en œuvre par les tumeurs pour se soustraire au système immunitaire sont nombreux : perte d’expression des antigènes tumoraux, résistance à la cytotoxicité, diffusion de molécules immunosuppressives ou encore le recrutement de cellules immunosuppressives. 2) Echappement immunitaire a) Altération de la machinerie de présentation des antigènes Selon la théorie de l’immunoédition, le système immunitaire exerce une pression de sélection sur les cellules tumorales et favorise le développement de cellules malignes peu immunogènes. Les cellules sélectionnées peuvent devenir « invisibles » pour le système immunitaire et lui échapper de cette manière. La perte d’immunogénicité peut s’opérer par au moins trois mécanismes : l’émergence de cellules tumorales n’exprimant pas d’antigènes fortement immunogènes, la perte d’expression du complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I) et l’altération des mécanismes d’apprêtement des antigènes. La sous-expression ou la perte complète de l’expression du CMH I a été mise en évidence dans plusieurs cancers, tels que les cancers de la prostate, les cancers du poumon, 16 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 ou les cancers issus de l’épithélium malpighien de la tête et du coup [23-25]. Ce défaut d’expression peut être dû à des mutations ponctuelles du gène du CMH I, à une régulation négative de son expression ou bien à des pertes d’hétérozygotie ayant pour conséquence la délétion de larges portions du gène [26-28]. La perte de réactivité à l’IFN-γ, régulateur majeur de la machinerie de présentation des antigènes, peut également conduire à une réduction drastique de l’expression du CMH I [29]. Enfin, les mécanismes d’apprêtement des antigènes peuvent être altérés. L’expression des protéines TAP1 et TAP2, requises pour le transport des antigènes, peut être inhibée [30]. Un autre exemple est la mutation de la microglobuline β2, qui a pour conséquence un défaut tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de transport de la molécule CMH I à la surface des cellules tumorales [31]. b) Résistance à la cytotoxicité Les cellules du système immunitaire, telles que les lymphocytes T cytotoxiques et les NK, peuvent éliminer directement les cellules tumorales induire l’apoptose par la voie des perforines/granzymes et par la voie des récepteurs à domaine de mort (Fas, DR4 et DR5 récepteurs de TRAIL). Perforines et granzymes sont présentes dans les granules libérées par les CTL et les NK. Après la dégranulation, ces molécules pénètrent dans la cellule et induise l’apoptose par voie caspase-dépendante et/ou caspase-indépendante. Les cellules malignes de mélanome, de cancer utérin ou de cancer du sein résistent à ce mode d’action en exprimant la protéine PI-9/SPI-6, inhibitrice de granzyme B [32]. La liaison des récepteurs à domaine de mort avec leur ligand induit la formation du complexe DISC. La formation de ce complexe permet le recrutement de la pro-caspase 8. La cascade d’évènement ainsi déclenchée aboutit à la libération du cytochrome C par les mitochondries et à l’activation des caspases effectrices. Les cellules tumorales peuvent résister à ce mode d’action en surexprimant la protéine anti-apoptotique C-FLIP. Celle-ci se fixe sur le complexe DISC et empêche le clivage de la pro-caspase 8 [33]. Un second mécanisme de résistance est la régulation négative par les cellules tumorales des récepteurs de mort Fas et DR4/5 ou l’acquisition de mutations délétères les rendant ceux-ci non- 17 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 fonctionnels [34, 35]. Enfin, les cellules tumorales peuvent exprimer de « faux » récepteurs non fonctionnels, transmembranaires ou solubles, qui vont servir de « leurre » [36, 37]. c) Induction de l’état d’épuisement des lymphocytes T Les lymphocytes T activés expriment les co-récepteurs inhibiteurs CTLA-4 et PD-1 qui interagissent avec les membres de la famille B7, respectivement B7.1 et B7.2 et B7-H1 (PD-L1), exprimés par les cellules présentatrices d’antigènes. L’engagement de ces récepteurs fait basculer les lymphocytes T activés dans un état d’épuisement, ou « exhaustion », qui se caractérise par une production réduite d’IL-2, un défaut de signalisation du TCR et un arrêt tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 du cycle cellulaire [38]. L’expression de B7-H1 a été mise en évidence dans plusieurs cancers, ce qui laisse à penser que les cellules tumorales participeraient directement à l’induction de cet état d’épuisement chez les lymphocytes T infiltrant la tumeur [39]. Le blocage des voies CTLA-4 et PD-1 permet la réactivation de la réponse immunitaire anti-tumorale et constitue une approche thérapeutique très prometteuse [40]. d) Immunosuppression médiée par les lymphocytes T régulateurs Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont généralement caractérisés par l’expression des marqueurs CD4, CD25 et FoxP3 [41]. Les Treg peuvent être issus de lymphocytes T FoxP3+ originaire du thymus, ou bien dériver de précurseurs T CD4+ naïfs circulants [42]. L’enrichissement en lymphocytes Treg dans le microenvironnement tumoral fut démontré pour la première fois dans les cancers du poumon et les cancers ovariens, il y a maintenant plus de dix ans [43]. Aujourd’hui, nous savons qu’ils infiltrent la plupart des tumeurs solides et qu’il protègent les cellules tumorales contre le système immunitaire [44-46]. Leur accumulation dans le microenvironnement tumoral peut être liée à un pronostic vital sombre, par exemple chez les patients atteints de cancer du sein, des ovaires ou gastriques. Paradoxalement, il existe des cas où la présence de Treg est synonyme de bon pronostic [49]. Les Treg sont activement recrutés par les cellules du microenvironnement tumoral grâce à plusieurs chimiokines, comme le CCL22 dans le carcinome ovarien [47]. Les fortes concentrations intratumorales de TGF-β favorisent la conversion des lymphocytes CD4+ [50]. 18 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Les Treg exercent leur activité suppressive par de nombreux moyens. Ils sécrètent des molécules immunosuppressives telles que l’IL-10 ou le TGF-β et limitent de cette manière les réponses anti-tumorales des cellules CD4+, CD8+ et NK. En outre, ils exercent une activité cytolytique directe sur les cellules T effectrices et les cellules dendritiques par l’intermédiaire des granzymes, de TRAIL et de la galectine-1 [51-54]. Ils expriment la molécule CTLA-4 et son invalidation réduit considérablement leur activité suppressive [55]. Enfin, ils appauvrissent le microenvironnement tumoral en IL-2 et catalysent la transformation de l’ATP en adénosine, inhibiteur des fonctions anti-tumorales des cellules T effectrices [56, 57]. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 e) Immunosupression médiée par les cellules myéloides suppressives Les cellules myéloïdes suppressives (MDSC) constituent une population hétérogène de cellules myéloïdes capable d’exercer une activité immunosuppressive. Ces cellules sont caractérisées chez la souris par l’expression de CD11b et de Gr1 [58]. L’absence d’homologue humain de Gr1 rend difficile la définition de cette population chez l’homme, néanmoins certains auteurs supposent qu’elle peut être composée de cellules LIN- HLA-DR- CD33+ ou CD11B+ CD14- CD33+ [59]. Le GM-CSF produit par les cellules tumorales est un facteur de croissance important pour l’expansion de cette population [60]. Comme les lymphocytes Treg, les MDSC exercent leur activité immunosuppresive par de multiples mécanismes. Elles produisent notamment de grandes quantités d’oxyde nitrique synthase induite (iNOS) et d’arginase [59]. L’oxyde nitrique exerce un rôle proapoptotique direct sur les cellules T tandis que la déplétion de L-arginine engendrée par l’activité de l’arginase réduit leur capacité proliférative [61]. D’autres mécanismes d’immunosuppression incluent la production de l’IL-10 et de dérivés réactifs de l’oxygène [62, 63]. Enfin, les MDSC pourraient favoriser la différenciation de cellules T CD4+ en lymphocytes T régulateurs [64]. 19 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 f) Facteurs immunosuppressifs produits par les cellules tumorales Les cellules malignes participent également à la mise en place d’un microenvironnement tumoral immunosuppressif, en sécrétant divers facteurs tels que le TGF-β, le vascular endothelial growth factor (VEGF), le GM-CSF, la protéine Indoleaminepyrrole 2,3 dioxygénase (IDO) ou encore les ligands des récepteurs à domaine de mort FasL et TRAIL [65-68]. Ces molécules peuvent inhiber la réponse immune anti-tumorale par de nombreux mécanismes, tels que la régulation négative directe des cellules effectrices ou le recrutement de cellules suppressives comme les Treg ou les MSDC. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Ainsi, le TGF-β induit l’épuisement des cellules T et l’expansion des Treg, le GM-CSF favorise le recrutement des MSDC, la protéine IDO provoque l’arrêt du cycle cellulaire des cellules T en réduisant leur accès au tryptophane et FasL ainsi que TRAIL déclenchent l’apoptose des cellules T effectrices [50, 68-72]. Il est intéressant de noter que de nombreuses tumeurs sont insensibles au effets de ces molécules, par exemple aux effets du TGF-β, de FasL et de TRAIL [68, 72, 73]. Les cellules tumorales sécrètent également une grande quantité de vésicules biologiquement actives, dont des nanovésicules appelées exosomes. Les exosomes sont des acteurs clés de la communication intercellulaire et leurs propriétés immunosuppressives exercent souvent un effet délètere sur le système immunitaire au sein du microenvironnement tumoral. 3) Exosomes tumoraux immunosupresseurs a) Structure et composition des exosomes Les exosomes sont des nanovésicules extracellulaires entourées d'une bicouche lipidique analogue à celle des membranes cellulaires. Le nom « exosome » est apparu pour la première fois en 1981, qualifiant des vésicules issues de différentes lignées cellulaires tumorales ou non et possédant une activité enzymatique [74]. Les exosomes se distinguent 20 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 3 : Biogenèse des exosomes. (Adapté de Ge et al, 2012). Les exosomes apparaissent sous forme de vésicules intraluminales (ILV) bourgeonnantes à l’intérieur des corps multivésiculaires (MVB). Lors de la fusion des MVB avec la membrane plasmique, les ILV sont libérées dans le milieu extracellulaire et sont alors appelées exosomes. Figure 4 : Composition biochimique des exosomes. (Adapté de Taylor et al, 2011). des autres microvésicules par leur petite taille (de 30 à 100 nm de diamètre) et par leur origine endosomale [75]. Ils apparaissent sous forme de vésicules bourgeonnantes à l’intérieur de corps multivésiculaire dérivés du compartiment endosomal profond. A ce stade, on les appelle ILV pour « Intra-Luminal Vesicles » [76]. Lors de la fusion des corps multivésiculaires avec la membrane plasmique, les ILV sont libérées dans le milieu extracellulaire et sont alors appelés exosomes (Figure 3). La plupart des cellules eucaryotes sécrètent des exosomes. Ils peuvent être mis en évidence dans de nombreux liquides biologiques incluant le sang, la salive, l’urine et le lait maternel. Les exosomes contiennent des lipides, des protéines et des acides nucléiques tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 (Figure 4) [77]. Leur composition protéique varie grandement en fonction du type cellulaire et de l’état physiologique des cellules productrices [78, 79]. Cependant, tous les exosomes contiennent des protéines de fusion et de transport membranaire (GTPases, Annexines), des tétraspannines (dont CD63, fréquemment utilisé comme marqueur des exosomes), des protéines de choc thermique (Hsp70, Hsp90) et des protéines impliquées dans la biogenèse des corps multivésiculaires (Alix, TSG101) [80]. Les exosomes sont également enrichis en lipides associés aux radeaux membranaires et en acides nucléiques, incluant des micros ARN et autres ARN non codants, des ARN messagers et probablement de l’ADN génomique dans le cas des exosomes tumoraux [81, 82]. b) Aperçu des fonctions biologiques des exosomes A l’origine décrits comme des « vésicules déchets » contenant des molécules indésirables dont la cellule se serait débarrassée, les exosomes sont maintenant considérés comme des médiateurs de la communication intercellulaire. Ignorés par les macrophages car reconnus comme composants du soi, et leur contenu protégé des protéases et nucléases, ils sont capable de délivrer un « message » en provenance de leur cellule d’origine à destination de cellules voisines et de cellules anatomiquement éloignées par l’intermédiaire des liquides biologiques [80, 83]. 21 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Le rôle des exosomes a été particulièrement étudié dans le système immunitaire, notamment dans la présentation des antigènes comme l’a montrée une étude tout à fait décisive de G. Raposo et al. publiée en 1996 [84]. Dans cette étude, les auteurs montrent que les exosomes produits par les lymphocytes B humains et murins peuvent présenter à un clone de lymphocyte T CD4+ des peptides antigéniques restreints dans le système HLA de classe II. Ainsi, les exosomes peuvent transporter des antigènes tumoraux et peuvent induire une réponse T spécifique en présence de cellules dendritiques n’ayant pas été en contact avec ces antigènes au préalable [85]. Ils peuvent également transporter des antigènes viraux et bactériens et favoriser l’inflammation [86-88]. D’autres fonctions ont été attribuées aux exosomes dans la mort programmée, l’angiogénèse, l’inflammation et la coagulation [80]. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Chez la drosophile, il existe des arguments expérimentaux suggérant une fonction de vésicules très semblables aux exosomes, les argosomes, dans l’établissement des gradients morphogénétiques [89]. Dans les contextes pathologiques, les fonctions de communication intercellulaire des exosomes peuvent être détournées. Ils jouent un rôle dans la dissémination de virus ou de composants viraux d’une cellule à une autre [90, 91]. Notre équipe a été l’une des premières à mettre en évidence la présence de microARN du virus Epstein-Barr dans les exosomes [92]. D’autres équipes ont mis en évidence le transfert de ces microARN viraux dans des cellules non-infectées in vitro avec des indices suggérant que des transferts semblables peuvent se produire in vivo chez l’homme [93]. Les exosomes sont impliqués dans le développement des cancers à de multiples niveaux. Ils véhiculent des oncogènes tels que HER2 ou la protéine LMP1 d’EBV [85, 94]. Leurs interactions avec les cellules du stroma permettent la mise en place d’un microenvironnement propice au développement tumoral, par exemple en reprogrammant les cellules endothéliales avoisinantes pour qu’elles sécrètent le VEGF qui les stimule d’une manière autocrine [95]. Les exosomes peuvent également permettre aux cellules tumorales d’échapper aux traitements notamment en « leurrant » les thérapies ciblées ou en favorisant l’élimination des agents de chimiothérapie. Ainsi, les exosomes transportant HER2 22 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 détournent l’anticorps monoclonal trastuzumab des cellules tumorales et les cellules de cancer du sein relarguent des exosomes riches en doxorubicin [96, 97]. Si les exosomes participent directement à la mise en place d’un microenvironnement procipe au développement tumoral, de plus en plus de preuves tendent à montrer qu’ils protégeraient activement la tumeur contre l’élimination par le système immunitaire grâce à une large panoplie de capacités immunosuppressives [98]. Nous allons maintenant nous intéresser en détail à ces propriétés. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 c) Exosomes tumoraux et immunosuppression Les exosomes tumoraux exercent une activité suppressive directe sur les cellules T effectrices en véhiculant FasL et TRAIL, ligands des récepteurs de mort exprimés à la surface des lymphocytes T activés [99, 100]. Le FasL exosomal est également responsable d’un défaut de signalisation du TCR chez les patientes atteintes de carcinome ovarien [101]. Les exosomes tumoraux transportent fréquemment les molécules CD39 et CD73, qui sont des enzymes catalysant la transformation de l’ATP en AMP (CD39) et de l’AMP en adénoside (CD73). Ces enzymes sont actives à la surface des exosomes [102]. L’adénosine extracellulaire exerce un rôle de régulateur négatif de la réponse immunitaire. Les exosomes tumoraux véhiculant les ligands du récepteur NKG2D interagissent avec les cellules NK, ce qui réduit l’expression de ce récepteur et limite ainsi les fonctions effectrices de ces cellules [103]. L’activité immunosuppressive des exosomes est également liée à leur capacité de régulation positive des Treg et des MDSC. Les exosomes issus d’ascites et de sang de patients atteints de cancer favorisent la conversion et l’expansion de cellules T CD4+ CD25en Treg CD4+ CD25+ FoxP3+ et accroissent leurs capacités fonctionnelles [104, 105]. Ces propriétés seraient dépendantes du transport du TGF-β par les exosomes [105, 106]. Chez la souris, les exosomes issus de lignées cellulaires tumorales favorisent la différenciation des cellules myéloïdes en MDSC CD11b+ Gr1+ [107]. 23 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 5 : Famille des galectines. (Adapté de Liu et al, 2005). (A) Les galectines constituent une famille de lectines caractériser par des domaines de reconnaissance des carbohydrates (CRD) conservés d’environ 130 acides aminés. A ce jour, 15 galectines ont été identifiées, dont 10 chez l’homme. Elles peuvent être classées en 3 groupes : prototype (un seul CRD : galectines-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14 et -15) tandem (deux CRD non homologues reliés par un peptide « linker » : galectines-4, -6, -8, -9, -12) et chimère (un CRD relié à un peptide : galectine-3). (B) Les galectines peuvent interagir avec les glycoconjugués présents à la surface des cellules et former des « lattices »à partir desquelles peuvent se déclencher des cascades de signalisation. Elles peuvent également médiées des interactions intercellulaires et cellules/matrice extracellulaire. Mon équipe d’accueil a mis en évidence l’activité immunosuppressive directe des exosomes de carcinome nasopharyngé (NPC) sur les lymphocytes Th1 [108]. Cette activité immunosuppressive est médiée par la galectine-9, fortement exprimée par les cellules de NPC et retrouvée en grande quantité dans les exosomes issus de ces cellules. II. La galectine-9, protéine immunomodulatrice 1) Famille des galectines tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 a) Structure et propriétés générales des galectines Les galectines, ou lectines de type S, constituent une famille composée de quinze membres chez les vertébrés, dont dix chez l’homme. Elles se distinguent par leur capacité à se lier spécifiquement aux groupements glucidiques de type β-galactosides grâce à leur domaine de reconnaissance des carbohydrates ou CRD (« Carbohydrates Recognition Domain »). Les galectines se différencient essentiellement par leur spécificité de liaison aux résidus glucidiques ainsi que par leur structure primaire (Figure 5) [109]. Il est possible de les classer en trois groupes selon celle-ci : - les galectines prototypes (« proto-type galectins »), constituées d’un seul domaine CRD capable de se dimériser (galectine-1, -2, -5, -7, -10, -11, -13, -14, -15). - les galectines avec répétitions en tandem (« tandem-repeat type galectins »), composées de deux domaines CRD non homologues reliés par un peptide « linker » (galectine-4, -6, -8, -9, et -12). - les galectines de type chimère (« chimera-type galectin »), ne possèdant qu’un seul domaine CRD en C-terminal relié à un peptide en N-terminal et capable de former des oligomères (galectine-3). 24 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Table 1 : Spécificité de ligation des galectines. (Adapté de Rabinovich et al, 2009). Les domaines CRD des galectines sont constitués de 135 à 140 acides aminés formant un sandwich beta légèrement courbé lui-même constitué de deux feuillets beta antiparallèles. Le côté concave est formé de six brins beta (S1 à S6) tandis que le côté convexe est formé de cinq brins beta (F1 à F5). Certains CRD possèdent un brin beta F supplémentaire (exemples : galectine-3, CRD N-terminal de la galectine-8). Le côté concave forme la cavité (ou « LBG » pour Ligand Binding Groove) dans laquelle vient se fixer le carbohydrate. Les brins beta sont reliés par de longues boucles variables, leur nom étant formé par concaténation des noms des deux brins qu’elles connectent. La figure 6 présente la structure tridimensionnelle de la galectine-1, galectine « prototype » généralement utilisée comme référence structurelle de la famille des galectines. Il est intéressant de noter que les structures tridimensionnelles des tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 CRD sont très similaires en dépit d’une identité de séquence protéique de seulement 29% [110]. Les principales différences structurelles entres les galectines se situent dans les boucles variables comme le montre l’alignement structurel présenté dans la figure 7. Les galectines reconnaissent des glycoconjugués, avec comme structure minimale reconnue le disaccharide N-acetyllactosamine (LacNAc) formé d’un galactose et d’un N-acetylglucosamine [111]. Le LacNAc peut être retrouvé dans les N-glycans et O-glycans et plusieurs unités (poly-LacNAc) peuvent être présentées sur les glycoprotéines membranaires. Il existe toutefois des différences significatives de reconnaissance des glycans entre les différents membres de la famille des galectines, principalement associées au nombre de branchements N-glycans, au nombre de répétitions LacNAc ou encore aux modifications des sacharides terminaux tels que la sialylation ou la fucosylation [110]. La table 1 présente les spécificités de ligation des galectines [112]. Il est possible que les différences structurelles observées dans les boucles reliant les feuillets beta soient cruciales pour la détermination de la spécificité des galectines envers leurs ligands [110]. Par définition, la capacité des galectines à lier des radicaux β-galactosides portés par des oligosaccharides branchés sur des glycoprotéines ou des glycolipides est leur propriété biologique essentielle. Le caractère divalent ou bivalent des galectines à deux CRD ou des dimères de galectines au CRD unique est une autre propriété essentielle de laquelle découle leur capacité de ponter de nombreuses variétés de macromolécules. Cette capacité est à la 25 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 6 : Structure tridimensionnelle de la galectine-1. (Guardia et al, 2011). La galectine-1 est une galectine « prototype » constituée d’un unique domaine de liaison des carbohydrates (CRD). Comme la plupart des autres CRD des galectines, le CRD de la galectine-1 est constituée de deux feuillets beta antiparallèles légèrement courbés (« S-sheet », brins S1à S6 et « F-sheet », brins F1 à F5). Le site de liaison des carbohydrates (Ligand Binding Groove, LBG) est situé dans le côté concave de la protéine (« S-sheet »). Figure 7 : Alignement structurel des galectines. (Guardia et al, 2011). La structure de la galectine-1 est utilisée comme référence pour cet alignement. Les régions bleues correspondent à des faibles valeurs de racine carrée moyenne de déviation (structure conservée) et les régions rouges à des fortes valeurs de racine carrée moyenne de déviation (structure variable). base de leur participation à l’organisation interne de la cellule, à la formation de nanodomaines membranaires, à la communication intercellulaire et aux interactions cellules/matrice extracellulaire (Figure 5) [109]. Elle est particulièrement bien illustrée par la formation de « lattices » à la surface des cellules (Figure 5) [113]. En pontant les oligosaccharides galactosylés appartenant à différents glycolipides ou glycoprotéines, les galectines peuvent entraîner la formation de véritables réseaux moléculaires [114]. Dans certains cas, des cascades de signalisation peuvent se mettre en place à partir de ces « lattices ». Les galectines peuvent aussi interagir directement avec d’autres molécules sans mettre en jeu de radicaux β-galactosides, notamment lorsqu’elles tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 participent à la régulation de processus biologiques intracellulaires [109]. b) Distribution tissulaire et localisation sub-cellulaire des galectines La distribution tissulaire des différentes galectines est variable. Certaines d’entre elles ont une distribution large, telles que les galectines-1, -3, -8 et -9, tandis que d’autres ont une distribution beaucoup plus restreinte, telle que les galectines-2, -4, et -6 spécifiques du tractus digestif, la galectine-7 retrouvée dans les tissus épithéliaux stratifiés, la galectine-12 présente dans les tissus adipeux, la galectine-10 exprimée dans les éosinophiles humains et les Treg et la galectine-5 restreinte aux érythrocytes et réticulocytes de rat [115-121]. Les galectines présentent certaines propriétés fondamentales propres aux protéines cytosoliques : elles sont synthétisées par les ribosomes cytosoliques, leur extrémité Nterminale est acétylée et elles ne possèdent pas de peptide «signal» [122]. Elles subissent peu de modifications post-traductionnelles [122]. Elles ne sont pas localisées exclusivement dans le cytosol et elles peuvent être associées aux membranes internes ou à la membrane plasmique, ou encore avoir une localisation nucléaire [123]. Dans la membrane plasmique, certaines galectines comme les galectines-4 et -9 peuvent être associées aux radeaux membranaires ou « rafts », des structures très riches en glycolipides [124-126]. Il est possible qu’elles contribuent à l’assemblage et à la stabilité de 26 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 ces structures. De plus, leur incorporation dans ces radeaux membranaires est nécessaire dans certains cas à leur activité de signalisation. Ainsi, la galectine-9 associée aux radeaux membranaires induit la prolifération des ostéoblastes par la voie de signalisation c-Src/ERK [126]. En dépit de leur manque de peptide « signal » normalement requis pour la sécrétion, elles peuvent être libérées dans le milieu extracellulaire en association avec les exosomes. Cela a été démontré pour la galectine-1 et la galectine-3 dans les cellules dendritiques, pour la galectine-5 dans les réticulocytes de rat, et dans les cellules de carcinome naso-pharyngé tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 pour la galectine-9 [94, 121, 127, 128]. c) Galectines, système immunitaire et cancer Les galectines peuvent influencer un grand nombre de processus biologiques tels que le développement embryonnaire, la néovascularisation et la modulation du système immunitaire [129]. Nous allons nous intéresser ici tout particulièrement à ce dernier aspect, en nous attardant sur les galectines -1 et -3 qui sont, avec la galectine-9, les galectines les plus étudiées. La galectine-9, principal objet de cette thèse, fera l’objet d’une partie spécifique. La galectine-1 possède des fonctions principalement anti-inflammatoires et immunosuppressives. Elle abolit les fonctions des neutrophiles, des macrophages inflammatoires et des mastocytes [130-132]. De plus, elle favorise directement ou indirectement l’apoptose des thymocytes et des lymphocytes T, inhibe leur fonction de sécrétion de cytokines pro-inflammatoires, augmente la production de la cytokine antiinflammatoire IL-10 et d’une manière générale affaiblit les réponses Th1 et Th17 [112, 133137]. La galectine-1 est fortement exprimée par les Treg [54]. La galectine-3 a été particulièrement étudiée dans le contexte de l’inflammation aigüe. Elle est impliquée dans l’activation et l’adhésion des neutrophiles, la chimio-attraction des monocytes et macrophages ou encore l’activation des mastocytes [138-140]. Son rôle de régulation des lymphocytes T est ambiguë. En effet, si la galectine-3 soluble induit l’apoptose 27 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 des lymphocytes T, les cellules T surexprimant la galectine-3 par transfection sont protégées de l’apoptose induite par plusieurs agents [141, 142]. De plus, le traitement de cellules T par des oligonucléotides antisens spécifiques de la galectine-3 réduit leur taux de prolifération [143]. Les galectines-2 et -4 induisent l’exposition des phosphatidylsérines des neutrophiles et provoquent l’apoptose des cellules T [135, 144, 145]. Cependant, la galectine-4 pourrait être un activateur des lymphocytes T dans certains cas en favorisant la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires [146]. De la même manière, la galectine-8 aurait un double rôle de régulation positive et négative des lymphocytes T [147, 148]. La galectine-10 pourrait jouer tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 un rôle dans la spécialisation des cellules myéloïdes [149]. Elle est également exprimée par les Treg d’une manière strictement intracellulaire et exercerait un rôle important dans la régulation des fonctions de ces cellules [119]. Les fonctions des galectines peuvent être détournées dans des contextes pathologiques, notamment dans les tissus tumoraux. Les galectines sont fréquemment exprimées par les cellules malignes, tout particulièrement la galectine-1, la galectine-3 et la galectine-8, impliquées dans la plupart des cancers [150]. La galectine-4 est également exprimée dans de nombreux types de cancer, à l’exception des cancers du sein et du poumon. A l’inverse, la galectine-7 est exprimée dans ces cancers, ainsi que dans le cancer du colon et les lymphomes [151]. La galectine-12 est exprimée dans les cancers du sein et les carcinomes ovariens [152]. Etant données les multiples activités de régulation des galectines, il est difficile de déterminer leur rôle précis dans les cancers où elles sont exprimées. La galectine-1 régule négativement la réponse anti-tumorale des cellules T, favorise le processus métastatique et l’angiogénèse [153-156]. La galectine-3 favorise la transformation tumorale en interagissant avec l’oncogène K-Ras et protège les cellules tumorales de l’apoptose [157, 158]. Comme la galectine-1, elle régule négativement la réponse anti-tumorale des cellules T et favorise le processus métastatique et l’angiogénèse [159-161]. 28 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 2) Découverte, structure et distribution de la galectine-9 a) Découverte de la galectine-9 La galectine-9 fut découverte par deux équipes indépendantes selon deux approches différentes. Elle fut tout d’abord identifiée dans la maladie de Hodgkin, en tant que cible d’auto-anticorps présents dans le sérum de la moitié des patients [162]. Elle fut décrite un peu plus tard par l’équipe de Mitsuomi Hirashima comme agent chimio-attractant des éosinophiles produit par les lymphocytes T [163], ce qui lui valut le nom alternatif d’ecalectine (ou « eosinophil chemoattractant lectine »). Depuis sa découverte, un large tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 éventail de fonctions lui a été attribuée, comme nous allons le voir dans cette partie. Ces fonctions sont principalement liées à la régulation du système immunitaire et il est aujourd’hui évident que la galectine-9 joue un rôle clé dans la modulation des réponses immunitaires innées et adaptatives. b) Structure du gène LGALS9 et de la protéine galectine-9 La galectine-9 est codée par le gène LGALS9 situé sur le chromosome 17p et constitué de onze exons séparés par dix introns. Le gène s’étend sur environ 18,8 Kpb [164] et peut subir trois épissages différents pouvant générer trois isoformes : longue (L), moyenne (M) et courte (S). Les ARN messagers de la forme courte sont dépourvus des exons 5 et 6, les messagers de la forme moyenne sont dépourvus de l’exon 5, et les messagers de la forme longue contiennent tous les exons [165, 166]. La protéine galectine-9 comporte deux domaines de reconnaissance des carbohydrates (CRD) non homologues présentés en tandem et reliés par un peptide de liaison dont la longueur varie selon les isoformes. Les isoformes L, M et S comptent respectivement 355, 323 et 311 acides aminés (poids moléculaires 39 kDa, 36 kDa et 35 kDa) avec des peptides de liaison de 58, 26, et 14 acides aminés respectivement. L’isoforme M serait prédominante dans l’intestin [167]. Il existe peu d’études fonctionnelles comparatives des différentes isoformes de la galectine-9, toutefois il a été montré qu’elles possédaient 29 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 A B Figure 8 : Spécificités de ligation de la galectine-9. (Adapté de Hirabayashi et al, 2002). Chromatographie d’affinité frontale. Les galectines sont immobilisées dans des colonnes dans lesquels sont déposés les différents oligosaccharides. Les différences de concentration avant et après passage par la colonne permettent de calculer la constante d’affinité (Ka). (A) Ensemble des oligosaccharide testés. (B) Ka des différents oligosaccharides testés avec la galectine-9. toutes les trois une activité comparable de chimio-attraction des eosinophiles [168]. De plus, l’expression transitoire de l’isoforme longue de la galectine-9 dans des cellules de carcinome de colon augmente l’expression de la protéine d’adhésion pro-métastatique sélectine-E tandis que l’expression transitoire des isoformes moyenne et courte réduit son niveau d’expression [169]. La galectine-9 possède une affinité élevée pour les oligosaccharides de type N-glycan avec branchements (Kd = 0,16 ~ 0,70 µM) et les oligolactosamines avec répétitions possédant une structure linéaire (Kd = 0,09 ~ 8,3 µM selon le nombre de répétitions, la constante de dissociation diminuant avec l’augmentation du nombre de répétitions) [111]. Les domaines tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 CRD N-terminal et C-terminal possèdent des spécifités de ligation différentes. Ainsi, le CRD N-terminal possède une forte affinité pour le pentasaccharide de Forssman (Kd = 0,09 µM) et l’A-hexasaccharide (Kd = 0,26 µM) au contraire du CRD C-terminal. La figure 8 présente les spécificités de ligation de la galectine-9 de ces différents oligosaccharides. Les affinités de la galectine-9 pour les oligosaccharides de type O-glycan sont encore mal connues à ce jour. Les structures tridimensionnelles des deux CRD de la galectine-9 ont été déterminées individuellement par cristallographie [170-172]. Le domaine C-terminal a été cristallisé en présence des oligosaccharides LacNAc, Sialac et BIPA (Figure 9). Comme les autres CRD des galectines, le CRD C-terminal de la galectine-9 adopte une configuration en sandwich beta formé de deux feuillets beta antiparallès, eux-mêmes constitués de six (S1 à S6) et cinq (F1 à F5) brins beta. A noter la présence d’une hélice supplémentaire (H1) située dans la boucle F5S2. Le CRD C-terminal forme un trimère lors de la cristallisation, cependant il est possible qu’il n’y ait pas de trimérisation en solution. Les auteurs de l’étude suggèrent que la structure large et peu profonde de la cavité favoriserait la liaison d’oligosaccharides avec branchements. Le CRD N-terminal a été cristallisé en présence de lactose, du pentasaccharide de Forssman et dans une seconde étude avec le poly-LacNAc [171, 172]. La structure du CRD N-terminal est semblable à celle du CRD C-terminal et l’on retrouve également l’hélice H1 (Figure 9). Ce CRD se cristallise sous forme monomèrique. 30 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 A B C Figure 9 : Structures tridimensionnelles des domaines CRD de la galectine-9. (Nagae et al, 2007 ; Yoshida et al, 2010). (A) Structure tridimensionnelle du domaine CRD N-terminal en complexe avec le lactose. (B) Structure tridimensionnelle du domaines CRD C-terminal en complexe avec les oligosaccharides LacNAc, SiaLac et BIPA. Les structures des deux domaines sont proches de la structure de la galectine-1, à l’exception de l’hélice H1 non présente dans la structure de cette dernière. (C) Structure détaillée du lactose, de LacNAc, SiaLac et BIPA. La galectine-9 se lie au récepteur TIM-3 par l’intermédiaire de résidus N-glycans [173]. L’expression de ce type de résidus est nécessaire pour l’induction de l’apoptose des cellules de la lignée Jurkat [174]. L’équipe d’Hirashima a récemment mis en évidence un effet suppresseur de la galectine-9 sur le développement des lymphocytes Th17 et celui-ci est indépendant du récepteur TIM-3 mais dépendant de la biosynthèse d’O-glycans [175]. c) Distribution tissulaire et subcellulaire de la galectine-9 La galectine-9 possède une distribution tissulaire large, cependant elle est peu exprimée en dehors d’un contexte inflammatoire. Elle est principalement produite par les tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 lymphocytes T, les macrophages, les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules épithéliales [163-165, 176-178]. Son expression est induite par plusieurs cytokines inflammatoires telles que l’IFN-γ ou l’IL-1 β, ou par l’activation antigénique pour les lymphocytes T [163, 178, 179]. Elle est régulée positivement par l’histone déacétylase 3 (HDAC3) dans les cellules endothéliales [180]. La galectine-9 est fortement exprimée par les cellules malignes de NPC et par les cellules de Kupffer infiltrant les tissus hépatiques infectés par le VHC, plus particulièrement dans le contexte d’hépatocarcinomes liés au VHC [124, 176]. Elle est retrouvée dans le sang des patients atteints par ces maladies [108, 176]. On la retrouve également exprimée dans d’autres cancers non liés à des virus, tels que le mélanome et le cancer du sein [181, 182]. Comme décrit précèdemment, les galectines ne sont généralement pas réduites à une seule localisation cellulaire et la galectine-9 ne déroge pas à cette règle. Celle-ci peut avoir une localisation cytoplasmique ou nucléaire, être associée à la membrane plasmique ou encore être sécrétée dans le milieu extracellulaire [94, 124, 183]. Comme les autres galectines, la galectine-9 ne possède pas de séquence signal et n’est pas sécrété par la voie classique dépendante du réticulum endoplasmique et de l’appareil de Golgi [184]. Mon équipe d’accueil a mis en évidence sa sécrétion en association avec les exosomes par les cellules malignes de carcinome nasopharyngé [94]. 31 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 10 : Famille des protéines TIM. (Adapté de Freeman et al, 2010). Représentation schématique. Les sites de glycosylations sont positionnés de manière approximative. d) Exosomes et galectine-9 La galectine-9 est présente en grande quantité dans les cellules de NPC et dans les exosomes sécrétés par ces cellules [94, 124]. Ces exosomes porteurs de galectine-9 sont retrouvés dans le sang de souris xénogreffées par des lignées de NPC et dans le sang de patients atteints de NPC [108]. L’inclusion de la galectine-9 dans la membrane des exosomes la protège de la digestion protéique par la trypsine et le traitement des exosomes par le Triton resensibilise la galectine-9 à cette digestion. Ces exosomes peuvent être capturé par des billes magnétiques recouvertes de l’anticorps anti-galectine-9 9M1-3, ce qui démontre qu’au moins une partie de la galectine-9 est exposée à la surface des exosomes. L’élément clé tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de cette étude est la démonstration que les exosomes vecteurs de galectine-9 peuvent agir en tant qu’agoniste de TIM-3. En effet, ils peuvent induire l’apoptose de clones CD4+ spécifiques de protéines d’EBV. Cette apoptose peut être inhibée par 9M1-3 et par un anticorps bloquant de TIM-3. 3) Récepteurs de la galectine-9 et signalisation a) Récepteur TIM-3 Les protéines TIM (T-cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing) constituent une famille de protéines membranaires de type I composées en N-terminal d’un domaine extracellulaire homologue des immunoglobulines, d’un domaine de type mucine, d’un domaine transmembranaire, et d’un domaine intracellulaire en C-terminal (Figure 10). Les protéines de la famille TIM sont au nombre de huit chez la souris (TIM-1 à -8), trois chez l’homme (TIM-1, TIM-3 et TIM-4), et sont toutes impliquées dans le fonctionnement du système immunitaire [185]. Le récepteur TIM-3 a tout d’abord été identifié comme marqueur des lymphocytes Th1 [186]. Nous savons maintenant qu’il est exprimé par les cellules T CD8+, les Th17, les Treg et les cellules de l’immunité innées telles que les monocytes, les cellules dendritiques et les NK [187-191]. Il possède un rôle inhibiteur lorsqu’il est exprimé par les Th1, les Th17 et 32 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 11 : Structure tridimensionnelle du domaine IgV de la protéine TIM-3 murine. (Adapté de Freeman et al, 2010). Les sites de liaison de la phosphatidylsérine et de la galectine-9 sont indiqués. Les chaînes latérales de deux asparagines pouvant être N-glycosylés sont représentées sous forme spérique. Figure 12 : Modèles d’interaction entre TIM-3 et la galectine-9. (Adapté de Freeman et al, 2010). TIM-3 peut interagir avec la phosphatidylsérine (en rouge) présente à la surface de cellules apoptotiques ou d’exosomes. La galectine-9 peut lier deux molécules TIM-3, ou bien lier une molécule TIM-3 et un autre récepteur. les T CD8+ et un rôle stimulateur pour les Treg [173, 187-191]. Il induit la production de cytokines pro-inflammatoires par les monocytes, les cellules dendritiques et les NK [176, 189]. Son expression peut être dérégulée dans différents contextes pathologiques. Ainsi, TIM-3 est sous-exprimé dans plusieurs maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaque, la polyarthrite rhumatoïde ou l’hépatite auto-immune [192-194]. Inversement, TIM-3 est souvent surexprimé à la surface des CTL lors d’infections chroniques virales [195-197]. Son expression caractérise une population de lymphocytes au phénotype « épuisé », qui se traduit par une réponse limitée après activation par les antigènes viraux en termes de tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 production de cytokines et de cytotoxicité. Cette association de TIM-3 à l’état d’épuisement des CTL est également retrouvée dans le mélanome pour des lymphocytes dirigés contre l’antigène tumoral NY-ESO-1 [198]. D’autres ligands de TIM-3 ont été décrits, dont la phosphatidylsérine et HMGB1 [199, 200]. L’interaction de TIM-3 avec HMGB1 atténue l’immunogénécité de l’ADN relargué par les cellules tumorales nécrotiques. Par ailleurs, TIM-3 est fortement exprimé par les cellules malignes de leucémie aiguë myéloïde et de cancer du poumon [201, 202]. Dans ce deuxième cas, l’expression de TIM-3 est corrélée avec une agressivité accrue de la tumeur. Le domaine IgV de la protéine TIM-3 murine a été cristallisé seul, et en complexe avec la phosphatidylsérine (figure 11) [199, 203]. Ce domaine existe en tant que monomère en solution. Il présente une structure en sandwich beta composé d’un feuillet beta avant (brins A’, G, F, C, C’, C’’) et d’un feuillet beta arrière (brins B, E, D). Les brins B et F sont reliés par un pont disulfure qui stabilise l’ensemble de la structure. Les boucles FG et CC’ forment une fente qui n’est pas présente habituellement dans la structure canonique des domaines IgV. La figure 12 présente différents modèles d’interaction envisageables impliquant TIM-3, la galectine-9 et la phosphatidylsérine présente à la surface de cellules apoptotiques ou d’exosomes. 33 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 b) Récepteurs alternatifs de la galectine-9 La plupart des fonctions connues de la galectine-9 dépendent de son interaction avec TIM-3, cependant celle-ci est capable de se lier à d’autres glycoprotéines telles que le CD44 et la « protein disulfide isomerase » (PDI) [204, 205]. Dans ces deux cas, elle altère les capacités migratoires des cellules en bloquant leurs interactions avec la matrice extacellulaire, à savoir liaison du CD44 avec l’acide hyaluronique et liaison de la PDI avec l’intégrine β3. D’autres données suggèrent qu’elle peut interagir avec les antigènes de Forssman et de ThomsenFriedenreich, des glycolipides préférentiellement exprimés à la surface des cellules malignes [171, 206]. Par ailleurs, plusieurs études ont mis en évidence des fonctions de la galectine-9 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 indépendantes de TIM-3, sans que le récepteur impliqué dans ces fonctions ne soit identifié [175, 207, 208]. c) Voies de signalisation induites par la galectine-9 Les voies de signalisation mises en jeu par la galectine-9 sont encore mal connues. De premiers éléments ont été apportés par l’étude de l’apoptose induite par la galectine-9 dans les lignées cellulaires de lymphomes T, Jurkat et MOLT-4. Dans ces cellules, la galectine-9 induit l’apoptose d’une manière dépendante du temps d’incubation et de la concentration [209]. L’apoptose induite est inhibée par le lactose et non le sucrose, suggérant la nécessité de liaison de la galectine-9 avec des résidus β-galactosides. Dans la lignée MOLT-4, l’apoptose peut être réduite par un inhibiteur de caspase-1, par un inhibiteur de la calpaïne, par 2-APB (inhibiteur d’IP3), par BAPTA-AM (chélateur intracellulaire de Ca2+), et non par l’EGTA (chélateur extracellulaire de Ca2+). Ces données suggèrent que la voie caspase-1/calpaïne et les flux intracellulaires de calcium sont impliqués dans l’apoptose médiée par la galectine-9 des cellules de la lignée MOLT-4. Le même groupe de recherche s’est intéressé par la suite plus précisément aux mécanismes de signalisation mis en jeu dans la lignée Jurkat [174]. Dans ces cellules, la galectine-9 induit une activation de la caspase-3 et le relargage de facteurs mitochondriaux (Smac/DIABLO, Cytochrome c). Toutefois, les inhibiteurs de caspases y compris l’inhibiteur 34 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de caspase-1 n’ont qu’un effet partiel sur l’exposition des phosphatidylsérines et la fragmentation de l’ADN. Les auteurs observent le relargage du facteur AIF, capable d’induire l’apoptose d’une manière indépendante des caspases, et suggèrent que la galectine-9 induit la mort des cellules Jurkat par des mécanismes à la fois caspasedépendants et caspase-indépendants. Ils constatent également un relargage du calcium dans les Jurkat, avec un effet réduit de BAPTA-AM et de l’inhibiteur de calpaïne par rapport aux cellules MOLT-4. Le récepteur de la galectine-9 n’est pas identifié dans cette étude, mais les auteurs écartent les molécules CD7, CD29 et CD45 grâce à l’utilisation de plusieurs sousclones de Jurkat. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Les voies de signalisation induites par la galectine-9 ont également été étudiées dans les ostéoblastes humains [126, 210]. Dans ces cellules, la galectine-9 active la voie de signalisation c-Src/ERK en regroupant les radeaux membranaires, ce qui induit la prolifération et elle induit leur différenciation en recrutant le CD44 et en activant ainsi la voie Smad. L’implication de la voie ERK dans la signalisation de la galectine-9 a également été montrée dans les cellules dendritiques [211]. Elle induit la phosphorylation des kinases « mitogen-activated protein » (MAP) p38 et « extracellular signal-regulated » (ERK1/2) ce qui entraine la maturation de ces cellules. La liaison de la galectine-9 au récepteur TIM-3 favorise la phosphorylation par ITK du résidu Y265 situé sur la portion intracellulaire de TIM-3 [212]. Cette tyrosine est situé dans un domaine très conservé de fixation au domaine d’homologie Src (SH2) et sa phosphorylation pourrait permettre le recrutement de protéines contenant le domaine SH2. Inversement, la liaison de la protéine Bat3 au domaine intracellulaire de TIM-3 protège les lymphocytes Th1 de l’apoptose induite par la liaison de la galectine-9 [213]. 35 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 4) Galectine-9 et système immunitaire a) Galectine-9 et immunosuppression La galectine-9 régule négativement les lymphocytes Th1 en induisant leur apoptose par l’intermédiaire du récepteur TIM-3 [108, 173]. Elle induit également l’apoptose des lymphocytes T CD8+, [176, 191, 214]. Un troisième aspect de l’immunosuppression médiée par la galectine-9 est la régulation négative des lymphocytes pro-inflammatoires Th17, démontrée principalement dans des modèles murins [175, 188, 215-217]. La galectine-9 inhibe la production d’IL-17, réduit la population Th17 et limite leur différenciation. En outre, la tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 réponse Th17 est exacerbée chez les souris invalidées pour la galectine-9. L’effet inhibiteur du développement des Th17 est indépendant de TIM-3, tandis que leur apoptose est dépendante de TIM-3 [175]. Parallèlement à ces fonctions immunosuppressives directes exercées sur les Th1, Th17 et T CD8+, la galectine-9 favorise indirectement l’immunosuppression en régulant positivement les lymphocytes Treg. Ce rôle a été principalement mis en évidence chez la souris [175, 188, 218]. Dans ces modèles murins, la galectine-9 exogène favorise l’expansion de Treg FoxP3+ à partir de lymphocytes T naïfs d’une manière dépendante de l’IL-2 et la population de Treg est réduite dans les souris invalidées pour la galectine-9. Chez l’homme, l’expansion des Treg médiée par la galectine-9 a été montrée dans le contexte de l’infection par HCV, d’une manière dépendante du TGF-β [176]. Ce lien entre TGF-β et galectine-9 pour l’induction des Treg a récemment été confirmé in vitro [219]. De plus, la galectine-9 est aussi directement exprimée par les Treg et le blocage de TIM-3 réduit l’activité suppressive qu’ils exercent sur des lymphocytes T CD4+ CD25- in vitro [220]. b) Galectine-9 et inflammation La galectine-9 augmente la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les monocytes humains [176, 187]. La production de TNF- α par ces cellules peut-être abolie en grande partie par le blocage de TIM-3 [187]. Elle augmente également la sécrétion de 36 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 cytokines pro-inflammatoires par les lymphocytes Th1 et Th2, cependant dans une moindre mesure et d’une manière indépendante de TIM-3 [207]. Sa surexpression intracellulaire artificielle active la production de cytokines inflammatoires dans les monocytes [183]. Chez la souris, la galectine-9 induit la maturation des cellules dendritiques et augmente leur production de TNF-α [187, 190]. Cette production est fortement réduite chez les souris invalidées pour TIM-3 [187]. La galectine-9 favorise également la maturation des cellules dendritiques chez l’homme [211]. Les cellules NK activées sont les lymphocytes qui expriment le plus fortement le tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 récepteur TIM-3 [189]. La galectine-9 augmente la production d’IFN-γ par les cellules de la lignée NK92 et cette production est encore supérieure lorsque les cellules NK92 sont génétiquement modifiées pour surexprimer TIM-3. Cet effet est également observé en cocultivant les cellules NK92 avec des cellules Raji génétiquement modifiées pour exprimer la galectine-9. La neutralisation de TIM-3 limite la production d’IFN-γ. c) Galectine-9 et auto-immunité Dans les maladies auto-immunes, le système immunitaire réagit de façon aberrante aux antigènes du soi et l’immunosuppression peut constituer une voie thérapeutique. Le récepteur TIM-3 ayant été largement décrit comme régulateur négatif de la réponse immune des Th1, plusieurs équipes se sont intéressées au statut de TIM-3 et au potentiel thérapeutique de son ciblage dans ce type de maladies [192-194, 221]. TIM-3 est sous-exprimé à la surface de lymphocytes T issus du liquide céphalo-rachidien de patients atteints de sclérose en plaque, ce qui a pour effet de limiter son rôle de régulateur négatif de la réponse immune [192, 221]. Un défaut d’expression de TIM-3 similaire a été rapporté dans l’hépatite auto-immune et la polyarthrite rhumatoïde [193, 194]. Les lymphocytes T CD4+ issus de patients atteints de ces maladies sous-expriment TIM-3 et sont plus résistants à l’apoptose induite par la galectine-9. Cette sous-expression favorise ainsi la persistance des réponses Th1 et Th17 et par conséquent la persistance de la maladie. 37 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Dans des modèles murins d’allergie, la galectine-9 réduit l’inflammation en limitant les réponses Th1 et Th17 et en empechant l’interaction des leukocytes avec la matrice extracellulaire par blocage de l’interaction CD44/acide hyaluronique [204, 216]. Paradoxalement, elle contribuerait au développement de la pathologie en recrutant les éosinophiles et en favorisant la réponse Th2 [222]. De plus, l’expression de la galectine-9 est augmentée dans les cellules épithéliales intestinales de patients atteints d’allergie alimentaire, et son blocage réduit la sévérité des symptomes allergiques dans un modèle murin de cette pathologie [223]. Comme nous l’avons vu, la galectine-9 et son récepteur le plus étudié, TIM-3, sont tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 exprimés par un grand nombre de cellules effectrices du système immunitaire. La galectine-9 est principalement produite dans un contexte inflammatoire et renforce l’inflammation en soutenant la réponse immunitaire innée, puis exerce un rétrocontrôle négatif sur les cellules de l’immunité adaptative. La voie galectine-9/TIM-3 peut être altérée lors de dérèglements du système immunitaire, comme dans les maladies auto-immunes et, comme nous allons le voir maintenant, lors d’infections virales et de cancers associés à ces infections. 5). Rôle de la galectine-9 dans les infections virales et les cancers associés aux virus a) Virus de l’immunodéficience humaine Deux groupes de recherche se sont intéressés aux effets directs de la galectine-9 sur les lymphocytes T CD4+ dans le contexte de l’infection par le VIH [205, 224]. Les auteurs de la première étude montrent que la galectine-9 favorise la rétention des PDI à la surface membranaires des lymphocytes Th2 [205]. Les PDI modifient la conformation des protéines en ouvrant ou fermant les ponts disulfures et leur rétention favorise l’entrée du virus dans les lymphocytes Th2. Cette rétention facilite également la migration des lymphocytes à travers la matrice extracellulaire grâce à l’association des PDI avec l’intégrine β3 présente dans la matrice extracellulaire. 38 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Paradoxalement, les auteurs de la seconde étude mettent en évidence un rôle protecteur de la galectine-9 pour les lymphocytes T CD4+ lors de l’infection par le VIH [224]. L’interaction de la galectine-9 avec TIM-3 réduit l’expression membranaire de CCR5, CXCR4 et α4β7, corécepteurs nécessaires à l’entrée du virus. De plus, la galectine-9 augmente l’expression de la protéine p21 dans les lymphocytes T CD4+ activés, ce qui réduit leur susceptibilité à l’infection. Les auteurs suggèrent que les effets de la galectine-9 dépendent du stade de l’infection et du type de cellule cible. Les variations de concentration de galectine-9 dans le microenvironnement infectieux pourraient également être à l’origine des effets antagonistes ainsi observés. Les auteurs détectent une concentration élevée de galectine-9 plasmatique chez les patients infectés de manière chronique par le VIH, tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 cependant la source de galectine-9 n’est pas identifiée dans cette étude. Lors de l’infection chronique par le VIH, le récepteur TIM-3 caractérise une population de lymphocytes T CD8+ ne proliférant pas et ne produisant pas de cytokines en réponse à une activation antigénique [195]. Le niveau d’expression de TIM-3 sur ces lymphocytes est corrélé positivement avec la charge virale du VIH et inversement corrélée avec la quantité de lymphocytes T CD4+. Le blocage de TIM-3 in vitro restaure partiellement la prolifération et la capacité de sécrétion de cytokines des cellules T spécifiques du VIH, ainsi que les capacités cytotoxiques des CTL spécifiques du VIH [225]. Les auteurs de ces études ne démontrent pas que la galectine-9 joue un rôle dans l’établissement et/ou de maintien du phénotype d’épuisement des lymphocytes T CD8+ dans le contexte de l’infection chronique par le VIH. b) Virus Herpès Simplex de type 1 Le rôle de la galectine-9 et de son interaction avec TIM-3 a été étudié dans un modèle murin d’infection par le virus Herpès Simplex de type 1 (HSV-1). Dans les lésions oculaires causées par HSV-1, près de la moitié des lymphocytes expriment le récepteur TIM-3. Le blocage de TIM-3 par l’anticorps monoclonal antagoniste « 2E2 » augmente la sévérité des lésions. Inversement, l’injection de galectine-9 recombinante chez les animaux réduit leur sévérité. L’effet protecteur de la galectine-9 provient de sa capacité à réduire la population de 39 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 lymphocytes Th1 et donc à diminuer la production de cytokines pro-inflammatoires. Il provient également de sa capacité à favoriser la conversion de lymphocytes T en lymphocytes Treg et l’expansion de cette population [226]. Dans le même modèle murin, les effets d’un traitement combinant la galectine-9 recombinante en avec le MabT25 ont été analysés. Le MabT25 est un anticorps monoclonal agoniste de TNFRSF25, membre de la superfamille des récepteurs pour le TNF. Il favorise l’expansion des Treg. Le traitement simultané par la galectine-9 et le MabT25 limite grandement la sévérité des lésions oculaires induites par le HSV-1 chez la souris, en réduisant les dégats tissulaires provoqués par les lymphocytes T CD4+ pro-inflammatoires tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 [227]. Il est toutefois important de noter que la galectine-9 induit l’apoptose des lymphocytes T CD8+ du ganglion trigeminal dans ce modèle murin. La perte de ces lymphocytes se traduit par une plus grande fréquence et une plus grande amplitude de la réactivation virale. Les effets de la galectine-9 dans ce modèle murin d’infection par HSV-1 ne sont donc pas uniquement positifs [214]. c) Hepatites virales et hépatocarcinomes Le taux de galectine-9 est élevé dans le sang des patients infectés de manière chronique par le VHC et plus élevé encore chez les patients dont la maladie a évolué en hépatocarcinome [176]. La galectine-9 est produite par les macrophages hépatiques, ou cellules de Kupffer, ainsi que par les monocytes. Cette production est induite par l’IFN-γ. En retour, la galectine-9 induit la production de cytokines pro-inflammatoires par les PBMC et les monocytes hépatiques. Elle contribue également à limiter la réponse immunitaire en favorisant l’expansion des Treg via le TGF-β et en induisant l’apoptose des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques du VHC. Les auteurs ne démontrent pas que l’interaction de la galectine-9 avec le récepteur TIM-3 est directement responsable de cette apoptose. L’infection chronique par le VHC est caractérisée par la présence d’une population de lymphocytes T CD8+ au phénotype épuisé, avec une expression membranaire de récepteurs inhibiteurs, incluant PD-1 et TIM-3 [196]. Le blocage de PD-1 ou de TIM-3 augmente la 40 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 prolifération des CTL in vitro. Par ailleurs, le blocage de TIM-3 a pour effet d’améliorer la cytotoxicité des CTL envers des lignées cellulaires hépatiques exprimant des épitopes du VHC. Le rôle de la galectine-9 dans l’entretien de ce phénotype n’est pas démontré dans cette étude. TIM-3 est également exprimé par les Treg lors de l’infection chronique par le VHC [228]. Son expression est corrélée avec l’expression du marqueur de prolifération Ki67 et son blocage sensibilise les Treg à l’apoptose induite par l’activation du TCR. Dans un modèle murin d’infection par le VHB, les lymphocytes hépatiques expriment fortement TIM-3, particulièrement les lymphocytes T CD8+ [197]. Lorsque ceux-ci sont invalidés pour TIM-3 par shRNA, ils produisent davantage d’ IFN-γ. Le rôle de TIM-3 lors tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de l’infection chronique par le VHC a été confirmé chez l’homme [229]. L’activation antigénique ne déclenche pas de prolifération ni de forte production de cytokines des lymphocytes T CD8+ TIM-3+ des patients étudiés. Le blocage de TIM-3 restore de manière significative la prolifération et la production de cytokines par ces lymphocytes lorsqu’ils sont exposés à des peptides antigèniques issus du VHB. Le rôle de la galectine-9 n’est pas évoqué dans ces deux études. d) Virus d’Epstein-Barr et carcinome nasopharyngé La galectine-9 est fortement exprimée par les lymphocytes B immortalisés par le virus d’Epstein-Barr (EBV) et dans les cellules de carcinome nasopharyngé (NPC) infectées par l’EBV [124]. La forme indifférenciée du NPC, de loin la plus fréquente, est constamment associée à l’EBV et le génome du virus est présent dans le noyau des cellules malignes [230, 231]. La plupart des gènes d’EBV sont silencieux dans les cellules de NPC, cependant les protéines virales LMP1, LMP2, EBNA1 et BARF1, ainsi que les ARN viraux EBERS sont constamment exprimés et contribuent au phénotype malin [13]. La galectine-9 interagit avec la protéine LMP1 dans les rafts membranaires et ces deux protéines sont retrouvées dans les exosomes sécrétées par les cellules de NPC [94]. Comme nous l’avons vu, les exosomes vecteurs de galectine-9 peuvent agir en tant qu’agoniste de TIM-3 et induire l’apoptose de cellules Th1 [108]. 41 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Les cellules tumorales de NPC expriment des antigènes viraux et leur machinerie de présentation des antigènes est fonctionnelle, de plus les patients atteints de NPC sont rarement immunodéficients et produisent une réponse immunitaire contre les protéines d’EBV [232-235]. Pourtant, les lymphocytes T infiltrant les tumeurs ne parviennent pas à éliminer les cellules malignes infectées par EBV. L’expression des facteurs « classiques » d’immunosuppression (TGF-β, IL-10, FasL, B7-H1, iNOS) a été analysée dans le microenvironnement tumoral des NPC sans résultat convaincant [236]. Il est donc possible que la galectine-9 joue un rôle immunosuppressif essentiel dans ces tumeurs. Les résultats décrits au cours de cette partie tendent à démontrer que la galectine-9 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 serait au cœur d’une nouvelle voie de régulation majeure du système immunitaire, dépendante en grande partie du récepteur TIM-3. Le blocage de ces voies de régulation constitue aujourd’hui un enjeu crucial en oncologie, comme l’atteste le succès clinique récent de l’anticorps immunomodulateur ipilimumab. III. Anticorps monoclonaux immunomodulateurs 1) Historique A la fin du XIXème siècle, le médecin et microbiologiste Kitasato Shibasaburo décrivit la présence d’un médiateur réagissant avec les toxines diphtériques et tétaniques dans le sérum, et proposa la théorie de l’immunité humorale. Ces médiateurs seraient par la suite baptisés Antikörper, ou anticorps, par l’immunologiste Paul Ehrlich. En 1975, Georges Köhler et César Milstein publièrent une méthode d’obtention de lymphocytes B fusionnés à des cellules de myélome, ou « hybridomes », sécrétant des anticorps à la spécificité prédéfinie [237]. Pendant longtemps, il fut impossible de maintenir des lymphocytes B en culture prolongée et cela reste techniquement difficile. La fusion des lymphocytes B avec les cellules cancéreuses de myélome leur permet d’acquérir un potentiel de réplication illimité dans des conditions de culture ordinaires. La mise au point des hybridomes valut à Köhler et Milstein le prix Nobel de médecine en 1984. Cette découverte allait révolutionner le monde 42 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 13 : Principe de production des hybridomes. L’animal immunisé est sacrifié et ses lymphocytes B sont fusionnées avec des cellules de myélome et incubées dans du milieu de sélection HAT. Les cellules de myélomes et les lymphocytes B non fusionnés vont être rapidement éliminées. Les hybridomes possèdent les caractéristiques des lymphocytes B (production d’anticorps) et des cellules cancéreuses (potentiel de réplication illimité). Un screening est effectué pour sélectionner les clones sécrétant l’anticorps d’intérêt, puis les clones sélectionnés sont sous-clonés juqu’à l’obtention d’hybridomes monoclonaux, sécrétant des anticorps monoclonaux. A B Figure 14 : Structure des anticorps. (Adapté de Strand et al, 2007 ; bioatla.com). (A) Les anticorps se composés de deux chaînes légères et deux chaîns lourdes reliées entre par des ponts disulfures. Les régions variables octroient aux anticorps leur spécificité via les régions déterminantes de complémentarités (CDR), tandis que la région constante connecte l’anticorps aux cellules actrices du système immunitaire. (B) Répartition des domaines murins (en bleu) et des domaines humains (en rouge) dans les cinq types d’anticorps monoclonaux les plus courant. Des suffixes spécifiques sont attribués aux anticorps selon leur origine et leur fonction d’après la nomenclature définie par l’Organisation Mondiale de la Santé (voir Table 1 ci-dessous). des anticorps et contribuer d’une façon majeure au développement des thérapies ciblées en médecine. 2) Aspects techniques de la production d’hybridome L’animal immunisé est sacrifié et ses cellules productrices d’anticorps sont mises en présence de cellules de myélome, par exemple la lignée Sp2/0 dérivée du myélome MOPC21 (Figure 13). La fusion des membranes plasmique s’effectue avec du polyéthylène glycol [238]. Les cellules de myélome utilisées sont défectives pour une enzyme essentielle à leur survie, généralement l’hypoxanthine-guanine phosphoribosyl-transférase (HGPRT). Les tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 cellules eukaryotes synthétisent les nucléotides à partir de sucres et d’acides aminés (voie de synthèse de novo) ou à partir de nucléosides (voie alterne). L’HGPRT est essentielle pour la synthèse de nucléotides à partir de nucléosides. Une fois la fusion effectuée, les cellules sont incubées dans un milieu spécifique appelé HAT. Ce milieu contient de l’aminoptérine, inhibiteur de la voie de néosynthèse des nucléotides, unique voie de synthèse fonctionnelle pour les cellules de myélome HGPRT-. Les cellules non fusionnées vont rapidement péricliter dans le milieu HAT. Ce milieu contient en outre d’une part de l’hypoxanthine, qui satisfait un besoin transitoire en purines avant que la fusion cellulaire ne soit stabilisée et pleinement efficace, et d’autre part de la thymidine car l’aminoptérine bloque l’action de la thymidylate synthétase. Les hybridomes sélectionnés sont ensuite cultivés dans du milieu HT dépourvu d’aminoptérine, puis dans du milieu classique et pourront alors être clonés puis sous-clonés pour obtenir des hybridomes monoclonaux [239]. 3) Structure et ingénierie des anticorps Les anticorps, ou immunoglobulines, sont des protéines de haut poids moléculaire (150 kDa environ) constitués de deux chaînes lourdes identiques et de deux chaines légères identiques (Figure 14). Il existe cinq types de chaines lourdes chez les mammifères : α, δ, ε, γ, et µ, définissant respectivement les classes d’anticorps IgA, IgD, IgE, IgG et IgM impliqués dans des processus fonctionnels distincts [240]. De la même manière, il existe deux types de chaines légères chez les mammifères : κ et λ. 43 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Les immunoglobulines possèdent deux domaines variables de liaison des antigènes identiques appelés « Fab », et un fragment constant « Fc ». Les Fab octroient aux anticorps leur spécificité via les régions déterminantes de complémentarités (CDR) à haute variabilité, tandis que le Fc connecte l’anticorps aux cellules actrices du système immunitaire par l’intermédiaire des récepteurs Fc présents à la surface des cellules NK, des cellules dendritiques, des monocytes, des neutrophiles et des éosinophiles [241]. Si la découverte des hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux fut à l’origine d’avancées rapides dans les domaines de la recherche fondamentale et du diagnostic, l’origine murine de ces anticorps posa d’importants problèmes pour leur utilisation en tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 thérapeutique. En effet, l’utilisation régulière d’anticorps de souris chez l’humain provoque presque systématiquement l’apparition d’anticorps humains anti-souris. Cette réaction immunitaire réduit l’efficacité de l’anticorps murin thérapeutique et peut être à l’origine de l’apparition d’effets secondaires indésirables du fait de la formation de complexes immuns. La différence d’espèce implique également des différences de séquence des fragments constants des anticorps, pouvant être à l’origine d’une affinité réduite des récepteurs Fc humains pour les fragments Fc des anticorps non-humains. Cette diminution d’affinité peut avoir pour conséquence une réduction de leurs capacités effectrices pouvant être pourtant essentielles à leur action thérapeutique, telle que la cytotoxicité dépendante des anticorps [242]. Les progrès considérables de la biologie moléculaire réalisés dans les années 1980 apportèrent des solutions à ces problèmes en rendant accessible l’ingénierie des anticorps. Il est maintenant possible de concevoir des anticorps monoclonaux chimériques, humanisés ou même humains (Figure 14) [243-245]. Les anticorps chimériques sont constitués des domaines variables des chaines lourdes et légères de l’anticorps d’intérêt, greffés sur une région humaine constante dite « charpente » (exemple : rituximab). Les anticorps humanisés sont des anticorps chimériques où seules les régions CDR hypervariables de l’anticorps d’intérêt ont été greffées sur la « charpente », éliminant ainsi la quasi-totalité de la séquence non humaine (exemple : bevacizumab). Les anticorps humains sont obtenus à partir de banques de phages exprimant des régions variables humaines, ou bien par immunisation de 44 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Table 2 : Nomemclature des anticorps monoclonaux. (Organisation Mondiale de la santé, 2009). Le nom d’un anticorps monoclonal se compose d’un préfixe unique, d’une syllabe indiquant sa fonction (table de gauche), d’une syllabe indiquant son origine (table de droite) et du suffixe « mab ». En cas d’anticorps conjugué, le conjugat fait l’objet d’un second mot séparé. Table 3 : Anticorps monoclonaux actuellement approuvés en oncologie. (Galluzzi et al, 2012). Ces anticorps ont été approuvés en Europe par l’European Medicines Agency et/ou aux Etats-Unis par la Food and Drug Administration. Abbréviations : C, chimérique, H, humain, Hzed, humanisé, M, murin, M-R hybrid, hybride souris-rat. souris transgéniques exprimant les chaines lourdes et légères humaines (exemple : ipilimumab). Il existe une nomenclature internationale des anticorps monoclonaux établie par l’Organisation Mondiale de la Santé dans les années 1990 prenant en compte leur origine et leur fonction (Table 2). L’ingénierie des anticorps a également rendu possible la production de variants d’anticorps tels que les anticorps fragmentaires « single-chain variable fragment » (ScFv) constitués uniquement des domaines variables, les anticorps bispécifiques (exemple : catumaxomab, à la fois anti-CD3 et anti-EpCAM), les anticorps fusionnés à des toxines ou des enzymes, et les anticorps couplés à des ligands radioactifs ou des cytokines [246-248] tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 (Figure 15). 4) Anticorps monoclonaux et cancer En 1986, l’anticorps monoclonal murin anti-CD3 muromonab (ou OKT3) fut le premier anticorps à être autorisé par la Food and Drug Administration américaine (FDA) pour une utilisation clinique, en tant que traitement du rejet de greffe lors de la transplantation rénale. En oncologie, le premier anticorps autorisé fut le rituximab en 1997 pour le traitement des lymphomes non-hodgkinien réfractaires à la chimiothérapie. Aujourd’hui, une trentaine d’anticorps monoclonaux sont utilisés en clinique, dont près de la moitié en oncologie (Table 3). Le rituximab est un anticorps chimérique souris/humain dirigé contre la molécule CD20 présente à la surface des lymphocytes B sains et cancéreux. Il induit la mort des cellules B essentiellement par cytotoxicité dépendante des anticorps (ADCC) et cytotoxicité dépendante du complément (CDC) [249]. Il existe trois autres anticorps anti-CD20 autorisés en oncologie : l’ofatumumab, anti-CD20 humain plus efficace que le rituximab pour induire la cytotoxicité, l’ibritumomab et le tositumomab, tous deux couplés à des isotopes radioactifs [250]. Deux autres anticorps autorisés en clinique ciblent des antigènes spécifiques des lymphocytes : l’alemtuzumab (anti-CD52) et le brentuximab vidotin (anti-CD33 couplé au monométhyl auristatine E, un agent anti-mitotique). 45 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 15 : Amélioration de l’efficacité des anticorps par ingénierie. (Adapté de Carter, 2001). L’ingénierie des anticorps permet d’améliorer leur efficacité par de multiples méthodes : amélioration des fonctions effectrices par modifications de la séquence ou de la glycosylation, adressage de molécules cytotoxiques, armement direct par couplage à des cytokines, toxines ou radionuclides, armement direct par anticorps bispécifiques ou immunoliposomes. Le trastuzumab cible le récepteur HER2, un membre de la famille du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR). HER2 est surexprimé dans 30% des cancers du sein ainsi que dans d’autres tumeurs épithéliales, notamment celles des ovaires, de la prostate, des poumons et de l’appareil digestif [251, 252]. Le trastuzumab inhibe les mécanismes de signalisation du récepteur HER2 en empêchant son homodimérisation ou son hétérodimérisation et en empêchant le clivage de son domaine extracellulaire [253]. Il favorise également l’élimination des cellules tumorales par le système immunitaire en activant l’ADCC. Un second anticorps anti-HER2, le pertuzumab, a été autorisé en Juin 2012 par la FDA. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Le cetuximab se lie au récepteur EGFR (ou HER1) et empêche son hétérodimérisation ainsi que la fixation de ses ligands [254, 255]. L’EGFR est surexprimé dans de nombreux cancers incluant les cancers du colon, de la tête et du coup, des ovaires et des poumons [256]. L’inhibition des mécanismes de signalisation du récepteur EGFR induite par le cetuximab provoque fréquemment l’arrêt du cycle cellulaire et l’apoptose des cellules tumorales [254, 255]. Le panitumumab est un anticorps humain anti-EGFR également autorisé en utilisation clinique et ayant le même mode d’action que le cetuximab [257]. Trois anticorps actuellement utilisés en oncologie agissent directement sur le microenvironnement tumoral : le bevacizumab, le catumaxomab et l’ipilimumab [258-260]. Le bevacizumab fut le premier inhibiteur d’angiogénèse autorisé en clinique. Il se lie au Vascular Endothelial Growth Factor A (VEGF-A) circulant et l’empêche de se lier à son récepteur [258]. Le catumaxomab est un anticorps bispécifique anti-CD3 et anti-EpCAM qui recrute les lymphocytes T CD3+ au voisinage des cellules tumorales EpCAM+ et favorise de cette manière la réponse anti-tumorale des CTLs [259]. 46 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 5) Anticorps monoclonaux immunomodulateurs L’ipilimumab est un anticorps immunomodulateur autorisé en 2011 par la FDA et l’EMA. Cet anticorps brise la tolérance périphérique des lymphocytes T en antagonisant le récepteur inhibiteur CTLA-4 présent à leur surface, et rétablit ainsi la réponse anti-tumorale des CTLs. L’autorisation de cet anticorps pour une utilisation clinique révolutionna le traitement des mélanomes métastatiques, domaine qui n’avait connu aucune évolution depuis plus d’un demi-siècle et prouva la validité du concept de l’immunomodulation en médecine oncologique [260]. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 L’étude du potentiel thérapeutique en oncologie de nouveaux anticorps immunomodulateurs est actuellement en cours [261]. Parmi ces nouveaux anticorps, on peut citer le dacetuzumab, le GC-1008 et le CT-011. Le dacetuzumab est un agoniste du CD40. L’activation du CD40 augmente la présentation des antigènes par les APC, favorise l’activation des cellules T et possède un effet cytotoxique direct sur les cellules tumorales exprimant ce récepteur. Des résultats encourageant ont été obtenu avec le dacetuzumab lors d’un essai de phase I pour le traitement de lymphomes non-hodgkiniens réfractaires [262]. Il est actuellement en essai de phase II en combinaison avec une chimiothérapie pour le traitement des lymphomes B diffus à grandes cellules [261]. Le GC-1008 cible le TGF-β et est actuellement impliqué dans un essai de phase I pour le carcinome rénal métastatique et dans un essai de phase II pour le mélanome [261]. Enfin, le CT-011, dirigé contre le récepteur inhibiteur PD1, est impliqué dans sept essais de phase II [261]. Le développement de nouveaux anticorps immunomodulateurs modulant les voies de régulation du système immunitaire récemment découvertes, telle que la voie galectine-9/TIM-3, pourrait s’avérer être un enjeu majeur en oncologie. Aucun anticorps monoclonal anti-galectine-9 neutralisant performant n’ayant été décrit à ce jour, la première étape du développement consiste à produire de nouveaux anticorps anti-galectine-9 et à caractériser leurs propriétés. 47 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 OBJECTIFS DE LA THESE L’objectif général de ma thèse consiste à produire de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine-9 et à caractériser leur potentiel diagnostic et thérapeutique. Cet objectif général peut être décomposé en plusieurs objectifs spécifiques : 1) Production de nouveaux anticorps monoclonaux anti-galectine-9 par immunisation tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de souris avec la partie C-terminale de la protéine. 2) Caractérisation de ces anticorps en ELISA, western blot et immunohistochimie. 3) Mise au point de tests fonctionnels in vitro des effets de la galectine-9. 4) Utilisation de ces tests pour déterminer le potentiel de neutralisation de la galectine-9 des nouveaux anticorps. 48 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Article I BMC INFECTIOUS AGENTS AND CANCER « A novel monoclonal antibody for detection of galectin-9 in tissue sections : application to human tissues infected by oncogenic viruses » 49 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 RESUME DE L’ARTICLE I Afin de produire de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine-9, nous avons immunisé plusieurs souris avec la partie C-terminale de la protéine (résidus 191 à 355 de l’isoforme longue). Nous avons obtenu un panel d’hybridomes en fusionnant les lymphocytes de la souris ayant la plus forte réponse à l’immunisation avec des cellules de la lignée Sp2/0. Sept anticorps monoclonaux ayant une forte réactivité avec la galectine-9 en ELISA ont été sélectionnés pour une analyse plus poussée en western blot et immunohistochimie. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Parmi ces anticorps, cinq réagissent avec l’épitope « TPAIPPMMYPHPA » communs aux trois isoformes de la galectine-9 (résidus 210 à 222 de l’isoforme longue) et peuvent être utilisés pour leur détection en western blot. En immunohistochimie, l’anticorps 1G3 permet la détection de la galectine-9 sur coupes de tissus humains d’une manière très sensible et spécifique. 1G3 réagit avec la galectine-9 murine mais aucune cross-réactivité n’a été observée avec les autres membres de la famille des galectines. En utilisant 1G3 en immunohistochimie, nous confirmons l’expression constante et intense de la galectine-9 dans les cellules malignes de carcinome nasopharyngé, avec un marquage à la fois cytoplasmique et nucléaire dans la plupart des échantillons. Elle n’est pas détecté dans la muqueuse saine proche des foyers tumoraux. Nous confirmons également la forte expression de la galectine-9 dans les cellules de Kupffer présentes dans les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite C. Pour la première fois, nous mettons en évidence une expression de la galectine-9 dans les leukocytes infiltrant les tissus hépatiques infectés par le virus de l’hépatite B. De plus, nous observons une expression de la galectine-9 dans les hépatocytes infectés par ces deux virus, ce qui n’avait pas été démontré jusqu’à présent. Ces résultats ont été publiés en 2012 dans le journal BMC Infectious Agents and cancer. 50 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 RESEARCH ARTICLE Open Access A novel monoclonal antibody for detection of galectin-9 in tissue sections: application to human tissues infected by oncogenic viruses Clément Barjon1,2, Toshiro Niki3, Benjamin Vérillaud1, Paule Opolon1, Pierre Bedossa4, Mitsuomi Hirashima3, Stéphanie Blanchin5, Michel Wassef6, Hugo R Rosen7, Anne-Sophie Jimenez1, Ming Wei2 and Pierre Busson1* tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Abstract Background: Galectin-9 is a mammalian lectin which possesses immunosuppressive properties. Excessive production of galectin-9 has been reported in two types of human virus-associated diseases chronic hepatitis C and nasopharyngeal carcinoma associated to the Epstein-Barr virus. The objective of this study was to produce new monoclonal antibodies targeting galectin-9 in order to improve its detection in clinical samples, especially on tissue sections analysed by immunohistochemistry. Methods: Hybridomas were produced through immunization of mice with the recombinant c-terminus part of galectin-9 (residues 191 to 355 of the long isoform) and semi-solid fusion of spleen cells with Sp2/0 cells. Monoclonal antibodies were characterized using ELISA, epitope mapping, western blot and immunohistochemistry. Results: We selected seven hybridomas producing antibodies reacting with our recombinant c-terminus galectin-9 in ELISA. Five of them reacted with the epitope “TPAIPPMMYPHPA” (common to all isoforms, residues 210 to 222 of the long isoform) and stained all three isoforms of galectin-9 analysed by western blot. One of them, 1G3, demonstrated very good sensitivity and specificity when used for immunohistochemistry. Using 1G3, we could confirm the intense and constant expression of galectin-9 by Epstein-Barr virus positive malignant cells from nasopharyngeal carcinomas. In most samples, specific staining was detected in both cytoplasm and nuclei. Galectin-9 was also detected in liver biopsies from patients infected by the human hepatitis C or B viruses with expression not only in inflammatory leucocytes and Kupffer cells, but also in hepatocytes. In contrast, galectin-9 was virtually absent in non-infected liver specimens. Conclusion: The 1G3 monoclonal antibody will be a powerful tool to assess galectin-9 expression and distribution especially in diseases related to oncogenic viruses. Background Galectin-9 is a β-galactoside binding lectin of mammalian origin which possesses two distinct carbohydrates domains linked together by a peptide sequence of 14, 26 or 58 aminoacids depending on the isoform, respectively S, M or L isoform. Galectin-9 holds multiple immunomodulatory properties and an overall predominantly immunosuppressive function. In the context of murine immunity, galectin-9 has been shown to play a key role in a regulatory feed-back essential for a physiological * Correspondence: [email protected] 1 University Paris-Sud 11, CNRS-UMR 8126, Institut de Cancérologie Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France Full list of author information is available at the end of the article termination of the Th1 immune response [1]. CD4+ Th1 lymphocytes produce interferon-gamma which induces galectin-9 production by various cell types including fibroblasts and endothelial cells. Conversely, galectin-9 induces inhibition of CD4+ Th1 lymphocytes, at least in part through stimulation of the Tim-3 receptor. It also induces expansion of regulatory T-cells in mice [2,3]. Recent studies performed in murine systems have provided novel insights about its immunosuppressive functions in the context of viral infections. In mice infected by the herpes simplex virus 1 (HSV1), galectin-9 induces apoptosis of CD4+ Th1 and CD8+ T-lymphocytes [4,5]. Interestingly these immunosuppressive effects have both adverse and beneficial effects © 2012 Barjon et al.; licensee BioMed Central Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0), which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 regarding the pathological consequences of HSV1 infection. Galectin-9 favors HSV1 reactivation in the trigeminal nerve whereas it limits the extent of corneal lesions and neovascularisation in murine experimental herpetic keratitis. Galectin-9 also decreases the intensity of humoral and cellular immune response to RNA viruses like the influenza A virus in another murine experimental system [6]. Although recent data obtained in mouse experimental systems keep bringing new elements concerning the immunosuppressive and regulatory function of galectin-9, the physiological and pathological role of galectin-9 in humans remains poorly documented and controversial. There is evidence that alterations of galectin-9 functions could contribute to auto-immune diseases. For example, the Tim-3 receptor on CD4+ Th1 clones from patients with multiple sclerosis (MS) is defective in its response to galectin-9 [7,8]. Similar results were reported for patients with rheumatoid arthritis and recently autoimmune hepatitis [9,10]. Reciprocally, there is evidence of excessive galectin-9 production in two human diseases associated with oncogenic viruses : nasopharyngeal carcinomas (NPC) associated with the Epstein-Barr virus (EBV) and chronic infection by the hepatitis C virus (HCV) [11,12]. Indeed, recent works have shown the presence of tumor exosomes carrying galectin-9 in the blood of NPC patients. In vitro, NPC exosomes have a direct deleterious effect on several human CD4+ T-cell clones specific of EBV-antigens [11]. Using an ELISA test, we have detected unusually high concentrations of galectin-9 in the blood of patients with chronic hepatitis C, especially those HCV-related hepatocellular carcinomas [12]. It seems that in this context, galectin-9 is produced mainly by Kupffer cells. The same report demonstrates that in vitro recombinant galectin-9 induces expansion of regulatory T cells and apoptosis of HCV-specific cytotoxic T cells whereas it increases the production of pro-inflammatory cytokines from mononuclear cells [12]. Thus, galectin-9 may be a key element in regulating T cell response in the liver and thus in the establishment of viral persistence. Despite the growing number of studies being published on galectin-9, no monoclonal antibody (mab) has yet been recommended for immunohistochemistry. To our knowledge, in previous publications, immunohistochemistry of galectin-9 was only based on polyclonal antibodies [13]. Therefore we have produced a collection of novel antigalectin-9 hybridomas and we have selected one of them – the 1G3 clone - producing a mab highly efficient for staining of tissue sections. Using this antibody, we could observe strong staining of malignant epithelial cells in NPC tissue sections. We could also observe galectin-9 staining of inflammatory leucocytes, Kupffer cells and hepatocytes in liver biopsies from patients with chronic Page 2 of 11 viral hepatitisC and B. This antibody is expected to become useful in a wide range of human diseases, especially those related to oncogenic viruses. Methods Production of anti-galectin-9 monoclonal antibodies The recombinant S and M isoforms of human galectin-9 and the M isoform of murine galectin-9 were produced in E. coli as GST-fusion proteins. Tag-free proteins were purified by affinity chromatography on a lactose-agarose column [17]. The c-terminus galectin-9 (residues 191 to 355 of the galectin-9 long isoform) was produced in E. coli as a GST-fusion protein. The tag-free protein was purified by exclusion chromatography. Immunizations were conducted at PX’Therapeutics (Grenoble, France). Five BALB/c female mice (eight weeks old) were immunized with the recombinant c-terminus galectin-9. Immunizations (40 μg of protein) were administered intraperitoneally at days 0, 22, 37 and 54 with complete Freund’s adjuvant for the first immunization, then with incomplete Freund’s adjuvant for subsequent injections. We performed enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on mice serum to confirm response to galectin-9 immunization, using the same recombinant galectin-9 c-terminus part which was injected into mice. A rabbit polyclonal serum raised against the same portion of galectin-9 was used a positive control. The five immunized mice exhibited a specific and strong immune response against the c-terminus part of galectin-9. Three days after the last boost, the two best responding mice were sacrificed and their splenocytes were collected to use in subsequent liquid or semi-solid fusion with Sp2/0 cells at a ratio of 5:1 and 2:1 respectively. Hybridomas supernatants were assessed in galectin-9 ELISA. The semi-solid fusion was successful and a large collection of monoclonal hybridomas secreting anti-galectin-9 antibodies was obtained. Galectin-9 ELISA for assessment of mouse sera and selection of hybridomas Wells of microtiter plates (Greiner Bio-One, Courtaboeuf, France) were coated with 0.05 M carbonate/bicarbonate buffer (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, France) pH 9.6 containing 50 ng human c-terminus galectin-9 during 1 H at room temperature. After washing with phosphate buffered saline (PBS) containing 0.1% Tween-20 (Euromedex, Souffelweyersheim, France), the wells were saturated with 3% bovine serum albumine (BSA) (SigmaAldrich, St Quentin Fallavier, France) in PBS at room temperature for 1 H. They were then incubated with mouse sera or raw hybridoma supernatants in PBS with 1% BSA at room temperature for 2 H. After a washing step with PBS with 0.1% Tween-20, the anti-galectin-9 antibody level was determined using horseradish peroxidase-coupled Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 (HRP) goat antibodies to mouse IgG (Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) and 3,3’,5,5’ Tetramethylbenzidine (TMB) (Thermo Fisher Scientific, Brebieres, France) as substrate. Microtiter plates were incubated 15 min in the dark under shaking before stopping the reaction with 1 M H2SO4. Then, OD was read at 405 nm and 620 nm using a MultiSkan Ex microplate reader (Thermo Fisher Scientific). Experiments were performed in duplicates. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 ELISA for epitope mapping and oligopeptide competition A panel of 27 oligopeptides representative of the 168 amino-acids from the c-terminus galectin-9 used for mice immunisation was produced. Oligopeptides were 13 amino-acids long, with a 7 amino-acids overlap. For epitope mapping, each peptide was coated in 96-well plate using 100 ng/well during 16 hours at 4 °C. For oligopeptide competition, full length galectin-9 (recombinant S isoform produced in E. Coli) was coated in the same conditions. Wells were saturated in PBS + 0.1% BSA at room temperature during 2 hours, then incubated with purified mouse monoclonal antibodies during 2 hours at room temperature. For oligopeptide competition, 1G3 was tested in parallel with the mab 9S2-3 which targets the n-terminus of galectin-9 [14]. The antibodies were pre-incubated during 2 H at room temperature with control oligopeptide (“ITQTVIHTVQSAP”) or target oligopeptide (“TPAIPPMMYPHPA”) using serial dilutions ranging from 4 μg/ml to 2 ng/ml. Revelation of bound monoclonal antibodies was performed using a peroxidaseconjugated secondary antibody as described in the previous paragraph. Capture of biotinylated galectins on surface-bound antibodies For this assay, we used the following recombinant galectins: the S and M isoforms of human galectin-9, the murine M isoform of galectin-9 and human galectin-1, -2, -3, -4, -8 (M isoform) and −10. Preparation of recombinant galectins and their biotinylation have been already described in previous works [15-17]. 1G3 and control mouse IgG1 antibody (MOPC21 clone) were coated in 96-well plates overnight at 4 °C in assay buffer (PBS-Tween, 2% fetal calf serum (FCS), 0.05% NaN3). Plates were blocked with 5% FCS overnight at 4 °C then washed five times with PBS-Tween. Biotinylated galectins (1 nM) were incubated during 1 H at 37 °C in antibody-coated wells; then plates were washed five times with PBS-Tween. Revelation of captured biotynilated galectins was done by addition of SA-HRP for 1 H at 37 °C. After washing, TMB substrate was added during 2.5 min at room temperature. Reaction was stopped with 1 M phosphoric acid and OD was read at 405 nm and 620 nm. Experiments were performed in duplicates. Page 3 of 11 Cell lines BL2 and REMB1 cells were grown in RPMI 1640 medium (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA) supplemented with 10% FCS. BL2 is an EBV-negative B-cell line derived from a Burkitt’s Lymphoma. REMB1 is a lymphoblastoid cell line (LCL) resulting from in vitro EBVtransformation of B lymphocytes from a normal donor. HeLa cells were cultured in DMEM supplemented with 10% FCS. C15 is an EBV-positive NPC xenograft which was propagated by subcutaneous passages into nude mice [11]. C666-1 cells which are EBV-positive NPC cells were grown in vitro in RPMI 1640 medium supplemented with 25 mM HEPES and 7.5% FCS, in plastic flasks coated with collagen I (Biocoat; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ) [11]. Western blot Cell pellets were solubilized in RIPA buffer (150 mM NaCl, 25 mM Tris–HCl pH 7.5, 5 mM EDTA, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5% NP40, 0.1% SDS) supplemented with the complete protease inhibitor cocktail (Roche Applied Science, Neuilly-sur-Seine, France) and sonicated on ice. Extracts were clarified by centrifugation for 15 minutes at 16 000 g at 4 °C. Protein concentration was assayed by the Bradford method using BioRad protein assay (BioRad, Marnes-la-coquette, France). Cell protein extracts were separated on 12% polyacrylamide gels in standard conditions. Gels were blotted on PVDF membranes (Immobilon-P; Millipore, Molsheim, France) then blocked during one hour with TBS containing 3% non-fat milk powder and 4% glycine. Membranes were incubated overnight with mouse monoclonal antibodies at the concentration of 2 μg/ml in blocking solution. Specific protein bands were visualized using goat antimouse HRP–conjugated secondary antibodies and revealed by chemiluminescence using Immobilon Western kit (Millipore, Molsheim, France). Clinical specimens Thirteen samples from head and neck carcinomas were selected from a retrospective collection of biopsies collected for diagnosis purpose at Lariboisière hospital (Paris, France). This set of biopsies included ten nasopharyngeal carcinomas and three carcinomas of the oropharynx and oral cavity. Nine liver samples were selected from a retrospective collection obtained following partial or complete hepatectomy at Beaujon hospital (Paris, France). This set of surgical samples included three specimens infected by HCV, three specimens infected by the hepatitis B virus (HBV) and three specimens of uninfected patients having undergone partial hepatectomy for benign tumors. All these samples were obtained and processed according to Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 guidelines of Lariboisière and Beaujon hospitals institutional review boards. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Immunohistochemistry Biopsies from head and neck carcinomas and surgical liver samples were initially fixed in paraformaldehyde 4% and paraffin-embedded. Prior to galectin-9 staining, tissue sections were dewaxed with xylene and ethanol and rehydrated. Antigens were unmasked using a pH 6.0 citrate solution at 98 °C during 30 min. After adequate washing steps, sections were incubated 10 min with 3% H2O2, washed again and saturated with blocking serum (Biogenex, MM France, Francheville, France) for 1 hour. Sections were then incubated with mouse monoclonal antibodies diluted at 2 μg/ml in blocking serum for 1 hour at room temperature. Visualization was achieved by exposing sections to a goat anti-mouse HRP 1:50 (Southern Biotech, Clinisciences, Nanterre, France) during 30 min at room temperature then adding DAB substrate. The slides were counterstained with Mayer’s hematoxylin diluted at 1:2 during 1 min at room temperature. Results Preparation and selection of hybridomas Five mice were immunized with the recombinant cterminus portion of galectin-9 (residues 191 to 356 of the long isoform). Their immune response was monitored by serum ELISA on recombinant c-terminus galectin-9. As a positive control we used a previously described rabbit polyclonal serum raised against the same portion of galectin-9 [11]. Splenocytes were collected from the two best responding mice three days after the last c-terminus galectin-9 injection. Two fusions were performed, one with subsequent cloning in classical conditions (liquid medium in microwell plates) and the other in semi-solid medium. Only the fusion in semi-solid medium was successful. A panel of thirtynine hybridomas from which culture supernatants were positive in ELISA screening was obtained. Seven were selected for their abundant secretion of immunoglobulins and high reactivity with the c-terminus galectin-9 in ELISA (Figure 1A). Determination of antibodies epitopes Monoclonal antibodies produced by the seven selected hybridomas were subjected to epitope mapping, using a panel of oligopeptides (P1 to P27) representative of the 168 amino-acids from the c-terminus part of galectin-9. Five monoclonal antibodies (1G3, 1E12, 2E6, 1F4 and 1D8) were found to recognize the same linear epitope, with 1G3 consistently having the highest reactivity. The amino-acid sequence of this preferred epitope is “TPAIPPMMYPHPA” which corresponds to peptide P4 Page 4 of 11 and covers the end of the linker peptide and the beginning of galectin-9 c-terminus part (Figure 1B). This sequence exists in all three isoforms of galectin-9 (aa 166 to 178 in the S-isoform, aa 178 to 190 in the M-isoform, aa 210 to 222 in the L-isoform) suggesting that those antibodies can react with all galectin-9 isoforms. Epitopes of 2E12 and 2D12 antibodies couldn’t be determined in this experiment. Therefore these antibodies may react with a conformational epitope. To confirm 1G3 specificity toward the P4 peptide, a competitive ELISA was performed using serial dilution of a control peptide and P4 peptide. 9S2-3 monoclonal antibody, which targets the n-terminus part of galectin-9, was used as control antibody [14]. As shown in Figure 1C, only the peptide P4 was able to reduce 1G3 binding to galectin-9 S isoform in a concentration-dependent manner. Performance in western blot Protein extracts were prepared from various cell lines with or without endogenous expression of galectin-9. In addition, HeLa cells were short-term transfected with expression plasmids coding for each galectin-9 isoform (S, M or L). Protein extracts from each cell category were analysed by western blot using our anti-galectin-9 monoclonal antibodies. All seven antibodies were able to detect galectin-9 including 2E12 and 2D12 (data not shown). However, the strongest specific signals were consistently obtained using the 1G3 monoclonal antibody (Figure 2). All three isoforms were detected by 1G3 in HeLa cells transfected with the corresponding plasmids. A low amount of the S- and M-isoforms were detected in wild-type HeLa cells. All isoforms were detected in protein extracts from both C15 and C666-1 NPC xenografts. REMB1 cells (LCL) expressed mainly the M-isoform and a low amount of the L-isoform, while no S-isoform could be detected in this experiment. No galectin-9 was detected in BL2 cells (EBV-negative human B-cells derived from an EBV-negative Burkitt’s lymphoma) in agreement with one of our previous report [11]. Determination of 1G3 cross-reactivity Galectin-9 is a member of a large family of proteins which share some structural properties and conserved aminoacids. Therefore, it was important to verify that the 1G3 antibody did not cross-react with other members of the galectin family. A capture assay was performed using 1G3 or control mouse IgG bound to ELISA plates to assess their reactivity with biotynilated human galectin-1, -2, -3, -4, -8 (M isoform) and galectin-10. The M isoform of murine galectin-9 was also included in this experiment. Recombinant human galectin-9 isoforms S and M were used as positive controls. According to the data shown in Figure 3, 1G3 captures the S and M isoforms of human Page 5 of 11 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 Figure 1 Selection of anti-galectin 9 hybridomas and epitope mapping of the corresponding monoclonal antibodies. A) Seven hybridomas were selected for their performance in ELISA against recombinant c-terminus galectin-9 (2E12, 1E12, 2E6, 1F4, 1G3, 1D8, 2D12). Their crude supernatants gave about the same reactivity as the undiluted mouse serum sample taken prior to spleen collection (mouse polyclonal). Other hybridomas such as 1H12 and 2F4 were set aside due to their lower reactivity with c-terminus galectin-9 in ELISA. B) Mapping of the 1G3 epitope (TPAIPPMMYPHPA) contained in the three natural isoforms of galectin-9. This epitope is close to the n-terminus extremity of the recombinant c-terminus galectin-9 used for mouse immunization. C) Selective inhibition of 1G3 binding to the recombinant S-isoform of human galectin-9 by the P4 oligopeptide (TPAIPPMMYPHPA). Plates were coated with human galectin-9 S. Subsequent binding of the mabs 1G3 and 9S2-3 were done after pre-incubation with the P4 peptide or a control peptide. The binding of 1G3 to the galectin-9 is selectively inhibited by the P4 peptide at concentrations above 0.5 μg/ml. In constrast the binding of 9S2-3 is not affected. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 Figure 2 Western blot detection of galectin-9 isoforms using the 1G3 monoclonal antibody. A low amount of S and M galectin-9 isoforms are present in wild-type HeLa cells. These isoforms are readily detected following transfection with the appropriate expression plasmids. The L-isoform is expressed at a lower abundance than the two other forms. The three endogenous isoforms are detected in the protein extracts from the C15 and C666-1 NPC xenografts. The EBVpositive B-cell line REMB1 expresses a high amount of the M-isoform and a very low amount of L-isoform, however no S-isoform could be detected. In contrast with REMB1 cells, the BL2 cells derived from an EBV-negative B-cell lymphoma have no detectable galectin-9. The faint background bands visible after long exposure do not match with any galectin-9 isoform. galectin-9 as well as the murine galectine-9. In contrast, it does not cross-react with other human galectins. Performance of 1G3 monoclonal antibody in immunohistochemistry The seven mabs were assessed on paraffin-embedded cell pellets, using BL2 and REMB1 cells as negative and positive references, respectively. Again the 1G3 antibody Page 6 of 11 was the most efficient antibody with the best signal/ background ratio. It was selected for subsequent investigation of galectin-9 expression in various tissue specimens. As shown on Figure 4 and Table 1, galectin-9 expression was detected in malignant cells from all ten NPC specimens. It was consistently strong and homogeneous through the malignant cell population. Cytoplasmic staining was constant, coexisting in all but one case with nuclear staining in at least a fraction of the cells. Weaker scattered staining of stromal leucocytes was detected in six of ten cases. Tissue sections from three specimens of squamous cell carcinomas (SCC) of the oropharynx and oral cavity were also stained with 1G3 (Figure 4 and Table 1). In one of them, a tonsil SCC containing a strong lymphoid infiltrate, substantial galectin-9 staining was seen in malignant cells. In contrast, malignant cells were completely negative in tissue sections from other SCCs. For nine of these head and neck carcinoma specimens (NPC and non-NPC), fragments of non-malignant epithelium could be observed. In two cases, the epithelium was of the secretory type including one specimen with positive staining in about one third of the epithelial cells. In the seven other specimens, the epithelium was of the pluristratified Malpighian type with absence of galectin-9 staining in all but one case. Finally, the 1G3 monoclonal antibody was tested on nine liver tissue samples infected by HCV or HBV or uninfected (Figure 5 and Table 2). Galectin-9 was consistently detected in sections from infected but not from uninfected liver specimens. At a low magnification (X10, Figure 3 Demonstration of the specificity of 1G3 binding to galectin-9 by a capture ELISA assay. 1G3 and irrelevant mouse IgG were adsorbed on an ELISA plate and then incubated with various types of biotynilated human galectins (hGAL 1,2,3,4,7,8 and hG9 and hG10) or the M-isoform of murine galectin-mG9. Both human and murine galectin-9 are captured by 1G3 in contrast with other galectins which do not exhibit significant binding to 1G3. Page 7 of 11 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 Figure 4 Detection of galectin-9 in tissue sections from nasopharyngeal carcinomas and other head and neck carcinomas. Galectin-9 is detected by immunohistochemistry using the 1G3 mab. A) Absence of galectin-9 staining on a section of a paraffin-embedded pellet of BL2 cells (X200). B) Intense albeit heterogenous galectin-9 staining on a section of a paraffin-embedded pellet of REMB1 cells (X100). C) NPC tumor biopsy. (Table 1, patient #2, undifferentiated non-keratinizing) (X100). Intense galectin-9 staining is seen in the nests of malignant cells which are clearly separated from the abundant lymphoid stroma. In addition, a weaker staining is seen in a large number of stromal cells. D) NPC tumor biopsy (Table 1, patient #10, undifferentiated non-keratinizing) (X100). Galectin-9 staining is only seen in spans of epithelial cells which are distinct from the lymphoid stroma. E) NPC tumor biopsy (Table 1, patient #1, undifferentiated non-keratinizing) (X100). Malignant cells are intermingled with infiltrating leucocytes. Galectin-9 is detected in both malignant and infiltrating cells. In contrast, it is completely undetectable in the nonmalignant epithelium. F) Oropharynx squamous cell carcinoma (Table 1, patient #13) (X100). Complete absence of galectin-9 staining in malignant cells. X50 or X100), galectin-9 was not visible in hepatocytes. However it was visible in scattered polymorphic cells suggestive of inflammatory leucocytes and Kupffer cells. Restricted intense staining of cells with a morphology typical of Kupffer cells was observed in one case (patient #2) consistent with our previous report [12]. Scattered positive cells were also seen in all three specimens infected by HBV; it was not restricted to Kupffer cells but was seen in cells of various morphology probably various types of leucocytes. One additional, unexpected finding was made at a high magnification (X400). Delicate, punctate staining was visible in a large proportion of the hepatocytes in all six virus-infected liver samples. This punctate staining was almost identical for specimens infected by HCV or HBV. However it was not visible in sections from non-infected liver samples. Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 Page 8 of 11 Table 1 Detection of galectin-9 in biopsies from head and neck carcinomas tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Patient Origin Gender/ Age Tumor site/Histological Type Clinical stage Galectin-9 staining Malignant cells Stroma cells Adjacent mucosa (epithelium type) 1 Tunisia M/48 NPC/UNK* T4N3bM1 ++ + - (malpighian) 2 Romania F/34 NPC/UNK T2bN0M0 ++ + - (malpighian) 3 Cameroon M/62 NPC/UNK T4N2M0 ++ - + (secretory) 4 France M/63 NPC/UNK T4N0Mx ++ + n/a 5 France M/62 NPC/UNK T3N2M0 ++ + n/a 6 Portugal F/84 NPC/UNK T4N2M0 ++ + n/a 7 Algeria M/40 NPC/UNK T4N2M0 ++ - + (malpighian) 8 Turkey M/57 NPC/UNK T1N0M0 ++ + n/a 9 China F/31 NPC/UNK T4N0M0 ++ - - (malpighian) 10 France M/48 NPC/UNK T1N2M0 ++ - - (secretory) 11 France M/62 Tonsil/Infiltrating SCC** T2N1M0 + + - (malpighian) 12 France F/82 Tongue/Differentiated SCC T2N0M0 - + - (malpighian) 13 France M/64 Pelvi-lingual furrow/Differentiated SCC T2N1M0 - + - (malpighian) * NPC/UNK : nasopharyngeal carcinoma/undifferentiated non-keratinizing, ** SCC : squamous cell carcinoma, ++ : intense and homogeneous galectin-9 staining, + : moderate or scattered galectin-9 staining, - : absence of galectin-9 staining, n/a : not applicable (no segment of non malignant mucosa observed in the tissue section). Discussion Galectin-9 has complex immunomodulatory properties with action on effector cells of both innate and adaptative immunity. It induces secretion of pro-Th1 (interferon-gamma) and inflammatory cytokines by monocytes and NK-cells whereas it has an inhibitory effect on NK-cell cytotoxicity [18,19]. On the other hand it is inhibitory for mature CD4+ Th1 cells whereas it favors expansion of regulatory T-cells [1,12]. Overall galectin-9 appears to have pro-inflammatory and immunosuppressive functions. This is consistent with its role of facilitation for various types of viral infections in murine experimental systems [4,6]. Out of seven monoclonal antibodies directed to the c-terminus of galectin-9, 1G3 was the best suited for immunohistochemistry. The epitope mapping and competition assay provide evidence that its target epitope is included in the following aminoacid sequence TPAIPPMMYPHPA (residues 210 to 222 of the long isoform). The ELISA capture assay demonstrates that it cross-reacts with the murine galectin-9. 1G3 also reacts with murine galectin-9 analysed by western blotting (data not shown). This is not surprising because murine galectin-9 contains in its linker domain an amino-acid sequence which is highly homologous to its human target (residues 208 to 220 of murine galectin-9 long isoform, “TPGIPPVVYPTPA”). In contrast, 1G3 does not react with human galectin-1, 2, 3, 4, 8 and 10 in the same assay. Using 1G3 to analyse clinical specimens, we have confirmed that galectin-9 is abundant in two types of human tissues infected by oncogenic viruses, nasopharyngeal carcinoma and liver chronically infected by HCV or HBV. Galectin-9 was detected in malignant cells from all nasopharyngeal carcinoma specimens. Sporadic staining was also seen in some tumor infiltrating leucocytes. These finding are consistent with our initial report on galectin-9 in NPC [20]. However, in contrast with this initial report, galectin-9 was rarely detected in nonmalignant mucosa. This is probably due to the fact that the polyclonal antibody used for this previous study was causing more background staining than the purified 1G3 monoclonal antibody. Galectin-9 nuclear staining was observed at least in a fraction of the cells in all but one NPC case. Nuclear distribution of galectin-9 has been recently reported in a completely different setting, precisely in microglia/macrophages of active lesions of MS stained with a rabbit polyclonal anti-galectin-9 [13]. In contrast, in chronic inactive MS lesions, galectin-9 was entirely localized in the cytoplasm. To our knowledge, a specific role for nuclear galectin-9 has not been yet described. Keeping in mind the immunosuppressive functions of galectin-9, it will be interesting to know whether relative galectin-9 abundance will be predictive of NPC tumor response to various therapeutic modalities especially adoptive immunotherapy [21,22]. Staining galectin-9 in liver specimens has resulted in confirming results and some unexpected findings. First, we have confirmed that galectin-9 is undetectable or at very low abundance in non-infected liver parenchyma. In contrast, it is detectable in HCV-infected liver tissue Page 9 of 11 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 Figure 5 Detection of galectin-9 in liver tissue sections. A, B) Normal liver tissue next to an adenoma (Table 2, patient #8, X100 and X400 respectively). Complete absence of galectin-9 staining. C, D) HCV-related liver cirrhosis next to a carcinoma (Table 2, patient #2, X100 and X400 respectively). Prominent staining is visible in Kupffer cells which are characterized by a flat triangle shape and their close association with sinusoid vessels. At high magnification, delicate, punctate staining is visible in a large number of hepatocytes (black arrows). E and F) HBV-related liver cirrhosis next to a carcinoma. (Table 2, patient #5) Predominant staining in various types of leucocytes often with a round shape. At high magnification, delicate punctate staining is visible in a large number of hepatocytes (black arrows). sections. It is noteworthy that it is also detectable in liver samples infected by HBV. In addition to Kupffer cells, it seems to be often expressed by various types of inflammatory leucocytes. Surprisingly, it is also detected in a large proportion of hepatocytes in all infected samples under the form of small punctuations localized in the cytoplasm and visible only at high magnification (X400). This means that although the amount of galectin-9 per cell is relatively low in hepatocytes, altogether these hepatocytes probably represent a major source of galectin-9 for the organisms of HCV- or HBV-infected individuals. These observations raise a series of questions to be addressed in future experiments. It will be interesting to know whether the plasma concentration of galectin-9 is increased for patients chronically infected by HBV as reported by us for patients infected by HCV [12]. Another question will be to determine to what extent the intensity of galectin-9 expression in chronically infected livers correlates with the severity of tissue lesions and the risk of hepatocarcinoma. One may also wonder whether galectin-9 abundance in tissue sections correlates with its concentration in peripheral blood. Barjon et al. Infectious Agents and Cancer 2012, 7:16 http://www.infectagentscancer.com/content/7/1/16 Page 10 of 11 Table 2 Detection of galectin-9 in liver specimens from infected (HCV, HBV) or non-infected patients Patient 1 Gender/Age Medical History M/54 Viral diagnosis Histological diagnosis M/66 Hepatocytes HCV cirrhosis with transformed foci - ++ Chronic HCV infection Micronodular cirrhosis associated to a carcinoma + + (aspect of Kupffer cells) ++ Alcoholism tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Leucocytes or related cells Chronic HCV infection Alcoholism 2 Galectin-9 staining 3 M/61 Chronic HCV infection Micronodular cirrhosis with transformed foci + + 4 M/67 Chronic HBV infection Macronodular cirrhosis associated to a carcinoma + + 5 M/50 Chronic HBV infection Hepatic fibrosis associated to a carcinoma ++ ++ 6 M/30 Chronic HBV infection Liver tissue with minimal lesions next to a non-malignant nodule (focal nodular hyperplasia) + ++ 7 F/32 No infection Normal liver tissue next to a non-malignant nodule (focal nodular hyperplasia) - - 8 F/20 No infection Normal liver tissue next to an adenoma - - 9 F/28 No infection Normal liver tissue next to an adenoma (with steatosis) - - ++ : homogeneous galectin-9 staining, + : mild or scattered galectin-9 staining, - : absence of galectin-9 staining. Conclusion We report the performances of 1G3 a novel mab useful to assess not only the abundance and tissue distribution of galectin-9, but also its cytoplasmic and nuclear distribution. Future aims will be to investigate whether galectin-9 abundance in tissue sections is predictive of responses to various tumor modalities, especially adoptive immunotherapy. Regarding chronic hepatitis B and C, it will be useful to detemine whether galectin-9 abundance correlates with disease severity and correlates with the risk of hepatocarcinoma. Abbreviations BSA: Bovine serum albumine; EBV: Epstein-Barr virus; ELISA: Enzyme-linked immunosorbent assay; FCS: Fetal calf serum; HBV: Hepatitis B virus; HCV: Hepatitis C virus; HRP: Horseradish peroxydase; HSV1: Herpes simplex virus 1; LCL: Lymphoblastoid cell line; mab: Monoclonal antibody; MS: Multiple sclerosis; NPC: Nasopharyngeal carcinoma; PBS: Phosphate buffered saline; SCC: Squamous cell carcinoma; Tim-3: T cell Ig and Mucin domain 3; TMB: 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidine. Competing interests The authors declare that they have no competing interests. Authors’ contributions CB performed characterization of monoclonal antibodies by ELISA, western blotting, epitope mapping and competitive ELISA. TN has provided the gal9-CT plasmid construct and the polyclonal gal-9-CT antibody and has performed biotinylated galectins ELISA. SB has supervised the production of hybridomas. BV and ASJ have provided tumor cell protein extracts. MWa, PBe and BV have provided pathological samples for immunohistochemistry. PO has supervised the procedures of immunohistochemistry. PO, CB and PBu have analysed and interpreted stained tissue sections. MWe, HR and MH were involved in the design of the study and preparation of the manuscript. CB and PBu designed and coordinated the study, and drafted the manuscript. All authors read and approved the final manuscript. Acknowledgements This work was supported by the Eureka grant Oligoclonics (E ! 3942). Clément Barjon was supported by the « Association Nationale de la Recherche et la Technologie » (ANRT) and the « Association pour la Recherche contre le Cancer » (ARC). Author details 1 University Paris-Sud 11, CNRS-UMR 8126, Institut de Cancérologie Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France. 2Cellvax, Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort cedex, France. 3Department of Immunology and Immunopathology, Faculty of Medicine, Kagawa University, Kagawa 761-0793, Japan. 4Département de Pathologie, INSERM U773, Hôpital Beaujon, Université Paris-Diderot, 92110 Clichy, France. 5Px’ Therapeutics, 38040 Grenoble cedex 9, France. 6Département de Pathologie, Hôpital Lariboisière, Université Paris-Diderot, 75475 Paris cedex 10, France. 7 Department of Medicine, Division of Gastroenterology & Hepatology, University of Colorado School of Medicine, Aurora, CO, USA. Received: 27 March 2012 Accepted: 29 June 2012 Published: 17 July 2012 References 1. 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Cancer Res 2012, 72:1116–1125. doi:10.1186/1750-9378-7-16 Cite this article as: Barjon et al.: A novel monoclonal antibody for detection of galectin-9 in tissue sections: application to human tissues infected by oncogenic viruses. Infectious Agents and Cancer 2012 7:16. Submit your next manuscript to BioMed Central and take full advantage of: • Convenient online submission • Thorough peer review • No space constraints or color figure charges • Immediate publication on acceptance • Inclusion in PubMed, CAS, Scopus and Google Scholar • Research which is freely available for redistribution Submit your manuscript at www.biomedcentral.com/submit tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Article II (EN PREPARATION) « Monoclonal antibodies neutralizing human galectin-9 : comparative assessment using various biological assays » 62 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 RESUME DE L’ARTICLE II La galectine-9 est une lectine animale principalement exprimée dans un contexte inflammatoire et possèdant des propriétés à la fois inflammatoires et immunosuppressives. Elle induit la production de cytokines inflammatoires par les cellules du système immunitaire inné tandis qu’elle induit l’apoptose des lymphocytes Th1 CD4+ et favorise l’expansion des lymphocytes Treg. Les propriétés immunomodulatrices de la galectine-9 dépendent en grande partie de son interaction avec le récepteur TIM-3. Cependant, ces deux molécules interagissent chacune avec d’autres protéines et dans plusieurs contextes la responsabilité de l’interaction galectine-9/TIM-3 n’a pas été formellement démontrée. En tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 dehors de l’anticorps 9M1-3 utilisé pour la neutralisation de la galectine-9 dans un dispositif expérimental très précis et difficile à reproduire, il n’existait pas d’anticorps neutralisant de la galectine-9 performant. C’est pourquoi nous avons entrepris l’analyse comparative de plusieurs anticorps monoclonaux anti-galectine-9 dans des tests in vitro ayant pour cible deux lignées de lymphomes T humains, Jurkat et MOLT-4. L’activité de neutralisation de deux anticorps que nous avons produits, 1G3 et 2E12, est comparée à celle de 9M1-3 et d’un anticorps commercial encore jamais utilisé pour des tests de neutralisation, l’ECA-42. L’anticorps 2E12 bloque la fixation de la galectine-9 au récepteur TIM-3 dans un test acellulaire, au contraire d’1G3. Les anticorps 2E12 et ECA-42 neutralise complètement l’apoptose induite par la galectine-9 sur cellules Jurkat et MOLT-4, tandis que 9M1-3 neutralise partiellement cette activité. 1G3 ne possède pas d’activité neutralisante dans ce test. 2E12 neutralise également l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat. L’utilisation d’anticorps bloquant anti-TIM-3 ne parvient pas à bloquer ces effets, ce qui suggère que ceux-ci sont indépendant de TIM-3. Nous avons également caractérisé par microscopie électronique les effets de la galectine-9 et de son bloquage par 2E12 sur les cellules Jurkat. Cet article est actuellement en préparation. 63 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Monoclonal antibodies neutralizing human galectin-9 : comparative assessment using various biological assays Clément Barjon1,5, Olivier Dellis2, Toshiro Niki3, Sylvie Souquère4, Gérard Pierron4, AnneSophie Pailhes-Jimenez1, Ming Wei5, Pierre Busson1 1 University Paris-Sud 11, CNRS-UMR 8126, Institut Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France. 2 University Paris-Sud 11, UMR-S Inserm, Batiment 440/443, rue des Adèles, 91405 Orsay, tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 France. 3 Department of Immunology and Immunopathology, Faculty of Medicine, Kagawa University, Kagawa 761-0793, Japan. 4 CNRS UMR 8122, Institut Gustave Roussy, 114 rue Edouard Vaillant, 94805 Villejuif cedex, France. 5 Cellvax, Ecole Nationale Vétérinaire d’Alfort, 7 avenue du Général de Gaulle, 94704 Maisons-Alfort cedex, France. [email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected] ; [email protected] * Correspondence : [email protected] ABSTRACT Galectin-9 is a mammalian lectin which is mainly expressed in an inflammatory context which possesses both pro-inflammatory and immunosuppressive properties. It induces production of inflammatory cytokines by cells of the innate immune system whereas it induces apoptosis of Th1 CD4+ cells and promotes expansion of T regulatory cells. Immunomodulatory effects of galectin-9 are mostly dependent on its interaction with the TIM-3 receptor. However, galectin-9 and TIM-3 both interact with other molecules and for many cellular targets it is still unclear whether the effects of galectin-9 are dependent on TIM-3 or another type of receptor. Published data on antibodies neutralizing galectin-9 has tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 remained scarce so far, although they could prove useful to investigate galectin-9/TIM-3 pathway involvement in those cellular targets. Therefore, we undertook to investigate the neutralizing activity of several anti-galectin-9 mabs, including two recently developped antibodies. We here report that the novel antibody “2E12” is able to block galectin-9/TIM-3 interaction as well as inhibit galectin-9-induced cytosolic calcium release and apoptosis, which were both TIM-3 independent effects. On the basis of these observations, the 2E12 antibody is likely to become a powerful tool to study both TIM-3 dependent and TIM-3 independent functions of soluble galectin-9. INTRODUCTION Galectin-9 is a mammalian lectin with a selective affinity for the galactosyl residues of glycoproteins and glycolipids. It has two non-homologous Carbohydrate Recognition Domains (CRD) of about 130 amino acids each which are connected by a linker peptide. In humans, galectin-9 exists in three isoforms, long (L), medium (M) and short (S) that differ only in the length of the linker peptide (58, 26 and 14 amino-acids respectively). Galectin-9 may be localized in the cytosol, in the internal or/and plasma membranes and also in the nucleus [1-3]. It can be secreted into the extracellular medium following pathways which are not fully understood. It carries signaling functions both intracellular (in the manner of a tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 membrane receptor) and extracellular (in the manner of a cytokine) [4-6]. Outside an inflammatory context, galectin-9 is weakly expressed in most human tissues. Its expression increases under the influence of pro-inflammatory cytokines such as Interferon-γ (IFN-γ) and Interleukin-1 β (IL-1 β) [7, 8]. Cells producing galectin-9 belong to diverse tissues and systems including the immune system (T cells, macrophages), as well as endothelial cells, fibroblasts and epithelial cells from various organs [7, 9-13]. Galectin-9 generates both pro-inflammatory and immunosuppressive effects in the extracellular environment [14, 15]. It induces the production of inflammatory cytokines by monocytes, dendritic cells, NK cells and to a lesser extent T cells [15-17]. Its immunosuppressive action results - among others - from its inhibitory effects on CD4 + Th1 and its stimulatory effects on regulatory T-cells (Treg) [12, 14, 18]. The galectin-9/TIM-3 interaction is suspected to promote the establishment of the exhausted phenotype of CD8+ T cells in several chronic viral infections [19-22]. Galectin-9 is expressed at a high level in various types of human tumoral or pretumoral conditions. We have demonstrated its consistent intense expression in nasopharyngeal carcinomas (NPC) associated to the Esptein-Barr virus (EBV) [1, 5]. Later on, we and others have demonstrated its production by Kupffer cells in HCV-associated carcinomas [12]. More recently, using a novel mab highly performant in immunohistochemistry, we have shown that it is expressed not only by Kupffer cells but also by the hepatocytes themselves in both HCV- and HBV-infected liver tissues [3]. Expression of galectin-9 has also been reported in non virus-associated carcinomas such as melanoma and breast carcinoma cells [23, 24]. Immunosuppressive and inflammatory effects of galectin-9 depend to a large extent on the interaction of galectin-9 with the TIM-3 receptor at the surface of target T cells. However, galectin-9 has other receptors than TIM-3, for example the membrane enzyme Protein Disulfide Isomerase (PDI) involved in opening / closing protein disulfide bridges [25]. It can also bind lipid-associated glycans, for exemple the Forssman and the Thomsen– Friedenreich antigens which are glycolipids preferentially expressed on malignant cells [26, 27]. Conversely, the receptor TIM-3 has other ligands than galectin-9 especially phosphatidyl-serine (a phospholipid present at the internal face of the plasma membrane tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 switching to the external face in case of apoptosis) and HMGB1 (a DNA-binding protein released in the extracellular medium in the context of cell necrosis) [28, 29]. For many cellular targets, including Treg, it is unclear whether the effects of galectin-9 are dependent on TIM-3 or another type of receptor [17]. Although it is now obvious that extracellular galectin-9 has major functions in cell communications, especially in the immune system, published data on antibodies neutralizing galectin-9 has remained scarce. In a previous publication, we have reported neutralizing activity for a monoclonal antibody (mab) called 9M1-3 [30]. However, this activity was observed in an assay based on very specific cell targets, namely EBV-specific CD4 T cell clones expanded in the presence of recombinant EBV proteins. In addition, the neutralizing activity of 9M1-3 had not been assessed comparatively to other galectin-9 specific antibodies. Therefore, we undertook to investigate the neutralizing activity of several anti-galectin-9 mabs, including 9M1-3 as a positive control and two recently developped antibodies, in several types of in vitro assays. We here report that two mabs, including one of our novel antibodies, “2E12”, were able to prevent galectin-9 binding to TIM-3 in a cell-free assay. Additionally, they were able to inhibit galectin-9-induced cell death in two human T cell lines, as well as galectin-9-induced cytosolic calcium release in Jurkat cells in the case of 2E12. Both effects were not inhibited using TIM-3 blocking antibodies, suggesting that they were TIM-3 independent. On the basis of these observations, the 2E12 antibody is likely to become a powerful tool to study both TIM-3 dependent and TIM-3 independent functions of soluble tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 galectin-9. MATERIAL AND METHODS Blocking of galectin-9/TIM-3 interaction Soluble mouse TIM-3 (mTIM3-fc) was coated in 96-wells plates at 1 µg/ml. Biotinylated galectin-9 was added (30 ng/ml) with or without anti-galectin-9 monoclonal antibodies (range of 0.01 µg/ml to 10 µg/ml) : 9M1-3 from GalPharma (Kagawa, Japan) ; ECA-42 from MBL (Nagoya, Japan) ; 1G3 and 2E12 which were developped in our laboratory. Rabbit polyclonal anti-galectin-9 antibody (poly-9CT) and lactose (20 mM) were used as positive control of galectin-9/TIM-3 interaction blocking. Irrelevant mouse and rabbit immunoglobulins were used as negative control. Detection of biotinylated galectin-9 binding tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 to mTIM3-fc was performed using streptavidin coupled to horseradish-peroxydase. Assay was carried out at room temperature, in duplicate. Cell lines Jurkat and MOLT-4 cells obtained from American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) were grown in RPMI 1640 medium (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, USA) supplemented with 10% foetal calf serum (FCS) at 37°C in a 5% CO2 humidified atmosphere. For experiments carried out in serum free medium, Hybridoma-SFM also from Gibco was used in place of RPMI 1640. Flow cytometry analysis For apoptosis assays, Jurkat cells (1 x 105 cells in a 96-wells plate) were treated with recombinant human galectin-9 (short isoform) at 30 nM (1 µg/ml) during 6H in serum free medium. MOLT-4 cells were treated in the same conditions during 24H in FCSsupplemented medium. Galectin-9 was preincubated with or without anti-galectin-9 (9M1-3, ECA-42, 1G3 and 2E12) or anti-TIM-3 (2E2 from Biolegend (San Diego, USA) and 344823 from R&D systems (Minneapolis, USA) monoclonal antibodies (10 µg/ml) during 30 min at 37°C. Lactose (5 mM) and irrelevant mouse immunoglobulin were used as positive and negative control of galectin-9 neutralisation, respectively. Treated cells were washed with PBS supplemented with lactose then resuspended in Annexin V buffer. Annexin V-APC was added to the solution then the mixture was incubated 15 min in the dark at room temperature. Propidium iodide was added just before the analysis. Experiments shown are representatives of at least three experiments. For staining of surface membrane-bound galectin-9, Jurkat cells were incubated with primary anti-galectin-9 antibodies (poly-9CT, 9M1-3, ECA-42, 1G3 and 2E12 ; 5 µg/ml) or mouse irrelevant immunoglobulin for 1H at 4°C, then washed in ice-cold PBS and incubated 30 min at 4°C with donkey anti-rabbit antibody or goat anti-mouse antibody both coupled to phycoerythrin (PE). Analysis were performed with C6 flow cytometer from Accuri. Calcium mobilisation analysis The intracellular Ca2+ concentration of Jurkat cells was recorded by a fluorimetric tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 ratio technique. The fluorescent indicator Indo-1 was loaded by incubating the cells at room temperature with 4 µM Indo-1-AM (Invitrogen/Molecular Probes, Eugene, USA). Cells were resuspended in Hepes Buffer Saline (HBS) medium without CaCl2, then treated with galectin-9 (30 nM or 60 nM) with or without preincubation with 2E12 anti-galectin-9 antibody (2E12, 5 µg/ml or 10 µg/ml) or anti-TIM-3 antibodies (2E2 and 344823, 10 µg/ml). To determine the implication of Store-Operated Calcium Entry (SOCE) channels, cells were with 2-APB, an IP3 receptor inhibitor. Intracellular Ca2+ concentrations were calculated following the method already described by Dellis and collaborators [31]. Electron microscopy analysis Jurkat cells were treated with 60 nM galectin-9 (short isoform) during 3H with or without preincubation with 2E12 antibody (10 µg/ml), lactose (5 mM) or irrelevant mouse immunoglobulin. After treatment, cells were washed in PBS supplemented with lactose and pellets were fixed with 1.6% glutaraldehyde (Taab Lab Equip Ttd, Reading, UK) for 1H at 4°C. For visualization of cells ultrastructure, fixed pellets were rinsed for 1H in ice-cold phosphate buffer, post-fixed with 2% aqueous osmium tetroxide (Pelanne Instruments, Toulouse, France) and dehydrated in increasing concentrations of ethanol prior to Epon embedding. Ultrathin sections were cut with a Reichert Ultramicrotome III (Reichert, Depew, NY) and counterstained with uranyl acetate and lead citrate before being observed with a Tecnai Spirit transmission electron microscope (FEI, Hillsboro, OR, USA). For detection of galectin-9 and 2E12 antibody, cells were embedded in Lowicryl K4M. Their immunolocalization were performed using 1G3 anti-galectin-9 antibody and/or a secondary mouse antibody coupled to gold (BBInternational, UK). RESULTS Blocking of galectin-9/TIM-3 interaction with novel monoclonal anti-galectin-9 antibodies The neutralizing potential of the anti-gal-9 antibodies was first assayed in a cell-free assay. This test was based on the interaction of the biotinylated recombinant short isoform of human galectin-9 with recombinant murine TIM-3 coated in 96-wells plates. Galectin-9 binding to TIM-3 was not blocked by the 1G3 antibody and only partially by 9M1. In tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 contrast, it was blocked almost completely by 2E12 (Figure 1). Poly-9CT and 2E12 blocking were dose-dependent and could be observed with a concentration as low as 10 ng/ml. Inhibition of galectin-9-induced cell death in T lymphocytes cell lines The human leukemic T-cell lines Jurkat and MOLT-4 have already been described as useful target cells to assess the pro-apoptotic activity of extracellular galectin-9 [32, 33]. However, in classical culture condition, they are only sensitive to very high concentrations of galectin-9, which are not appropriate to assess the neutralizing power of antibodies. Recently, it was shown that melanoma cells are more sensitive to apoptosis induced by galectin-9 in serum free culture medium [34]. Authors of this study suggested that this loss of sensitivity may be due to serum elements binding to galectin-9, or shielding galectin-9 receptors on cells. We hypothesized that using serum-free medium could also make lymphoid target cells more sensitive to low concentrations of galectin-9. Indeed, we were able to observe cell death in 30% of Jurkat cells treated for 6h with 60 nM galectin-9 (S) using serum-free medium (data not shown). In the experiment shown in figure 2, a concentration of 30 nM of galectin-9 was used to better underscore differences of neutralization between antibodies. Cell death was assessed using Annexin-V/IP staining (Figure 2). Preincubation of galectin-9 with 2E12 and ECA-42 completely abolished galectin-9induced cell death, while it was only inhibited at 50% by preincubation with 9M1-3 (Figure 2). ECA-42 is commercially available but its capacity to inhibit galectin-9 functions had not been demonstrated. 1G3 did not inhibit galectin-9-induced cell death (data not shown). Lactose inhibited galectin-9-induced cell death, providing a confirmation that interaction of galectin-9 with carbohydrates residues is important for its pro-apoptotic function. TIM-3 is expressed at the plasma membrane of Jurkat cells (data not shown). To determine if TIM-3 is involved in galectin-9-induced cell death in this experiment, we preincubated Jurkat cells with two different anti-TIM-3 antibodies, including the monoclonal antibody 2E2 which is widely used to block TIM-3 interaction with its ligands [15]. Galectin-9-induced cell death was not inhibited by TIM-3 antagonists, suggesting that binding of galectin-9 to TIM-3 is not required to induce apoptosis in Jurkat cells. The same experiment was performed using MOLT-4 cells, which appeared to be more sensitive to galectin-9, thus normal RPMI medium supplemented with FCS could be used. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 However, galectin-9 induced death in a greater fraction of MOLT-4 cells when they were incubated in serum-free medium (data not shown). As with Jurkat cells, galectin-9-induced cell death was inhibited by lactose, ECA-42 and 2E12, slightly inhibited by 9M1-3, and not inhibited by 1G3 and TIM-3 antagonists (Figure 3). Jurkat cells express galectin-9 which can be detected at the surface of their plasma membrane (Figure 4). Poly-9CT was used as positive control. Strong staining was observed with ECA-42, very weak staining was observed with 2E12, and 9M1-3 did not stain Jurkat cells. Interestingly, the ability of ECA-42, 9M1-3 and 2E12 antibodies to stain membranous galectin-9 does not correlate with their neutralizing potential. Inhibition of galectin-9-induced intracellular calcium release Using the free calcium probe Indo-1, intracytosolic calcium release was assessed in Jurkat cells treated by recombinant galectin-9. Experiments were performed in serum free medium unlike previous studies [32, 33], which allowed us to use lower concentrations of galectin-9. Maximum intracellular calcium release was reached with 60 nM galectin-9, and an effect of galectin-9 could be observed with a dose as low as 6 nM (data not shown). Calcium release was rapid, occuring within 30 seconds after galectin-9 addition (Figure 5). It was inhibited by pre-treatment with 2-APB, an IP3 inhibitor. Preincubation of galectin-9 with 2E12 drastically reduced the intracytosolic calcium release in a dose-dependent manner. TIM-3 antagonists had no effect on it (Figure 5). Electron microscopy characterization of galectin-9/2E12 interactions Jurkat cells were treated with galectin-9 with or without pre-incubation with 2E12, then harvested for electron microscopy analysis (Figure 6). Untreated Jurkat cells (Figure 6A) exhibited normal, round shape with large nuclei and small-sized cytoplasm. In contrast with untreated cells, no isolated cells could be observed when treated with galectin-9 (Figure 6B and 6C). All of them were clustered with their membranes jointed side by side by dense junctional strings suggesting the presence of large quantities of protein in the intermembranous space (Figure 6B). Large vesicles were present in the cytoplasm of some cells. Moreover, most cells exhibited long and very dense intracellular strings reminiscent of the intermembrane material (Figure 6C). When using 2E12 to counteract galectin-9 effects, dense tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 junctional strings were no longer observed and cells were overall more isolated, resembling untreated ones (Figure 6D). However, dense globular structures were observed at the surface and inside the cells (Figure 6E and 6F). Cells treated with galectin-9 and lactose were structuraly identical to untreated cells and did not exhibit such globular structures (data not shown). Considering these results, we wanted to determine if galectin-9 and 2E12 were present in these dense linear or globular structures (Figure 7). Galectin-9 was localized using 1G3 antibody and a secondary antibody directed against mouse immunoglobulin and coupled to gold [3]. 2E12 was localized using the same secondary antibody. High quantity of galectin-9 was indeed present in dense junction between cells (Figure 7A and 7B) and in intracellular dense strings (Figure 7C and 7D), as well as in globular structures when cells were treated with both galectin-9 and 2E12 (Figure 7E and 7F). 2E12 antibody was also present in cell membrane globular structures (Figure 7G) and intracellular globular structures (Figure 7H). DISCUSSION Two monoclonal antibodies appear to have a high neutralizing power against recombinant galectin-9 in various in vitro assays : ECA-42 and 2E12. In contrast with ECA-42, 2E12 does not react with galectin-9 at the cell surface. Both reagents will be useful for basic and applied therapeutic research. Regarding basic research, these mabs will help elucidate TIM-3-dependent and -independent functions of extracellular galectin-9. For applied therapeutic research, they will be useful to evaluate the benefit of neutralising galectin-9 in preclinical tumor or virus models. First reports describing galectin-9 have been published in 1997 [35, 36]. A major thrust have been given to the investigations about galectin-9 functions when it was identified as one specific ligand of the Tim-3 receptor in 2005 [14]. Since this publication, a wide range of TIM-3 functions have been unveiled in various types of immune effector cells, in vitro as well as in vivo. As mentioned in the introduction, stimulation of TIM-3 induces the production of inflammatory cytokines by monocytes, dendritic cells, NK cells and to a lesser extent T cells whereas it has inhibitory effects on CD4 + Th1 cells and stimulatory effects on Treg [12, 14-18]. In addition, antibody cross-linking of TIM-3 on NK cells suppress their tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 toxicity [37]. TIM-3 is also involved in the induction of the exhausted phenotype of CD8+ T cells in various pathological conditions [19, 22]. In mice bearing syngenic tumors, systemic administration of an antibody against murine TIM-3 increases T cell IFN-γ-mediated immunity against tumors. This confirms the overall immunosuppressive function of TIM-3 at the systemic level [38]. One recently discovered immunosuppressive action of TIM-3 occurs at the level of tumor infiltrating dendritic cells : TIM-3 capture of HMGB1 inhibits the efficacy of DNA vaccination and reduces the immunogenicity of nucleic acids released from dying tumor cells [39]. Beyond the frontiers of the immune system, TIM-3 seems to have important functions in tissue homeostasy and tumor development. It is consistently expressed on acute myeloid leukemia stem cells [40]. It is expressed by lung carcinoma cells and its high level of expression is indicative of a higher risk of bad outcome, suggesting a function in tumor cell proliferation or survival [41]. Currently, it is difficult to appreciate the contribution of galectin-9 to these various functions of TIM-3. Operationally, one can distinguish several types of galectin-9 interactions with target cells. There are experimental settings where target cells are responsive to galectin-9 in complete absence of TIM-3 expression. This has been formally proven for murine Th1 and Th2 cells but - to our knowledge - not for any type of human cells [17]. There are situations where cells respond to galectin-9 through combined stimulation of TIM-3 and probably other galectin-9 membrane receptors. This is probably the case for various types of immune cells although it is difficult to demonstrate [17]. There are also situations where galectin-9 probably competes with other TIM-3 ligands (HMGB1 and phosphatidyl-serine) or at least modulate their action. TIM-3 includes an amino-terminal immunoglobulin variable domain followed by a mucin domain, a transmembrane domain and a cytoplasmic tail. Galectin-9 binds to TIM-3 through the amino-linked carbohydrates of the mucin domain whereas HMGB1 and phosphatidyl serine bind to TIM-3 through a metal ion-dependent ligand-binding site in the FG loop of the immunoglobulin variable domain [28]. Therefore, both types of ligands are suspected to induce distinct signaling events. Whether galectin-9 binding to TIM-3 can modulate intracellular signals triggered by HMGB1 or phosphatidyl-serine remains to be investigated. It is obvious that in all these situations, antibodies neutralizing human galectin-9 will be of major help. There are probably several mode of transport for extracellular galectin-9, including tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 association to exosomes [30]. One key issue in our future investigations will be to determine whether or not 2E12 can neutralizes exosomes carrying galectin-9 as it does for recombinant galectin-9. Exosomes produced by malignant cells can promote tumor progression and counteract anti-tumor immune response and their removal could become a interesting new therapeutic pathway [42]. Indeed, therapeutic devices designed for selective retention of exosomes from patients blood are already being developped [43]. A novel therapeutic strategy against virus and tumors has recently emerged which aims to neutralize the inhibiting factors of the immune response, in other words to break tolerance towards viral or tumor antigens. The benefit of this new strategy has been remarkably illustrated by the recent success of ipilumab for the treatment of metastatic melanoma [44]. This humanized antibody does not act directly on tumor cells but protects T cells from the suppressive effects of tumor cells and thus restores an effective antitumor response. Ipilumab neutralizes the CTLA-4 system but there is a rationale to target other systems inhibiting anti-tumor responses based on receptors such as PD1, LAG3 and TIM-3. One of our next aim is to use our mab 2E12 in preclinical murine models to assess its ability to antagonize the immunosuppressive effects of galectin-9 in vivo. If these experiments are successful, they will provide a basis for the production of a humanized monoclonal antibody against galectin-9 and its use in clinical trials. BIBLIOGRAPHY 1. 2. 3. 4. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. Pioche-Durieu C, Keryer C, Souquere S, Bosq J, Faigle W, Loew D, Hirashima M, Nishi N, Middeldorp J, Busson P: In nasopharyngeal carcinoma cells, Epstein-Barr virus LMP1 interacts with galectin 9 in membrane raft elements resistant to simvastatin. J Virol 2005, 79:13326-13337. 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Jurkat cells were treated during 6H with human recombinant galectin-9 with or without pre-incubation with various galectin-9 inhibitors or control reagents. During treatment, cells were incubated in serum-free medium. Cell death was inhibited with lactose, ECA-42 or 2E12 and only partially inhibited with 9M1-3. TIM-3 antagonists had no effect on galectin-9-induced cell death. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Annexin V-APC PI gal-9 + ECA-42 gal-9 + 2E12 Annexin V-APC gal-9 + lactose Annexin V-APC gal-9 + 2E2 (anti-TIM-3) PI Annexin V-APC PI PI gal-9 + 9M1-3 Annexin V-APC PI Annexin V-APC gal-9 + control Ig PI gal-9 PI PI untreated Annexin V-APC Annexin V-APC Figure 3 : Inhibition of galectin-9-induced cell death of MOLT-4 cells. MOLT-4 cells were treated during 24Hwith human recombinant galectin-9 with or without pre-incubation with various galectin-9 inhibitors or control reagents. Unlike Jurkat cells, MOLT-4 cells were sensitive to galectin-9-induced cell death even in the presence of FCS. As with Jurkat cells, death was inhibited with lactose, ECA-42 or 2E12 and only partially inhibited with 9M1-3. TIM-3 antagonists had no effect. 9M1-3 cell count cell count poly-9CT PE PE cell count tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 2E12 cell count ECA-42 PE PE Figure 4 : Detection of membrane-bound galectin-9 in Jurkat cells. Jurkat cells were stained with anti-galectin-9 primary antibodies and revealed with secondary antibodies coupled to PE. Staining were observed with poly-9CT and ECA-42, but not with 9M1-3. A weak staining could be observed with 2E12. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 Figure 5 : Inhibition of galectin-9-induced intracellular calcium release in Jurkat cells. Intracellular calcium concentration was measured with Indo-1 probe. Galectin-9 induced high intracellular calcium increase within 30 seconds of treatment, in a dose-dependent manner. This increase was strongly diminished by pre-incubating galectin-9 with 2E12 antibody, also in a dose-dependent manner. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 A B C D E F Figure 6 : Electron microscopy analysis of galectin-9 and galectin-9/2E12 interaction with Jurkat cells. Jurkat cells were treated with galectin-9 with or without pre-incubation with 2E12. (A) Untreated Jurkat cells. (B, C) Galectin-9 treated Jurkat cells. Cells are clustered and their membrane junctions are dense (panel B, frame). Long dense strings are present in their cytoplasm alongside large vesicles (panel C, black arrow). (D, E, F) Jurkat cells treated with galectin-9 pre-incubated with 2E12. Cells structure resemble that of untreated cells (panel D), with the exception of dense globular structure which could be observed at cell membrane (panel E, black arrow) and inside the cytoplasm (panel F, black arrow). A B (cell 2) (cell 1) (cell 2) tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 (cell 1) C D E F G H Figure 7 : Immunolocalization of galectin-9 and 2E12 in Jurkat cells. Cells were treated with galectin-9 with or without pre-incubation with 2E12. Immunolocalizations of galectin-9 and 2E12 were performed with anti-galectin-9 1G3 antibody and/or a secondary antibody coupled to gold. (A) Ultrastructure of galectin-9-treated cells with dense membrane junction and (B) galectin-9 immunolocalization. (C) Ultrastucture of galectin-9-treated cells showing intracellular dense strings and (D) galectin-9 immunolocalization. (E,) Ultrastructure of galectin-9/2E12 treated cells showing membrane-associated dense globular structure and (F) galectin-9 immunolocalization. (G,H) Immunolocalization of 2E12 in galectin-9/2E12 treated cells. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 DISCUSSION 87 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 DISCUSSION Au cours de ma thèse, j’ai développé et caractérisé de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés contre la galectine-9. L’un d’entre eux, l’anticorps 1G3, s’est révélé être un outil performant pour l’étude de la distribution tissulaire de la galectine-9 dans différents contextes d’infections virales et de cancers associés. A l’aide d’un second anticorps, 2E12, nous sommes parvenus à neutraliser l’effet pro-apoptotique de la galectine-9 sur des lignées humaines de lymphocytes T. Les résultats obtenus lors de ces expériences soulèvent de nouvelles questions sur la biologie de galectine-9. Dans les lignes qui suivent, je me propose d’exposer quelles sont ces problématiques et de discuter comment elles pourraient être tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 résolues. 1) Production et caractérisation des anticorps 1G3 et 2E12 En immunisant des souris avec l’extrémité C-terminale de la galectine-9, nous avons produit une collection d’anticorps monoclonaux ayant une forte réactivité en ELISA pour celle-ci. Plus particulièrement, l’anticorps 1G3 apparait comme un outil intéressant pour la détection de la galectine-9 sur coupes de tissu. L’anticorps 2E12, quant à lui, neutralise l’effet pro-apoptotique de la galectine-9 sur des cellules de lymphomes T humains. Nous avons choisi d’immuniser les animaux avec l’extrémité C-terminale en considérant l’expérience de nos collaborateurs japonais. Ils avaient déjà obtenu un anticorps polyclonal de lapin capable de réagir avec la galectine-9 membranaire à la surface des cellules en utilisant cette extrémité. De plus, l’anticorps 9M1-3, capable d’immunocapturer les exosomes de galectine-9, est également dirigé contre un épitope situé dans la partie Cterminale de la galectine-9. Notre espoir initial était de développer un anticorps monoclonal réagissant à la fois contre la galectine-9 présente à la membrane des cellules cellulaire et contre la galectine-9 intégrée dans la membrane des exosomes. Nous avons donc testé les sérums des souris immunisés puis les surnageants des clones obtenus sur cellules gal-9 +/- à chaque étape de production des hybridomes. Bien que les anticorps sériques des souris 88 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 immunisées réagissaient avec la galectine-9 membranaire, nous ne sommes finalement pas parvenus à identifier d’hybridomes sécrétant des anticorps ayant conservé cette propriété. Nous avons souhaité déterminer les épitopes reconnus par nos anticorps en effectuant une cartographie des épitopes. Cette expérience nous a permis de déterminer que l’anticorps 1G3 reconnait un épitope linéaire (TPAIPPMMYPHPA) situé partiellement en Cterminal du domaine linker et en N-terminal du domaine CRD C-terminal de la galectine-9. Nous avons confirmé ce résultat en utilisant le peptide dans une expérience d’ELISA de compétition. Une analyse par « alanine-scanning » pourrait permettre de déterminer quels sont les acides aminés cruciaux pour la reconnaissance du peptide par 1G3. Une telle analyse tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 consiste à remplacer successivement chacun des acides aminés du peptide par une alanine et à tester ensuite l’altération de réactivité de l’anticorps. Nous avons également entrepris une étude structurale du complexe 1G3/galectine-9 C-terminale en collaboration avec Enrico Stura (CEA de Saclay), toutefois ces expériences n’ont pas abouti à l’heure actuelle. L’échec de la cartographie des épitopes pour l’anticorps 2E12 laisse à penser que cet anticorps pourrait reconnaître un épitope conformationnel, cependant nous n’avons pas réalisé d’expériences complémentaires pour le prouver et cette question reste donc en suspens. Il pourrait s’avérer intéressant de produire de nouveaux anticorps monoclonaux dirigés cette fois-ci contre l’extrémité N-terminale de la galectine-9, ou bien contre des peptides portant des acides aminés critiques pour la reconnaissance des oligosaccharides par les domaines CRD de la protéine. Les arginines 65 (CRD N-terminal) et 221 (CRD Cterminal), impliquées respectivement dans la reconnaissance du lactose et des oligosaccharides sialylés, pourraient s’avérer intéressant à cibler [170]. 2) Détection de la galectine-9 dans les tissus humains infectés par des virus oncogènes La galectine-9 est une protéine immunomodulatrice aux propriétés complexes agissant sur les cellules de l’imunité innée et de l’immunité adaptative. Sa surexpression a été décrite dans le contexte du NPC ainsi que dans celui de l’infection par le VHC et des hépatocarcinomes associés. En utilisant l’anticorps 1G3 dans des expériences 89 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 d’immunohistologie sur coupes de tissus de patients, nous avons précisé la distribution de la galectine-9 dans ces deux contextes ainsi que dans celui de l’infection par le VHB. Dans le NPC, elle est fortement exprimée par les cellules tumorales et on retrouve parfois son expression dans les leucocytes infiltrants. Elle n’est pratiquement pas détectable dans la muqueuse saine avoisinant la tumeur. L’anticorps 1G3 s’est révélé être un outil d’immunohistochimie plus sensible et plus spécifique que l’anticorps polyclonal utilisé auparavant par notre équipe pour l’étude du NPC [124]. Dans les tissus infectés par le VHC, nous avons confirmé la forte expression de la galectine-9 par les cellules de Kupffer et nous avons mis évidence son expression dans les tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 hépatocytes, ce qui était inattendu. L’expression de la galectine-9 par les hépatocytes infectés par le VHC a été confirmée dans une publication très récente [263]. Concernant les tissus infectés par le VHB, la galectine-9 est fortement exprimée par les leucocytes infiltrant et détectable dans les hépatocytes. Les hépatocytes pourraient représenter une source non négligeable de galectine-9 dans ces deux pathologies. L’implication de la galectine-9 dans l’infection par le VHB n’avait pas été mise en évidence jusqu’à présent et depuis la publication de ces résultats, deux nouvelles études ont confirmé le lien entre galectine-9 et l’infection par le VHB [264, 265]. Nous avons observé un marquage nucléaire de la galectine-9 dans une fraction des cellules malignes de NPC dans neuf cas examinés sur dix. La quantité de cellules présentant un marquage de ce type est variable d’un patient à l’autre. A notre connaissance, il n’existe pas d’étude fonctionnelle de la galectine-9 nucléaire. Seule une étude récente s’est intéressée à la distribution intracellulaire de la galectine-9 avec comme modèle les microglia/macrophages présents dans les lésions de sclérose en plaques [266]. Les auteurs démontrent que la galectine-9 est exclusivement nucléaire dans les lésions actives alors qu’elle est majoritairement cytoplasmique dans les lésions inactives. Ces données suggèrent un rôle spécifique de la galectine-9 nucléaire, à l’image de la galectine-3 nucléaire qui favorise l’apoptose de cellules issues d’une lignée de cancer de prostate [158]. L’étude de la localisation intracellulaire de la galectine-9 selon le stade de la maladie ou selon la réponse de la tumeur à différents traitements pourrait apporter un éclairage sur cet aspect. Plus 90 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 généralement, il serait intéressant de vérifier s’il existe une corrélation entre la quantité de galectine-9 détectée dans les tissus infectés et l’amplitude de la réponse aux traitements, notamment la réponse aux immunothérapies pour les patients atteints de NPC étant donné les propriétés immunosuppressives de la galectine-9. En conditions physiologiques, lors de la réponse immunitaire de l’hôte contre les pathogènes, celle-ci doit être régulée présicément pour limiter les dégats des tissus infectés. La galectine-9 joue alors un rôle dans l’atténuation et la terminaison de cette réaction. Mais lors de certaines affections virales chroniques ou lors de maladies tumorales, l’action immunosuppressive de la galectine-9 peut être mise en jeu de façon inappropriée. Cette tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 action s’opère de plusieurs manières. La galectine-9 induit l’apoptose des lymphocytes Th1, Th17 et T CD8+, favorise la production de cytokines immunosuppressives et l’expansion des Treg [108, 173, 175, 176, 188, 191, 214-220]. Un autre aspect de cette régulation négative pourrait être lié au phénotype d’épuisement des lymphocytes CD8+. La population de lymphocytes CD8+ épuisés se caractérise par une forte expression de récepteurs inhibiteurs, notamment PD-1 et/ou TIM-3 chez les patients infectés chroniquement par le VIH, le VHC et le VHB [195, 196, 225, 264, 265]. La neutralisation de TIM-3 rétablit partiellement ou largement, selon les études, les capacités cytotoxiques des lymphocytes CD8+. Cependant, cette neutralisation est effectuée à l’aide d’un anticorps bloquant anti-TIM-3 ou d’un compétiteur soluble de TIM-3. L’implication directe de la galectine-9 n’est donc jamais formellement démontrée dans ces publications. L’utilisation de l’anticorps neutralisant 2E12 dans ces expériences pourrait aider à déterminer si la galectine-9 est bien le ligand de TIM-3 impliqué dans la mise en place et/ou l’entretien du phénotype d’épuisement des CD8+ lorsque ces infections virales deviennent chroniques. 3) Neutralisation de l’apoptose induite par la galectine-9 sur lignées T humaines La galectine-9 induit l’apoptose des cellules de lymphomes T humaines Jurkat et MOLT-4. Cet effet était déjà connu, cependant l’utilisation de milieu de culture dépourvu de 91 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 sérum de veau fœtal nous a permis d’utiliser des concentrations inférieures aux concentrations décrites dans ces publications [209]. Il est possible que des éléments présents dans le sérum se fixent à la galectine-9 ou bien protègent ses récepteurs [267]. Il est intéressant de noter que les cellules MOLT-4 paraissent plus sensibles à l’apoptose induite par la galectine-9 que les cellules Jurkat, cependant nous n’avons pas pu déterminer la raison de cette susceptibilité accrue. L’anticorps 2E12 bloque l’interaction de galectine-9 avec TIM-3 dans un test acellulaire. 9M1-3 est également capable de bloquer cette interaction mais dans une moindre mesure, tandis qu’1G3 est incapable de la bloquer. Nous n’avons pas encore réalisé cette tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 expérience pour ECA-42. Parallèlement, les anticorps 2E12 et ECA-42 nous ont permis de neutraliser complètement l’effet pro-apoptotique de la galectine-9 sur les deux lignées Jurkat et MOLT-4. 9M1-3 ne neutralise que partiellement cet effet, tandis qu’1G3 n’a aucun effet neutralisant. Bien que ces résultats semblent correspondre aux capacités de blocage de l’interaction galectine-9/TIM-3 par les anticorps, nous avons constaté que l’utilisation de deux anticorps bloquant de TIM-3 n’ont aucun effet sur l’apoptose induite par la galectine-9. L’effet pro-apoptotique de la galectine-9 serait donc indépendant de TIM-3 dans ce modèle. Nous souhaiterions confirmer ce résultat en vérifiant l’effet de la galectine-9 sur des cellules Jurkat invalidées pour TIM-3. Nous avons confirmé l’augmentation de calcium cytosolique induite par la galectine-9 dans les cellules Jurkat et nous avons montré la probable indépendance de TIM-3 dans ce mécanisme. Cette expérience pourrait être répétée avec les cellules Jurkat invalidées pour TIM-3 et également avec la lignée MOLT-4. Enfin, nous avons caractérisé par microscopie électronique l’effet de la galectine-9 sur les cellules Jurkat et l’impact de la neutralisation par 2E12 de cet effet. La galectine-9 semble s’accumuler dans la membrane plasmique aux zones de contact des cellules et favoriser la formation de cordons denses entre celles-ci. Il semble que ces cordons puissent être internalisés. Le pré-traitement par 2E12 empêche la formation de ces cordons et l’on peut observer l’apparition de structures denses globulaires contenant à la fois la galectine-9 et 2E12. Ces structures seraient, elles aussi, internalisées par les cellules. Il serait intéressant de caractériser l’ultrastructure des cellules 92 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 MOLT-4 après traitement par la galectine-9 étant donné que celles-ci sont plus sensibles à son effet pro-apoptotique. 4) Effets des exosomes porteurs de galectine-9 Les travaux réalisés précédemment dans l’équipe ont démontré que la galectine-9 est sécrétée par les cellules de NPC en association avec les exosomes et que ceux-ci sont détectables dans le sang de patients atteints de NPC [108]. Etant donné que la galectine-9 est présente dans le sang de patients infectés par le VIH et le VHC, il serait intéressant de déterminer si elle est associée aux exosomes dans ces contextes infectieux [176, 224]. A notre tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 connaissance, seule l’étude de notre équipe sur les exosomes de NPC s’est intéressée aux effects directs de la galectine-9 lorsqu’elle est associée aux exosomes. Pour mémoire, la galectine-9 véhiculée par les exosomes de NPC peut interagir avec TIM-3 et ainsi induire la mort de clones CD4+ spécifiques de protéines d’EBV. Il nous semble primordial d’approfondir l’étude des exosomes porteurs de galectine-9, car il est possible qu’en conditions physiologiques la majorité de la galectine-9 soluble soit intégrée à la membrane des exosomes. Pour l’étude des exosomes vecteurs de galectine-9, nous avons développé deux lignées cellulaires à partir de la lignée de lymphome de Burkitt BL2 : une lignée exprimant de façon stable la galectine-9 (BL2-gal9) et une lignée contrôle exprimant de façon stable la GFP (BL2-GFP). Les cellules de cette lignée produisent de grandes quantités d’exosomes. Lors d’une expérience préliminaire, nous avons purifié des exosomes de BL2-GFP et de BL2-gal9 puis nous avons comparé leur effet pro-apoptotique sur les cellules Jurkat par cytométrie de flux grâce à un marquage Annexin-V/IP. Nous n’avons pas pu mettre en évidence d’effet accru des exosomes galectine-9 par rapport aux exosomes GFP sur la mortalité des cellules Jurkat au cours de cette expérience. Il est possible que ce test ne soit pas assez sensible étant donné qu’il nous est difficile de constater un effet de la galectine-9 recombinante à des concentrations inférieures à 1 µg/ml (30 nM) sur les cellules Jurkat. D’après notre évaluation de la quantité de galectine-9 dans les exosomes de BL2, il faudrait traiter les cellules avec au moins 200 µg/ml d’exosomes pour retrouver une concentration de 93 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 galectine-9 équivalente. Outre les difficultés techniques que cela représenterait, l’utilisation d’une telle quantité d’exosome pourrait ne pas être représentative des quantités réelles d’exosomes circulant in vivo. Ce point est néanmoins discutable car il est envisageable que la concentration en exosomes soit localement très élevée dans le microenvironnement tumoral. L’une des pistes possibles pour la mise en évidence d’effets des exosomes porteurs de galectine-9 serait la mesure de l’augmentation du calcium cytosolique libre dans les cellules Jurkat, selon le protocole décrit dans les résultats du second article. Lors de cette expérience, nous avons observé un effet de la galectine-9 à une concentration de 0,2 µg/ml (6 nM). Cette haute sensibilité pourrait convenir à l’étude des exosomes. Si nous parvenions à mettre tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 évidence un effet des exosomes sur les cellules Jurkat ou dans un autre modèle, nous pourrions déterminer si nos anticorps sont en mesure de bloquer cet effet. Nous savons déjà que l’anticorps 1G3 est capable d’immunoprécipiter les exosomes porteurs de galectine-9 issus d’une lignée cellulaire de NPC. La capacité de capture des exosomes par l’anticorps 2E12 reste à déterminer. Si aucune nouvelle étude de ne s’est intéressée directement aux exosomes vecteurs de galectine-9, ceux-ci pourraient jouer un rôle dans deux modèles distincts présentés dans deux publications récentes [189, 268]. Nous avons déjà évoqué la première de ces deux publications où sont analysés les effets de la galectine-9 recombinante une lignée de cellules NK. Dans ce modèle, la galectine-9 augmente la production d’IFN-γ par les cellules NK d’une manière dépendante de TIM-3. Les auteurs obtiennent les mêmes résultats en substituant la galectine-9 recombinante par des cellules Raji exprimant la galectine-9 de manière stable (Raji-gal9). Il serait intéressant de déterminer si les exosomes de Raji-gal9 contiennent la galectine-9 et si les effets observés sont dûs à la galectine-9 membranaire, à la galectine-9 transportée par les exosomes ou bien à ces deux types de présentation de la galectine-9. Dans la seconde publication, les auteurs démontrent que les cellules T CD4+ possèdant une expression membranaire de la galectine-9 (gal9+ Th) sont capables de la sécréter. La co-culture de ces cellules régule négativement les Th17 et positivement les Treg, 94 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de la même manière que la galectine-9 recombinante. Il serait là aussi intéressant de caractériser les exosomes provenant des cellules gal9+ Th et de déterminer leur rôle dans la régulation des Th17 et des Treg. 5) Nouveaux tests in vitro de neutralisation des effets de la galectine-9 Les tests réalisés sur les cellules Jurkat et MOLT-4 pourraient être complétés par de nouvelles expériences in vitro sur lignées cellulaires et cellules primaires. Les cibles physiologiques de la galectine-9 sont nombreuses et il est crucial de déterminer si 2E12 est capable d’inhiber l’ensemble de ses fonctions ou une partie d’entre elles. La mise au point de tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 nouveaux tests pourrait également nous permettre de révéler de nouveaux effets inhibiteurs d’autres anticorps anti-galectine-9. De plus, les tests s’avèrant assez sensibles pourraient être adaptés pour l’étude des exosomes vecteurs de galectine-9. Nous pourrions ainsi déterminer la capacité de nos anticorps à inhiber la production de cytokines par les monocytes [176, 187] et les cellules NK [189]. Comme nous l’avons vu en introduction, l’interaction de la galectine-9 avec TIM-3 induit la production de TNF-α, IL-1β et IFN-γ par les monocytes et la production d’IFN-γ par les cellules NK (lignée NK92). Pour l’étude des monocytes, nous utiliserions la lignée leucémique monocytaire THP-1 et des monocytes CD14+ issus de PBMC totaux triés à l’aide de billes magnétiques. Pour l’étude des cellules NK, nous utiliserions la lignée NK92 citée ci-dessus que nous a transmis l’équipe de JS Miller. Pour confirmer les résultats obtenus sur lignées T, nous pourrions réaliser de nouveaux tests de viabilité cellulaire après traitement avec la galectine-9 en prenant pour cible des lymphocytes T primaires humains issus de PBMC totaux et stimulés par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28. La stimulation de l’expansion des Treg et potentiellement de leur activité suppressive est une composante essentielle de l’action immunosuppressive de la galectine-9, mais celle-ci a surtout été étudiée chez la souris et relativement peu chez l’homme [175, 176]. Cet aspect pourrait être traité en collaboration avec l’équipe de Nadira Delhem (CNRS UMR 8161, Institut de Biologie de Lille) qui possède une remarquable expérience dans la manipulation 95 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 des Treg humains. Leur équipe a obtenu des résultats encourageants avec l’anticorps 1G3 en montrant que celui-ci était capable de réduire l’action suppressive des Treg sur des lymphocytes T CD4+ CD25- autologues. L’obtention de ces données souligne l’importance de la mise au point de nouveaux modèles pour la poursuite de la caractérisation des anticorps que nous avons obtenus. 6) Modèles in vivo de neutralisation des effets de la galectine-9 Nous avons démontré le potentiel neutralisant de l’anticorps 2E12 sur la galectine-9 in vitro. L’étape suivante sur le chemin de l’anticorps thérapeutique serait la démonstration tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 de cette capacité dans un modèle murin in vivo. Un premier modèle simple consisterait à transposer le test in vitro de viabilité sur les Jurkat en test in vivo. Pour cela nous pourrions greffer des cellules Jurkat sur des souris immunodéficientes puis traiter ces souris avec de la galectine-9 recombinante accompagnée ou non de 2E12. La comparaison des croissances tumorales nous permettrait de déterminer si la galectine-9 recombinante exerce son effet cytotoxique sur les cellules Jurkat in vivo et si cet effet est contrecarré par 2E12. Nous utiliserions des cellules Jurkat exprimant la luciférase (Jurkat-Luc) pour faciliter l’évaluation de la croissance tumorale par imagerie optique externe. La lignée Jurkat-Luc pourrait être développée rapidement grâce à un système de lentivirus mis au point par notre équipe [269]. Si ce modèle s’avérait donner des résultats satisfaisants, nous pourrions remplacer la galectine-9 recombinante par des exosomes purifiés issus de cellules BL2-gal9, puis par les cellules BL2-gal9 et observer l’effet de 2E12 dans ces différents modèles. Ce premier modèle pourrait nous apporter des informations cruciales sur la susceptibilité des cellules Jurkat à la galectine-9 et le potentiel de neutralisation de 2E12 dans un système in vivo. Toutefois, il serait loin de refléter la complexité des interactions entre la galectine-9, les cellules tumorales, et les cellules immunitaires. Une seconde approche pourrait être mise en œuvre sur des souris SCID splénectomisée dont le système immunitaire aurait été reconstitué avec des PBMC humains, selon un protocole bien maitrisé dans l’équipe de Nadira Delhem. Dans cette approche, la galectine-9 recombinante serait injectée par voie systémique en étant accompagnée ou non de 2E12. Nous observerions l’effet de la 96 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 galectine-9 et le potentiel de neutralisation de cet effet sur les sous-populations lymphocytaires humaines des souris. L’injection de galectine-9 pourrait par la suite être remplacée par une greffe sous-cutanée de cellules malignes de NPC produisant des quantités tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 élevées d’exosomes vecteurs de galectine-9. 97 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 BIBLIOGRAPHIE 98 tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. tel-00820984, version 1 - 7 May 2013 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 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