Mécanismes d`activation cellulaire par les anticorps

Revue
Hématologie 2008 ; 14 (5) : 354-65
Mécanismes d’activation cellulaire
par les anticorps antiphospholipides
Copyright © 2017 John Libbey Eurotext. Téléchargé par un robot venant de 88.99.165.207 le 03/06/2017.
Antiphospholipid antibodies: mechanisms of cellular activation
Nathalie Satta
Egbert K.O. Kruithof
Guido Reber
Philippe de Moerloose
Service d’angiologie et d’hémostase,
Hôpitaux Universitaires de Genève,
1211 Genève 14, Suisse
<[email protected]>
Résumé. Le syndrome antiphospholipide (SAPL) est caractérisé par des manifestations cliniques (thromboses et/ou complications obstétricales) associées à la présence d’anticorps dits antiphospholipides (aPL). Ces aPL sont en fait principalement
dirigés contre des complexes phospholipides-protéines, la protéine cible principale
étant la b2-glycoprotéine 1. Après quelques rappels sur le SAPL et son diagnostic,
nous discuterons de certains mécanismes expliquant les complications vasculaires
observées dans ce syndrome. Il peut s’agir de mécanismes interférant avec la
coagulation (facteurs de coagulation, inhibiteurs ou fibrinolyse), ou de mécanismes
d’activation cellulaire. Les cellules (principalement les cellules endothéliales, les
monocytes et les plaquettes) activées par les aPL seront capables d’exprimer entre
autres des cytokines, des molécules d’adhésion et du facteur tissulaire. Le but
principal de cette revue est de présenter les connaissances actuelles sur les principaux
récepteurs cellulaires des aPL (annexine A2, TLR, ApoER2’, GPIba), de discuter des
voies d’activation intracellulaire, et finalement d’entrevoir certaines perspectives
thérapeutiques découlant de ces nouvelles connaissances.
Mots clés : anticorps antiphospholipides, b2-glycoprotéine 1, récepteurs toll like,
annexine A2, thromboses
Abstract. The antiphospholipid syndrome is characterized by clinical manifestations (thrombosis and/or pregnancy morbidity) associated with the so-called
antiphospholipid antibodies (aPL). These antibodies are in fact mainly directed
against protein-phospholipid complexes, the main protein being b2-glycoprotein
1. After a brief review on the syndrome and its diagnosis, we will discuss the
possible mechanisms responsible for the clinical complications. aPL can interfere
directly with the coagulation system (coagulation factors, inhibitors or fibrinolysis).
They can induice an activation of endothelial cells, monocytes and platelets. After
activation, these cells will express, among others, cytokines, adhesion molecules
and tissue factor. Our review aims specifically at presenting the current knowledge
on the main aPL receptors (annexin A2, TLR, ApoER2’, GPIba), at describing some
intracellular pathways and finally at discussing new therapeutic avenues based on
this recent knowledge.
Keywords: antiphospholipid antibodies, beta 2-glycoprotein 1, toll-like receptors,
annexin A2, thrombosis
L
ney en 2004 [2]. Aujourd’hui, il est
défini par la présence de manifestations
cliniques (thromboses et/ou complications obstétricales) associées à la
présence d’anticorps antiphospholipides (lupus anticoagulant, anti-b2Hématologie, vol. 14, n° 5, septembre-octobre 2008
doi: 10.1684/hma.2008.0283
354
Tirés à part :
P. de Moerloose
e syndrome antiphospholipide (SAPL), connu depuis
les années 1960, a fait
l’objet d’un consensus à
Sapporo en 1999 [1] et a
été l’objet d’une nouvelle révision à Syd-
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glycoprotéine 1 [-b2GP1] et anticorps anticardiolipines).
Malgré toutes les données accumulées tout au long de ces
années, de nombreux points d’interrogation subsistent.
Ceux-ci concernent en particulier les mécanismes par lesquels ces anticorps agissent. Après avoir fait quelques rappels sur le syndrome (diagnostic et clinique), nous nous
focaliserons dans cette revue sur les mécanismes, en particulier d’activation cellulaire, permettant d’expliquer les complications vasculaires (nous ne discuterons pas des mécanismes
à l’origine des complications obstétricales même si une partie
de celles-ci est probablement également d’origine vasculaire). Sur la base de ces connaissances récentes, nous
discuterons de certaines perspectives thérapeutiques.
Le syndrome antiphospholipide :
rappels
Le diagnostic biologique du SAPL est fondé sur la présence
d’anticorps antiphospholipides (aPL) détectés par deux types
de tests, des tests de coagulation et des tests immunologiques. Les tests de coagulation permettent de rechercher la
présence d’un anticoagulant de type lupique ou LA (lupus
anticoagulant). Cette recherche doit suivre une séquence de
tests bien précise [3] et est l’apanage de laboratoires spécialisés. Les tests immunologiques sont en général des tests ELISA
qui détectent des anticorps de type IgG ou IgM, soit des
anticorps dits anticardiolipines (aCL), soit des anti-b2GP1.
Bien que d’importants progrès aient été réalisés, ces tests sont
encore loin d’être standardisés [4-6]. En effet, de nombreuses
discussions sont en cours quant au meilleur choix de l’antigène, des microplaques, des calibrateurs et de la manière de
définir le cut-off. Les aPL sont généralement polyclonaux,
hétérogènes, et ceci complique le diagnostic. Le lien causal
entre la présence d’un aPL de spécificité connue et l’augmentation du risque de thrombose n’est pas encore bien défini. Il
apparaît clairement que les aPL ne présentent pas tous un
potentiel pathogène, seule une sous-population étant responsable des complications cliniques. Actuellement, la cible
principale des aPL semble être la b2GP1. Il s’agit d’une
protéine présente dans le plasma à la concentration de 200
lg/mL. Elle est constituée de 4 domaines homologues et d’un
cinquième domaine possédant un site de liaison aux phospholipides anioniques composé de 14 acides aminés chargés positivement et d’une courte séquence hydrophobe qui
s’insère dans la membrane. C’est sous la forme liée à la
membrane par l’intermédiaire des phospholipides anioniques que la b2GP1 est reconnue par les aPL. Cette fixation
entraîne un changement de conformation de la protéine et
induit l’exposition d’un épitope, normalement encrypté dans
la forme native de la protéine, situé entre le résidu G40 et le
résidu R43 du domaine I. Cet épitope devient alors accessible et permet l’interaction des aPL avec la b2GP1. Des
travaux récents ont montré que les aPL qui reconnaissent avec
forte affinité cet épitope ont également une activité anticoagulante de type lupique (lupus-like anticoagulant ou LAC),
Hématologie, vol. 14, n° 5, septembre-octobre 2008
correspondant au prolongement du temps de coagulation
dans les tests in vitro. Leur présence est en lien dans la plupart
des cas de SAPL avec l’existence d’événements thrombotiques. Ces aPL forment donc une sous-population d’anticorps
anti-b2GP1 à fort potentiel pathogène [7,8]. La théorie du
« cryptic » épitope expliquerait en partie la difficulté de
standardisation des tests de dépistage des anticorps antib2GP1. Il est fort probable que l’adsorption de la b2GP1 sur
les surfaces hydrophiles ou hydrophobes des plaques ELISA
ne permet pas une exposition optimale de cet épitope,
réduisant ainsi l’affinité des anticorps anti-b2GP1 pour la
b2GP1, et par conséquent la sensibilité du test.
En ce qui concerne la clinique, deux grandes complications
sont retenues dans la définition de ce syndrome : les événements thrombotiques et les complications obstétricales. Les
thromboses peuvent être veineuses et/ou artérielles et toucher n’importe quelle partie de l’arbre vasculaire. Les manifestations iront donc de la maladie thromboembolique veineuse aux atteintes artérielles cérébrales (principalement),
coronariennes ou artérielles périphériques. Les complications
obstétricales, regroupées sous le terme anglais de « pregnancy morbidity », sont également variées et peuvent survenir à tous les stades de la grossesse ; la complication principale est la survenue d’épisodes répétés d’avortements
spontanés et/ou de pertes fœtales. D’autres manifestations
(thrombopénie et livedo par exemple) peuvent faire évoquer
un SAPL mais ne font pas partie des critères retenus lors du
dernier consensus [2].
Mécanismes responsables
des complications vasculaires
Deux mécanismes seraient à l’origine des complications
thrombotiques provoquées par les aPL. L’un concerne l’interférence par les aPL avec certains composants du système de
la coagulation (activateurs, inhibiteurs, fibrinolyse). L’autre
met en jeu l’activation par les aPL de cellules impliquées dans
la coagulation (endothélium, plaquettes, monocytes).
Interférence dans le système
de la coagulation
Les aPL interfèrent principalement avec le système anticoagulant de la protéine C activée (PCa). Le système anticoagulant
de la PCa sert de régulateur à la génération de thrombine en
inactivant les facteurs Va et VIIIa. Tout dysfonctionnement de
ce système peut entraîner des complications thrombotiques,
principalement veineuses. Il a été démontré que des anticorps
monoclonaux de souris anti-b2GP1 peuvent en présence
de b2GP1 inhiber l’activité anticoagulante de la PCa [9]
(figure 1). Il a été suggéré que le complexe immun anti-b2GP1/
b2GP1 se comporte comme un inhibiteur compétitif de la
fixation du complexe anticoagulant de la PCa aux phospholipides anioniques présents sur la membrane des cellules
activées. Le complexe anti-b2GP1/b2GP1 peut aussi provo-
355
A
Va
IIa
PC
TM
PCa
VIIIa
Vi
VIIIi
PCa
PS
EPCR
Va
Va PS
VIIIa
B
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PCa
IIa
PC
TM
VIIIa
Va
Va
VIIIa
PCa
EPCR
PS
Figure 1. Effet inhibiteur des aPL sur le système anticoagulant de la protéine C activée (PCa). A) Représentation du fonctionnement
physiologique du système anticoagulant de la protéine C activée. La protéine C (PC) liée à son récepteur membranaire EPCR est activée
par le complexe thrombine (IIa)/thrombomoduline (TM). Après activation, la PCa interagit avec la protéine S pour inactiver le facteur Va ou
le facteur VIIIa. B) Les anticorps anti-b2GP1 complexés à la b2GP1 se lient sur la membrane exposant de la phosphatidyléthanolamine
ou des phospholipides oxydés ( ). Ils entrent en compétition avec la PCa empêchant sa fixation sur la membrane et la formation des
complexes anticoagulants PCa/PS/FVa ou PCa/PS/FVa/FVIIIa.
356
quer le désassemblage des complexes anticoagulants déjà
formés [10]. On s’attendrait à ce que, en limitant l’accès aux
phospholipides anioniques, les complexes auto-immuns
miment les effets des anticoagulants oraux qui diminuent
l’affinité des facteurs vitamine K-dépendants pour la membrane. La résultante devrait être en faveur d’un état anticoagulant plutôt que procoagulant, ce qui n’est pas le cas. Des
travaux récents sur les composants membranaires nécessaires au support des complexes procoagulants versus anticoagulants peuvent expliquer pourquoi les aPL perturbent préférentiellement le système anticoagulant. Le complexe
anticoagulant de la PCa fonctionne de manière optimale
lorsque la membrane expose de la phosphatidyléthanolamine (PE) ou bien lorsque les phospholipides membranaires
sont sous forme oxydée, éléments qui n’ont par contre pas
d’influence sur les complexes procoagulants [11,12]. Safa
et al. [13] ont montré que l’inhibition de l’activité anticoagulante de la PCa par les complexes anti-b2GP1/b2GP1 était
favorisée par la présence de phospholipides contenant de la
PE oxydée, résultats également retrouvés en utilisant des aPL
purifiés de patients présentant un SAPL associé à des thromboses. Le fait que dans le SAPL on retrouve un taux de lipides
oxydés plus important que chez des sujets sains corrobore ce
concept. Ceci révèle l’existence d’un lien étroit entre l’activité
thrombogène des aPL et l’état d’oxydation des membranes
cellulaires.
Les aPL ont aussi d’autres actions dans le système anticoagulant. Ils interfèrent dans l’inhibition du facteur X activé par le
complexe protéine Z/protein Z-dependent-protease inhibitor
et par le TFPI (tissue factor pathway inhibitor). Ils peuvent
inhiber l’activité de l’antithrombine en se fixant de manière
compétitive sur les héparan sulfates par l’intermédiaire de
leurs charges négatives, favorisant ainsi la formation de
fibrine par la thrombine [14]. D’autres dysfonctionnements
du système fibrinolytique sont retrouvés chez les SAPL dont
une augmentation de la sécrétion de PAI-1 par les cellules
endothéliales (CE) activées ; la présence d’anticorps antiannexine A2 pouvant inhiber la fixation du tPA ou du plasminogène à la surface des CE [15] ; la présence chez certains
patients d’anticorps anti-tPA et antiplasmine ; et enfin, un effet
inhibiteur de la b2GP1 sous forme clivée sur la fixation du
plasminogène à l’annexine A2. Tous ces effets favorisent le
maintien du thrombus.
Activation cellulaire
Les aPL en présence de b2GP1 sont capables d’activer les
cellules telles que les CE, les monocytes, les plaquettes et les
fibroblastes. Des études in vivo chez la souris ont mis en
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évidence que l’activation des CE par les aPL joue un rôle
important dans le SAPL. En effet, l’injection d’aPL humains
chez la souris induit une augmentation de taille du thrombus
formé après lésion de l’endothélium [16]. La formation du
thrombus est réduite de manière significative dans le cas de
souris déficientes en molécules d’adhésion leucocytaires
ICAM, V-CAM, E-Selectine ou P-Selectine [17]. De plus, il a
été montré que les aPL induisent le relargage par les CE de
microparticules porteuses d’une activité procoagulante, et
que le taux de microparticules circulantes dérivées de l’endothélium était plus élevé chez les patients avec un SAPL [18].
Ceci implique que l’activation de l’endothélium vasculaire
par les aPL constitue un mécanisme thrombogénique important dans cette pathologie.
Plusieurs études in vitro ont montré que les anticorps antib2GP1 reconnaissent la b2GP1 présente à la surface des
CE, et activent les CE, ce qui entraîne une augmentation de
l’expression des molécules d’adhésion leucocytaires, du facteur tissulaire, ainsi que de la sécrétion de chémokines et
cytokines inflammatoires (MCP1, IL6, IL1). Ces facteurs sont
responsables de l’attraction, l’adhésion et l’activation des
cellules du système immunitaire (leucocytes, monocytes).
Celles-ci vont contribuer à l’amplification locale des activités
procoagulantes et pro-inflammatoires et augmenter le risque
d’occlusions thrombotiques [19, 20].
Les monocytes jouent également un rôle important dans le
risque thrombotique lié à la présence des aPL. Leur activation
par les aPL a pour effet d’augmenter l’expression du facteur
tissulaire par les monocytes [21]. De plus, les monocytes
produisent de la b2GP1, ce qui favorise leur activation par
les anticorps anti-b2GP1 [22].
Les plaquettes sont également la cible des aPL. Il a été montré
que les complexes immuns anti-b2GP1/b2GP1 favorisent
l’activation des plaquettes et leur dépôt sur le sousendothélium en condition de flux [23].
Ainsi, les CE, les monocytes et les plaquettes participent de
façon directe et coopérative dans le développement et/ou le
maintien d’un état hypercoagulant chez les patients avec
un SAPL.
Mécanismes d’activation des cellules
par les aPL, récepteurs
et voies de signalisation
Les mécanismes d’activation des cellules par les aPL sont peu
connus et font actuellement l’objet d’une recherche intensive.
Le point commun de ces mécanismes, que ce soit pour les CE,
pour les monocytes et pour les plaquettes, est la nécessité de
la présence de la b2GP1 dans le système. Il a été montré que
les anticorps anti-b2GP1 lient la b2GP1 à la surface des
cellules endothéliales isolées de cordons ombilicaux
(HUVEC), que ces anticorps sont internalisés, qu’ils s’accumulent dans les endosomes tardifs et bloquent le trafic protéique
entre l’appareil de Golgi et les endosomes [24, 25]. Cependant, les récepteurs membranaires des aPL à la surface
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cellulaire sont encore mal connus. Récemment, un certain
nombre de protéines ont été identifiées comme acteurs potentiels dans l’activation cellulaire induite par les aPL soit comme
récepteurs, soit comme cofacteurs.
Protéines impliquées dans l’activation
des cellules endothéliales
Rôle de l’annexine A2
Les travaux de Ma et al. [26] ont mis en évidence la présence
d’un récepteur pour la b2GP1 à la surface des cellules
endothéliales. Il s’agit de l’annexine A2 connue pour son rôle
dans le système fibrinolytique comme corécepteur du plasminogène et de l’activateur tissulaire du plasminogène ou t-PA
[27]. L’annexine A2 est exprimée sous forme tétramérique
comprenant 2 molécules d’annexine A2 en vis-à-vis associées chacune à une molécule cofacteur p11. Environ 4 % de
l’annexine A2 synthétisée par les CE est associé à la face
externe de la membrane plasmique par l’intermédiaire d’interactions calcium dépendantes avec les aminophospholipides
membranaires. Des études de cinétique de liaison utilisant les
HUVEC ont déterminé que la b2GP1 se lie à l’annexine A2
avec une forte affinité [26]. Zhang et McCrae [28] ont
démontré que les anticorps anti-b2GP1 de patients, en présence de b2GP1, ou bien des anticorps anti-annexine A2
activaient les CE alors que les fragments F(ab) obtenus par
digestion de ces mêmes anticorps n’étaient pas capables
d’induire la stimulation des cellules. En revanche, l’utilisation
des parties F(ab’)2 des anticorps anti-b2GP1 ou antiannexine A2 produisait une stimulation cellulaire. Ils en
concluent que l’activation des CE nécessite un cross-linkage
de l’annexine A2 aussi bien par les anticorps anti-annexine
A2 que par les anticorps anti-b2GP1 mais, pour ces derniers,
l’interaction avec l’annexine A2 est dépendante de la b2GP1
(figure 2). Ces expériences confirment également que la
stimulation des cellules ne fait pas intervenir les récepteurs
FccR2 comme démontré précédemment [29]. Le crosslinkage de l’annexine A2 par les anticorps n’est pas suffisant
en soi pour transmettre un signal intracellulaire car l’annexine
A2 n’est pas une protéine transmembranaire. Cela implique
qu’un récepteur membranaire doit nécessairement faire partie du complexe protéique. Ce récepteur pourrait interagir
soit avec l’annexine A2, soit avec la b2GP1, soit avec les
deux. On pourrait imaginer un modèle où la b2GP1 liée à
l’annexine A2 interagit avec le récepteur en formant une
entité protéique trimérique. Le cross-linkage de deux b2GP1
ou de deux annexines A2 par les anticorps entraînerait la
dimérisation du récepteur se qui provoquerait un signal
intracellulaire (figure 2).
Rôle des récepteurs toll-like (TLR)
La signalisation intracellulaire induite dans les CE par les aPL
implique les facteurs transcriptionnels NF-kB et MAPkinase
p38 [30–32], les médiateurs intracellulaires TRAF-6 et
Myd88 [33]. Ces deux derniers fonctionnent principalement
avec une famille de récepteurs dénommée les récepteurs
toll-like (TLR) (figure 3). Il existe dix TLR fonctionnels chez
357
Anti-β2GP1
β2GP1
Annexine A2
Récepteur ?
I
I
II
II
III
III
IV
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P11
IV
V
V
P11
Signal
Figure 2. Modèle d’interaction des complexes anticorps anti-b2GP1/b2GP1 avec l’annexine A2 à la surface des cellules activées.
L’annexine A2 est fixée à la surface membranaire grâce à des interactions charges-dépendantes avec les phospholipides anioniques ( ).
La b2GP1 interagit avec les phospholipides anioniques de la membrane et l’annexine A2 par l’intermédiaire de son domaine 5.
Les anticorps anti-b2GP1 induisent un cross-linkage de l’annexine A2 en fixant deux molécules de b2GP1 au niveau de leur domaine I.
La transmission d’un signal nécessite la présence d’un récepteur encore inconnu qui interagit soit avec l’annexine A2 soit avec la b2GP1
soit avec les deux. La dimérisation des complexes annexine A2/b2GP1 par les anticorps anti-b2GP1 entraînera la dimérisation du
récepteur et le signal d’activation.
358
l’homme. Les TLR interviennent dans l’immunité innée en tant
que premiers détecteurs de pathogènes. Ils reconnaissent de
façon très spécifique des motifs pathogéniques présentés par
un grand nombre de bactéries, virus ou champignons et ils
déclenchent la réponse immune spécifique. Ces récepteurs
sont pour la plupart sous forme d’homodimère. Seul le TLR2
forme un hétérodimère avec ses corécepteurs TLR1 ou TLR6, ce
qui augmente sa capacité de discrimination. En effet, les
TLR2/TLR1 reconnaissent les lipopeptides triacylés présents
dans la paroi des bactéries Gram-positives alors que les
TLR2/TLR6 reconnaissent les lipopeptides diacylés. Le TLR4
reconnaît spécifiquement le lipopolysaccharide (LPS) des bactéries Gram-négatives, le TLR5 des épitopes structurels de la
flagelline bactérienne. Le TLR3 et les TLR7 et TLR8 reconnaissent respectivement les RNA double brins et les RNA simple
brin des virus. Le TLR9 reconnaît spécifiquement les motifs
CpG non méthylés des molécules d’ADN bactériens. Les
récepteurs TLR3, TLR7, TLR8 et TLR9 sont intracellulaires,
localisés dans les endosomes, alors que les récepteurs TLR4,
TLR2, TLR1 et TLR6 sont exprimés à la surface des cellules,
essentiellement les cellules épithéliales, les cellules dendritiques, les lymphocytes, les monocytes/macrophages et les
plaquettes [34]. Les TLR fonctionnent sous forme de complexes
multiprotéiques hétérotypiques avec des protéines accessoires
dont le rôle est de reconnaître le ligand et de le diriger vers le
TLR correspondant. Le CD14 est une des protéines accessoires
clés du système. Il est capable de reconnaître aussi bien le LPS
que les lipopeptides di- et tri-acylés et selon la nature du
ligand, il va interagir spécifiquement avec le TLR4 ou bien les
hétérodimères TLR1/TLR2 ou TLR6/TLR2 [35]. Les autres protéines accessoires connues sont le récepteur scavenger CD36
et le CD11b/CD18 qui fonctionnent avec le TLR2 [36],
le MD2 spécifique du TLR4 [37] et le récepteur CD32
(FCgammaR2A) qui lui fonctionne avec le TLR9 [38].
Les grandes étapes des mécanismes de stimulation via les TLR
sont similaires que ce soit pour les récepteurs extracellulaires
ou intracellulaires. Tout d’abord, il y a reconnaissance et
liaison du ligand sur la ou les protéines accessoires qui sont
localisées dans les domaines membranaires riches en lipides
(domaine raft). Il s’ensuit le recrutement du TLR spécifique au
ligand dans le domaine raft et la formation du complexe
hétérotypique à partir duquel est généré le signal intracellulaire. Le complexe multiprotéique est ensuite internalisé par la
voie endosomale dépendante des clathrines vers l’appareil
de Golgi où les différentes protéines seront soit recyclées soit
détruites [37, 39]. Dans le cas des TLR intracelluaires, le
ligand sera internalisé lié à la protéine accessoire dans les
endosomes où il entrera en contact avec le TLR et le signal
stimulateur sera généré à partir de l’endosome [38].
Certains TLR ont été impliqués dans les mécanismes inflammatoires développés au cours de maladies auto-immunes. Ils
peuvent reconnaître « par défaut » des molécules endogènes
modifiées et enclencher une réponse inflammatoire chronique. Par exemple, le TLR9 joue un rôle dans le lupus érythémateux systémique (LES) : en reconnaissant les motifs CpG
des molécules d’ADN composant les complexes immuns
Hématologie, vol. 14, n° 5, septembre-octobre 2008
Triacylés
Lipopetides
LPS
Diacylés
TLR4
TLR2/TLR1
TLR5
CD14
CD36
MD2
TLR6/TLR2
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TRAM
TIR
TRIF
TIRAP
Myd88
TRAF6
TRAF6
IRAK4
IRAK1
P
Endosome
P
ARN
TLR9
TRAF6
ADN
TBK1
IRAK1
P
MAPKs
TLR3
P
NF-kB
TLR7/8
IRF3
Cytokines pro-inflammatoires
INF-β
Figure 3. Fonctionnement des récepteurs toll-like. Les TLR sont exprimés à la surface membranaire ou dans les endosomes et
reconnaissent des motifs pathogéniques spécifiques. L’interaction du pathogène avec le TLR correspondant entraîne une dimérisation du
récepteur et un signal stimulateur est transmis. Il comprend le recrutement des médiateurs Myd88 et TIRAP au niveau des domaines TIR
des TLR. Il s’ensuit le recrutement de l’enzyme IRAK4 et du complexe TRAF6-IRAK1. IRAK4 induit la phosphorylation de IRAK1 ce qui
libère le complexe TRAF6-IRAK1 qui va alors pouvoir activer les MAPkinases et NF-kB. Une voie alterne existe pour le TLR4 employant le
médiateur TRIF complexé au TRAM. Cette voie stimule spécialement la synthèse de INFb. TLR3 fonctionne également avec les
médiateurs TRIF/TRAM.
anticorps antinucléaire/ADN, il induit la stimulation des
cellules immunitaires et la production d’IL8 et d’IFNa [38].
Le TLR2 est impliqué dans l’arthrite rhumatoïde en induisant la
production de chémokines inflammatoires par les fibroblastes
synoviaux [40]. Il n’est donc pas étonnant de retrouver cette
famille de récepteurs impliquée dans le SAPL. Actuellement,
les travaux de recherche ont pour but d’identifier lequel des
TLR est le principal responsable de la stimulation des cellules
par les aPL. En utilisant un modèle murin de thrombose induite
Hématologie, vol. 14, n° 5, septembre-octobre 2008
par la destruction de l’endothélium suite à une compression
de la veine, le groupe de Pierangeli [41] a montré que les
souris déficientes en TLR4 ayant eu une injection d’aPL
développent un thrombus de plus petite taille que les souris
sauvages utilisées dans les mêmes conditions. Ceci impliquerait un rôle du TLR4 dans la réponse aux aPL. Cependant,
l’utilisation d’un tel modèle donne une vue générale du
processus pathologique et ne démontre pas l’implication
directe du TLR4 dans la stimulation des CE par des aPL.
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Pour répondre à cela, il est plus approprié d’utiliser des
cellules isolées. Sachant que les aPL humains stimulent les
cellules murines (cf. modèle animal) et que les fibroblastes
sont capables de répondre à une stimulation provoquée par
des auto-anticorps (cf. cas de l’arthrite rhumatoïde), nous
avons utilisé des fibroblastes embryonnaires de souris déficientes pour le TLR1, TLR2, TLR6 ou TLR4. Ces cellules ont été
stimulées en présence de sérum, source de b2GP1, avec des
aPL de patients ou des anticorps anti-b2GP1 immunopurifiés.
Nous avons ainsi montré que le TLR2 est indispensable pour
l’activation des fibroblastes par les aPL, que le TLR1 est
probablement le corécepteur impliqué avec le TLR2 car la
réponse aux aPL des fibroblastes déficients en TLR1 était plus
faible que celle des fibroblastes déficients en TLR6. L’implication du TLR2 et non du TLR4 a été confirmée en utilisant les
fibroblastes sauvages et des anticorps bloquant la fonction
des TLR2 et TLR4 [42]. Ce résultat n’est pas forcément en
désaccord avec celui trouvé dans l’étude in vivo. Il est
possible que les deux TLR soient impliqués de manière
différente selon le type cellulaire. L’hétérogénéité des aPL
peut permettre d’envisager que certains aPL vont interagir
plutôt avec un TLR et d’autres plutôt avec l’autre. Il faut aussi
prendre en compte que l’expression et le fonctionnement des
TLR2 et TLR4 dans une même cellule sont interdépendants
entraînant une régulation de l’un par rapport à l’autre. Par
exemple, nous avons observé que la réponse des fibroblastes
déficients en TLR4 aux agonistes du TLR2 est plus forte que la
réponse des fibroblastes normaux. Ceci sous-entend que la
présence du TLR4 va influencer la réponse via le TLR2 et
vice-versa [42]. De plus, nous avons aussi observé que des
stimuli inflammatoires (LPS, TNFa et l’IL1b) induisent une forte
augmentation des ARN messagers du TLR2 et une diminution
des ARN messagers du TLR4 dans la CE (voir ci-dessous). Il se
peut donc que dans les souris déficientes en TLR4, le niveau
d’expression du TLR2 dans l’endothélium soit plus bas que
celui des souris sauvages ce qui peut expliquer pourquoi le
développement du thrombus est moins important dans les
souris déficientes en TLR4 que dans les souris sauvages. Le
fonctionnement des TLR fait appel à des multicomplexes
protéiques dont les intervenants dans la stimulation par les
aPL ne sont pas encore tous connus. Des différences au
niveau de la représentation des protéines accessoires entre le
modèle murin in vivo et le modèle cellulaire peuvent exister
privilégiant un TLR en faveur de l’autre.
360
Un modèle cellulaire probablement plus adapté à la pathologie que le fibroblaste est la CE humaine. Celle-ci est cependant plus difficile à exploiter car la CE ne répond que
faiblement à la stimulation des aPL. En quantifiant les ARN
messagers des TLR dans les HUVEC, nous avons constaté que
l’expression du TLR2 est très faible comparée à celle du TLR4,
mais cette expression est fortement augmentée suite à une
stimulation inflammatoire (TNF, LPS, IL1) alors que l’expression du TLR4 est plutôt diminuée et celle des TLR1 et TLR6 reste
inchangée (résultats non publiés). Nous avons également
trouvé que l’activation des HUVEC par des aPL est inhibée
par un anticorps bloquant anti-TLR2 mais pas par un anticorps bloquant anti-TLR4 et que cette activation est partiellement inhibée par un anticorps anti-CD14. Ceci semble indiquer que le TLR2 et le CD14 ont un rôle dans le mécanisme de
stimulation des CE par les aPL. De plus, le blocage du CD14
par un anticorps anti-CD14 ou l’utilisation de la nystatine,
une drogue qui désagrège les rafts, abroge l’internalisation
des aPL, ce qui indique que la clairance des complexes
aPL/récepteurs de la surface cellulaire emploie la voie endosomale [43]. Nos résultats suggèrent donc que dans la CE,
les aPL agissent via le TLR2 et le CD14 et que le CD14 soit
indispensable à l’internalisation des complexes dans les
endosomes via les rafts. Il ne faut pas oublier que la b2GP1,
l’annexine A2 et certainement d’autres protéines accessoires
jouent également un rôle rendant ce mécanisme encore plus
complexe. Les mécanismes d’activation des CE par les aPL ne
seront réellement élucidés que lorsque l’on aura établi avec
précision la séquence des interactions entre les autoanticorps, les cofacteurs et les récepteurs et le rôle de chacun.
Différents travaux ont montré que, in vivo, la formation des
complexes anticorps anti-b2GP1/b2GP1 ne pouvait induire
le développement de thrombus sans un facteur initiateur
d’ordre inflammatoire qui prédisposerait l’endothélium à
répondre aux aPL (concept du « two-hit ») [44]. Le fait que
l’expression du TLR2 dans les CE est augmentée suite à une
stimulation inflammatoire, rendant ainsi ces récepteurs disponibles aux complexes anti-b2GP1/b2GP1, corrobore ce
concept.
Protéines impliquées dans l’activation
des monocytes
Le monocyte est la cellule centrale du couplage
inflammation/thrombose. En tant que cellule phagocytaire,
le monocyte a un rôle prépondérant dans le système immunitaire inné. Il exprime tous les TLR ce qui lui permet de
discriminer les pathogènes phagocytés et de coordonner la
réponse inflammatoire. De plus, suite à une stimulation infectieuse ou inflammatoire, il va exprimer un phénotype procoagulant (exposition du facteur tissulaire et des phospholipides
anioniques) qui sera propagé par émission de microparticules dans la circulation [45]. Le monocyte activé stimule la CE
par l’intermédiaire des cytokines sécrétées entraînant
l’expression des molécules d’adhésion qui vont lui permettre
d’adhérer à l’endothélium. Ainsi le monocyte va contribuer à
amplifier localement la réponse thrombotique.
Il est largement démontré que les aPL activent les monocytes
et induisent la production de facteur tissulaire [21, 22].
D’ailleurs, chez les patients ayant un SAPL, les monocytes
circulants expriment plus de facteur tissulaire que ceux des
sujets sains [46]. L’induction du facteur tissulaire par les aPL
fait intervenir les voies de signalisation dépendantes de la
MAPkinase p38, de la phosphorylation des protéines MEK1/ERK, et de la translocation nucléaire du facteur transcriptionnel NF-kB [21]. Cependant, les complexes protéiques
responsables de la transmission du signal ne sont pas
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connus. Comme les TLR ont un rôle central dans le fonctionnement des monocytes, il est fort probable que ces récepteurs
aient également un rôle à jouer dans les mécanismes d’activation des aPL. Il en est de même des récepteurs scavengers
tel que le CD36 ou des molécules accessoires telles que le
CD14 qui ont un rôle important dans la reconnaissance des
lipides oxydés, de la phosphatidylsérine, des lipopetides. Les
travaux récents de Sorice et al. [47] amènent quelques
éléments laissant d’entrevoir les grandes lignes d’un mécanisme. Ils ont montré que l’incubation des monocytes avec les
anticorps anti-b2GP1 entraîne le recrutement du TLR4 dans
les domaines rafts de la même manière que le LPS et que la
signalisation intracellulaire induite par les anticorps antib2GP1 nécessite l’intégrité des rafts. Il reste cependant à
démontrer que la stimulation cellulaire est transmise par le
TLR4. Comme le monocyte exprime également à sa surface le
TLR2 et ses corécepteurs, l’utilisation d’anticorps bloquant la
fonction des TLR semble le meilleur moyen indiqué pour
déterminer lequel des TLR est impliqué dans la transmission
du signal.
Protéines impliquées dans l’activation
des plaquettes
L’activation des plaquettes in vivo peut être mesurée de
manière indirecte par quantification des métabolites du
thromboxane A2 dans les urines des patients. Dans le cas du
SAPL, la quantité des métabolites est supérieure à la normale
ce qui est un indicateur de la présence de plaquettes activées
chez ce groupe de patients [48]. Plusieurs autres travaux
indiquent également que les aPL peuvent activer les plaquettes in vivo [44]. Dans les tests de coagulation, les aPL
présentant une activité lupus anticoagulant sont responsables
du prolongement des temps de coagulation en interagissant,
de façon dépendante de la présence de b2GP1, avec les
surfaces chargées négativement. C’est sous forme dimérique,
induite par la fixation des anticorps anti-b2GP1, que la
b2GP1 a la plus forte affinité pour les phospholipides
membranaires et peut entrer en compétition pour la fixation
des facteurs de la coagulation. Les complexes antib2GP1/b2GP1 ainsi formés sont capables de stimuler les
plaquettes mais cette stimulation nécessite la présence d’un
récepteur [49]. Lutters et al. [49] ont montré que la protéine
RAP (receptor associated protein), inhibiteur universel de la
famille des récepteurs aux LDL, bloquait complètement l’activation et l’adhésion des plaquettes au collagène induite par
les complexes anti-b2GP1/b2GP1. Cette observation les a
conduits à s’intéresser au récepteur ApoER2’, le seul représentant de la famille des LDL-R exprimé par la plaquette. Le
mécanisme d’activation est en partie connu. Les anticorps
anti-b2GP1 en interagissant avec la b2GP1, induisent sa
dimérisation et augmentent son affinité pour la membrane
des plaquettes. En conséquence, les complexes antib2GP1/b2GP1 vont s’accumuler sur la surface membranaire
et par un simple processus d’action de masse augmenter les
possibilités d’interaction avec le récepteur ApoER2’. L’interHématologie, vol. 14, n° 5, septembre-octobre 2008
action des anticorps anti-b2GP1 avec la b2GP1 provoque
également un changement de conformation de la protéine
entraînant l’apparition d’un site d’interaction avec
l’ApoER2’. Les domaines 1 et 5 de la b2GP1 interagissent
avec l’ApoER2’. La b2GP1 peut interagir de la même
manière avec les autres membres de la famille de récepteurs
LDL dont le VLDL-R [50]. L’interaction des complexes antib2GP1/b2GP1 avec l’ApoER2’ induit la phosphorylation du
récepteur ce qui résulte en la synthèse du thromboxane A2
(figure 4). Celui-ci induit une hypersensibilisation de la plaquette. Ainsi les aPL ont pour effet de rendre les plaquettes
plus sensibles et prêtes à répondre à des doses plus faibles
d’agonistes.
D’autres travaux ont montré que la sous-unité GPIba du
récepteur GPIba/IX/V présente sur les plaquettes peut lier la
b2GP1 via les domaines 2 et 5. Le cross-linkage de deux
molécules de b2GP1 par les anticorps anti-b2GP1 est nécessaire pour induire une stimulation via la GPIba ce qui sousentend que ce récepteur doit être sous forme dimérique pour
transmettre un signal. La stimulation induite utilise les voies de
la MAPkinase p38 et de PI3-kinase/Akt et contribue à la
production de thromboxane A2 et à la stimulation de l’intégrine aIIb3b [51]. Pennings et al. [52] ont récemment mis en
évidence par des expériences de coprécipitation que la
GPIba et le récepteur ApoER2’ forment un complexe à la
surface des plaquettes. Ce complexe interagit avec la b2GP1
sous forme de dimère et augmente l’adhésion des plaquettes
au collagène dans des conditions de flux veineux ou artériel.
Il semble donc que les deux récepteurs ApoER’2 et GPIba
fonctionnent en coopération pour fixer les complexes antib2GP1/b2GP1 et pour former le multicomplexe capable de
transmettre des signaux activateurs de la plaquette.
Synthèse et réflexions autour
de l’hypothèse du « two-hit »
L’implication de différents récepteurs et cofacteurs dans l’activation des cellules par les aPL, montre combien les mécanismes mis en jeu sont complexes et variables selon le type
cellulaire. Cependant un certain nombre d’éléments communs ressortent. Le premier est le rôle central de la b2GP1
sous forme de dimère, qui permet l’opsonisation des aPL à la
surface membranaire. Deuxièmement, c’est par la b2GP1
que l’interaction avec les récepteurs se fait, provoquant une
dimérisation ou oligomérisation des récepteurs nécessaire à
la transmission du signal. Troisièmement, tous les récepteurs
pouvant avoir un rôle dans la transmission du signal sont des
récepteurs qui reconnaissent des lipides, ou lipoprotéines. Le
quatrième élément est une implication évidente des domaines
rafts des membranes dans le processus. Tous ces éléments
forment actuellement un puzzle. Trouver les pièces manquantes permettra de comprendre le ou les mécanismes cellulaires
pathologiques des aPL. Il est à considérer que ces mécanismes quels qu’ils soient doivent pouvoir expliquer pourquoi
malgré la présence d’un taux d’auto-anticorps circulants
élevés, les patients avec SAPL ne développent pas systémati-
361
β2GP1
GP1bα
ApoER2'
Augmentation
de l'affinité
S
S
S
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Interaction
Thromboxane A2
Synthèse et sécrétion
αllbβ3
Activation
P
COOH
COOH
MAPK P38
P13-kinase/Akt
Figure 4. Modèle de sensibilisation des plaquettes par les complexes anti-b2GP1/b2GP1 (d’après [51,52]).
Les anticorps anti-b2GP1 induisent la dimérisation de la b2GP1 ce qui augmente son affinité pour la membrane. La fixation du complexe
sur la membrane entraîne un changement conformationnel de la b2GP1 faisant apparaître un site de liaison pour le récepteur ApoER2’ et
pour la GPIba. La dimérisation des deux récepteurs par la b2GP1 induit un signal intracellulaire aboutissant à la synthèse de thromboxane
A2 et à la stimulation de l’intégrine aIIbb3.
quement ou de manière permanente des complications thrombotiques. Cette constatation clinique est à l’origine du concept
du « two-hit » qui suggère que les aPL interviendraient en
second lieu d’un facteur initiateur d’ordre infectieux ou inflammatoire et exacerberaient la réponse. Deux observations tirées
des mécanismes de stimulation cellulaire de la plaquette et de
la cellule endothéliale soutiennent cette idée. En premier lieu,
les anticorps anti-b2GP1 induisent une pré-activation des plaquettes. Celles-ci seront plus aptes à répondre à des faibles
doses d’agonistes. La deuxième observation concerne le faible
taux d’expression de TLR2 par les cellules endothéliales. Ceci
expliquerait pourquoi en condition normale l’endothélium n’est
pas sensible aux aPL, alors que lors d’un épisode infectieux,
une exposition à des agents inflammatoires ou infectieux
entraînerait l’augmentation de l’expression du TLR2 par la
cellule endothéliale et la rendrait alors capable de répondre
aux aPL. Cette réponse, qui est essentiellement de favoriser
l’adhésion des monocytes, leucocytes et plaquettes et de les
activer in situ, place l’endothélium au centre des mécanismes
pathologiques du SAPL. En tous les cas, ces deux observations
pourraient expliquer pourquoi la présence des aPL ne fait
qu’augmenter le risque de thrombose.
Perspectives thérapeutiques
362
Les traitements appliqués en cas de SAPL peuvent être des
traitements préventifs ou curatifs du problème thrombotique,
soit par administration d’agents antithrombotiques (antiplaquettaires ou anticoagulants, soit plus rarement par des
traitements modulant la réponse immune tels que stéroïdes et
immunoglobulines). Ces traitements ont des effets secondaires non négligeables. Une meilleure connaissance des mécanismes d’activation cellulaire par les aPL, que ce soit au
niveau des récepteurs membranaires initiateurs du signal ou
bien de la signalisation intracellulaire impliquée, permettrait
de concevoir des thérapies plus adaptées. Quel que soit le
type cellulaire, la signalisation intracellulaire induite par les
aPL dépend de la MAPkinase p38 et du facteur transcriptionnel NF-kB. L’utilisation in vitro d’inhibiteurs de la MAPkinase
p38 entraîne une réduction de 40 % de l’activité du facteur
tissulaire des CE stimulées par des aPL [32] ou bien de la
production de thromboxane A2 par les plaquettes. L’utilisation in vivo d’inhibiteurs de la MAPkinase p38 diminue la
taille de thrombus induit par l’injection d’aPL, abroge
l’expression des molécules d’adhésion VCAM-1 par l’endothélium et l’adhésion des monocytes [53]. Le potentiel thérapeutique des inhibiteurs de la MAPkinase p38 est très attractif à cause du rôle central que cette enzyme tient dans la
réponse inflammatoire et spécialement dans le cas des maladies auto-immunes. Depuis plusieurs années, on assiste à une
recherche intense dans ce domaine pour découvrir des
inhibiteurs de plus en plus spécifiques de la p38 et utilisables
en clinique. Actuellement, un certain nombre d’entre eux sont
entrés en essais cliniques et déjà plusieurs rapports ont attesté
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de l’effet bénéfique de l’administration orale des inhibiteurs
de p38 dans le cas de l’arthrite rhumatoïde. Dans un futur
proche, la gestion thérapeutique des maladies présentant
une exacerbation de la synthèse de cytokines proinflammatoires consistera à cibler la kinase p38 [54].
L’hydroxychloroquine gagne de l’intérêt comme agent thérapeutique du SAPL. L’hydroxychloroquine est utilisée de
manière efficace dans le traitement du lupus érythémateux
systémique (LES). Par son action anticoagulante, elle réduit le
risque de thrombose chez les patients présentant un LES avec
des aPL. Elle réduit également la taille et le temps de persistance du thrombus dans un modèle de souris injectées avec
des aPL, très certainement en inhibant l’expression de la
glycoprotéine GPIIb/IIIa induite dans les plaquettes par les
aPL [55]. Son effet immuno-modulateur caractérisé entre
autres par le blocage de la voie endosomale est déjà utilisé
dans l’arthrite rhumatoïde ou le LES et pourrait être bénéfique
en cas de SAPL. Cependant, selon notre expérience, la
chloroquine n’a pas d’effet inhibiteur sur l’activation des CE
par les aPL (données non publiées). Ceci peut s’expliquer par
le fait que le signal de stimulation cellulaire est induit par les
aPL au niveau de la membrane alors que dans les deux autres
maladies auto-immunes, il est généré à partir des endosomes
dans lesquels se trouvent internalisés les complexes autoimmuns. L’effet immuno-modulateur de l’hydroxychloroquine
s’explique aussi par son action inhibitrice sur l’activation des
lymphocytes T et B. Cet effet inhibiteur du système immunitaire pourrait être plus utile dans le cas de patients présentant
un SAPL et ne supportant pas un traitement d’anticoagulants
oraux ou bien pour ceux, qui malgré une anticoagulation
adéquate, présentent toujours des épisodes thrombotiques.
Parmi les récepteurs potentiellement impliqués dans le SAPL,
les TLR émergent par leur rôle prépondérant dans de multiples
pathologies infectieuses et inflammatoires. Ils sont donc devenus des cibles très prisées d’un point de vue pharmacologique. Parmi les agents thérapeutiques potentiels, on trouve
des anticorps neutralisant l’interaction ligand-récepteur, des
molécules ciblant la signalisation intracellulaire, une des
cibles actuelles étant l’enzyme IRAK4 (figure 3), ainsi que des
peptides bloquant les interactions protéine/protéine des
médiateurs de la signalisation. Les connaissances actuelles
de la structure des domaines intracellulaires des TLR2 et TLR4
(domaine TIR) ont mis en évidence les acides aminés impliqués dans l’interaction avec l’adapteur Myd88, ce qui a
permis de dessiner des peptides perméables à la cellule
bloquant spécifiquement l’un ou l’autre des récepteurs [56].
Ces peptides constituent une nouvelle classe d’agents thérapeutiques qui vont probablement être conceptualisés et développés par l’industrie pharmaceutique dans les prochaines
années.
Conclusion
L’implication des récepteurs TLR et d’un représentant de la
famille des récepteurs LDL-R ainsi qu’un certain nombre de
Hématologie, vol. 14, n° 5, septembre-octobre 2008
cofacteurs protéiques dans l’activation cellulaire par les aPLconstitue une grande avancée dans la connaissance des
mécanismes d’action des aPL. Ces deux familles de récepteurs ont en commun de reconnaître des lipoprotéines, de
fonctionner en association avec des récepteurs scavengers et
d’être impliquées dans la réponse inflammatoire. Elles interviennent déjà ensemble dans des pathologies inflammatoires
comme, par exemple, dans l’athérosclérose. Une meilleure
connaissance du fonctionnement de ces récepteurs pourra
conduire au développement de traitements thérapeutiques
plus ciblés non seulement dans le cas du SAPL mais également pour d’autres maladies auto-immunes. Un grand nombre de questions concernant le SAPL demeurent encore en
suspens : quels sont les mécanismes qui contribuent à la
production des aPL, pourquoi certains aPL sont-ils plus pathogènes que d’autres, quel est le facteur déclenchant des
manifestations cliniques, existe-t-il un facteur ou des facteurs
qui prédisposeraient à la thrombose veineuse plutôt qu’artérielle ou bien encore aux complications obstétricales ? De
larges études multicentriques menées dans le but de trouver
une association entre les manifestations cliniques et la présence d’un groupe particulier d’aPL pourront apporter une
réponse quant à la nature pathologique des aPL et permettront de mieux définir leur rôle dans le développement de
complications thrombotiques. Il semble aussi important de
déterminer quelles sont, parmi les multiples interactions de la
b2GP1 décrites actuellement, celles qui ont un rôle physiologique prépondérant. Ces connaissances permettront de définir les mécanismes pathologiques qui conduisent aux manifestations cliniques associées au SAPL. Ces mécanismes
devront pouvoir expliquer ce qui fait basculer un SAPL
présentant uniquement des anticorps circulant vers un SAPL
avec complications thrombotiques. ■
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