Biologie cellulaire
publicité
UE: Biologie cellulaire Licence 1 - Année 2016- 2017 Semestre 1 Cours magistraux (CM) Travaux dirigés (TD) Travaux pratiques (TP) Responsable : Hanna Hlawaty [email protected] Biologie cellulaire Travaux dirigés (TD) 6 TD au total 1TD = 2h contrôle continu (CC) sous forme de TD noté •exercices •QCM •questions simples des cours •mots croisées/définitions •texte à trou Biologie cellulaire Travaux pratiques (TP) Compte-rendu TP=3h 3 TP au total 1. Etude de l’ovogenèse 2. Etude de l’osmose 3. Extraction d’ADN •RETARD RESPECT •changement de groupe professeurs + collègues + matériel •cheveux non attachés •téléphone portable •casquette travail en équipe travail en blouse prévenir en cas de retard dû à la SNCF / RATP •talons •nouriture absence sans justificatif = 0/20 UE: Biologie cellulaire Licence 1 - Année 2016- 2017 Cours magistraux (CM) Travaux dirigés (TD) Travaux pratiques (TP) Cours 2 : Le cytosquelette (Hanna Hlawaty) Cours 3 : Glucides, lipides, protéines I (Nathalie Charnaux) Cours 4: Glucides, lipides, protéines I (Nathalie Charnaux) Cours 5: Compartiments membranaires et trafic intracellulaire I (Hanna Hlawaty) Cours 6 :Compartiments membranaires et trafic intracellulaire Ii (Hanna Hlawaty) TD1: réviser les cours !!! Cours 7 :La meïose, La spermatogenèse (Anne Arlot) Cours 8 : L'ovogenèse, Fécondation (Anne Arlot) TD2: réviser les cours !!! Cours 9 :Membranes biologiques (Nathalie Charnaux) Cours 11 : Cycle cellulaire et Mitose (Anne Denys) TD3: réviser les cours !!! Cours 12 : Structure de l’ADN, Chromosome, La chromatine, La réplication I (Anne Denys) Cours 13 : Structure de l’ADN, Chromosome, La chromatine, La réplication II (Anne Denys) Cours 14 : Problèmes liés à la compartimentation (Anne Denys) TD4: réviser les cours !!! Cours 15 :Cytosol - Trafic des acides nucléiques (Anne Denys) Cours 16 : La traduction, Le noyau - Le nucléole I (Anne Denys) Cours 17 :Matrice extracellulaire (Nathalie Charnaux) Cours 18 : La traduction, Le noyau - Le nucléole II (Anne Denys) TD5: réviser les cours !!! Cours 19 : La production d’énergie dans la cellule (Anne Denys) Cours 20 :Communications intercellulaires et Jonctions cellulaires (Nathalie Charnaux) TD6: réviser les cours !!! (S1F1) Cours 10 :Membrane et antigène (Nathalie Charnaux) PLAN GENERAL DU COURS DE BIOLOGIE CELLULAIRE Cours 1 : Introduction à la biologie cellulaire (Hanna Hlawaty) Liste des livres et ouvrages à consulter Biologie cellulaire Biologie du développement Biologie moléculaire ETIENNE J. LEROY F. GILBERT S. F. Le vivant transparent Avec la collaboration de VERDIN S. Lavoisier (ed) Biologie du développement Biochimie génétique. Biologie moléculaire Masson (ed) De Boeck (ed) KARP G. LEWIN B. Biologie cellulaire et moléculaire Gènes VI Concepts et expériences De Boeck (ed) (Traduction par BOUHARMONT J.) De Boeck (ed) DE DUVE Chr. LE MOIGNE A. & FOUCRIER J. Une visite guidée de la cellule vivante Biologie du développement De Boeck (ed) Dunod (ed) DARNELL J.LODISH H.BALTIMORE D.BERK A.ZIPURSKY S.L.MATSUDAIRA P. Biologie moléculaire de la cellule De Boeck (ed) Dis moi et j'oublierai Montre moi et je me souviendrai Implique moi et je comprendrai Confucius Kung Fu Li 1665 : la notion de cellule a été introduite par Hooke (1635-1703) 1830 : Notion de cellules par Schleiden (1804-1881) et Schwann (1810-1882) « la cellule est l’unité structurale et fonctionnelle des plantes et Schwann des animaux » Schleiden 1855 : Rudolf Ludwig Karl Virchow (1821-1902) « Une cellule ne peut provenir que de la division d’une cellule déjà existante » 1886 : Zeiss (1816–1888) a fabriqué des lentilles qui ont permis au microscope optique d’améliorer sa résolution. D’où la possibilité à la fin du XIXe siècle de faire de la description de cellules et de tissus en microscopie optique Entre 1850 et 1900 correspond à la structure en microscopie optique. En même temps que l’outil s’est amélioré, il y a une amélioration des techniques de coloration. Techniques spécifiques. Golgi (1843-1926) et Cajal (1852-1934) (Prix Nobel 1906) : fin 19e : technique d’imprégnation : appareil de Golgi Santiago Ramon y Cajal : description des différents neurones qui existent dans l’organisme. C. Golgi 1930 : Microscope à contraste de phase Cajal 1931 : Construction du premier Microscope Electronique à Transmission (MET) ce qui a permis les premières publications en 1945 de la première description de la cellule. 1941 : Coons AH : localisation de molécules dans les tissus, dans les cellules grâce à la réaction antigène/anticorps. Technique d’immunofluorescence (IF : technique toujours utilisée). 1988 : Microscope confocal (3D) Il faut connaître les possibilités et les limites de l’outil pour connaître les bons résultats. Ordre de grandeur des objets biologiques microscope électronique à transmission microscope optique œil cm mm 0,1mm 10µm neurone ovocyte G.R. N CM squel adipocyte (7µm) (80 µm) 1 µm 0,1µm 10nm ribo. 1nm 1Å molec. atome mitochondrie lysosome épais. membrane Microscopies 1. Microscope photonique 2. Microscope à contraste de phase 3. Microscope électronique à transmission 4. Microscope électronique à balayage (3D) 5. Microscope à fluorescence 6. Microscope confocal (3D) 1. Schéma d'un microscope photonique œil Oculaire : x10 Objectif : x40 x400 épiderme d'oignon, coloré au violet de gentiane Lame de verre Condenseur Source lumineuse x400 un détail de la tête d'un acarien 2. Microscope à contraste de phase Augmentation de la brillance Diminution de la brillance SCHÉMA D'UN MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE À TRANSMISSION 3. Schéma d'un microscope électronique à transmission Cathode (filament chauffé) Anode (tension 40 à 100 kVolts) Condenseur Objet Objectif Granulocyte Projectif Ecran fluorescent Lymphocyte B Plaque photographique Procaryote Schéma d'une cellule eucaryote animale SCHÉMA D'UN MICROSCOPE ÉLECTRONIQUE À BALAYAGE 4. Schéma d'un microscope électronique à balayage Cathode (filament chauffé) Anode (tension 1 à 40 kVolts) Condenseur Spermatozoïde et ovule Bobines déflectrices du faisceau (⇒ balayage) Faisceau d’électrons mobile Détecteur d’e- Tête fourmi Electrons émis par l’objet Image TV Globules rouges Poils de sourcil humain La tête d’un moustique : Un pou sur un cheveux Des spermatozoïdes humain : Image en MET et en MEB MET MEB 2D 3D Protocoles : préparations des échantillons biologiques Fixation aldéhydes, alcool Ex:glutaraldéhyde Déshydratation bains d'éthanol ou d'acétone Inclusion en paraffine Inclusion en résines plastiques Coupe 5 µm Métallisation : or, platine Coupe < 0,1 µm Lame de verre 22 mm x 70 mm Coloration MO Contraste : uranium, plomb MET Échantillons massifs MEB Haute résolution Observation au microscope 5. Microscopie à fluorescence (a)source lumineuse (b)filtres qui sélectionnent λ pour l’excitation et l’émission (c)photodétecteur longueur d’onde d’excitation Préparation Détecteur λ2 Lampe U.V. λ2 λ1 λ1 filtre d'excitation : sélection de λ1 lumière fluorescente λ1 < λ2 filtre d'arrêt : ( de λ1) Image Fibroblastes de rat (microtubules, facteur protéique régulant la transcription de l'ADN, noyau). Cellule endothéliale de l'artère pulmonaire bovine SCHÉMA D'UN MICROSCOPE à fluorescence - noyaux - DAPI - microtubules- un anticorps (lié au FITC) - filament d’actine - la phalloïdine (liée à la TRITC) Cellules endothéliales d'une artère pulmonaire 6. Microscopie confocale 3D X, Y, Z Miroir dichroïque Système de détection Cellule Scanner X et y Acqisition z lasers SCHÉMA D'UN MICROSCOPE confocale Feuille de violette (limbe corneta) ADN : bleu (DAPI) 3D : human endothelial cells forming a functional vessel (PECAM-1, nuclei), (Wong/Searson Lab) Image en microscope photonique et confocale M. photonique M. confocale 2D 3D fluorescence Immunofluorescence, immunohistochimie, et autoradiographie Activité enzymatique Substrat Produit (que l’on veut visible) Produit coloré Ac primaire Ac secondaire : AC anti-anticoprs (IgG) fait chez la chèvre Ac primaire fait chez le lapin Billes d'or 1 à 20 nm MET Techniques en biologie cellulaire 1. Cryométrie en flux : FACS 2. Chromatographie 3. ELISA 4. Electrophorèse 5. Western Blot 6. Culture cellulaire 1. Cryométrie en flux : FACS (fluorescence-assisted cell sorting) Les cellules sont dispersées dans du sérum physiologique et passent à travers un faisceau de lumière laser. La diminution de l’intensité du faisceau direct permet de mesurer la masse cellulaire ou la masse d’ADN. Les cellules qui émettent de la fluorescence sont reconnues par une cellule photoélectrique particulière. cellules Cryométrie en flux : FACS Appareil: Résultats: cellules GRANULOCYTES Taille MONOCYTES LYMPHOCYTES Granulosité Parmi les paramètres mesurables par cytométrie en flux: - volume (taille) et complexité morphologique des cellules - contenu en acides nucléiques - quantification de l'ADN (étude du cycle cellulaire) - protéines - antigènes de surface - antigènes intracellulaires (cytosquelette, cytokines) - activités enzymatiques - fluidité membranaire (flux ioniques) - viabilité cellulaire - manifestations de l'apoptose - typage lymphocytaire pour le suivi du SIDA Techniques en biologie cellulaire 1. Cryométrie en flux : FACS 2. Chromatographie 3. ELISA 4. Electrophorèse 5. Western Blot 6. Culture cellulaire 2. Chromatographie 3 1 2 3 4 5 6 5 Techniques en biologie cellulaire 1. Cryométrie en flux : FACS 2. Chromatographie 3. ELISA 4. Electrophorèse 5. Western Blot 6. Culture cellulaire 3. ELISA ELISA Techniques en biologie cellulaire 1. Cryométrie en flux : FACS 2. Chromatographie 3. ELISA 4. Electrophorèse 5. Western Blot 6. Culture cellulaire 4. Principe de l'électrophorèse A Chauffage Chauffage en en présence présence de de SDS SDS et et d’un d’un agent agent réducteur réducteur des des ponts ponts disulfures disulfures A Molécules de SDS complexées aux protéines C B Protéines marqueurs de poids moléculaire B 116 000 Courant continu 97 000 C 66 000 A 48 000 + Piste 1 Piste 2 Piste 3 5. Western Blot + Migration des protéines dans le gel - Techniques en biologie cellulaire 1. Cryométrie en flux : FACS 2. Chromatographie 3. ELISA 4. Electrophorèse 5. Western Blot 6. Culture cellulaire 6. Culture cellulaire Dis moi et j'oublierai Montre moi et je me souviendrai Implique moi et je comprendrai Confucius Kung Fu Li Cryométrie en flux : FACS Phase G1 Phase G2 Phase S Qqt d’AND /cellule
