Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines

LE BAYON Jean-Christophe
Master de sciences, technologie et santé, mention génétique et biologie cellulaire
(GBC), spécialité génétique fonctionnelle et pathologie cellulaire (recherche) de
l’université Claude Bernard – Lyon I – Numéro d’immatriculation du ministère :
20070447
Mail : jc.le.bayon AT gmail POINT com
Étude des interactions fonctionnelles entre les glycoprotéines
d’enveloppe F et HN, impliquées dans le mécanisme d’entrée
cellulaire des virus parainfluenza humains et animaux.
Année 2009-2010 : première année de thèse
Résumé
L’entrée des paramyxovirus dans la cellule hôte nécessite, en général, l’implication
coopérative de deux glycoprotéines (GP) virales de surface. Chez les virus parainfluenza et
les avulavirus, ce rôle est joué par la GP d’ancrage hémagglutinine-neuraminidase (HN) et la
GP de fusion (F). L’activation de la GP F par la GP HN est nécessaire au processus de fusion
membranaire, mais son mécanisme moléculaire reste encore mal connu. Mon projet de
recherche consistera en l’évaluation de caractéristiques fonctionnelles des GP, du virus
parainfluenza humain de type 2 (hPIV-2) et du virus de la maladie de Newcastle affectant les
poulets (NDV), mutées sur la base de mutations déjà caractérisées au sein du laboratoire sur le
virus parainfluenza de type 5 (PIV-5), et de mutation observée sur les GP de souches
variantes de hPIV-2.
La synthèse de mutants des GP F et de HN de hPIV-2 et NDV jouant un rôle sur la fusion
membranaire devra être abordée dans un premier temps. Les ADNc des gènes viraux codant
pour ces GP ont déjà été extraits et placés dans un plasmide d’expression eucaryote. Un
ensemble de mutations sont aujourd’hui à effectuer, en utilisant la technique de mutagénèse
dirigée. Les mutations seront choisies en fonction de mutation déjà observée sur la GP F de
souches variantes ayant des capacité à former des syncytia en culture cellulaire importante ou
alors déterminées par rapport à des mutations connues pour jouer un rôle dans l’autonomie de
F de PIV-5 (souche W3A) et par ailleurs déjà caractérisées au laboratoire (article soumis pour
publication, brevets FR 08/06547 et FR 08/06548).
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La caractérisation fonctionnelle de ces GP lors de leur expression transitoire par des
cellules devra ensuite être effectuée. La quantification du potentiel fusogène des GP F ou de
la combinaison F/HN se fera grâce à des tests de fusion cellule-cellule. La quantification de
l’expression en surface de ces glycoprotéines se fera grâce à l’observation de ces cellules
immuno-marquées en cytométrie en flux et par Western-blot. La fusion intercellulaire et
l’expression des GP pourront être observés par observation de cellules immuno-marquées par
un fluorophore au microscope confocal.
L’expression puis étude de ces mutants sur des particules pseudo-virales (VLP). Ce
système permettra d’analyser plus finement le comportement de glycoprotéines et d’utiliser
des méthodes plus sensibles pour caractériser la fusion inter-membranaire comme le “lipidmixing”. L’incorporation des glycoprotéines sera observée et analysée grâce à des techniques
de microscopie électronique à transmission et de microscopie cryo-électronique. De plus le
laboratoire devrait acquérir un système de génétique inverse de NDV, qui sera utilisé afin
d’étudier le comportement des différents mutants dans le cadre d’une infection. Ce système
pourra être adapté à hPIV-2 et PIV-5 et aura l’avantage de confirmer le rôle des GP mutées
dans un contexte viral.
Pour certains mutants présentant des caractéristiques impliquant la coopération entre F et
HN, des études d’interactions entre F et HN seront menées, afin de déterminer les domaines
de la GP impliqués dans l’interaction. Ceci sera possible notamment grâce à des techniques
de co-immunoprécipitation.
Nous pensons ainsi, grâce à ces études, pouvoir comprendre plus finement le mécanisme
d’entrée de ces virus dans la cellule, plus particulièrement la relation entre les GP
d’attachement et de fusion. Cette connaissance pourrait permettre le développement de
nouveaux antiviraux, inhibiteurs d’entrée, comme le Fuzéon® contre HIV-1, mais ciblant
l’interaction entre F et HN. Ces drogues pourraient ainsi 1) empêcher l’activation de la GP F
par HN 2) bloquer les interactions entre HN et F et rendre ainsi cette dernière nonfonctionnelle ou 3) activer précocement la GP F, en mimant l’action de HN, et inactiver ainsi
celle-ci.
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UMR : CNRS FRE 3011
Équipe : Pathogénèse des virus respiratoires
Responsable de l'équipe : Pr Bruno Lina
Directeur de thèse : Dr Manuel Rosa-Calatrava
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