Bip, une protéine requise pour l`intégration de bactéries

Bip, une protéine requise pour l'intégration de bactéries planctoniques
dans des biofilms.
L'intégration de bactéries planctoniques dans un biofilm est une étape majeure dans la
constitution de biofilms multiespèces. Elle est aussi un élément important dans la
croissance des biofilms monoespèces. Chez la bactérie Bacillus thuringiensis, la
population planctonique coexistant avec le biofilm en croissance est rapidement
intégrée dans celui-ci. Nous avons fait l'hypothèse que cette intégration nécessite la
présence de mécanismes moléculaires spécifiques. Ces mécanismes peuvent être
impliqués dans le mouvement de la bactérie vers le biofilm, dans la pénétration de la
bactérie immigrante à l'intérieur du biofilm, ou dans son interaction avec la matrice du
biofilm ou avec les bactéries résidentes.
Par mutagenèse aléatoire et à l'aide d'une méthode expérimentale permettant de
quantifier le recrutement de bactéries planctoniques par le biofilm, notre laboratoire a
identifié un gène plasmidique fortement impliqué dans ce recrutement. L'inactivation de
ce gène chez les bactéries planctoniques - mais pas chez les bactéries sessiles - provoque
une chute de 80% du nombre de bactéries planctoniques recrutées dans le biofilm, et la
complémentation rétablit le taux initial de recrutement. Le produit de ce gène est la
protéine Bthur002_62720, de masse moléculaire 21 kDa et de fonction inconnue. Cette
protéine (que nous appellerons 'Bip' pour Biofilm integration protein) possède à son
extrémité N-terminale un peptide signal suivi par un domaine transmembranaire, et à
son extrémité C-terminale deux domaines transmembranaires, suggérant une
localisation pariétale. A l'aide d'une fusion traductionnelle avec la GFP, nous avons
confirmé que la protéine Bip est localisée à la surface bactérienne.
L'objectif principal de ce projet est de déterminer comment la protéine Bip promeut
l'intégration de bactéries planctoniques dans un biofilm. Sa localisation à la surface
bactérienne suggère que Bip interagit avec des éléments du biofilm, dans une interaction
de type ligand-récepteur. Le partenaire de Bip sera donc recherché dans le biofilm à
l'aide de plusieurs approches. Après clonage de son gène dans un vecteur de
surexpression, la protéine recombinante rBip sera produite et purifiée, et des anticorps
spécifiques dirigés contre cette protéine seront obtenus. rBipR sera incubée avec un
biofilm formé par un mutant Bip-, puis localisée dans le biofilm à l'aide des anticorps
produits, ce qui permettra de préciser si les interactants de cette protéine sont situés à
la surface bactérienne ou dans la matrice du biofilm. Ces interactants seront ensuite
isolés (par des techniques d'affinité de type 'pull-down') sur des extraits protéiques ou
polysaccharidiques réalisés à partir de la matrice du biofilm ou de la surface cellulaire.
Dans le cas où l'interactant de Bip est une protéine, celle-ci sera partiellement séquencée
par spectrométrie de masse, et le gène codant pour cette protéine sera identifié à partir
du génome séquencé de la souche bactérienne utilisée. Si l'interactant est un
polysaccharide, sa structure chimique sera établie en association avec le laboratoire de
glycobiologie de l'université de Lille, avec lequel nous avons déjà une collaboration. Les
gènes impliqués dans la biosynthèse de ce polysaccharide pourront être identifiés si
celui-ci est identique aux deux exopolysaccharides majeurs produits par la bactérie en
biofilm, sur lesquels notre laboratoire travaille déjà dans le cadre d'un autre programme.
Le projet a également comme objectif d'identifier les réseaux de régulation contrôlant la
production des deux partenaires impliqués dans le recrutement des bactéries
planctoniques par le biofilm, de façon à comprendre comment se met en place, dans le
temps et dans l'espace, ce recrutement. L'expression des gènes codant pour la protéine
Bip ou impliqués dans la production de son interactant sera déterminée à l'aide de
fusions transcriptionnelles avec des gènes rapporteurs codant pour des protéines
fluorescentes. Cette expression sera suivie au cours de la croissance bactérienne en
culture planctonique et en biofilm, et essayée dans les différents mutants de régulateurs
contrôlant la formation des biofilms disponibles dans la collection de souches du
laboratoire (spo0A, sinI, sinR, codY). Comme le plasmide sur lequel se trouve le gène bip
possède des gènes codant pour un régulateur ou pour des peptides potentiellement
impliqués dans des phénomènes de quorum sensing, ces gènes seront inactivés ou
surexprimés, et la transcription de bip et des gènes impliqués dans la production de son
interactant sera déterminée pour chacun des mutants obtenus. D'autre part, la
proportion des bactéries exprimant l'un ou l'autre de ces gènes (ou les deux) dans les
deux conditions de culture (planctonique et biofilm) sera estimée par cytométrie de flux.
Enfin, la localisation spatiale dans le biofilm de l'expression des gènes requis pour la
production de l'interactant de Bip sera déterminé en utilisant les fusions
transcriptionnelles et à l'aide de cryocoupes, de façon à conserver la structure du biofilm
in situ.
L'étude du rôle du recrutement dans la formation des biofilms monoespèces et
multiespèces constitue le troisième volet de cette étude. La proportion de bactéries
d'origine planctonique intégrées dans des biofilms d'âges variables, et leur devenir dans
le biofilm, seront déterminés à l'aide de techniques d'imagerie, d'histologie et de
cytométrie en flux. La contribution du recrutement à la formation des biofilms sera
évaluée en comparant la croissance d'un biofilm formé à partir d'une souche mutante
Bip- à celle d'un biofilm produit par la souche sauvage. Le rôle éventuel de la protéine
Bip dans la constitution des biofilms multiespèces sera étudié en comparant
l'intégration de bactéries planctoniques sauvages et mutantes dans des biofilms formés
par différentes espèces bactériennes.
CALENDRIER PREVISIONNEL DE LA THESE :
Lieu de Travail
Période
Equipe GME, INRA, Micalis,
Jouy-en-Josas
Février 2017 - Aout
2017
Equipe BGF, Université SaintJoseph, Mar Roukos Liban
Caractérisation de la protéine
candidate Bip.


Production et purification de la
protéine recombinante rBip.
Localisation dans le biofilm et
détermination de ces
interactants.
Septembre 2017 –
Septembre 2018
Isolement des interactants de Bip
Si l'interactant de Bip est une protéine

Séquençage partiel par spectrométrie
de masse, et identification du gène
codant pour cette protéine.
Si l'interactant est un polysaccharide.

Octobre 2018Janvier 2019
Etablissement de sa structure chimique
en collaboration avec le laboratoire de
glycobiologie de l'université de Lille et
identification des gènes impliqués dans
la biosynthèse de ce polysaccharide.
Identification des réseaux de régulation
contrôlant la production des deux
partenaires
impliqués
dans
le
recrutement des bactéries planctoniques
par le biofilm.
Etudier l'expression des gènes codant
pour la protéine Bip ou impliqués dans
la production de son interactant.

Fusions transcriptionnelles avec des
gènes rapporteurs codant pour des
protéines fluorescentes dans les
différents mutants de régulateurs
contrôlant la formation des biofilms
disponibles dans la collection de
souches du laboratoire (spo0A, sinI,
sinR, codY).
Localisation spatiale dans le biofilm de
l'expression des gènes requis pour la
production de l'interactant de Bip.

Février 2019- Juillet
2019
Fusions
transcriptionnelles
des
cryocoupes de façon à conserver la
structure du biofilm in situ.
L'étude du rôle du recrutement
dans la formation des biofilms
mono-espèces et multi-espèces.
Détermination de la proportion de
bactéries d'origine planctonique
intégrées dans des biofilms d'âges
variables, et leur devenir dans le
biofilm, seront déterminés

Techniques
d'imagerie,
d'histologie et de cytométrie en
flux.
Evaluation de la contribution du
recrutement à la formation des
biofilms
en
comparant
la
croissance d'un biofilm formé à
partir d'une souche mutante Bip- à
celle d'un biofilm produit par la
souche sauvage.
Septembre 2019Fevrier 2020


Rédaction de la thèse
Rédaction des articles




Rédaction de la thèse
Rédaction des articles