HGT - SCB Biologie UAA3 AUTEUR : Philippe Schweich Fiche d’expérience 3 Cette expérience peut être réalisée par les élèves moyennant le respect des mesures préconisées dans l’analyse de risques. Les points 2 à 5 de cette fiche seront alors mis à leur disposition. Observer les chromosomes présents dans les cellules d’oignon 1. Description générale Le noyau est visible dans la plupart des cellules. Il contient les chromosomes qui ont alors l’aspect de filaments très enchevêtrés constituant la chromatine. Cependant, lorsqu’une cellule entre en division au cours d’un phénomène appelé mitose, le noyau disparait et les chromosomes se condensent pour prendre la forme de petits bâtonnets. Pour observer les noyaux de cellules ainsi que les chromosomes au cours de mitoses, on utilise la coloration de Feulgen. Celle-ci donne une couleur rouge spécifique à l'ADN. On peut alors observer des noyaux en interphase (la chromatine est colorée mais pas les nucléoles) ainsi que différents moments de la mitose au cours desquels les chromosomes sont bien individualisés (comme par exemple durant la métaphase). 2. Objectifs d’apprentissage Identifier différentes étapes du cycle cellulaire. L’élève apprend à reconnaitre dans un tissu une cellule en interphase et une cellule en cours de division (ou en mitose). De plus, l’observation de différentes cellules en mitose permettra d’identifier quelques moments importants de la division : la prophase, la métaphase, l’anaphase et la télophase. 3. Matériel et produits - Une lame porte-objet - Une lamelle couvre-objet - Un oignon mis en germination - De l’acide chlorhydrique 1 mol/L - Du réactif de Schiff - Une solution aqueuse de Na2S2O5 à 5 % acidifiée par quelques gouttes d'HCl 1mol/L (facultatif) - De l’eau de la distribution - Un bain-marie à 60°C 1 Document1 4. Santé, sécurité La réalisation d’expériences suppose le respect d’un certain nombre de règles permettant à chacun, élèves et professeur, de vivre ces séances de laboratoire dans les meilleures conditions de sécurité. Pour chaque local où se déroulent de telles expériences, existe un règlement de laboratoire, approuvé par le Conseiller en Prévention. Il sera signé par le chef d’établissement, le professeur, l’élève et ses parents/responsables. Chaque élève a une bonne connaissance de ce document. Analyse de risques Phases Points-clés Sources de danger Nature du risque Avant (Professeur) Pendant (Professeur et élèves) Organisation de la classe Les déplacements des élèves Afin de limiter les déplacements, installer des postes de travail avec tout le matériel nécessaire pour le groupe. Chauffage de HCl 1M à 60°C pendant 12 min Attention l’acide chlorhydrique est un produit corrosif : utiliser un bain thermostatisé à 60°C La manipulation se déroulera sous hotte. Rinçage des apex dans une solution de Na2S2O5 Les vapeurs dégagées sont du SO2, un gaz irritant. La manipulation se déroulera sous hotte. Risque de coupure Les lames brisées au cours de la manipulation doivent être placées, par le professeur, dans un contenant prévu pour la récupération du verre cassé. La préparation microscopique se brise suite à une manipulation Nettoyage du matériel et des mains de manière hygiénique Après (Professeur et élèves) Mesures de prévention préconisées Nettoyage et rangement des lames Coupures si de la verrerie est cassée Nettoyage des mains Les lamelles couvre-objet peuvent être jetées à la poubelle, tandis que les lames porte-objet seront nettoyées minutieusement avec du savon désinfectant. Les élèves appellent le professeur qui se charge lui-même de ramasser les débris. Professeur et élèves se lavent les mains en fin de séance. 2 Document1 5. Mode opératoire a) Mettre en germination 4 à 5 jours avant la séance, des petits oignons (voir photo ci-dessus). b) Couper les racines à 1 cm de la pointe lorsqu’elles ont atteint la longueur de 1,5 cm. c) Mettre ces pointes de racine (appelées apex) dans HCl 1 mol/L à 60°C pendant 12 minutes. d) Rincer les apex dans l'eau de distribution. e) Placer les apex dans du réactif de Schiff pendant minimum 15 minutes. f) Récupérer les apex, rincer dans de l'eau puis (facultatif) dans une solution de Na 2S2O5 à 5 %. g) Déposer les apex sur une lame porteobjet et réaliser le montage dans une goutte d'eau. h) Presser la lamelle couvre-objet pour écraser la préparation afin de disperser les cellules. i) Observer d'abord à faible grossissement (voir fiche FM1), sélectionner une cellule en division puis passer au grossissement x 400 pour observer les noyaux et les figures de mitose. j) Réaliser un dessin d’observation (voir fiche FM2). 6. Notes pour le professeur a) Au cours de sa vie, une cellule grandit puis se divise pour donner deux cellules filles qui lui sont identiques. On désigne sous le terme de cycle cellulaire les différentes étapes par lesquelles passe une cellule vivante entre deux divisions successives. Un cycle cellulaire comporte deux étapes : l'interphase et la mitose. b) La coloration de Feulgen a été mise au point en 1924 par le chimiste allemand Robert Feulgen (1884-1955). Elle permet la mise en évidence des chromosomes et leur observation au microscope photonique. Dans un premier temps, une hydrolyse acide libère une forme aldéhydique du désoxyribose, qui est décelée par le réactif de Schiff (fuchsine basique décolorée par le SO2). Le squelette de l'ADN n'est pas modifié, il reste en place et il est coloré en rose rouge. Le rinçage dans une solution de Na2S2O5 à 5 % est facultatif mais cette étape permet d’éviter certaines colorations parasites. 3 Document1 c) Les observations réalisées par les élèves seront les suivantes À faible grossissement, repérer les cellules en division. Passer ensuite au grossissement X400 pour observer les différentes moments de la mitose. Métaphase Télophase Cellules de racine d’oignon (X400) 7. Développements attendus principalement visés Décrire les phases du cycle cellulaire et expliquer le rôle de la mitose (C8). L'élève décrit comment l’ADN est transmis afin de maintenir la même information génétique dans toutes les cellules somatiques. L'élève explique que la multiplication cellulaire est un phénomène indispensable au développement d’un organisme (augmenter le nombre de cellules et les renouveler). Identifier les chromosomes au cours de la mitose sur des images de coupe de microscope optique (A2). L’élève repère les différentes apparences que peut prendre l’intérieur du noyau d’une cellule et identifie les différents aspects de la chromatine et des chromosomes. 8. Bibliographie Vidéo montrant comment colorer les noyaux d’une cellule par la méthode de Feulgen, avec le réactif de Schiff. Durée : 117 s http://www.svt.ac-versailles.fr/spip.php?article459 (page visitée le 1/02/2016) Autre site présentant la technique de coloration de Feulgen http://jean-jacques.auclair.pagesperso-orange.fr/travaux/mitose/feulgen.htm (page visitée le 1/02/2016) 4 Document1