Transcriptome et métabolisme de l`ovocyte bovin

Transcriptome et métabolisme de l'ovocyte bovin
Thèse
Sara-Myriam Scantland-Marchand
Doctorat en Sciences Animales
Philosophiae doctor (PhD)
Québec, Canada
© Sara-Myriam Scantland-Marchand, 2014
Résumé
Durant la croissance, les ovocytes emmagasinent des quantités importantes d’ARNm
maternel dans leur cytoplasme. Ces ARNm pourront plus tard être traduit en protéines afin
de soutenir la maturation ovocytaire et le développement précoce et ce, jusqu’à l’activation
du génome de l’embryon qui est une étape cruciale du développement. Trois catégories
d’ARNm peuvent être distinguées durant cette période : les ARNm emmagasinés, les
ARNm en voie de traduction (ARNm polyribosomaux) et les ARNm voués à la
dégradation. De ces trois catégories, seuls les ARNm polyribosomaux ont un impact direct
sur la physiologie cellulaire sous-jacente.
Dans cet ouvrage, j’ai développé une méthode permettant d’isoler les ARN
polyribosomaux afin de faciliter l’étude de la physiologie de l’ovocyte et de l’embryon
précoce. Cette méthodologie a permis de découvrir plusieurs faits très intéressants portant
sur le métabolisme énergétique et la synthèse protéique durant la maturation ovocytaire.
Les cinq complexes mitochondriaux ainsi que la production énergétique sont fortement
diminués durant la maturation ovocytaire. L’impact direct d’une telle inhibition se traduit
par une réduction de la production d’ATP par la mitochondrie et l’initiation d’une
quiescence dans l’ovocyte entraînant une diminution importante des capacités
traductionnelles. Ces découvertes m’ont amenés à m’enquérir de la présence de
mécanismes alternatifs dans l’ovocyte permettant de soutenir les besoins énergétiques
durant la maturation. Le transfert de molécules telles que l’AMP et l’AMPc provenant des
cellules du cumulus ainsi que la récupération des AMP libérés au moment de la dégradation
de la queue poly(A) des ARNm maternels semblent être deux mécanismes d’importance
permettant de soutenir les besoins énergétiques de l’ovocyte.
Il semble donc que la maturation ovocytaire représente une période de préparation à la
fécondation caractérisée par une maturation nucléaire, cytoplasmique et moléculaire mais
également une période d’entrée en quiescence et de ralentissement métabolique afin de
survivre aux nombreuses heures d’attentes précédent la fécondation et avant l’activation du
génome embryonnaire.
iii
Abstract
During growth, oocytes store large quantities of maternal mRNAs within their cytoplasm.
These mRNAs can then be translated into proteins at different times to sustain oocyte
maturation and early development, up until a crucial step in development: the embryonic
genome activation. Three categories of mRNAs can be identified during this period: stored
mRNAs, mRNAs in the process of being translated (polyribosomal mRNAs) and mRNAs
fated for decay. Of these three categories, only polyribosomal mRNAs have an impact on
the underlying cell physiology.
Within this text, we have developed a method to isolate polyribosomal mRNAs to facilitate
the study of oocyte and early embryo physiology. This methodology allowed us to
investigate the energetic metabolism of mitochondria and protein synthesis during oocyte
maturation. All five mitochondrial complexes as well as energy production are strongly
incapacitated during oocyte maturation. The direct impact of such an incapacitation is a
limitation of ATP production by mitochondria and the initiation of quiescence within the
oocyte which results in an important diminution of translational potential. These
discoveries caused us to start inquiring about the presence of alternative mechanisms which
could sustain the energetic needs of the oocyte during maturation. The transfer of molecules
such as AMP and AMPc from the cumulus and the salvage of AMPs freed during the
degradation of the poly(A) tail of maternal mRNAs appear to be two important mechanisms
which could sustain the energetic needs of the oocyte.
Thus, it seems that oocyte maturation represents not only a period of preparation for
fertilization through a nuclear, cytoplasmic and molecular maturation but also a period of
entry into quiescence and metabolic slow down in order to survive the long wait before
fertilization and subsequent embryonic genome activation.
v
Table des matières
Résumé............................................................................................................................... iii
Abstract ............................................................................................................................... v
Table des matières ............................................................................................................ vii
Table des illustrations ........................................................................................................ ix
Table des tableaux ............................................................................................................. xi
Liste des abréviations....................................................................................................... xiii
Remerciements................................................................................................................ xvii
Avant-propos ................................................................................................................... xxi
1. Chapitre 1. Introduction à la maturation ovocytaire et au développement précoce .... 1
1.1 L’OVOCYTE ............................................................................................................ 1
1.1.1 Origine et migration des cellules germinales primordiales ................................. 1
1.1.2 Folliculogenèse .................................................................................................... 5
1.1.3 Ovogenèse ........................................................................................................... 9
1.1.4 Fécondation ....................................................................................................... 17
1.2 L’EMBRYON ......................................................................................................... 18
1.2.1 Anatomie du développement précoce ............................................................... 18
1.2.2 Première semaine de développement ................................................................ 18
1.2.3 Poursuite du développement embryonnaire ...................................................... 20
1.2.4 Structuration des cellules embryonnaires .......................................................... 20
1.2.5 Destin cellulaire ................................................................................................. 21
1.3 LA TRANSCRIPTION DANS L’OVOCYTE ET L’EMBRYON PRÉCOCE ..... 22
1.3.1 Transcription ovocytaire .................................................................................... 22
1.3.2 Mécanismes d’emmagasinage des transcrits ..................................................... 23
1.3.3 Arrêt de la transcription ..................................................................................... 26
1.3.4 Régulation de la traduction des transcrits emmagasinés ................................... 29
1.3.5 La durée du silence transcriptionnel .................................................................. 31
1.4 RÉGULATION DE LA TRADUCTION DES ARNm MATERNEL ................... 35
1.4.1 Réadénylation des ARNm emmagasinés........................................................... 35
1.4.2 Les joueurs clés de la régulation de la traduction.............................................. 36
1.5 MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE ....................................................................... 44
1.5.1 Les mitochondries ovocytaires .......................................................................... 44
1.5.2 Mitochondries et production énergétique .......................................................... 48
1.5.3 Mitochondries et fécondation ............................................................................ 49
1.5.4 Mitochondries et développement précoce ......................................................... 50
1.5.5. Substrats métaboliques ..................................................................................... 51
1.6 OBJECTIFS DE LA THÈSE .................................................................................. 54
1.7 RÉFÉRENCES ........................................................................................................ 57
2. Chapitre 2 : Isolation des ARNm polyribosomaux pour l’étude du développement
embryonnaire précoce ....................................................................................................... 71
2.1 Résumé .................................................................................................................... 72
2.2 Abstract ................................................................................................................... 73
2.3 Background ............................................................................................................. 74
2.4 Results ..................................................................................................................... 76
2.5 Discussion ............................................................................................................... 79
vii
2.6 Conclusions ............................................................................................................. 82
2.7 Methods ................................................................................................................... 82
2.8 Authors' contributions ............................................................................................. 88
2.9 Acknowledgements ................................................................................................. 89
2.10 References ............................................................................................................. 89
3. Chapitre 3 : L’analyse des ARNm polyribosomaux révèle l’acquisition de la
quiescence énergétique durant la maturation ovocytaire chez le bovin .......................... 102
3.1 Résumé .................................................................................................................. 103
3.2 Abstract .................................................................................................................. 104
3.3 Introduction ........................................................................................................... 105
3.4 Results ................................................................................................................... 107
3.5 Discussion .............................................................................................................. 109
3.6 The Quiet Oocyte................................................................................................... 114
3.7 Methods ................................................................................................................. 115
3.8 References ............................................................................................................. 120
4. Chapitre 4. Source alternative d’ATP durant la maturation ovocytaire bovine. ...... 135
4.1 Résumé .................................................................................................................. 136
4.2 Abstract .................................................................................................................. 137
4.3 Introduction ........................................................................................................... 138
4.4 Results ................................................................................................................... 139
4.5 Discussion .............................................................................................................. 142
4.6 Conclusion ............................................................................................................. 147
4.7 Methods ................................................................................................................. 147
4.8 Authors' contributions ........................................................................................... 150
4.9 References ............................................................................................................. 151
5. Chapitre 5. Conclusion............................................................................................. 163
5.2 Références ............................................................................................................. 167
viii
Table des illustrations
Figure 1-1 Migration des cellules germinales primordiales chez l’humain. ........................................................ 2
Figure 1-2 Représentation schématique des différents stades de croissance des follicules. .............................. 7
Figure 1-3 Représentation du cycle œstral à trois vagues chez la vache. .......................................................... 8
Figure 1-4 Représentation du mode d’action du MPF. ..................................................................................... 14
Figure 1-5 Ligne du temps de l’activité du MPF et du CSF. ............................................................................... 16
Figure 1-6 Progression des premiers stades embryonnaires précoces. ............................................................ 19
Figure 1-7 La liaison de la protéine EDEN-BP favorise le recrutement des déadénylases. ............................... 24
Figure 1-8 La voie de l’ARNm dans l’ovocyte. ................................................................................................... 30
Figure 1-9 Compétition entre la poly(A) ribonucléase PARN et la poly(A) polymérase GLD2. .......................... 36
Figure 1-10 Modèle du mécanisme de stimulation de la traduction par Paip1. .............................................. 38
Figure 1-11 Circularisation de l’ARN ................................................................................................................. 40
Figure 1-12 Contrôle de la traduction par l’intermédiaire de la protéine Maskin. .......................................... 41
Figure 1-13 Phénotypes mitochondriaux. ......................................................................................................... 47
Figure 2-1 Effect of cross-linking on recovery of RNA extracted from Drosophila SL2 cells. ............................. 93
Figure 2-2 Neutralization of formaldehyde in Drosophila SL2 cell extract. ....................................................... 94
Figure 2-3 Distribution of Drosophila SL2 polyribosomes in sucrose density gradient fractions ...................... 95
Figure 2-4 Confirmation that the high-sedimenting materials contain polyribosomes. ................................... 96
Figure 2-5 Reproducibility of the polyribosome mRNA extraction method. ..................................................... 97
Figure 2-6 Determination of total, poly(A) and polyribosomal RNA in oocytes at different stages .................. 98
Figure 2-7 Relative abundance of selected polyribosomal mRNA sequences and corresponding proteins. ..... 99
Figure 3-1 Polyribosomal profiles. .................................................................................................................. 124
Figure 3-2 Venn diagram of expressed and differentially expressed genes between GV or MII oocytes. ...... 125
Figure 3-3 Comparison analysis of cellular functions. ..................................................................................... 126
Figure 3-4 Comparison analysis of canonical pathways. ................................................................................ 127
Figure 3-5 RT-PCR validations. ........................................................................................................................ 128
Figure 3-6 ATP and ADP:ATP ratios during oocyte maturation. ..................................................................... 129
Figure 3-7 Reduction of EIF2 signaling during oocyte maturation. ................................................................. 130
Figure 3-8 Reduction of oxidative phosphorylation during oocyte maturation. ............................................. 131
Figure 4-1 Alternative ATP production mechanisms during oocyte maturation ............................................. 155
Figure 4-2 Impact of OXPHOS inhibitor (CCCP) ............................................................................................... 156
Figure 4-3 QPCR validation for 3 candidates in the adenosine salvage pathway .......................................... 157
Figure 4-4 Impact of AK and CK inhibitor ........................................................................................................ 158
Figure 4-5 Creatine kinase assay..................................................................................................................... 159
Figure 4-6 Impact of adding phosphocreatine (PCr) to the culture media ...................................................... 160
Figure 4-7 Impact of culture under different form .......................................................................................... 161
Figure 4-8 Impact of PARN inhibitor and AMP rescue .................................................................................... 162
ix
Table des tableaux
Tableau 1-1 Caractéristiques associées à la maturation de l’ovocyte au stade de vésicule germinale. .......... 11
Tableau 1-2 Activation du génome embryonnaire chez différentes espèces. .................................................. 34
Table 2-1 Proportion of detected microarray signals above threshold ........................................................... 100
Table 2-2 Description of RT-PCR or PCR primers for examined genes............................................................. 101
Table 3-1 Log-ratios and p-values associated with molecules related to mitochondrial function.................. 132
Table 3-2 Log-ratios and the p-value associated with different molecules in EIF2 signaling pathway ........... 133
Table 3-3 Primer sequences for QPCR ............................................................................................................ 134
xi
Liste des abréviations
%
4E-BP
A
ADN
AGE
AMP
AMPc
AP
AR
ARE
ARN
ARNm
ARNr
ATP
Axe A-P
Axe D-V
BMP
C
CCCP
CCNB1
CCR4-Pop2-Not
Cdc
CDK
CPE
CPEB
CPSF
CSF
CTD
Cx
CYP26B1
DCP1A
DDX6
DICE
E
EDEN
eIF
FRGY
FSH
G
GLD2
GV
GVBD
HBP
Pourcentage
eIF4E-binding protein
Adénine
Acide désoxyribonucléique
Activation du génome embryonnaire
Adénosine monophosphate
Adénosine monophosphate cyclique
Phosphatase alkaline
Acide rétinoïque
AU-rich element
Acide ribonucléique
Acide ribonucléique messager
Acide ribonucléique ribosomal
Adénosine triphosphate
Axe antéro-postérieur
Axe dorso-ventral
Bone morphogenetic protein
Cytosine
Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone
Cycline B1
C-C chemokine receptor type 4 – popeye 2 – Not transcription
complexe
Cell-division cycle
Cyclin dependant kinase
Cytoplasmic polyadenylation element
Cytoplasmic polyadenylation element binding
Cleavage and polysadenylation specific factor
Cytostatic factor
Carbon-terminal domain
Connexine
Cytochrome p450
Decapping enzyme 1A
DEAD (Asp-Glu-Ala-Asp) box helicase 6
Differential control element
Embryonnaire
Embryo deadenylation element
eukaryotic initiation factor
Frog Y-box protein 2
Follicle-stimulating hormone
Guanine
Glucose dehydrogenase 2
Germinal vesicle
Germinal vesicle breakdown
Hexosamine biosynthesis pathway
xiii
HEX
ICM
Kb
KL
LH
mg
MI
MII
MIV
mm
Mos
MPF
MSY
MZT
ng
PABP
PAIBP
Paip
PARN
PDE
PFK
pg
PGC
Phase G
Phase M
Phase S
PI3K
PKA
PPP
Pro
RNAP
Ror2
ROS
RPB1
RRM
S
SCF
Ser
Thr
Tyr
U
UTR
Wnt
YBX
ZP
μm
xiv
Hexanucléotide de polyadénylation (AAUAAA)
Inner cell mass
Kilobase
Kit-ligand
Luteinizing hormone
miligramme
Métaphase I
Métaphase II
Maturation in vitro
Milimètre
v-mos Moloney murine sarcoma viral oncogene
Maturation promoting factor
Mouse Y-box
Maternal to zygotic transition
Nanogramme
Poly-A binding protein
Poly-A interacting binding protein
Poly-A interacting protein
Poly-A ribonucléase
Phosphodietérase
Phosphofructokinase
Picogramme
Primordial germ cell
Phase ‘gap’
Phase de mitose
Phase de synthèse/duplication de l’ADN
Phosphatidylinositol 3-kinase
cAMP dependent protein kinase
Pentose phosphate pathway
Proline
Ribonucleic acid polymerase
Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2
Reactif oxygen species
RNA polymerase II large subunit
RNA-recognition motif
Svedberg (unité de sédimentation)
Stem-cell factor
Sérine
Thréonine
Tyrosine
Uracil
Untranslated region
Wingless-type
Y box protein
Zone pellucide
Micromètre
À mon amoureux, Éric, et à mon père, Raymond
xv
Remerciements
Après toutes ces années aux études supérieures, je voudrais prendre le temps de remercier
les personnes qui ont contribuées à mon succès. Je remercie d’abord mon directeur de
recherche, Dr. Claude Robert, pour m’avoir permis de concilier ma passion pour
l’enseignement avec tout le travail demandé par les études graduées. Je suis également
particulièrement heureuse d’avoir réussi à te convaincre de l’intérêt de mes dernières
hypothèses sur le métabolisme énergétique. Je remercie également mon co-directeur, Dr.
Marc-André Sirard, pour son tact et son grand pouvoir tampon lors de ses interventions qui
m’ont permis d’en arriver au point où je peux aujourd’hui, faire le dépôt de ma thèse. J’ai
énormément apprécié ton support et tes conseils dans les moments cruciaux de mon
doctorat. Je prends ici le temps de remercier un étudiant qui a joué un rôle particulier au
cours de mon doctorat : Dr. Gaël Cagnone. Gaël a mis en pratique ses qualités de futur
directeur de recherche pour me ‘diriger’ dans certains de mes travaux. Nos longues
discussions, ses sempiternels questionnements et surtout sa considération pour mes idées
auront joué un rôle particulièrement formateur dans l’acquisition de mes compétences
professionnelles. Un énorme merci d’avoir fait parti -non officielle- de mon équipe de
direction.
Les professionnels de recherche des équipes du Dr. Robert et du Dr.Sirard ont été d’une
aide précieuse au cours de mes études. Je remercie particulièrement Dominic Gagné qui a
été une personne référence essentielle et qui, par ses connaissances, son expérience et sa
disponibilité en ont fait un allié précieux; Dr. Isabelle Dufort qui a participé régulièrement à
la résolution des problèmes rencontrés en laboratoire ainsi que l’exceptionnelle Dr. Julie
Nieminen, simplement pour sa personnalité qui m’a permis d’apprécier encore davantage
mon doctorat. Enfin, je dois ici ajouter mon conjoint, Éric, qui en plus d’être une personne
extraordinaire dans ma vie de tous les jours, m’a apporté une aide professionnelle presque
quotidienne par ses analyses bioinformatiques, les corrections d’anglais qui m’ont permis
chaque fois de remettre des articles de meilleures qualités et surtout, ses nombreuses
discussions sur mes projets de recherche. Ces quatre personnes ont joué un rôle majeur tout
au long de mon doctorat mais également du point de vu personnel puisqu’ils sont aussi
devenu des amis. Merci pour tout!
xvii
Un merci particulier à Isabelle Laflamme pour toute son aide lors des ponctions et la
production des embryons 8 cellules mais surtout, pour toutes les heures de jasette qui
rendaient la ponction beaucoup plus agréable. Merci également aux étudiants que j’ai
côtoyés au cours de toutes ces années : Eve-Lyne Sylvestre, Florence Pagé-Larivière, Dany
Plourde, Élise Mondou, Isabelle Gilbert, Audrey Bunel, Anne-Laure Nivet, Ernesto
Orozco-Lucero, Annie Girard, Julietta Caballero, Carolina Macabelli,
Maëlla Gohin,
Nicolas Guillemin, Luis Baldoceda, Angus Macaulay et Habib Shojaei Saadi.
Comme je l’ai mentionné au début des remerciements, l’enseignement a toujours eu une
place importante dans ma vie et je voudrais remercier toutes les personnes qui m’ont offert
des opportunités incroyables d’enseignement au cours de mes études. Premièrement, je
voudrais remercier Robert Chartrand avec qui tout a commencé. L’assistance dans les
laboratoires d’Anatomie et physiologie animales, la mise en place d’une nouvelle section
d’histologie puis la chance inouïe que j’ai eu à te remplacer durant ton année sabbatique ont
été des moments exceptionnels dans ma vie. Merci de m’avoir fait confiance et de m’avoir
offert cette chance alors que je n’étais qu’une étudiante de premier cycle à l’époque. Milles
merci également à Dr. Éric Philippe qui a cru en moi et m’a offert de nombreuses
possibilités d’enseignement en histologie et surtout, bonheur! en embryologie.
Ces
expériences ont marquée ma vie. Que ce soit en médecine dentaire, en sciences
biomédicales ou en biologie moléculaire, mon passage à la faculté de médecine m’aura
permis d’élargir mon réseau et d’améliorer mes compétences en enseignement, tout cela,
grâce à votre confiance. Un grand merci également à Dr. Janice Bailey et Dr. Michel
Lefrançois qui m’ont offert ma première charge de cours complète dans une matière que
j’adore, l’anatomie et physiologie animales. Avoir ma première cohorte d’étudiants et les
voir évoluer durant toute la session a été très stimulant et surtout, de vivre cette passion
durant la partie la plus difficile de mon doctorat m’a beaucoup aidé à passer au travers et à
apprécier cette période. Je souhaite de tout cœur avoir l’occasion de poursuivre
l’expérience dans les prochaines années.
Même si cela peut sembler étrange, la plus belle chose que m’a apportée mon doctorat a été
de redécouvrir mon père, Raymond, et de renouer avec lui. Au cours des dernières années,
j’ai eu l’occasion de comprendre ce que ma mère m’a écrit dans sa lettre posthume «C’est
xviii
le talent qui va te permettre de rejoindre ton père ». Finalement, j’ai définitivement suivi tes
traces puisque j’ai même pu avoir l’honneur de te remplacer en tant qu’enseignante en
embryologie. J’ai adoré nos dîners en tête à tête et nos conversations passant du coq à l’âne
qui aurait essoufflé toute autre personne présente! Merci pour tout le transfert de
connaissance, merci pour tous les conseils tant en enseignement qu’en recherche, merci
pour ta ‘supervision’ lors de mes milles projets de rénovation, merci pour ton support!
Merci également à ma mère, Suzanne, pour tout l’amour qu’elle m’a donné au cours de mes
11 premières années de vie. Cet amour immense a réussi à me porter jusqu’aujourd’hui et
pour les années futures. Merci à ma sœur, Catherine, qui sera toujours là pour moi comme
je serai toujours là pour elle. Merci également à mes ‘familles adoptives’, Nathalie,
Normand, Kassandra et Myriam ainsi que Lucie et Marie-Hélène qui m’ont supporté dans
les moments les plus difficiles. Merci à ma belle-famille : Mamie Francine qui sera bientôt
Grand-Maman pour la première fois et Maxime que j’ai appris à apprécier énormément
(même ton terrible sarcasme). Je vous aime énormément.
Pour terminer, je voudrais remercier ma petite famille. Même si je t’ai déjà remercié, je
veux encore te dire merci Éric de faire partie de ma vie et pour toutes les autres raisons
aussi nombreuses qu’évidentes. Merci à ‘Ti-Pou’, mon fils qui naîtra dans les prochains
jours et que j’aime déjà de tout mon cœur. De te porter en moi durant les derniers mois a
été l’élément le plus encourageant pour terminer mon doctorat ‘à temps’ pour pouvoir te
consacrer tout mon temps. Et finalement, merci à Roxie et Vénus, mes deux amours canins
qui réussissent toujours à ramener un sourire à mes lèvres même dans les temps difficiles.
xix
Avant-propos
Chapitre 1 : Sara Scantland est l’unique auteure du chapitre 1. Certaines sections des souschapitres «Transcription dans l’ovocyte et l’embryon précoce» et «Régulation de la
traduction des ARNm maternels» correspondent à une traduction générale de l’anglais de
certaines sections rédigées par Sara Scantland dans le chapitre de livre publié sous la
référence :Sara Scantland*, Angus Macaulay * and Claude Robert, RNA Processing During
Early Embryogenesis: Managing Storage, Utilisation and Destruction in the book «RNA
Processing» edited by Paula Grabowski, University of Pittsburgh, USA, ISBN 978-953307-557-0, InTech, August 8, 2011. * Les deux auteurs ont contribués de façon équivalente
à ce manuscrit.
Le chapitre 2 est un manuscrit publié. Le chapitre 3 et le chapitre 4 seront soumis sous la
forme d’un seul article qui n’a pas encore été soumis pour publication.
Chapitre 2 : Scantland S, Grenon JP, Desrochers MH, Sirard MA, Khandjian EW, Robert
C. BMC Dev Biol. 2011 Feb 15;11:8. Method to isolate polyribosomal mRNA from scarce
samples such as mammalian oocytes and early embryos
Dans cet article, Sara Scantland a effectué la majorité des expériences incluant le
développement de la méthode, l’évaluation de la robustesse de la méthode ainsi que toutes
les expériences en contexte biologique. Elle a également rédigé le manuscrit. Jean-Philippe
Grenon a testé les conditions préliminaires pour la préparation des ARNm exogènes et la
préparation des ovocytes, il a validé la linéarité du gradient et a déterminé les conditions
optimales d’hybridations des micropuces. Marie-Hélène Desrochers a effectué certains des
immunobuvardage. Dr. Edward W. Khandjian a fourni une expertise en polyribosomes et a
aidé à la rédaction du manuscrit. Dr. Claude Robert a conçu l’étude, a supervisé les
étudiants gradués et a aidé à la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé
le manuscrit final.
Chapitre 3 : Sara Scantland, Gaël Cagnone, Éric Fournier, Carolina H. Macabelli, Dominic
Gagné, Claude Robert. Polyribosomal mRNA analysis reveals quietness acquisition during
bovine oocyte maturation.
xxi
Dans cet article, Sara Scantland a effectué toutes les expériences, excepté certains QPCR.
Elle a également rédigé le manuscrit. Dr. Gaël Cagnone a participé à la conception de
l’étude, a fourni une expertise en métabolisme cellulaire et a participé à la récolte des
échantillons. Éric Fournier a réalisé toutes les analyses statistiques et a participé à la
correction linguistique du manuscrit. Carolina H. Macabelli a réalisé la majorité des QPCR.
Dominic Gagné a participé à la supervision technique des étudiants gradués. Dr. Claude
Robert a participé à la conception du projet.
Chapitre 4 : Sara Scantland, Éric Fournier, Dominic Gagné, Claude Robert. Alternative
ATP source during bovine oocyte maturation.
Dans cet article, Sara Scantland a effectué toutes les expériences et rédigé le manuscrit.
Dominic Gagné a offert une supervision technique. Éric Fournier a aidé à la rédaction du
manuscrit et à sa correction linguistique. Dr. Claude Robert a supervisé l’étudiante graduée.
xxii
1. Chapitre 1. Introduction à la maturation ovocytaire et
au développement précoce
1.1 L’OVOCYTE
1.1.1 Origine et migration des cellules germinales primordiales
Les cellules germinales primordiales (PGC, primordial germ cell) proviennent de
l’ectoderme embryonnaire. Cependant, elles migrent rapidement vers l’allantoïde et le sac
vitellin, deux annexes extra-embryonnaires, et y demeurent durant une période spécifique à
chaque espèce avant de migrer à nouveau vers les crêtes génitales en formation (Figure 11). La forte activité phosphatase alkaline (AP) des PGC a permis d’étudier leur migration
chez plusieurs espèces. Cependant, si l’AP est un marqueur efficace des PGC, elle n’est pas
essentielle à leur développement. Chez la souris, les PGC sont observées pour la première
fois autour du jour embryonnaire E7.5 alors qu’elles forment une grappe d’une quarantaine
de cellules situées à la base de l’allantoïde. Les PGC migrent à travers la ligne primitive
pour envahir l’endoderme au niveau de l’intestin postérieur. Vers le jour E10.5, les PGC
atteignent la crête génitale en formation [1]. Chez le bovin, les premières PGC potentielles
ne sont observées qu’au jour E18 dans l’embryon au disque embryonnaire tridermique,
dans la portion proximale du sac vitellin. Entre les jours E23 et E25, la majorité des PGC
sont retrouvées au niveau de l’intestin postérieur où se développeront, à partir du jour 27,
les futures crêtes génitales [2]. Chez l’humain, malgré la durée très semblable de la
grossesse chez la femme et de la gestation chez la vache, le processus de migration des
gamètes est légèrement décalé et allongé. Les PGC apparaissent près de l’allantoïde au jour
E24 chez l’humain et colonisent les gonades au début de la 5ème semaine de développement
[3]. Durant ces quelques jours (voire semaines) les PGC subissent de nombreuses mitoses,
et ce dans toutes les espèces. Chez la souris, on compte environ 24 000 PGC dans les crêtes
génitales suite à leur colonisation [4] alors qu’on en compte environ 1000 chez le bovin
[2].
1
Figure 1-1 Migration des cellules germinales primordiales chez l’humain.
A) 2è semaine de développement, les cellules germinales primordiales ne sont pas différenciées,
elles originent de l’épiblaste B) 3 à 6 semaines de développement, les CGP migrent à l’extérieur du
corps de l’embryon pour se situer près de l’allantoïde C) Entre la 5e et la 12e semaines de
développement, les CGP migrent vers les crêtes génitales. A et B) Reproduit avec la permission de
Dr. Raymond Marchand, C) Image tirée de [5], reproduit avec permission.
Le mode de déplacement des PGC est encore sous étude et plusieurs théories ont été
proposées pour l’expliquer. La théorie la plus connue est celle de la migration active des
2
PGC par mouvement amiboïde, dirigée par des chimio-attractants et en interaction avec la
matrice extracellulaire. Le principal chimio-attractant serait Kit ligand (KL), aussi connu
sous le nom de Stem-cell factor (SCF). KL stimule la réorganisation du cytosquelette et la
production de filopodes, permettant d’initier le mouvement amiboïde des PGC. Il agit
également sur la voie de signalisation PI3K, favorisant l’activation de la machinerie
migratoire des PGC [6]. Plusieurs membres de la famille des protéines Bone
Morphogenetic proteins (BMP), sécrétés par les annexes extra-embryonnaires, seraient à
l’origine de l’induction des PGC [7]. La voie de signalisation BMP serait essentielle à la
survie et à la migration des cellules germinales primordiales jusqu’à leur colonisation des
futures gonades. Ce serait entre autres la voie de signalisation BMP qui permettrait
l’expression du chimio-attractant KL [8]. La voie de signalisation Wnt serait également
essentielle à la migration des PGC. Le récepteur tyrosine kinase-like Ror2 serait une cible
de cette voie de signalisation. Ror2 serait un facteur permissif dans la réponse des PGC aux
chimio-attractants [9].
Plusieurs PGC ont été observées dans le système circulatoire de l’embryon, menant à l’idée
que ce moyen de transport pouvait être utilisé pour mener les PGC à destination. Il semble
que les espèces aviaires privilégient cette méthode de migration des PGC. Chez le poulet,
les PGC sont initialement retrouvées dans une région antérieure à la tête puis entrent dans
la circulation sanguine en concomitance avec la formation du système vasculaire
embryonnaire. Plus tard, les PGC vont activement quitter les vaisseaux sanguins pour
migrer le long du mésentère dorsal et coloniser les crêtes génitales [10]. Cependant,
puisque le cheminement des PGC est très différent chez ces espèces, il peut être difficile de
comparer les oiseaux aux mammifères. Pour l’instant, la théorie de l’utilisation du système
sanguin comme mode de transport des PGC chez les mammifères n’a pas encore été
prouvée. La théorie très controversée de l’équipe de Jonathan L. Tilly est basée sur ce
possible transport des cellules germinales par le sang [11, 12]. Selon cette théorie, la
transplantation de moelle osseuse d’un donneur sain permettrait de rétablir la production
d’ovocytes chez les souris stérilisées suite à des traitements de chimiothérapie. Ainsi, les
cellules souches présentes dans la moelle osseuse pourraient recoloniser l’ovaire grâce au
transport sanguin périphérique et permettre la production de nouveaux ovocytes.
3
Cependant, la communauté scientifique demeure particulièrement sceptique face à ces
résultats puisque plusieurs conclusions seraient inexactes ou incomplètes [13-15].
Une autre théorie expliquant la distribution spatiotemporelle des PGC dans le conceptus
tente toutefois d’invalider la théorie de la migration active des PGC sans, non plus, appuyer
la théorie du transport sanguin. Elle affirme que chez l’embryon bovin, la migration active
des PGC est inutile dû au développement morphologique de l’embryon. Le déplacement
des PGC de la région caudale du sac vitellin (jour embryonnaire E18) jusqu’au
mésonéphros, site des futures gonades (E23) peut être expliqué par les plicatures de
l’embryon. Ces plicatures permettent à l’embryon de passer de la forme de disque
tridermique à un corps embryonnaire cylindrique. Durant ce processus de plicature, les
PGC situées dans le sac vitellin se retrouvent incorporées dans l’embryon lorsqu’une
portion du sac se transforme en intestin moyen et postérieur. Ainsi, lorsque les crêtes
génitales apparaissent au jour E27, elles contiennent déjà des PGC présentes depuis le tout
début. Aucune migration active ne serait nécessaire pour expliquer cette colonisation [2].
Après avoir colonisé les crêtes génitales, les PGC poursuivent leurs mitoses afin de créer le
réservoir définitif d’ovogonies estimé à 2,7 millions chez la vache [16] et à sept millions
chez la femme [17]. Cependant, ce nombre diminue fortement durant la gestation pour
atteindre en moyenne 68 000 ovocytes chez la vache et environ un million chez la femme à
la naissance. Contrairement aux gamètes mâles qui sont produites de façon continue par un
processus inépuisable, le processus de formation des gamètes femelles est discontinu et non
renouvelable. Chez la femme, les ovogonies vont initier le processus de méiose entre la
10ème et la 11ème semaine fœtale où on les retrouve majoritairement au stade leptotène. Par
la suite, malgré le fait que tous les ovocytes ne sont pas synchronisés, on peut évaluer leur
progression dans la prophase I de la méiose. On observe les premiers ovocytes aux stades
zygotène et pachytène vers la semaine embryonnaire 10.5 et 11.5 respectivement et les
premiers ovocytes au stade diplotène vers la 12ème semaine [18]. À ce stade, les ovocytes
subiront le premier arrêt méiotique. Ce stade correspond également à l’apparition des
cellules folliculaires autour de l’ovocyte et à la formation du follicule primordial. Alors que
le follicule poursuivra son développement, la méiose demeurera en latence. Ainsi, peu
importe leur stade folliculaire à la naissance, tous les ovocytes sont arrêtés au stade
4
diplotène de la prophase I de la méiose. Ils demeureront sous cette forme jusqu’à la puberté
où, suite au pic de LH, les ovocytes sélectionnés pourront reprendre le processus méiotique.
L’acide rétinoïque (AR) est une molécule clée dans l’initiation de la méiose [19-21].
Produite par le mésonéphros tant chez le mâle que chez la femelle, il est rapidement
dégradé chez le mâle par l’enzyme spécifique CYP26B1, inhibant la reprise de la méiose et
forçant plutôt l’entrée des PGC en phase G0/G1 du cycle mitotique. L’absence de
CYP26B1 dans l’ovaire permet le maintien d’une forte dose d’AR qui induit l’entrée en
méiose des ovocytes [21]. Selon de récentes études, il semble même que la production
ovarienne d’acide rétinoïque serait suffisante pour initier la méiose, la production par le
mésonéphros serait donc superflue [22].
1.1.2 Folliculogenèse
L’accumulation de cellules somatiques autour de l’ovocyte pour former un follicule est
essentielle à sa survie. Chez les rongeurs, la folliculogenèse ne débute qu’après la naissance
[23] alors que chez l’humain et le bovin [18, 24], elle est initiée durant la période
embryonnaire. Les PGC qui existaient alors sous forme de grappes de plusieurs ovocytes,
sous forme de syncytium où les connections intercellulaires permettaient des échanges
d’organelles entre les ovocytes adjacents, se séparent et s’entourent individuellement de
cellules folliculaires [25]. Chez le bovin, les premières cellules folliculaires, les cellules de
granulosa, apparaissent vers le jour E74, donnant naissance au follicule primordial [24, 26].
Ces quelques 5 à 8 cellules de granulosa sont initialement aplaties et entourent un ovocyte
ovoïde plutôt que sphérique d’un diamètre d’environ 30 μm pour former un follicule de
moins de 40 μm. Les cellules de granulosa adjacentes peuvent communiquer entre elles par
des jonctions communicantes (gap junction) [27]. L’apparition du follicule correspond au
moment du premier arrêt méiotique et tous les ovocytes se retrouvent au stade diplotène de
la prophase I de la méiose. Le mécanisme induisant la formation du follicule primordial est
peu connu mais il est indépendant de la concentration en FSH, l’ovocyte ne possédant pas
de récepteur à cette hormone [24]. Avec la croissance du follicule, on observe l’apparition
de plusieurs couches de cellules de granulosa, de la zone pellucide, d’une membrane basale
et de couches cellulaires supplémentaires vascularisées et innervées, les cellules de la
thèque. Les follicules ont été catégorisés selon ces étapes de développement (Figure 1-2).
5
Follicule primaire
Chez le bovin, le follicule primaire est observé pour la première fois dès le jour E91.
L’ovocyte contenu dans le follicule primaire est sphérique et une couche simple de 8 à 20
cellules de granulosa cuboïdes l’entoure complètement. On observe pour la première fois
l’apparition de quelques petites sections de zone pellucide entre l’ovocyte et les cellules de
granulosa en division [27]. Alors que l’ovocyte croît peu, le diamètre du follicule peut
doubler et mesure généralement entre 40 et 80 μm [28].
Follicule secondaire
Le follicule secondaire, d’un diamètre de 80 à 130 μm, est caractérisé par une double
couche partielle ou complète de cellules de granulosa cuboïdes. Il est observé pour la
première fois chez le bovin vers le jour E120. De grandes régions de l’ovocyte peuvent être
couvertes de zone pellucide. Les cellules de granulosa en contact avec l’ovocyte sont
pourvues d’extensions qui entrent en contact avec l’ovocyte formant des jonctions
communicantes favorisant les échanges [27]. Quelques capillaires sanguins sont observés
autour des follicules secondaires et deviennent particulièrement apparent autour du jour
E160 [24].
Follicule tertiaire
Plusieurs couches de granulosa entourent maintenant l’ovocyte du follicule tertiaire qui
peut atteindre un diamètre allant jusqu’à 250 μm [28]. On observe déjà l’apparition de
quelques espaces lacunaires entre les cellules de granulosa. L’ovocyte est maintenant
complètement entouré de la zone pellucide, traversée par les prolongements cellulaires des
cellules de la corona radiata, la couche de cellules folliculaire directement en contact avec
l’ovocyte [27]. Quelques petits follicules pré-antraux peuvent apparaître durant la période
embryonnaire à partir du jour E150 [24].
Follicule antral
À partir du stade antral, on parle de croissance folliculaire terminale. Les follicules
deviennent dépendants des gonadotrophines pour poursuivre leur développement [29-32].
Les premières vagues de follicules antraux apparaissent donc à la puberté durant les
premiers cycles hormonaux. Chez la vache, on observe pour la première fois des follicules
antraux vers l’âge de 5 mois [33]. La formation de l’antre permet de faire la distinction
6
entre les cellules de granulosa murales, près de la paroi du follicule, et les cellules de
cumulus qui entourent l’ovocyte [34]. Durant la croissance folliculaire terminale, une forte
activité transcriptionnelle est observée dans l’ovocyte pour permettre l’accumulation finale
des transcrits nécessaires au programme embryonnaire précoce. Cette activité
transcriptionnelle sera tranquillement réduite pour être totalement inhibée lorsque l’ovocyte
atteint sa taille finale. Chez la souris, cela se produit peu avant l’ovulation [35-37] alors que
chez le bovin, l’arrêt transcriptionnel se produirait plus tôt dans des follicules aussi petits
que de 1,5 à 6 mm [35, 38-41]. L’acquisition de la compétence au développement apparaît
lorsque le follicule bovin atteint une taille de plus de 2 mm [42, 43]. À ce moment,
l’ovocyte a atteint sa taille mature approchant 120 μm et a accumulé tous les transcrits
nécessaires à la maturation, la fécondation et à la réalisation du programme embryonnaire
précoce [37].
Figure 1-2 Représentation schématique des différents stades de croissance des follicules.
Image tirée de [44]. Droit de reproduction libre.
7
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8
On observe les taux relatifs des hormones du cycle cellulaire ainsi que la croissance et l’atrésie des
follicules durant les vagues folliculaires. Reproduit avec la permission de Audrey Bunel.
Cependant, tous les follicules dominants ne subissent pas l’ovulation. Seule la dernière
vague du cycle mènera à l’expulsion d’un ovocyte puisque les premières vagues se
produisent en présence de progestérone. Cette hormone, sécrétée par le corps jaune produit
lors du cycle précédent, prévient la décharge finale de LH nécessaire à l’ovulation [45, 51].
1.1.3 Ovogenèse
Morphologie de la maturation ovocytaire
La morphologie des ovocytes est amenée à changer durant la croissance et la maturation
ovocytaire. Afin de mieux définir les changements qui se produisent et être à même de
déterminer le niveau de développement des ovocytes par l’observation de leur phénotype,
plusieurs phases ont été caractérisées [27, 39, 41]. Différents termes peuvent être utilisés
pour chacune des phases mais les mêmes caractéristiques ont été observées par différents
auteurs. De façon générale, on peut caractériser les ovocytes des phases GV0 à GV3 (ou
GV4 selon les auteurs) selon leur niveau de développement et leur compétence à produire
un embryon viable.
La phase GV0 correspond à des ovocytes en pleine croissance encore très actifs au niveau
de la transcription. On les retrouve dans les petits follicules antraux de moins de 0,7 mm
jusqu’à 1,5 mm [39]. En pleine période d’accumulation de transcrits, la chromatine est
retrouvée sous forme de filaments diffus, bien décondensée. Le noyau est retrouvé près du
centre de l’ovocyte et son enveloppe est bien lisse. Les organelles sont dispersées dans le
cytoplasme, de même que les granules corticaux. Les mitochondries présentes sont rondes
et distribuées en grappes [27, 41]. Leur forme laisse supposer qu’elles sont encore actives.
À la surface de l’ovocyte, on observe des microvillis dressés qui s’étendent dans la zone
pellucide [27]. Ces ovocytes sont caractérisés par une très faible capacité, in vitro, à
compléter la méiose et gagneraient à subir une phase de ‘pré’-maturation pour accélérer
leur croissance et leur permettre d’acquérir la compétence au développement [52].
À partir de la phase GV1, on observe une condensation progressive de la chromatine
accompagnée d’une réduction graduelle de la transcription. On retrouve les GV1 dans des
9
follicules antraux moyens, à partir de 1,5 mm. Le noyau se rapproche tranquillement de la
zone pellucide et on observe une légère ondulation de la membrane nucléaire, signe de
l’initiation de la maturation nucléaire. Les organelles se déplacent vers le cortex de
l’ovocyte et le cytoplasme se rempli progressivement de vésicules laissant de moins en
moins de matrice cytoplasmique. C’est à ce stade qu’on observe une subtile apparition de
l’espace périvitellin provoquant la libération des microvillis de la zone pellucide [27, 41].
En GV2, la chromatine se condense davantage et forme des amas bien visible se
rapprochant du nucléole. La transcription est de moins en moins active et on observe une
ondulation marquée de la membrane nucléaire, particulièrement du côté faisant face à la
zone pellucide puisque le noyau est maintenant situé en périphérie de l’ovocyte. Les
mitochondries ont subies d’importantes modifications morphologiques [27, 41]. Alors
qu’elles étaient bien rondes en GV0, la majorité prennent maintenant une forme
encapuchonnée, caractéristique de leur état peu actif et demeureront sous cette forme
jusqu’à l’activation du génome de l’embryon [53]. Plusieurs organelles ont également
subies des modifications. Les réticulums endoplasmiques sont beaucoup moins extensifs et
on remarque une réduction considérable de l’appareil de Golgi. Les granules corticaux sont
maintenant situés dans le cortex de l’ovocyte et présentent différents degrés de
dégénération [41]. C’est à partir de GV2 que les ovocytes, contenus dans des follicules
mesurant de 1,8 à 3 mm, commencent à acquérir la compétence à compléter la méiose [39,
52]. En dessous de cette taille, les ovocytes sont incapables de reprendre la méiose.
Cependant, les follicules de moins de 3 mm sont incapables de se développer au-delà du
stade embryonnaire de 8 cellules in vitro [54].
À partir du stade de GV3, la chromatine bien condensée n’est plus du tout permissive à la
transcription. Elle se concentre principalement autour du nucléole et peut même
l’encapsuler complètement. Les organelles sont maintenant regroupées dans le cortex de
l’ovocyte. Le cytoplasme est rempli de vésicules et on observe plusieurs signes de
dégénérescences cellulaires telles que la détérioration des granules corticaux et des régions
sans organelle. L’ovocyte a atteint sa taille mature (environ 120 μm) et à partir de ce
moment, seul le follicule poursuivra sa croissance [41]. La majorité des follicules sont
10
synchronisés sous forme de GV3 avant d’entreprendre la maturation ovocytaire, initiée par
le bris de la vésicule germinale (GVBD).
Afin de démontrer la présence ou l’absence de transcription durant la maturation ovocytaire
et plus tard durant le développement embryonnaire, plusieurs études ont réalisés des
marquages à l’uridine triciée ou autrement marquée (5’bromo-UTP). Ces études ont permis
de démontrer la forte diminution de la transcription dans les ovocytes aux stades de GV1 et
GV2 et l’inhibition globale dans les GV3 [41, 55].
Tout au long du processus de croissance, on assiste également à l’inactivation du nucléole,
site de transcription des ARN ribosomaux. Cette inactivation se produit en parallèle avec
l’encapsulation du nucléole par les amas de chromatine et sa vacuolisation, c’est-à-dire,
l’apparition d’une grosse vacuole en son centre [41]. Cet arrêt de la production d’ARN
ribosomaux suggère que l’ovocyte et l’embryon précoce ont un potentiel limité pour le
renouvellement des ribosomes et la traduction. Cette théorie est appuyée par la faible
quantité d’ARN ribosomaux 28S et d’un rapport anormal entre le nombre d’ARN
ribosomaux 18S et 28S durant les premiers stades de développement [56].
Tableau 1-1 Caractéristiques associées à la maturation de l’ovocyte au stade de vésicule
germinale.
Tiré et modifié avec permissions. [41].
GV0
GV1
GV2
GV3
Localisation du noyau
Excentré
En périphérie
En périphérie
En périphérie
Ondulation de
l'enveloppe nucléaire
Presque absente
Légère
Profonde
Profonde
Distribution des
organelles
Éparpillés
Homogènes dans
le cortex de
l'ovocyte
Homogènes dans
le cortex de
l'ovocyte
En amas dans le
cortex de l'ovocyte
Espace périvitellin
Absent
Présent
Présent
Présent
Microvillis
Érigées
Courbés
Courbés
Courbés
Phénotype
mitochondrial
Rondes
À capuchon
À capuchon
À capuchon
Petits amas
dispersés dans le
cytoplasme
Profondément
dans le cortex
Profondément
dans le cortex
En périphérie
Localisation des
mitochondries
11
Reprise méiotique
Alors que l’ovocyte a acquis une certaine maturité durant sa croissance, une maturation
finale est nécessaire chez le follicule dominant destiné à ovuler à la fin de la vague
folliculaire du cycle œstral. Cette maturation finale est caractérisée par la reprise de la
méiose et est initiée, chez les mammifères, par l’augmentation de la pulsatilité de
l’hormone lutéinisante (LH, luteinizing hormone). La reprise de la méiose provoque la
dissolution de la membrane nucléaire ou bris de la vésicule germinale (GVBD), l’expulsion
du premier globule polaire puis un second arrêt méiotique en métaphase II. Les mécanismes
de reprise de la méiose se retrouvent régulièrement sous la loupe des chercheurs. Malgré les
nombreuses recherches et l’avancement des connaissances, plusieurs mystères entourant ce
processus ont encore à être élucidés.
Tel que mentionné précédemment, la reprise de la méiose in vivo est provoquée par
l’augmentation de la pulsatilité de la LH vers la fin du cycle œstral. Le pic de LH provoque
de nombreuses modifications cellulaires, la plus importante consistant au bris de la
communication entre les cellules. Plus précisément, le pic de LH provoque le bris des
jonctions communicantes par la phosphorylation et l’inactivation de la connexine 43
(Cx43), la principale molécule associée à l’assemblage des jonctions communicantes entre
les cellules de granulosa [57]. Ce bris de communication aura des effets importants sur
l’ovocyte, principalement en raison de l’arrêt de l’apport en AMPc. L’AMPc joue un rôle
fondamental durant la maturation ovocytaire mais son rôle est bien différent entre les
cellules de granulosa et l’ovocyte. Contrairement à l’ovocyte, les cellules de cumulus et de
granulosa possèdent des récepteurs à la LH. Elles répondent au pic de LH par une
augmentation marquée de la production d’AMPc due à la stimulation de l’adénylate
cyclase. Avant le bris des jonctions communicantes, l’AMPc produit par les cellules de
cumulus et de granulosa est continuellement transféré vers l’ovocyte et permet de maintenir
celui-ci en arrêt méiotique. Hors, suite au pic de LH, on observe une augmentation
transitoire d’AMPc dans l’ovocyte, provoquée par la surproduction d’AMPc par les cellules
de cumulus, suivi par une diminution drastique suite au bris des jonctions communicantes.
12
Cette baisse des niveaux d’AMPc constitue le principal signal pour la reprise de la méiose
[58, 59].
Le mode d’action de l’AMPc est intimement associé à son rôle dans l’activation de la
protéine kinase A (PKA) [60] (voir Figure 1-4). La PKA régule directement 2 enzymes : elle
active la kinase Wee1B et inhibe la phosphatase Cdc25. Wee1B et Cdc25 contrôlent la
phosphorylation de CDK1 (Cyclin-dependant kinases, CDK), composante régulatrice du
complexe MPF (Maturation Promoting Factor). La phosphorylation de CDK1 par Wee1B
inactive le complexe MPF et inhibe la reprise de la méiose. Au contraire, Cdc25
déphosphoryle CDK1, ce qui active le MPF et initie la reprise de la méiose. Ainsi, avant le
pic de LH, les hauts niveaux d’AMPc dans l’ovocyte stimulent la PKA qui maintient
l’activité de Wee1B. Wee1B phosphoryle CDK1 qui inactive le MPF. Au moment de la
reprise de la méiose, une chute importante d’AMPc intra-ovocytaire provoque
l’inactivation de PKA. Cdc25, inhibée jusque-là par la phosphorylation induite par PKA,
est activée et déphosphoryle CDK1, provoquant l’activation du complexe MPF (revue dans
[61]. Le rôle de PKA ne s’arrête pas là. Il semble que la PKA ait directement un rôle dans
la diminution d’AMPc en phosphorylant et activant la phosphodiestérase PDE3A. Les
phosphodiestérase dégradent les nucléotides cycliques permettant de diminuer les taux
d’AMPc dans l’ovocyte. Cette forte diminution d’AMPc provoque une boucle de
rétroaction qui inactive la PKA. En résumé, la diminution d’AMPc est provoquée
passivement par le bris des jonctions communicantes et activement par les
phosphodiestérases.
13
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14
mitotique [64]. L’activation du MPF permet le bris de la vésicule germinale (GVBD), la
condensation des chromosomes et la formation des fuseaux mitotiques. Cependant, il est
crucial d’inactiver rapidement le MPF suite à la métaphase I (MI) pour permettre
l’extrusion du premier globule polaire. Pour y arriver, la protéine CDK1 est inactivée et le
protéasome provoque la dégradation de la CCNB1 [64].
Dans le cas d’une mitose, cette inactivation du MPF est maintenue et la cellule entre alors
en interphase, caractérisée par la duplication de l’ADN. Évidemment, durant la méiose, la
duplication de l’ADN doit absolument être évitée. Il est donc crucial de réactiver
rapidement le MPF par une production de novo de CCNB1 et une réactivation de CDK1.
La protéine Mos (c-mos, pp39mos), le composant catalytique du facteur cytostatique (CytoStatic Factor, CSF), semble être essentielle à la réactivation de CDK1 et joue donc un rôle
crucial dans l’inhibition de la duplication de l’ADN [65, 66]. Cette protéine apparaît après
le bris de la vésicule germinale, augmente graduellement jusqu’en MII où elle provoque un
second arrêt méiotique puis diminue abruptement au moment de la fécondation [67]. C’est
la vague calcique produite au moment de la fécondation qui provoque l’inactivation du CSF
et permet l’extrusion du second globule polaire [68] (Figure 1-5). En l’absence de Mos, le
second arrêt méiotique n’a pas lieu et l’ovocyte expulse son second globule polaire,
provoquant parfois une activation parthénogénétique de l’œuf qui peut alors se diviser
jusqu’à atteindre 4 cellules [69].
15
Figure 1-5 Ligne du temps de l’activité du MPF et du CSF.
Activation relative du MPF et du CSF exprimé en unité arbitraire. On observe l’activation du MPF
au moment de la reprise de la méiose, son inactivation au moment de la méiose 1 et les vagues
d’activation/inactivation pour chaque cycle cellulaire. On observe également l’activation du CSF
suite à la reprise de la méiose et sa disparition complète suite à la fécondation. Traduit et adapté de
[70]. Reproduit et modifié avec permissions.
Compétence au développement et atrésie folliculaire
Plusieurs études se sont penchées sur le lien de plus en plus évident entre compétence au
développement et atrésie folliculaire. En effet, même si cela peut paraître étonnant, les
ovocytes présentant des signes légers d’atrésie seraient les plus compétents à reprendre la
méiose et à poursuivre le développement embryonnaire [39, 54, 71-73]. La réduction de la
taille de l’appareil de Golgi, l’ondulation de l’enveloppe nucléaire, la dégénérescence des
granules corticaux et la présence de régions sans organelle sont toutes des caractéristiques
phénotypiques associées à l’atrésie qui sont également associées à la compétence
ovocytaire. La configuration de plus en plus compactée de la chromatine, corrélée avec les
précédentes caractéristiques, pourrait représenter un pas de plus vers l’atrésie. La
proportion d’ovocytes qui entreprennent la GVBD augmente significativement dans les
follicules présentant des signes de faible atrésie [39]. Il semble même qu’un haut degré
16
d’atrésie ne serait pas détrimentaire pour la compétence ovocytaire [72]. Il en serait de
même pour la production embryonnaire qui est augmentée dans les classes de follicules
présentant quelques signes d’atrésie (ovoplasme légèrement granuleux et cumulus en
expansion). Il semble également que la morphologie ovocytaire soit corrélée à la
morphologie folliculaire. Les ovocytes en GV0 et GV1 seraient davantage retrouvés dans
des follicules non atrétiques alors que les ovocytes en GV2 et GV3 seraient observés dans
des follicules légèrement atrétiques [54].
1.1.4 Fécondation
La fécondation est un processus complexe où la fusion de l’ovocyte et du spermatozoïde,
deux cellules haploïdes hautement spécialisées, est à l’origine de la première cellule d’un
futur être. Plusieurs étapes sont nécessaires au bon déroulement de ce processus mais seul
un rapide survol sera réalisé dans cette thèse. La première étape consiste en la fusion du
spermatozoïde à la zone pellucide de l’ovocyte. C’est une glycoprotéine située sur la zone
pellucide qui assure la spécificité de l’espèce : seuls les spermatozoïdes d’un mâle de la
même espèce que celle de l’ovocyte peuvent se lier à cette glycoprotéine. Chez le bovin,
c’est la protéine ZP3 qui joue ce rôle de spécificité alors que d’autres protéines ZP peuvent
être impliquées chez d’autres espèces. La liaison du spermatozoïde à l’ovocyte provoque la
fusion des membranes externe et interne de l’acrosome et la formation de pores dans la
membrane cellulaire du spermatozoïde. Le contenu de l’acrosome, contenant entre autres
de la hyaluronidase et de l’acrosine, sera déversé et permettra de dissoudre la zone
pellucide pour la fragiliser et faciliter le passage du spermatozoïde. Plusieurs
spermatozoïdes peuvent initier la réaction acrosomique mais normalement, un seul peut
pénétrer l’ovocyte. La réaction corticale permet de protéger l’ovocyte contre la
polyspermie. L’entrée du spermatozoïde provoque une cascade de signalisation, initiée par
un flux calcique qui provoque la fusion des granules corticaux à la membrane externe de
l’ovocyte. Les granules corticaux libèrent alors leur contenu dans l’espace périvitellin et
provoque une modification de la protéine ZP3, inhibant l’attachement du spermatozoïde à
l’ovocyte. De plus, suite à la fécondation, la membrane plasmique de l’ovocyte se rétracte
davantage, rendant plus difficile la pénétration de spermatozoïdes additionnels.
17
Tel que mentionné plus haut, le flux calcique provoque également l’inactivation du facteur
cytostatique et la reprise de la méiose, caractérisée par l’expulsion du second globule
polaire. Ainsi, le spermatozoïde, en plus d’apporter le bagage génétique nécessaire au
rétablissement de la diploïdie, est responsable de l’activation de l’œuf. Son seul apport
supplémentaire est un centriole, le deuxième centriole étant apporté par l’ovocyte.
1.2 L’EMBRYON
1.2.1 Anatomie du développement précoce
La première cellule, le zygote, est totalement indifférenciée et totipotente. Par
multiplication cellulaire et par différenciation, le zygote est à l’origine de la formation de
tous les tissus et de tous les organes, incluant les annexes embryonnaires qui assurent la
survie de l’embryon durant la gestation.
1.2.2 Première semaine de développement
La fécondation est un processus qui dure environ 28 heures chez le bovin et se termine par
une première division mitotique pour former un embryon de deux cellules. Par la suite, les
deuxième (2 à 4 cellules) et troisième (4 à 8 cellules) clivages sont très rapides et
caractérisés par l’absence ou la forte réduction des phases G1 et G2 du cycle cellulaire,
normalement dédiées à la synthèse d’ARNm. L’embryon duplique donc rapidement son
génome (phase S) avant d’entrer à nouveau en mitose (phase M), ce qui prend environ 8 à 9
heures chez le bovin. Le quatrième cycle cellulaire (8 à 16 cellules) est beaucoup plus lent,
dure environ 40 heures et correspond à une phase critique du développement embryonnaire
précoce: l’activation du génome de l’embryon, qui sera détaillée dans la section
1.3.5 ‘Durée du silence transcriptionnel’. C’est le premier cycle cellulaire où sont présentes
les quatre phases du cycle cellulaire normal : G1, S, G2 et M [74]. Par la suite, l’embryon
poursuit ses divisions pour former un amas compact de cellules appelé morula, contenant
de 32 à 64 cellules. Chacune des cellules embryonnaires est appelée un blastomère.
Les premières divisions cellulaires chez l’embryon se font sans aucune augmentation de
volume puisque l’embryon est toujours prisonnier de la zone pellucide rigide. Chaque
clivage produit donc deux blastomères dont le volume individuel correspond à la moitié du
volume de la cellule mère. C’est seulement au stade de blastocyste, après l’apparition d’une
18
cavité appelée blastocoèle, qu’on observe la première augmentation du volume, associé à
une fragilisation de la zone pellucide puis à l’éclosion du blastocyste (Voir Figure 1-6).
Chez le bovin, l’embryon atteint le stade de blastocyste vers la fin de la première semaine
de développement.
Figure 1-6 Progression des premiers stades embryonnaires précoces.
A) Ovocyte au stade de GV B) Embryon 2 cellules C) Embryon 4 cellules D) Embryon 6 cellules
E) Embryon 8 cellules F) Morula G) Blastocyste H) Éclosion du blastocyste I) Blasctocyste éclos
Figure produite par l’auteure Sara Scantland et Dr.Claude Robert.
Chez l’humain, l’éclosion du blastocyste est rapidement suivie de l’attachement de
l’embryon à la paroi utérine puis à son implantation directement à l’intérieur de la
muqueuse utérine, une caractéristique propre aux humains, aux primates, aux rongeurs et
aux lagomorphes (lapin, lièvre, pica) [75, 76]. Chez le bovin, l’embryon ne s’implantera
jamais dans la muqueuse utérine mais s’attachera à la paroi par des projections des
membranes fœtales jusqu’aux caroncules maternels. Le moment exact de l’attachement de
l’embryon bovin demeure incertain. En 1927, Hammond affirmait que les membranes
fœtales n’étaient toujours pas attachées à l’utérus maternel à la fin du premier mois de
gestation [77]. En 1942, Winters soutenait plutôt que l’embryon s’attachait entre les jours
11 et 12 après fécondation alors que Kingman (1948) supposait qu’une union fragile des
membranes embryonnaires à l’utérus était initiée entre les jours 15 et 19 post-fécondation
[77, 78]. Une étude histologique de Melton (1951) soulignait qu’aucune membrane
n’unissait l’embryon à la mère après 31 jours de gestation, qu’un attachement très fragile
19
pouvait être observé à 33 jours et que ce n’était qu’à partir de 35 jours que l’attachement
entre les tissus chorioniques et les caroncules maternels étaient suffisamment profond pour
permettre une union intime entre ces tissus [77]. Pour assurer la survie de l’embryon malgré
la longue période avant son attachement, la reconnaissance maternelle de la gestation doit
avoir lieu rapidement. Selon [79], l’attachement chez le bovin se produirait en 5 étapes : 1)
l’éclosion, 2) le contact initial, 3) l’apposition, 4) l’adhésion et enfin 5) une invasion très
limitée de l’endomètre. Chez le bovin, l’éclosion du blastocyste se produit aux environs des
jours 9 à 10. Par la suite, l’embryon passe par une étape d’allongement où il prend une
forme filamenteuse. Sa croissance est telle qu’il passe d’une forme ovoïde d’environ 2 mm
au jour 13 à une longueur d’environ 6 cm au jour 16 puis de 20 cm au jour 19. Si le
moment exact de l’attachement n’est pas encore connu, les chercheurs s’entendent que ce
n’est qu’après cette date que le conceptus initie son attachement en s’apposant à la paroi
endométriale et en développant des projections qui s’étendent jusque dans les glandes
utérines [80-83].
1.2.3 Poursuite du développement embryonnaire
Le développement embryonnaire précoce englobe la première semaine de développement et
se termine au moment où l’embryon, sous forme de blastocyste éclos, est prêt à s’attacher à
la paroi utérine ou, in vitro, est prêt à être transféré dans l’utérus d’une mère porteuse. Chez
l’humain, la phase embryonnaire correspond aux huit premières semaines de
développement. Après ce temps, l’embryon est parfaitement formé et tous ses tissus et
organes ont été modelés. Les semaines de développement subséquentes correspondent à la
phase fœtale et seront caractérisées par une forte croissance et par la maturation des
organes. La période embryonnaire et tout particulièrement les quatre premières semaines
de développement correspondant à l’organogenèse représentent une période fort
intéressante. Cependant, les objectifs de cette thèse se concentrent exclusivement sur le
développement précoce et donc sur la première semaine de développement. Le
développement embryonnaire subséquent ne sera donc pas abordé ici.
1.2.4 Structuration des cellules embryonnaires
Lorsque l’embryon atteint le stade de morula, on assiste à un processus de compaction qui
modifie les cellules embryonnaires et mène à une première différenciation. Les cellules
20
embryonnaires retrouvées au centre de l’embryon seront plus grosses que celles retrouvées
en périphérie. On parle alors de macro-blastomères et de micro-blastomères. Suite à
l’apparition du blastocœle au stade subséquent, les macro- et micro-blastomères se
différencieront davantage pour former la masse cellulaire interne (Inner cell mass, ICM,
également appelé bourgeon embryonnaire) et le trophoblaste, respectivement. La masse
cellulaire interne permet la formation du corps de l’embryon ainsi que de quelques annexes
embryonnaires (sacs amniotique et vitellin) alors que le trophoblaste ne formera que des
annexes (chorion placentaire) [84].
1.2.5 Destin cellulaire
Dans plusieurs organismes, l’œuf possède déjà une certaine polarité établie durant
l’ovogenèse, qui permet de déterminer les axes du corps de l’embryon. C’est le cas de la
drosophile où l’établissement des axes antéro-postérieur (A-P) et dorso-ventral (D-V) est
déterminé durant l’ovogenèse par la position de l’ovocyte par rapport aux cellules
nourricières et selon la position de la vésicule germinale dans l’ovocyte. Les cellules
nourricières, en syncytium avec l’ovocyte, ont un rôle majeur à jouer dans l’établissement
du destin cellulaire en transférant des ARNm vers l’ovocyte. Ce transfert d’ARNm
permettra d’établir un gradient d’ARNm et de protéines dans l’embryon dont la
concentration spécifique permettra la détermination des segments corporels [85] (et revu
dans [86]).
Chez d’autres espèces, tel que le nématode C. elegans, la polarité de l’ovocyte n’est pas
détectable avant la fécondation. Les axes embryonnaires seront déterminés au moment de la
fécondation, le site d’entrée du spermatozoïde signalant le pôle postérieur de l’embryon.
L’aster spermatique interagit avec le cortex ovocytaire voisin pour ségréger certaines
protéines de polarité au pôle postérieur [87-89].
Chez le Xénope et l’ascidie, la polarité de l’embryon est déterminée avant et après la
fécondation. Durant la maturation ovocytaire, un pôle animal et un pôle végétal
apparaissent dans l’ovocyte, la position des chromosomes méiotique et le site d’extrusion
des globules polaires définissant le pôle animal. Mais ce n’est seulement qu’au moment de
la fécondation que seront déterminés les axes
A-P et D-V grâce à l’entrée du
21
spermatozoïde. Celle-ci provoque une onde de contraction précisant l’axe D-V et
introduisant le centrosome paternel, qui définit le côté postérieur [89].
Le cas des mammifères est beaucoup plus complexe car la détermination des axes
embryonnaires s’exprime tardivement. Ce n’est qu’à partir du stade de blastocyste que l’on
peut observer une réelle polarité et que le premier axe embryonnaire (dorso-ventral) peut
être défini de façon claire. Tout comme les ovocytes de plusieurs autres espèces, les
ovocytes de mammifères possèdent un pôle végétal et un pôle animal. Toutefois, celui-ci
n’est pas aussi facilement visible à l’œil nu et n’est déterminé qu’au moment de l’expulsion
des globules polaires, le site d’extrusion déterminant le pôle animal. Extrapolant sur les
données obtenues chez les autres espèces, plusieurs auteurs ont tenté de découvrir une
certaine polarité précoce associée au pôle animal-végétal et/ou au site de pénétration du
spermatozoïde [90, 91]. Cependant, la communauté scientifique demeure mitigée face à ces
résultats puisque plusieurs autres études les ont contredits [92-94]. Dans le même ordre
d’idées, d’autres chercheurs ont affirmé que la destinée cellulaire est déjà établie suite au
premier clivage. Les deux blastomères obtenus suite à cette division produiraient
respectivement la masse cellulaire interne et le trophectoderme [95]. Encore une fois, ces
résultats sont fortement controversés puisqu’il est possible d’éliminer l’une de ces deux
cellules sans effet délétère sur le développement. En fait, jusqu’au stade de huit cellules, il
est possible d’éliminer certaines cellules sans provoquer le moindre problème
développemental, chaque cellule étant parfaitement totipotentes [96]. De même, des
chimères formées de deux embryons huit cellules formeront des animaux normaux [97].
Ces observations contredisent l’idée que les axes embryonnaires pourraient être déterminés
avant le stade de blastocyste.
1.3 LA TRANSCRIPTION DANS L’OVOCYTE ET L’EMBRYON PRÉCOCE
1.3.1 Transcription ovocytaire
Une période de transcription active se produit durant la croissance de l’ovocyte et se
termine lorsque l’ovocyte atteint sa taille mature. De fait, il semble que chez la souris 95%
de l’ARNm soit accumulé durant la période où l’ovocyte passe de 65% de sa taille jusqu’à
l’atteinte de sa taille mature [98]. Cette production importante de transcrits permettra
d’accumuler et d’emmagasiner les ressources nécessaires à la maturation ovocytaire, à la
22
fécondation et aux premières étapes du développement précoce. Cette accumulation de
transcrits modifie profondément les rapports ARNm/ARN totaux dans l’ovocyte par
rapport aux cellules somatiques. Alors que les cellules somatiques sont normalement
composées de 95% d’ARN ribosomaux (ARNr) et de quelques 5% d’ARNm, le
pourcentage d’ARNm augmente drastiquement durant la croissance de l’ovocyte. Malgré
ces quantités phénoménales de transcrits accumulés dans l’ovocyte, la difficulté d’obtenir
de grandes quantités de matériel biologique est problématique lorsqu’on étudie l’ovocyte. Il
reste donc difficile de mesurer la teneur en ARNm de ceux-ci avec les outils moléculaires
disponibles actuellement. Cependant, plusieurs estimations ont été réalisées chez
différentes espèces. Ainsi, on estime à 350 pg la quantité d’ARNm présents dans l’ovocyte
bovin [56], 330 pg chez l’humain [99] et 650 pg chez le porc [100]. Chez certaines espèces,
les quantités peuvent être remarquables. Par exemple, on retrouve jusqu’à 15 ng d’ARNm
dans l’ovocyte de lapin et plus de 1 μg dans certains œufs d’oiseaux [100].
1.3.2 Mécanismes d’emmagasinage des transcrits
Dans les cellules somatiques, la transcription des ARNm est généralement suivie par leur
traduction en protéine pour une utilisation rapide. Cependant, puisque l’ovocyte doit
accumuler une multitude de transcrits qui ne seront utilisés que plus tard durant la
maturation ovocytaire, la fécondation ou les premières étapes du développement
embryonnaire, il est nécessaire de les emmagasiner de façon à les protéger à la fois de la
traduction et de la dégradation.
Déadénylation des transcrits
La première étape essentielle à l’emmagasinage des transcrits est leur déadénylation. Ceci
permet probablement de les protéger de la traduction précoce. Cette étape est parfois
régulée par de courtes séquences riches en adénylate et en uridylate présentes dans la région
non-traduite située en 3’. Ces séquences sont appelés ARE (éléments riches en AU de
l’anglais AU-Rich Elements). La séquence EDEN (embryo deadenylation element) est
l’ARE le plus connu dans l’ovocyte et l’embryon précoce chez l’humain et le Xénope [101,
102] mais aucun homologue n’a été trouvé chez le bovin. Lorsque la protéine de liaison
23
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24
protéger ceux-ci de la dégradation. Après la reprise de la méiose chez la souris, YBX2 est
phosphorylée par la kinase CDK1 provoquant une dégradation massive des transcrits
maternels. Chez cette espèce, 90% des ARNm maternels sont dégradés au stade de deux
cellules, l’activation du génome de l’embryon étant initiée dès le stade zygotique [108].
Cette dégradation des transcrits maternels serait essentielle puisqu’en inhibant leur
dégradation, on bloque la transition maternelle-zygotique chez la souris [107, 109]. Le
mécanisme équivalent est probablement plus complexe chez les grands mammifères
puisque l’activation du génome de l’embryon survient à des stades subséquents et nécessite
un contrôle plus séquentiel de la dégradation des transcrits maternels. De plus, certains
ARNm maternel subsistent suite à l’AGE. Par exemple, les transcrits MATER, ZAR1,
BMP15 et GDF9, d’origine maternelle, sont encore faiblement retrouvés au stade de
morula et ce, malgré l’absence de transcription de novo suite à l’AGE [110]. Ceci suggère
que la dégradation des ARNm maternels est plus progressive chez les grands mammifères.
Granules d’ARN
Afin d’assurer une protection supplémentaire aux ARNm maternels contre la dégradation,
il est fort probable que les ribonucléoprotéines soient accumulées dans des granules
d’ARN. Il existe différents types de granules permettant la protection, l’emmagasinage
et/ou la dégradation des transcrits. De nombreuses protéines de différentes fonctions
cellulaires s’y accumulent et agissent pour stabiliser l’ARNm ou, au contraire, initier sa
dégradation. On y retrouve des protéines de liaison à l’ARN tel que YBX2 et CPEB
(Cytoplasmic Polyadenylation Element Binding), toutes deux associées à la stabilisation
des transcrits, ainsi que DDX6, une hélicase jouant à la fois un rôle dans la stabilisation de
l’ARN et dans l’inhibition de la traduction [111]. En revanche, on y retrouve également des
protéines telles que DCP1A, une enzyme du complexe de décoiffage qui initie la
dégradation des ARNm.
Les granules d’ARN les plus communes dans les cellules de mammifères sont les
processing bodies (P-bodies). Ces granules sont souvent associées à la dégradation des
transcrits et accumulent toutes les enzymes nécessaires à l’enlèvement de la coiffe. Un
25
second type de granules, les granules de stress, permettraient également l’accumulation de
transcrits tout en les protégeant contre la dégradation afin de pouvoir les rendre rapidement
disponible en situation de stress. Pour éviter la dégradation des transcrits, les enzymes du
complexe de décoiffage DCP1A seraient absentes des granules de stress. Dans les ovocytes
de Xenopus tropicalis, Drosophila melanogaster, Caenorhabditis elegans et de Danio
renio, des granules ‘germinales’ ont été caractérisées et semblent agir au niveau de la
stabilisation des ARNm [112-114]. Par contre, chez les mammifères, la dynamique de tels
granules d’ARN est moins connue.
Basé sur la localisation de différents marqueurs, la présence de P-bodies a été confirmée
dans les ovocytes immatures. On assiste toutefois à une diminution marquée de leur taille
en parallèle avec la croissance de l’ovocyte et leur trace est indétectable lorsque l’ovocyte
atteint sa taille mature. Par contre, cette disparition des P-bodies serait compensée par
l’apparition de granules d’ARN subcorticaux contenant plusieurs protéines de liaison à
l’ARN (entre autres YBX2, CPEB et DDX6) ainsi que des ARNm en dormance [111]. La
disparition des P-bodies se produit en concomitance avec une forte diminution de l’enzyme
DCP1A qui ne réapparait, chez la souris, qu’au moment de la reprise de la méiose. Cette
disparition de DCP1A dans un moment critique d’emmagasinage des transcrits puis sa
réapparition dans un moment de forte dégradation des transcrits correspond bien à sa
fonction de décoiffage des ARNm en voie de dégradation [111].
1.3.3 Arrêt de la transcription
Il a été mentionné à plusieurs reprises que l’ovocyte arrête complètement toute activité
transcriptionnelle lorsqu’il atteint sa taille mature. À première vue, il semble logique
d’affirmer que la compaction graduelle de la chromatine observée durant la maturation
ovocytaire puisse être la principale cause de l’inhibition de la transcription (Voir la section
Morphologie de la maturation ovocytaire). La compaction limite considérablement la
capacité transcriptionnelle en réduisant l’accès des protéines impliquées à l’ADN.
Cependant, il semblerait que le remodelage de la chromatine ne soit pas indispensable pour
réprimer la transcription puisqu’il est possible expérimentalement d’inhiber la compaction
sans affecter le silence transcriptionnel [55]. Cette découverte implique la nécessité de
mécanismes alternatifs pour inhiber la transcription. Ainsi, en plus de la compaction de la
26
chromatine, il semble que la transcription soit inhibée par l’inactivation de l’ARN
polymérase II (RNAPII) et par l’inhibition de certaines phases du cycle cellulaire normal.
Inactivation de RNAPII
C’est le complexe de l’ARN polymérase II (RNAPII) qui est responsable de la transcription
des ARNm chez les mammifères. Tant chez la souris que chez le porc, où l’activité de
RNAPII a été évaluée, les chercheurs semblent s’accorder à l’idée que la polymérase
devient inactive durant la maturation ovocytaire et provoquerait l’arrêt de la transcription
[115-117]. Cependant, aucun consensus n’a été établi à savoir si RNAPII est dégradée ou
simplement inactivée. Selon Abe (2010), RNAPII serait retrouvée sur 42% des gènes
inactifs mais ne serait pas en mesure de transcrire les gènes dû à sa forme
hypophosphorylée. La plus grosse sous-unité de RNAPII, RPB1, contient un domaine
carbo-terminal (CTD, Carbo-terminal domain) qui peut être phosphorylé réversiblement
durant le processus de transcription. Le CTD contient 52 répétitions d’un heptapeptide,
Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser [118, 119]. Lorsque le CTD n’est pas phosphorylé, RNAPII
peut être activement recrutée au site d’initiation de la transcription mais son activité est
inhibée. La transcription peut être initiée lorsque la cinquième Ser est phosphorylée, mais
une double phosphorylation en Ser2 et en Ser5 est nécessaire pour les étapes de
d’élongation et d’épissage de l’ARNm [120, 121]. Corroborant cette idée, RNAPII est
retrouvée à la fois sous forme phosphorylée et déphosphorylée dans les ovocytes en
croissance (et donc transcriptionnellement actifs) alors que seul la forme déphosphorylée de
RNAPII se retrouve dans l’ovocyte mature [115, 117]. Une autre étude avance plutôt l’idée
qu’en plus d’être déphosphorylée, la sous-unité RPB1 de RNAPII serait carrément
dégradée durant la maturation [116]. Cette conclusion a cependant été remise en question
par des recherches ultérieures. Chez le porc, la sous-unité déphosphorylée a été détectée
durant la métaphase I mais demeure indétectable au moment de la métaphase II. Cela
suppose que RPB1, la sous-unité de RNAPII, est au moins partiellement dégradée durant la
maturation ovocytaire [117]. Chez le bovin, il semble que la sous-unité déphosphorylée soit
détectée durant la maturation ovocytaire et durant la première division embryonnaire mais
serait graduellement dégradée lors des deuxième et troisième divisions embryonnaires
[119]. Toutes ses caractéristiques supportent l’idée que l’ovocyte et l’embryon précoce sont
27
incapables de transcrire leur génome, la polymérase responsable de la transcription des
ARNm étant inactive.
Inhibition du cycle cellulaire
En plus de la condensation de la chromatine et de l’absence d’une ARN polymérase
efficace, le silence transcriptionnel se poursuivrait suite à la fécondation puisque les
premiers cycles cellulaires ne se prêtent pas aisément à la synthèse de novo d’ARN. Que ce
soit chez la drosophile [122], le xénope [123], le poisson zèbre [124] ou le bovin [125], il
semble que les premières divisions cellulaires se produisent très rapidement et sans passer
par les phases G1 et G2 du cycle cellulaire. Ces phases sont normalement dédiées à la
synthèse d’ARN puisque c’est à ce moment que la chromatine se trouve dans un état
décondensé et accessible pour la polymérase et les autres protéines nécessaires à la
transcription.
Avant
l’activation
du
génome
embryonnaire,
les
cycles
cellulaires
consistent
principalement en une phase S suivie d’une phase M. Ce n’est qu’au moment de
l’activation du génome de l’embryon que les phases G1 et G2 font leur apparition,
augmentant drastiquement la durée du cycle cellulaire. La raison de l’absence des phases
«gaps» est peu connue mais semble associée avec la régulation particulière des ARNm et
des protéines maternelles avant l’activation de la transcription embryonnaire. L’absence de
phase G1 pourrait être expliquée par la forte activité de la protéine CDK2 durant les
premiers cycles cellulaires. Un excès de cette protéine pourrait provoquer l’initiation d’une
nouvelle phase S dès la fin de la phase M, lorsque la cyclin B1 est dégradée et l’activité
MPF inhibée [126, 127].
L’absence de phase G2 pourrait quant à elle être expliquée, entre autres, par la régulation
de cdc25 [128, 129]. Cette protéine est normalement nécessaire à la progression de la phase
G2 vers la phase M. Cependant, une expression importante et rapide de cdc25 dès que la
synthèse d’ADN est complétée (phase S, phase de synthèse / duplication de l’ADN)
provoquerait une initiation prématurée de la phase M (mitose). Après l’activation de la
transcription embryonnaire, un changement dans l’expression de cdc25 permettrait
28
l’apparition d’une première phase G2. Lorsque l’activité de cdc25 est inhibée, une phase
G2 peut apparaître avant l’activation de la transcription [126].
1.3.4 Régulation de la traduction des transcrits emmagasinés
Durant la période de répression de la transcription, les ARNm maternels sont
rigoureusement régulés. Ceci est nécessaire pour permettre l’expression génique, aux
moments spécifiques, des protéines essentielles à chaque étape du développement. Cette
régulation se traduit par des modifications post-traductionnelles qui permettent l’activation
de protéines ainsi que par la synthèse de novo de protéines à partir des ARNm maternels
emmagasinés durant la croissance de l’ovocyte (Figure 1-8).
Un exemple classique de contrôle de l’expression génique utilisant à la fois la traduction de
novo et les modifications post-traductionnelles est la régulation de la reprise de la méiose
par l’action du facteur MPF. Comme je l’ai mentionné à la section Reprise méiotique, ce
complexe est composé de deux sous-unités : la ‘cyclin-dependant kinase’ (CDK1) et l’unité
régulatrice, la cycline B1 (CCNB1) [130]. Deux étapes sont nécessaires afin d’activer le
complexe et initier la maturation méiotique par le bris de la vésicule germinale. La
première étape correspond à la synthèse de ces deux molécules si elles ne sont pas déjà
présentes dans le cytoplasme de l’ovocyte. La deuxième correspond à l’activation du
complexe. Selon les espèces, une des deux protéines est généralement présente dans le
cytoplasme alors que l’autre doit être traduite au moment opportun pour initier la reprise de
la méiose [131, 132]. La présence des deux sous-unités du MPF est nécessaire mais non
suffisante pour assurer la compétence méiotique. La régulation post-traductionnelle est
péremptoire pour activer le MPF par l’intermédiaire de la déphosphorylation de la sousunité CDK1. Ce type de fine régulation du recrutement des ARNm emmagasinés et des
protéines est ubiquitaire et indispensable à la poursuite du développement précoce.
La série d’évènements complexes qui permettent d’orchestrer le recrutement des ARNm
maternels n’est pas bien comprise et demeure sous continuelle investigation. Une fois
emmagasinés, les ARNm peuvent être recrutés pour la traduction. Toutefois, une grande
partie d’entre eux seront simplement expédiés vers la voie de la dégradation (Figure 1-8). Il
n’est pas encore déterminé si ces mécanismes de recrutement sont généraux, spécifiques ou
une combinaison des deux. Cependant, considérant que le développement nécessite une
29
progression étape par étape, les ARNm ne peuvent être traduits ou dégradés en une seule et
unique vague de recrutement. Il est donc probable que leur gestion soit effectuée par un
mécanisme spécifique mais encore inconnu.
Figure 1-8 La voie de l’ARNm dans l’ovocyte.
La transcription de l’ARNm a lieu dans le noyau où il est épissé puis exporté au cytoplasme. Une
fois rendu au cytoplasme, l’ARNm est déadénylé puis lié à des protéines qui le protègeront de la
dégradation ou de la traduction précoce. Au cours de la maturation ou du développement précoce,
certains ARNm seront sélectionnés pour la traduction et des ribosomes viendront s’y lier pour
former les ARN polyribosomaux. Droit de reproduction libre.
Pour revenir à l’exemple du complexe MPF, les cyclines doivent être régulées de façon
chronologique durant le programme embryonnaire. La dégradation des cyclines à la fin de
chaque cycle cellulaire est indispensable pour permettre l’inactivation des kinases
dépendantes des cyclines (CDK). Cette inactivation est nécessaire afin de compléter les
étapes essentielles que sont le démantèlement des fuseaux mitotiques, la cytokinèse et la
transition vers la phase G1 [133]. Évidemment, de nouvelles cyclines doivent être
30
synthétisées avant chaque nouvelle division cellulaire. Jusqu’à l’AGE, cette synthèse de
novo doit se produire par un processus précis de recrutement et de traduction des ARN
emmagasinés afin d’assurer la présence des cyclines nécessaires au bon moment du
développement précoce.
De la même façon, certains ARN messagers doivent être dégradés à des moments
spécifiques du développement. Par exemple, certains ARNm impliqués dans des
évènements spécifiques de la méiose doivent être dégradés rapidement suite à la
fécondation sans quoi leur présence pourrait devenir délétère pour le développement
subséquent. C’est le cas du proto-oncogène Mos, qui est nécessaire pour réaliser le second
arrêt méiotique en attendant la fécondation. La présence de Mos suite à la fécondation
provoque rapidement l’arrêt du développement embryonnaire [134]. L’élimination de la
protéine Mos n’est toutefois pas suffisante : les ARNm de Mos emmagasinés doivent
également être rapidement dégradés après la fécondation, ce transcrit étant potentiellement
nuisible pour le développement subséquent.
Ces exemples tendent à indiquer que la gestion des ARNm maternels est probablement le
fait de nombreux mécanismes d’action et non d’un seul processus global. Il semble en effet
que les besoins spatio-temporels de l’embryon en protéines spécifiques nécessitent une
variété de mécanismes de production. Jusqu’à maintenant, quelques mécanismes de
régulation ont été découverts et seraient impliqués dans la régulation d’au moins une
fraction des ARNm emmagasinés. Une section complète de cette thèse (section 1.4) sera
consacrée aux mécanismes connus de régulation de la traduction.
1.3.5 La durée du silence transcriptionnel
La durée du silence transcriptionnel varie entre les espèces. Alors que cette période est très
courte chez la souris, elle peut durer plusieurs jours chez de nombreuses autres espèces.
Chez la souris, le génome embryonnaire est activé dès la fin du stade zygotique. Selon
Schultz [108], une activation mineure du génome de la souris se produit aussi tôt que le
stade G2 dans le zygote alors que l’activation majeure du développement se produit au
stade de deux cellules. Ainsi, la contribution des ARNm maternels n’est requise que pour
supporter le premier cycle cellulaire. Il y a donc une différence importante entre la souris et
les grands mammifères tels que l’humain, le porc, le bovin et les ovins où l’activation du
31
génome embryonnaire se produit beaucoup plus tard, vers la fin du troisième ou du
quatrième cycle cellulaire. Chez d’autres organismes, les ARNm emmagasinés peuvent
supporter jusqu’à 16 cycles cellulaires, ce qui correspond à plus de 30 000 cellules [135]. Il
y a donc une différence importante entre les mammifères et les non-mammifères tels que
les poissons, les amphibiens, les insectes et les oiseaux. Chez le poisson-zèbre (Danio
Rerio), l’activation de la transcription est initiée au cours du 10e cycle cellulaire (entre 512
et 1024 cellules). Les neuf premiers cycles étant contrôlés par une horloge interne qui
permet des clivages parfaitement synchronisés aux 15 minutes [136]. Chez Xenopus,
l’embryon entreprend 12 clivages rapides (4096 à 8192 cellules) synchronisés aux 35
minutes avant qu’une transcription ne soit détectable [137]. Chez la drosophile, la
transcription s’amorce durant le 14ème cycle cellulaire (8192 à 16 384 cellules) [138]. Le
poulet représente un modèle extrême où la transcription est décelée pour la première fois
durant le 16ème cycle cellulaire alors que l’embryon est constitué de 30 000 à 50 000
cellules [135]. Enfin, C. elegans représente également un cas extravagant. Si la
transcription débute normalement dès le stade de 4 cellules, le vers peut se développer
jusqu’à la gastrulation (28 cellules) avant de voir son développement embryonnaire affecté
par une absence de transcription. Par la suite, quelques aberrations sont détectées mais le
vers poursuit tout de même son développement jusqu’à atteindre environ 100 cellules. Ceci
est particulièrement impressionnant sachant que le vers adulte ne possède que 558 cellules
[139]! La grande variabilité observée entre les espèces dans le nombre de cycle cellulaire et
le nombre de cellules requises pour initier la transition maternelle embryonnaire est
remarquable. Elle est également tributaire de la grande quantité de ressources accumulées
durant l’ovogenèse.
Le temps total (en heure) écoulé avant l’AGE est également un aspect impressionnant de ce
phénomène. Bien que la souris atteigne l’AGE dès le stade zygotique (on parle alors de
transition maternelle-zygotique, MZT), il demeure qu’une période de 23 heures s’écoule
entre la fécondation et l’observation d’une première activité transcriptionnelle. En ajoutant
le temps écoulé entre la reprise de la méiose et son second arrêt au stade de MII, soit
environ 10 heures, la période totale de silence transcriptionnel est de plus de 30 heures.
Chez les grands mammifères, la période totale durant laquelle les ARNm maternels doivent
être emmagasinés peut être encore plus longue. Chez le bovin, les ovocytes atteignent leur
32
taille mature alors que les follicules qui les contiennent mesurent environ 3 mm. Plusieurs
de ces ovocytes ont déjà une chromatine hautement condensée et transcriptionnellement
silencieuse [39]. Ce follicule de 3 mm devra atteindre la taille préovulatoire, ce qui peut
prendre de 4 à 8 jours selon le nombre de vagues folliculaires (2 ou 3) observées durant le
cycle. De plus, il faut considérer le temps nécessaire pour atteindre les autres étapes
fondamentales du développement, c’est-à-dire le temps entre le pic de LH provoquant
l’ovulation (1 jour), le temps alloué à la fécondation et le temps nécessaire pour le zygote à
atteindre l’AGE, quelques 3 à 4 jours plus tard. Considérant cette chronologie et étant
donné le fait que certains ARNm sont emmagasinés dès les premières étapes du
recrutement ovocytaire et ne sont traduits qu’au moment de l’AGE, certains ARNm
maternels peuvent être emmagasinés pour une période de plus de deux semaines avant
d’être utilisés.
Le nombre de cycles cellulaires accomplis avant l’AGE et la durée du silence
transcriptionnel ne sont pas corrélés. En effet, il est intéressant de remarquer que dû à leurs
cycles cellulaires extrêmement rapides, les embryons de drosophile et de xénope peuvent
atteindre plusieurs milliers de cellules avant l’AGE mais demeurer silencieux
transcriptionnellement seulement 3 et 7 heures, respectivement [108, 137]. Par analogie,
l’embryon de poulet atteint le 16ème (30 000 à 50 000 cellules) seulement 24 heures après la
fécondation [135].
33
Tableau 1-2 Activation du génome embryonnaire chez différentes espèces.
Espèce
Stade de développement
Nombre de cycle cellulaire
Souris
1 cellule
0
[108]
4-6 cellules
2-3
[140]
Humain
4-8 cells
2-3
[141]
Bovin
8-16 cells
3-4
[119]
Lapin
8-16 cells
3-4
[142]
Mouton
8-16 cells
3-4
[143]
512-1,024 cells
9-10
[136]
Xénope
4,096-8,192 cells
12-13
[137]
Drosophile
8,192-16,384 cells
13-14
[138]
Poulet
30,000-50,000 cells
15-16
[135]
Porc
Poisson-zèbre
34
Réferences
1.4 RÉGULATION DE LA TRADUCTION DES ARNm MATERNEL
1.4.1 Réadénylation des ARNm emmagasinés
La première étape du recrutement des ARNm emmagasinés pour la traduction est
généralement l’allongement de la queue poly(A). La majorité des ARNm emmagasinés
dans le cytoplasme ont une queue poly(A) courte, contenant souvent moins de 50
nucléotides, et l’allongement de la queue à plus de 200 nucléotides initie la traduction [144146]. Les mécanismes associés à l’allongement de la queue poly(A) sont bien connus chez
le Xénope et la souris mais moins chez le bovin [145, 147-149]. Le processus pourrait
toutefois être semblable chez le bovin [150]. Cette polyadénylation est régulée par deux
éléments agissant en cis, présent dans la région 3’ non-traduite (3’UTR, Untranslated
region) de l’ARNm. Le premier correspond à l’hexanucléotide de la polyadénylation
(HEX), AAUAAA. Cette séquence est un pré-requis tant pour la polyadénylation nucléaire
que pour la repolyadénylation cytoplasmique de tous les ARNm. Le deuxième est l’élément
de polyadénylation cytoplasmique (CPE, cytoplasmic polyadenylation element) dont la
séquence consensus est UUUUUAU [151]. La séquence HEX et la séquence CPE sont liés
par les facteurs CPSF (cleavage and polyadenylation specific factor) et CPEB (CPEBinding protein) respectivement. Cependant, la présence de ces séquences spécifiques sur
tous les transcrits est insuffisante pour expliquer l’utilisation graduelle des transcrits durant
le programme embryonnaire. Pour revenir à l’exemple de la régulation des cyclines, si tous
les transcrits portaient les mêmes séquences spécifiques, leur traduction serait
synchronisée. Pour répondre à la contrainte de régulation temporelle des transcrits,
plusieurs isoformes portant des séquences régulatrices différentes en 3’UTR devraient être
retrouvés dans les ressources maternelles emmagasinées dans le cytoplasme [152, 153].
Une population hétérogène de transcrits pourrait donc être accumulée durant l’ovogenèse.
Lorsque qu’un ARNm est recruté pour la traduction, les mécanismes associés aux
séquences HEX et CPE sont initiés pour stimuler l’allongement de la queue poly(A). Ces
mécanismes se produisent différemment selon les espèces. La majorité des études sur le
sujet portent sur les ovocytes et les embryons précoces de xénopes puisque leur grande
taille et leur disponibilité conviennent parfaitement à de telles études. Ainsi, chez les
espèces non-mammaliennes, il semble que la polyadénylation soit induite par la poly(A)
35
polymérase GLD2, qui se lie aux protéines CPSF et CPEB. La réadénylation cytoplasmique
semble se produire par la compétition entre les activités de déadénylation promue par la
PARN et d’adénylation stimulée par la GLD2. La PARN ribonucléase et la polymérase
GLD2 font toutes deux partie du complexe de polyadénylation cytoplasmique et la
longueur de la queue poly(A) est contrôlée par la balance de ces deux enzymes aux
activités antagonistes. La phosphorylation de la protéine CPEB lors du recrutement d’un
transcrit pour la traduction joue également un rôle clé dans l’allongement de la queue
poly(A) car cette modification provoque l’expulsion de PARN du complexe, laissant la
possibilité à la polymérase GLD2 de prendre le dessus pour allonger la queue poly(A)
(Figure 1-9) (revue dans [144, 154]).
Figure 1-9 Compétition entre la poly(A) ribonucléase PARN et la poly(A) polymérase GLD2.
Lorsque PARN est expulsée suite à la phosphorylation de CPEB, GLD2 stimule l’allongement de la
queue poly(A). [154] Reproduit avec permission.
1.4.2 Les joueurs clés de la régulation de la traduction
Rôle des protéines de liaison à la queue poly(A)
La longueur de la queue poly(A) joue un rôle clé dans l’initiation de la traduction. Cette
stimulation est facilitée par la liaison de protéines spécifiques, les Poly(A) binding proteins
36
(PABP), à la queue poly(A) et ce, tant chez la levure, le xénope, la souris et l’humain [155157]. Peu d’études ont été réalisées chez le bovin mais un mécanisme semblable serait
utilisé [158]. Chaque PABP possède quatre motifs de reconnaissance de l’ARN (RNA
recognition motifs, RRM) et un domaine carboxy-terminal. Ces sites représentent des sites
d’ancrage pour de nombreuses protéines qui vont stimuler la traduction. Par exemple,
l’association entre les PABP et la coiffe de l’ARNm permet la circularisation du transcrit.
La protéine PABP se lie au facteur d’initiation de la traduction eukaryotic initiation factor
4G (eIF4G), qui s’associe lui-même au facteur eIF4E, qui lui est en contact direct avec la
coiffe de l’ARNm. Ces interactions permettent de stabiliser le complexe d’initiation eIF4F
et stimule la liaison de la sous-unité ribosomale 40S [155].
Afin de réguler la liaison des PABP à la queue poly(A) et ainsi réguler la traduction, deux
protéines aux fonctions opposées, les poly(A) binding protein interacting protein (Paip1 et
Paip2), vont se confronter. La première, Paip1, va stimuler la traduction à plusieurs
niveaux. D’abord, Paip1 montre de nombreuses similarités avec la portion centrale de
eIF4G qui, tout comme ce dernier, lui permet d’interagir avec eIF4A, une hélicase
spécifique à l’ARN et dépendante de l’ATP. Ainsi, Paip1 stimule l’action de PABP puisque
sa liaison à eIF4A en 5’UTR de l’ARNm cible provoque le déroulement des structures
secondaires de l’ARN. Cette action facilite la liaison du ribosome et stimule l’initiation de
la traduction. De la même façon, Paip1 pourrait interagir avec eIF3, qui agit comme un
adaptateur entre le ribosome et la protéine eIF4G [157, 159]. Cette interaction entre Paip1
et eIF3 permet de rapprocher PABP et le ribosome, corroborant l’idée de la circularisation
de l’ARN, ce qui stimule la traduction grâce à la proximité des deux extrémités de l’ARN
(Figure 1-10).
37
Figure 1-10 Modèle du mécanisme de stimulation de la traduction par Paip1.
Paip1 stabilise l’intéraction entre eIF4G et PABP par l’intermédiaire de eIF3 et stimule la
circularisation de l’ARN. [159]. Reproduit avec permission.
La protéine Paip2 joue quant à elle un rôle opposé en réprimant la traduction. Lorsque
Paip2 est active, elle prévient complètement la multimérisation de PABP qui ne peut plus
jouer son rôle organisationnel au niveau de la queue poly(A) [160]. Le mécanisme
d’inhibition est expliqué par la compétition entre Paip2 et eIF4G pour la liaison à PABP.
Tel qu’il a été mentionné plus haut, les motifs de liaison à l’ARN retrouvés sur PABP
représentent des sites d’ancrage pour de nombreuses protéines. Cependant, les sites de
liaison de Paip2 et eIF4G se chevauchent au niveau du second RRM, expliquant qu’une
seule des deux molécules puisse s’y lier [160]. En empêchant l’action de PABP, Paip2
romprait la circularisation de l’ARNm. De plus, il a été démontré que Paip2 inhibe la
formation du complexe d’initiation du ribosome 80S. Cependant, la principale action de
Paip2 demeure sa compétition directe avec Paip1 pour la liaison à PABP. Alors que Paip1
se lie aux RRM 1 et 2 de PABP, Paip2 interagit avec les RRM 2 et 3. Ainsi, tout comme
pour la compétition entre Paip2 et eIF4G, le chevauchement des deux protéines sur le
second RRM provoque une liaison exclusive d’une seule des Paip sur PABP [155].
Paip1 et Paip2 jouent donc un rôle clé dans la régulation de la traduction par l’intermédiaire
de leur action sur PABP. Leur mécanisme d’action est bien connu chez l’humain [157, 159,
38
160] mais serait également utilisé chez le bovin [158]. Cependant, la régulation de l’activité
des Paip demeure peu connue. Puisque Paip1 et Paip2 sont toutes deux des
phosphoprotéines, leur état de phosphorylation pourrait permettre de réguler leurs activités
[155].
Rôle des protéines de liaison à eIF4E
D’autres joueurs clés de la régulation de la traduction sont les eIF4e binding proteins (4EBP). Par leurs interactions directes avec eIF4E, les 4E-BP empêchent la liaison de eIF4G,
paralysant la formation du complexe d’initiation. Ce complexe, nommé eIF4F, est composé
du facteur eIF4E, de l’hélicase eIF4A et d’eIF4G. eIF4E est la protéine directement
associée à la coiffe alors qu’eIF4G correspond à la protéine d’échaffaudage sur laquelle se
lie de nombreuses protéines impliquées dans l’initiation de la traduction. La liaison des 4EBP sur eIF4E permet de séquestrer cette protéine de façon réversible puisqu’elle est régulée
par la phosphorylation des 4E-BP [155].
Le modèle de la boucle fermée
Tel qu’il a été mentionné plus haut, l’interaction physique entre des protéines liées à la
queue poly(A) des ARNm (PABP, PAIBP, CPEB) et des protéines associées au complexe
d’initiation de la traduction (eIF4G, eIF4A, eIF3), en 5’UTR, permet la circularisation de
l’ARN en associant les deux extrémités (Voir Figure 1-11). Ce modèle de la traduction en
boucle fermée est important pour favoriser l’initiation de la traduction mais aussi
l’efficacité de la synthèse protéique. En effet, la circularisation de l’ARN favorise le
recyclage des ribosomes sur le même ARNm de par la proximité physique des deux
extrémités [155, 161]. Ces interactions permettent également de protéger la cellule contre la
production potentiellement létale de protéines tronquées puisque seuls les ARNm intacts
seront traduits. Les ARNm dont la queue poly(A) ou la coiffe ont été dégradés par des
ribonucléases ne pourront plus se circulariser et leur traduction en sera inhibée. De plus, ce
modèle en boucle fermée permet de limiter l’accès des exonucléases à l’ARN en protégeant
ses extrémités [155].
39
Figure 1-11 Circularisation de l’ARN
A) Visualisation de la circularisation de l’ARN par microscopie à force atomique [162] Reproduit
avec permission. B) Principales molécules impliquées dans la circularisation de l’ARN [163].
Reproduit avec permission (Pr.Dietz).
Le modèle CPEB-Maskin chez le xénope
Toutes ces recherches mènent à considérer les extrémités 5’ et 3’ des ARNm comme des
régions clés pour la régulation de la traduction. De nombreux modèles tentent d’élucider les
mécanismes responsables de la régulation temporelle des transcrits maternels. La majorité
d’entre eux impliquent les protéines de liaison à eIF4E, les différentes voies de
polyadénylation et les différents processus favorisant la formation du modèle de la boucle
fermée. Un de ces modèles [151] implique la protéine Maskin, une 4E-BP. Maskin se lie à
la fois à CPEB et à eIF4E (Voir Figure 1-12). Sa présence inhibe la liaison eIF4E-eIF4G ce
qui empêche la formation du complexe d’initiation
[164]. Il a été démontré que les
interactions entre Maskin et eIF4E sont considérablement réduites durant la maturation
ovocytaire, moment où de nombreux ARNm sont recrutés pour la traduction [164]. Le
mécanisme sous-jacent de régulation de la traduction implique le relâchement de Maskin du
complexe CPEB-Maskin-eIF4E suite à la phosphorylation de CPEB par la protéine kinase
Aurora A. Cette phosphorylation augmente également l’affinité de CPEB pour CPSF, qui
vient se lier à l’hexanucléotide HEX. Cette liaison favorise le recrutement de la poly(A)
polymérase qui allonge la queue poly(A). Une fois la queue poly(A) allongée, les PABP
peuvent venir se lier à celle-ci, stimulant la formation de la boucle fermée en s’associant au
facteur eIF4G du complexe d’initiation. eIF4G est une protéine ‘échafaud’ qui permet le
40
recrutement de nombreuses protéines pour former le complexe d’initiation eIF4F.
L’hélicase eIF4A vient se lier au complexe et favorise le déroulement de l’ARN et de ses
structures secondaires pour faciliter la liaison de nouvelles molécules dont les ribosomes.
EIF3 viendra également se lier au complexe d’initiation et favorisera le recrutement de la
sous-unité ribosomale 40S pour initier la traduction. Une fois le complexe eIF4F
complètement recruté, il initie son voyage le long de l’ARNm pour atteindre le codon
d’initiation AUG où la sous-unité 60S se liera à lui et commencera la traduction. Le modèle
CPEB-Maskin est probablement le modèle le plus connu de régulation de la traduction dans
le contexte de la gestion des ARNm maternels. Cependant, la proportion d’ARNm régulée
par l’intermédiaire de ce modèle demeure inconnue. De plus, l’application universelle de ce
modèle est le sujet de nombreux débats puisqu’aucun homologue à la protéine Maskin n’a
été identifié jusqu’à ce jour dans les espèces non-mammaliennes [165]. Cette divergence
vient encore une fois souligner la grande variation des méthodes de régulation de la
traduction et de gestion des ARNm durant le développement embryonnaire entre les
espèces.
Figure 1-12 Contrôle de la traduction par l’intermédiaire de la protéine Maskin.
La phosphorylation de CPEB inhibe la liaison de Maskin à eIF4E, permettant l’assemblage du
complexe d’initiation sur la coiffe de l’ARNm. [166] Reproduit avec permission.
Un code combinatoire dans le 3’UTR
Il semble évident que la régulation de la traduction passe par des liaisons de protéines à
certaines régions (souvent situées en 3’UTR) de l’ARN. Cependant, afin de contrôler de
41
façon temporelle la synthèse protéique à partir des ARNm maternels qui sont emmagasinés,
la présence d’un ‘code’ dans les régions non traduites de l’ARN est nécessaire. Plusieurs
séquences ont déjà été identifiées pour leur rôle dans la polyadénylation des transcrits. En
plus des séquences HEX et CPE connues pour leur rôle dans la polyadénylation des
transcrits, la séquence EDEN joue quant à elle un rôle dans leur déadénylation chez le
xénope. Cette séquence riche en purines A et en pyrimidines U est retrouvée dans la région
3’ non traduite de certains ARNm. Sa présence induit la déadénylation d’une sous-classe
d’ARNm qui n’est déadénylée qu’après la fécondation. Une protéine de liaison, EDEN-BP,
est responsable du recrutement des déadénylases telles que PARN ou le complexe CCR4Pop2-Not [103].
En plus de ces processus généraux de régulation, il a été proposé que la région non traduite
en 3’ de l’ARNm puisse contenir un code combinatoire qui serait utilisé tel un langage
moléculaire afin d’expliquer la régulation temporelle de la traduction. Ce code impliquerait
les séquences CPE et HEX et permettrait d’expliquer comment un même ARNm peut être
recruté pour la traduction à différents moments durant la maturation [153]. Ces
observations ont été réalisées à partir d’une analyse comparative des régions 3’ non-traduite
des ARNm. Le nombre et la position relative de ces deux éléments (HEX et CPE)
permettent de déterminer l’état actif ou réprimé de l’ARNm. Un ARNm portant une seule
séquence CPE qui ne chevauche pas une séquence HEX sera polyadénylé et sa traduction
sera activée si la distance entre les deux séquences n’excède pas 121 nucléotides. La
distance entre les séquences CPE et HEX modulerait la force de l’activation. Une activation
maximale serait induite par des séquences rapprochées mais sans chevauchement alors
qu’une plus grande distance entre les deux séquences n’induit qu’une faible
polyadénylation [153]. Au contraire, un ARNm dont la région 3’ non traduite comprend au
moins deux séquences CPE sera maintenu dans un état déadénylé. La distance entre les
séquences CPE module l’efficacité de la répression. Une distance de 10 à 12 nucléotides
maximise cette répression. Ces résultats portent à proposer que la protéine Maskin se lie à
un hétérodimère de CPEB mais ne peut se lier efficacement à une seule molécule. La
séquence HEX quant à elle serait impliquée dans la régulation temporelle de la
polyadénylation. Une polyadénylation précoce durant la maturation ovocytaire est
déclenchée par la protéine kinase Aurora A qui phosphoryle CPEB. Cette phosphorylation
42
augmente l’affinité de CPEB pour CPSF, qui vient se lier à la séquence HEX [153]. Par la
suite, le mécanisme présenté plus haut commence : PARN est expulsée et la
polyadénylation, déclenchée par GLD2, initie la traduction. Une polyadénylation plus
tardive sera spécifique aux ARNm où une séquence CPE chevauche la séquence HEX,
empêchant la liaison de CPSF dû à la présence de CPEB sur la séquence CPE. Dans cette
situation, l’ARNm est silencieux. Ce silence sera maintenu jusqu’à la synthèse de Mos, un
élément du facteur cytostatique, et la phosphorylation de CPEB. Ces conditions vont mener
à la dégradation de la majorité des CPEB. Une fois dégradé, CPSF peut se lier à la
séquence HEX et enclencher la polyadénylation [153]. Ce code combinatoire pourrait être
applicable dans plusieurs cas tant chez le xénope, la souris que chez l’humain [153] mais ne
peut répondre à tous les besoins de régulation temporelle des ARNm de l’ovocyte et de
l’embryon.
En plus de réguler la longueur de la queue poly(A), les séquences présentes en 3’UTR des
transcrits peuvent également agir dans des étapes subséquentes du recrutement. Entre
autres, ses séquences peuvent avoir un impact durant l’initiation de la traduction.
Normalement, suite à l’allongement de la queue poly(A) qui permet l’association du
complexe eIF4F, la sous-unité ribosomale 40S se lie à l’ARNm et commence à balayer la
région 5’UTR à la recherche du codon d’initiation. Durant ce processus, la majorité des
facteurs du complexe eIF4F sont relâchés, faisant place aux facteurs d’initiation eIF5 qui se
lient à l’ARNm. La liaison des facteurs eIF5 favorise l’association de la sous-unité
ribosomale 60S au moment de la reconnaissance du codon d’initiation [155]. Un exemple
de séquence affectant l’initiation de la traduction est le ‘Differential control element’
(DICE) qui interfère avec le recrutement de la sous-unité 60S du ribosome, inhibant la
formation du monosome chez l’humain. De cette façon, le complexe DICE permet de
maintenir le silence traductionnel [167]. Sceller le destin des transcrits selon les séquences
spécifiques retrouvées en 3’UTR est un modèle plutôt séduisant. Cependant, ce modèle est
incomplet. Il convient davantage au programme embryonnaire de la souris, qui ne dure que
le temps d’un cycle cellulaire, mais peut difficilement s’appliquer aux autres espèces dont
les cycles embryonnaires doivent subir de nombreux cycles cellulaires. En effet, les
séquences spécifiques retrouvées en 3’UTR devraient être particulièrement complexes pour
répondre à tous les besoins de la cellule. Avec le développement récent du séquençage à
43
haut-débit, les transcrits embryonnaires ont pu être analysés mais une telle hétérogénéité
dans les régions 3’non traduites n’a pas été démontré. Il semble donc que d’autres
mécanismes sont nécessaires pour permettre une régulation temporelle des transcrits. De
plus, si les régions 3’UTR se retrouvent souvent sous la loupe des chercheurs, les régions
en 5’UTR sont rarement l’objet de telles recherches mais dissimulent probablement
plusieurs séquences clés pour la régulation des transcrits.
1.5 MÉTABOLISME ÉNERGÉTIQUE
L’ovocyte a besoin d’énergie afin de réguler la transcription, la traduction, le mouvement
des organelles et tous les autres processus cellulaires mentionnés dans cette thèse. Le
métabolisme est un terme qui englobe toutes les transformations et les dépenses
énergétiques qui prennent place dans la cellule. Le métabolisme énergétique est basé sur la
production d’ATP, la molécule clé de l’énergie. Plusieurs mécanismes permettent de
produire l’ATP, les principaux utilisant le processus de phosphorylation oxydative réalisé
par les mitochondries afin de produire l’ATP en quantité suffisante.
Le présent texte se limitera principalement aux rôles de la mitochondrie durant la
maturation ovocytaire, la fécondation et le développement précoce. Plus précisément, ses
rôles dans la production d’ATP par le processus de phosphorylation oxydative et la
régulation du calcium intracellulaire seront discutés. Enfin, un court résumé des sources
énergétiques (oxygène, glucose et pyruvate) chez l’ovocyte et l’embryon sera également
présenté.
1.5.1 Les mitochondries ovocytaires
Les mitochondries sont des organelles essentielles à la survie de toute cellule eucaryote de
par leurs rôles dans la production énergétique cellulaire. Ces organelles ont la particularité
de posséder leur propre génome. Le génome mitochondrial correspond à un peu plus de 16
kb d’ADN à l’origine de 37 gènes. De ceux-ci, 13 codent pour des protéines associées à la
phosphorylation oxydative; 22 forment des ARN de transfert unique à la mitochondrie et 2
sont
à
l’origine
d’ARN
ribosomaux
(12S
et
16S)
[168].
La
transmission
intergénérationnelle des mitochondries est uniparentale et se produit de façon
exclusivement maternelle. Même s’il a longtemps été considéré que les mitochondries
44
paternelles apportées par le spermatozoïde lors de la fécondation pouvaient participer au
bassin mitochondriale de l’embryon, il semble qu’un consensus soit maintenant établi pour
éliminer cette possibilité. Les mitochondries paternelles seraient rapidement détruites dès
leur entrée dans l’ovocyte par un processus de protéolyse dans une voie dépendante de
l’ubiquitine [169-171]. Chez la drosophile, il existe également un mécanisme permettant la
destruction de l’ADN mitochondrial durant la spermatogenèse, éliminant la capacité du
spermatozoïde à transmettre un génome mitochondrial à sa descendance [172]. Il semble
cependant que dans de très rares occasions, les processus mis en place pour éliminer la
transmission paternelle de l’ADN mitochondrial peuvent être déficients. Un cas humain de
transfert d’ADN mitochondrial a déjà été rapportée [171].
Le nombre de mitochondries présentes dans l’ovocyte mature fait encore l’objet de débats.
Un très petit bassin de mitochondries pouvant représenter moins de 10 organelles serait
retrouvé dans les ovogonies et leur multiplication serait à l’origine de toutes les
mitochondries présentes dans l’ovocyte mature et le futur embryon [173]. Lorsque
l’évaluation du nombre de mitochondries se fait par microscopie à transmission
électronique, des estimations de 300 000 à 400 000 mitochondries sont obtenues [173]. Ces
estimations présupposent cependant que les mitochondries sont uniformément distribuées
dans l’ovocyte. Toutefois, comme nous le verrons plus loin, tel ne semble pas être le cas.
Lorsque le nombre de mitochondries est estimé à partir du nombre de copies du génome
mitochondrial, obtenu à partir de méthodes PCR (polymerase chain reaction), d’énormes
variations sont observées. L’équipe de Reynier (2001) observe des variations allant de
20 000 à 598 000 copies du génome par ovocyte et ce, même chez les ovocytes d’un seul et
même individu. De fait, le nombre de copies du génome par mitochondrie est variable et
pourrait aller de 1 à 15 selon les auteurs [174-176].
Tel que mentionné dans la section consacrée à la morphologie de la maturation ovocytaire,
les mitochondries présentes dans l’ovocyte adoptent une forme particulière qui demeure
inchangée durant les premières divisions embryonnaires. Les mitochondries retrouvées
dans les ovocytes matures ont une forme variable, allant d'arrondie à légèrement
triangulaire, avec un diamètre d’environ 0,5 μm et présentant souvent une forme
encapuchonnée et une matrice interne dense mais contenant peu de cristaux (voir Figure
45
1-13). Les quelques cristaux présents traversent rarement la matrice interne et sont plutôt
rétractés en périphérie [27, 41, 53, 177]. Cette forme laisse supposer que les mitochondries
sont immatures et peu efficaces dans la production d’énergie. Par contre, les mitochondries
demeurent les organelles les plus abondantes dans l’ovocyte et leur nombre pourrait
contrebalancer leur faible capacité respiratoire [178]. Chez l’humain, cette forme serait
maintenue jusqu’au stade de morula [178]. Chez le bovin, les mitochondries
encapuchonnées sont retrouvées jusqu’à l’activation du génome embryonnaire au jour 4,
stade 8 à 16 cellules [53]. À partir de ce stade, les mitochondries reprennent une forme plus
conventionnelle caractérisée par un aspect allongé avec de plus en plus de cristaux
traversant complètement la matrice interne. Cette forme serait plus mature et permettrait de
produire activement de l’ATP par le mécanisme de phosphorylation oxydative [179].
46
Figure 1-13 Phénotypes mitochondriaux.
(A, B) Mitochondries à capuchon (hooded) retrouvées dans les ovocytes matures (C) Mitochondrie
orthodoxe observée dans les cellules somatiques. [53]. Reproduit avec permission.
Il a également été mentionné plus haut que les mitochondries migrent durant la maturation
ovocytaire. Originalement retrouvées en grappes dispersées dans le cytoplasme de
l’ovocyte au stade GV0, les mitochondries se déplacent vers le cortex durant la maturation
[41]. Du moins chez la souris, les mitochondries se déplaceraient le long des microtubules
et migreraient préférentiellement vers la région périnucléaire, le noyau lui-même s’étant
déplacé en périphérie de l’ovocyte. On retrouve alors des sphères d’organelles entourant les
chromosomes et plus tard, entourant les fuseaux métaphasiques. Ce remodelage spatial des
47
mitochondries pourrait permettre de subvenir localement aux besoins plus élevés en ATP
requis afin de mener à bien les différentes étapes de la méiose et de la fécondation [180].
1.5.2 Mitochondries et production énergétique
La morphologie sous-développée des mitochondries dans l’ovocyte et l’embryon précoce a
été traditionnellement interprétée dans un contexte de faible activité respiratoire.
Considérant l’absence de vascularisation dans les follicules, l’ovocyte se développe dans un
milieu près de l’anoxie et la faible concentration en oxygène pourrait limiter la respiration
oxydative des mitochondries [178]. Si tel est le cas, la demande énergétique de l’ovocyte
pourrait être minimale ou une source exogène d’ATP pourrait être utilisée pour combler ses
besoins énergétiques. Par exemple, puisque les cellules de cumulus sont en contact direct
avec l’ovocyte par l’intermédiaire des jonctions communicantes, il est possible que l’ATP
soit importée à partir de ces cellules [178] ou, selon nos propres hypothèses, que des
molécules (AMP, AMPc) provenant des cellules de cumulus soient importées puis agissent
comme élément moteur de la production d’ATP dans l’ovocyte. Cependant, les projections
reliant cellules de cumulus et ovocytes sont rompues durant les premières heures (3 à 12
heures) de maturation [181]. D’autres mécanismes alternatifs seraient donc nécessaires
pour fournir de l’énergie à l’ovocyte puis à l’embryon suite aux bris de la communication.
Plusieurs étapes de la maturation ovocytaire, de la fécondation et du développement
précoce représentent des activités énergivores et nécessitent une quantité élevée d'ATP. Il
est donc impossible de penser que le phénotype immature des mitochondries est associé à
un arrêt complet de la production énergétique. Le nombre de mitochondries présentes dans
l’ovocyte pourrait avoir un rôle considérable sur la compétence au développement. Des
variations de la quantité d’ATP pouvant aller jusqu’à un ordre de magnitude peuvent être
observées dans des cohortes de MII non fécondé. [178]. Les ovocytes contenant une faible
quantité de mitochondries (entre 20 000 et 60 000 copies du génome mitochondrial) sont
associées à une faible capacité métabolique et à un plus grand taux d’échec à la fécondation
[182]. Cette découverte supporte l’idée que la faible capacité de maturation, de fécondation
ou de développement pourrait parfois être provoquée par une insuffisance de production
d’ATP. D’un autre côté, les ovocytes contenant un nombre très élevé de mitochondries ou
dont les mitochondries seraient très actives sur le plan métabolique pourraient être
48
incapables de bien réguler la production de ROS (reactive oxygen species) et provoquer
une toxicité irréversible durant le développement. Un arrêt prématuré du développement
chez des souris mutantes a déjà été relié à la présence d’un niveau très élevé de
phosphorylation oxydative et à une forte production d’ATP [183]. Cette forte activité
mitochondriale pourrait stimuler la production de ROS jusqu’à un niveau où l’ovocyte ou
l’embryon ne pourrait plus en réguler l’élimination. Une telle concentration de ROS
pourrait provoquer une détérioration du cytoplasme, une perturbation mitochondriale et
l’entrée en apoptose ou en sénescence [184]. Ainsi, le phénotype immature des
mitochondries dans l’ovocyte et l’embryon précoce pourrait être essentiel au
développement.
En plus du nombre de mitochondries, il semble que la localisation spatio-temporelle de
celles-ci ait également un impact sur la production énergétique [185]. Une étude de
Dumollard et al. (2004) chez la souris démontre que la demande et la production d’ATP
durant la maturation et la fécondation seraient étroitement liées. En migrant le long des
microtubules afin de se relocaliser autour des fuseaux métaphasiques, les mitochondries
pourraient répondre à un besoin localisé élevé d’ATP. Leur nouvelle localisation
permettrait une génération et une consommation couplée d’ATP. Cet équilibre
maintiendrait les niveaux intracellulaires d’ATP tout en évitant la production superflue de
ROS.
1.5.3 Mitochondries et fécondation
En plus de leur rôle dans la production d’ATP nécessaire à la survie de l’embryon, les
mitochondries jouent un rôle essentiel dans la régulation du calcium intracellulaire. Cette
fonction est cruciale, particulièrement au moment de la fécondation lorsque l’entrée du
spermatozoïde provoque le relâchement du calcium emmagasiné dans le réticulum
endoplasmique lisse. En effet, il est connu depuis longtemps que les mitochondries régulent
la concentration du calcium intracellulaire par leur habileté à le séquestrer et à le relâcher
en réponse à une variété de signaux (revue dans [178]). Lorsque le calcium emmagasiné
dans le réticulum endoplasmique lisse est relâché, la mitochondrie récupère une partie de ce
calcium et le relâche de façon lente et transitoire afin de contribuer à la fréquence des
oscillations et à la recharge en calcium du réticulum. Si les fonctions mitochondriales sont
49
affectées, par exemple en découplant le gradient de proton avec du Carbonyl cyanide mchlorophenyl hydrazone (CCCP), les concentrations de calcium intracellulaire demeurent
constamment élevées et provoquent rapidement la mort cellulaire [186, 187]. L’étude de
Dumollard (2004) démontre également un lien entre la respiration mitochondriale et les
niveaux de calcium intracellulaire. Il semblerait que la séquestration et le relâchement du
calcium par la mitochondrie soit associé à leur activité métabolique. Ces auteurs semblent
également affirmer que le nombre et la localisation des mitochondries affectent la
compétence au développement de l’embryon. L’entrée du spermatozoïde stimulerait
localement la respiration mitochondriale afin de répondre aux besoins urgents associés à la
fécondation tels que l’exocytose des granules corticaux, l’extrusion de second globule
polaire et l’homéostasie du calcium. Grâce à cette production localisée d’ATP pour
subvenir aux besoins immédiats de la cellule, la majorité des ovocytes ne montrent pas
d’augmentation significative d’ATP suite à la fécondation [187]. Un certain pourcentage
d’ovocytes montre cependant une augmentation graduelle d’ATP et il serait intéressant
d’évaluer si ces ovocytes sont tout aussi compétents au développement. Il serait possible en
effet que les ovocytes qui ne réussissent pas à stabiliser leur production d’ATP au moment
de la fécondation produisent davantage de ROS et nuisent au développement subséquent de
l’embryon.
1.5.4 Mitochondries et développement précoce
La fécondation et les premières étapes du développement embryonnaire se produisent dans
l’oviducte, où la concentration en oxygène est limitée (entre 2 et 8% d’oxygène) [188]. Il
semble cependant que la majorité de l’ATP produit durant les stades pré-implantatoire chez
la souris provienne tout de même de la phosphorylation oxydative, principalement celle de
substrats tels que le pyruvate, qui est nécessaire au développement précoce [187]. La
consommation d’oxygène semble augmenter progressivement avec le développement, les
blastocystes consommant environ 60 à 70% d’oxygène pour la phosphorylation oxydative
alors que l’embryon en clivage n’en consommerait que 30% [189].
Puisqu’il n’y a pas de réplication mitochondriale durant les stades pré-implantatoires, il
semble que le nombre de mitochondries par cellule diminue de moitié avec chaque
division. L’augmentation de l’activité respiratoire pourrait alors compenser pour le nombre
50
décroissant de mitochondries. Cependant, une ségrégation disproportionnée des
mitochondries peut provoquer des variations importantes entre les blastomères quant à leur
capacité à produire de l’ATP. Les conséquences peuvent alors provoquer des effets allant
de l’arrêt de la division cellulaire jusqu’au gonflement et à la lyse des blastomères [178,
179]. Lorsque l’embryon atteint le stade de blastocyste, des changements phénotypiques
sont observés chez les mitochondries. Celles-ci prennent une forme beaucoup plus standard
associée à une forte activité respiratoire. Cette augmentation dans la capacité respiratoire
est également associée à une demande augmentée en ATP puisque le blastocyste doit
former le blastocœle et éclore, deux processus énergivores.
1.5.5. Substrats métaboliques
L’ovocyte et l’embryon utilisent différents substrats métaboliques afin de produire
l’énergie nécessaire à leur survie. L’oxygène, le glucose, le pyruvate et le lactate
représentent les principaux substrats. Un survol de leur utilisation sera présenté ici.
L’oxygène
L’utilisation de l’oxygène est directement reliée à sa disponibilité dans le milieu
environnant ainsi que par le taux d’activité des mitochondries. In vivo, la concentration en
oxygène dans l’ovaire est limitée due à l’absence de vascularisation dans les follicules
[178].
Cependant,
les
niveaux
d’oxygène
disponible
pourraient
augmenter
significativement durant la période pré-ovulatoire puisque l’accumulation de fluide dans
l’antre folliculaire et l’augmentation du débit sanguin dans la région périfolliculaire
augmente durant le développement du follicule de Graaf [178]. Les concentrations
d’oxygène dans l’oviducte et l’utérus varient entre 1,5% et 9% d’oxygène selon les espèces
(singe, lapin, hamster), soit des concentrations fortement inférieures à celle de l’atmosphère
[190]. Durant la MIV chez le bovin, les concentrations en oxygène ne sont pas modifiées
(concentration atmosphérique, 21%) alors qu’elles sont réduites à environ 5% durant le
développement embryonnaire afin de mimer les concentrations d’oxygène réduites
observées dans l’oviducte et l’utérus.
51
Comme nous l’avons vu dans les derniers paragraphes, l’activité mitochondriale est limitée
durant la maturation ovocytaire et les premiers clivages dû à l’état immature et peu
développé des mitochondries. Selon , environ 65% de la respiration basale est utilisée pour
la respiration mitochondriale dans l’ovocyte immature bovin et seulement 63% de la
respiration mitochondriale est couplée à la production d’ATP. Lorsque l’ovocyte atteint la
maturité (MII), moins de 50% de la respiration mitochondriale se retrouve couplée à la
production d’ATP, suggérant que la phosphorylation oxydative est fortement diminuée
durant la maturation ovocytaire. Une étude semblable réalisée chez l’embryon de souris
démontrait une plus forte baisse encore des capacités mitochondriales dans les premiers
stades embryonnaires puisque seulement 30% de l’oxygène consommé serait utilisé par la
phosphorylation oxydative [189]. Ce n’est qu’au cours du développement embryonnaire,
suite à l’AGE chez le bovin, que les mitochondries se différencient et récupèrent leur
entière fonctionnalité dans l’activité respiratoire. La consommation d’oxygène par
l’ovocyte et l’embryon précoce suit cette transformation puisqu’elle demeure faible avant le
stade de 8 cellules puis augmente rapidement pour atteindre les niveaux les plus élevés
dans le blastocyste [191]. Chez la souris, où les mitochondries atteignent un stade de
maturité autour du stade de blastocyste, ce n’est qu’à ce moment que la capacité
respiratoire de l’embryon serait améliorée : 60 à 70% de la consommation d’oxygène serait
liée à la respiration mitochondriale. Ainsi, malgré la faible concentration d’oxygène dans
l’oviducte et l’utérus, l’embryon dont les mitochondries sont bien développées peut
maximiser sa consommation d’oxygène.
Le glucose
Plusieurs études ont démontrés que l’ovocyte a une faible capacité de consommation de
glucose dû à la faible présence de transporteurs ayant une forte affinité pour celui-ci [192,
193] ainsi qu'à la faible activité de la phosphofructokinase (PFK), une enzyme limitante de
la glycolyse [194]. Hors, le glucose représente un métabolite essentiel pour le complexe
ovocyte-cumulus et joue un rôle important au niveau de nombreuses voies métaboliques
telles que la glycolyse, la voie des pentoses phosphates (PPP), la voie de la synthèse des
hexosamines (HBP) et la voie des polyols. Il semble que les cellules de cumulus, qui
consomment de grande quantité de glucose, métabolisent celui-ci et en fournissent les
52
intermédiaires à l’ovocyte (revue dans [195]). De fait, les cellules de cumulus
consommeraient 23 fois plus de glucose mais 3 fois moins d’oxygène que l’ovocyte [196],
une situation favorisant grandement la glycolyse.
In vivo, la concentration en glucose du fluide folliculaire se rapproche des niveaux
sanguins, autour de 2,3 mM chez le bovin [197] alors que durant la MIV, des
concentrations supraphysiologiques sont utilisées (TCM-199, 5,6 mM de glucose) afin de
contrer les risques d’épuisement du milieu, ce dernier demeurant statique durant environ 24
heures. Le glucose consommé par les cellules de cumulus peut être utilisé pour la
production énergétique; pour la synthèse de novo de purine; pour la maturation nucléaire
par l’intermédiaire du PPP; pour la formation de matrice extracellulaire; pour la stimulation
de la signalisation cellulaire par l’intermédiaire du HBP ou enfin, pour la régulation de
l’homéostasie cellulaire par l’intermédiaire de la voie des polyols (revue dans [195]).
Durant le développement embryonnaire précoce, le métabolisme du glucose par l’embryon
est également fortement limité. Il semble que la faible quantité de glucose consommé serait
principalement utilisée par la voie des PPP durant les premiers stades embryonnaires
puisque les enzymes de la glycolyse seraient absentes ou peu actives alors que celles de la
voie des PPP seraient fortement présentes [198]. La première augmentation significative du
métabolisme du glucose se produit suite à l’activation du génome embryonnaire [199], dû à
la traduction des enzymes responsables de la glycolyse. À partir de ce moment, la
fermentation lactique devient une voie importante de dégradation du glucose et postcompaction, la glycolyse génère jusqu’à 15% de l’ATP produit par l’embryon [200].
Le pyruvate et le lactate
Le pyruvate représenterait la source majeure d’énergie dans l’ovocyte et l’embryon précoce
[191]. Durant la maturation, le pyruvate est principalement apporté par les cellules de
cumulus suite à la dégradation du glucose via la glycolyse alors que durant le
développement embryonnaire, le pyruvate est principalement fournit par le milieu extérieur.
En condition aérobie, le pyruvate entre dans le cycle de Kreb associé à la respiration
53
mitochondriale alors qu’en condition anaérobie, le pyruvate est plutôt converti en lactate
par des réactions de fermentation. Ainsi, durant les premiers clivages, la majorité du
pyruvate serait transformé en lactate alors qu’à partir des stades de 16 cellules chez le
bovin, son utilisation par la phosphorylation oxydative augmente fortement et génère
environ 80% de l’ATP [191].
La forte utilisation du pyruvate et du lactate pour subvenir aux besoins de l’ovocyte et de
l’embryon est dû, en partie, à leur disponibilité dans le milieu environnant. Dans l’oviducte
bovin, la concentration en lactate atteint 6 mM et diminue jusqu’à 1 mM dans l’utérus.
Cette concentration en lactate dans l’oviducte est grandement supérieure à la concentration
retrouvée dans le plasma (< 1 mM) et favorise son utilisation par l’ovocyte et l’embryon
précoce. Quant au pyruvate, sa concentration dans l’oviducte et l’utérus est semblable à
celle retrouvée dans le plasma, c'est-à-dire environ 0,1 mM [201]. Le transport du pyruvate
dans l’ovocyte et dans l’embryon serait régulé par des transporteurs actifs et passifs qui
sont fortement présents durant les premiers stades embryonnaires [202].
1.6 OBJECTIFS DE LA THÈSE
La maturation ovocytaire représente une fenêtre développementale très dynamique où
l’ovocyte subit de nombreuses modifications phénotypiques, moléculaires et métaboliques.
Elle représente également une période de silence transcriptionnel qui se prolongera par delà
la fécondation et les premiers clivages, jusqu’à l’activation de génome embryonnaire. Afin
de survivre à cette période où il lui devient impossible de transcrire son génome pour
répondre aux stimuli et aux stress environnementaux, l’ovocyte accumule des quantités
remarquables d’ARN durant sa croissance et les emmagasine de façon à les protéger de la
dégradation et de la traduction précoce. Cette caractéristique permet à l’ovocyte et à
l’embryon de survivre mais complique grandement l’étude transcriptomique de la
maturation ovocytaire puisque la majorité des ARN présents ne représentent pas la
physiologie sous-jacente de la cellule. Seule une petite proportion des ARNm seront
traduits/actifs durant chaque stade de la maturation et du développement précoce. Ces ARN
se distinguent des ARN emmagasinés par leur liaison à des ribosomes afin d’initier leur
traduction et on les appelle les ARN polyribosomaux. Dans ce contexte, j’émets
l’hypothèse que l’extraction des polyribosomes permettra de mettre en lumière les
54
différences entre les ovocytes immatures (GV) et les ovocytes matures (MII). Ces
différences me permettront d’expliquer certains mécanismes de maturation ovocytaire.
Afin de valider cette hypothèse, la première partie de mon projet (Chapitre 2) consistait à
mettre au point une méthode permettant d’extraire spécifiquement les ARN
polyribosomaux à partir d’un nombre limité d’ovocytes. Pour y arriver, il était important de
rencontrer deux principaux objectifs. Le premier objectif était de pouvoir prouver la nature
polyribosomale des transcrits et ce, malgré l’utilisation d’un nombre très limité d’ovocytes.
Cet objectif a été atteint par l’ajout d’ARN exogène afin d’obtenir un profil UV de
distribution des polyribosomes. Le deuxième objectif était de pouvoir identifier les
transcrits, c’est-à-dire de pouvoir les différencier des ARN exogènes ajoutés durant le
processus d’extraction. Ce second objectif a été atteint grâce à la fusion des ARN exogènes
– par procédé chimique – avant de les ajouter aux échantillons d’ovocytes bovins.
Cette nouvelle méthode a été utilisée (Chapitre 3) afin de comparer les transcrits
polyribosomaux d’ovocytes immatures au stade de vésicules germinales à celui d'ovocytes
matures au stade de métaphase II de la méiose. L’objectif de cette seconde partie du projet
était de découvrir différentes fonctions cellulaires importantes durant cette période afin de
mieux comprendre certains aspects de la physiologie de la maturation ovocytaire. Les
résultats obtenus en comparant les transcrits polyribosomaux durant la maturation
ovocytaire m’ont permis de mettre en lumière une forte diminution de la phosphorylation
oxydative et de la synthèse protéique dans l’ovocyte. La réduction substantielle de la
phosphorylation oxydative diminue la capacité de production énergétique de l’ovocyte.
Parallèlement, la diminution de la synthèse protéique est un phénomène courant lorsqu’une
cellule subit un stress énergétique puisque ce mécanisme cellulaire est l’un des plus
demandant énergétiquement [203-205]. Combinées, ces deux informations m’ont amenés à
poser l’hypothèse que l’ovocyte acquiert une certaine quiescence durant sa maturation.
Cette quiescence permettrait à l’ovocyte de survivre à cette période critique
énergétiquement. Il est bien connu que l’embryon quiescent a plus de chance de survivre et
d’atteindre le stade de blastocyste [206]. Mes recherches tendent à prouver que cette
quiescence est acquise avant même la fécondation, durant la maturation.
55
Enfin, puisque la production énergétique est fortement affectée par la réduction de la
respiration cellulaire, et puisque l’ATP est une ressource nécessaire à la survie de
l’ovocyte, je me suis penchée sur l’étude de mécanismes alternatifs de production d’énergie
afin de combler les besoins de l’ovocyte durant cette période. J’ai émis l’hypothèse que
l’ovocyte pouvait récupérer les grandes quantités d’AMP disponibles durant la maturation
pour stimuler la production d’ATP grâce aux enzymes responsables de la voie de
récupération des adénosines (adenosine salvage pathway). Mes résultats démontrent que
deux enzymes permettant, l’une la transformation d’AMP en ADP (adénylate kinase) et
l’autre, la transformation d’ADP en ATP (créatine kinase), conduisent à la production de
novo d’ATP durant la maturation ovocytaire. L’AMP libéré suite à la dégradation de la
queue poly(A) des ARNm ainsi que celui produit suite à la dégradation de l’AMPc par les
phosphodiestérases semblent être rephosphorylés afin de produire l’ATP essentiel à la
survie de l’ovocyte. La mise en place de cette voie de récupération durant la maturation
ovocytaire permettrait à l’ovocyte de combler des besoins spatiotemporels spécifiques en
ATP.
56
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2. Chapitre 2 : Isolation des ARNm polyribosomaux
pour l’étude du développement embryonnaire
précoce
Sara Scantland, Jean-Philippe Grenon, Marie-Hélène Desrochers, Marc-André Sirard,
Edouard W. Khandjian, Claude Robert
Cet article a été publié dans la revue «BMC Developmental Biology» sous la référence
suivante : Scantland S, Grenon JP, Desrochers MH, Sirard MA, Khandjian EW, Robert C.
Method to isolate polyribosomal mRNA from scarce samples such as mammalian oocytes
and early embryos. BMC Dev Biol. 2011 Feb 15;11:8.
71
2.1 Résumé
Introduction : Bien que les techniques d’amplification des acides nucléiques permettent
d’obtenir le profil transcriptomique de très petites quantités de cellules, il demeure difficile
de distinguer les ARN messagers actifs de ceux emmagasinés. L’emmagasinage des
transcrits se produit durant certains stades spécifiques de la gamétogenèse et du
développement embryonnaire précoce, période durant laquelle l’activité transcriptionnelle
du génome est négligeable et les ARNm emmagasinés sont utilisés afin de soutenir la
production de novo de protéines. Dans plusieurs cas, les ARNm emmagasinés peuvent être
beaucoup plus abondant que les ARNm utilisés pour la traduction. Afin d’identifier les
ARNm actifs dans les ovocytes bovins, nous avons développé une méthode d’isolation de
très petites quantités d’ARN polyribosomaux. Résultats: La méthode proposée est basée
sur l’utilisation d’un mélange du cytoplasme extrait des ovocytes avec une préparation de
polyribosomes provenant d’une source non-homologue (Drosophila) qui est fractionné sur
un gradient de sucrose afin de concentrer les polyribosomes. Ceci implique la fusion des
polyribosomes non-homologues suivi de la neutralisation de l’agent de fusion. En utilisant
cette méthode, nous avons démontré que les différents stades de maturation ovocytaire
corrélaient avec des changements dans l’abondance des ARNm polyribosomaux. Cette
corrélation n’était toutefois pas détectées observée en ce qui concerne l’abondance des
ARN totaux ou des ARNm poly(A). Nous avons également démontré que l’abondance de
transcrits sélectionnées correspondaient au niveau protéique. Conclusions: Nous exposons
dans cet article la mise au point avec succès d’une méthode afin d’obtenir le profil en
ARNm présents dans les fractions polyribosomales à partir d’aussi peu que 75 ovocytes. Le
fractionnement des ARNm polyribosomaux fourni un nouvel outil afin d’étudier la
gamétogenèse et le développement embryonnaire précoce avec une meilleure
représentation de la physiologie sous-jascente de la cellule.
72
2.2 Abstract
Background: Although the transcriptome of minute quantities of cells can be profiled
using nucleic acid amplification techniques, it remains difficult to distinguish between
active and stored messenger RNA. Transcript storage occurs at specific stages of
gametogenesis and early embryogenesis, during which genome transcription activity is
negligible and stored mRNA is used to sustain de novo protein synthesis. In many cases,
stored mRNA can be several times more abundant than mRNA ready for translation. In
order to identify active mRNA in bovine oocytes, we sought to develop a method of
isolating very small amounts of polyribosome mRNA. Results: The proposed method is
based on mixing the extracted oocyte cytoplasm with a preparation of polyribosomes
obtained from a non-homologous source (Drosophila) and using density gradient
fractionation to concentrate the polyribosomes. It involves cross-linking the nonhomologous polyribosomes and neutralizing the cross-linking agent. Using this method, we
showed that certain stages of oocyte maturation coincide with changes in the abundance of
polyribosomal mRNA but not total RNA or poly(A). We also showed that the abundance of
selected sequences matched changes in the corresponding protein levels. Conclusions: We
report here the successful use of a method to profile mRNA present in the polyribosomal
fraction obtained from as little as 75 oocytes. Polyribosomal mRNA fractionation thus
provides a new tool for studying gametogenesis and early development with better
representation of the underlying physiological status.
73
2.3 Background
Gametogenesis and embryonic development in mammals involve several major cellular
events marked by an unusual mode of messenger RNA management. In nearly all animal
species, mRNA molecules are stored in the developing oocyte until use during maturation
or after fertilization [1-8]. These stored mRNAs direct protein synthesis during the period
of transcriptional silence, which begins when the germinal stage oocyte reaches its full size
[9-13] and lasts until embryonic genome activation [14-16]. In cattle, this size is
approximately 120 μm within a follicular antrum 3-5 mm in diameter [10, 15, 17]. During
the period covering the remaining follicular development (i.e. from 3 to 25 mm in antral
diameter), the post-LH-surge oocyte maturation, fertilization and the onset of embryonic
genome activation, very little genomic transcription occurs. It is generally believed that
transcript storage begins in the early stages of oogenesis and may thus last for several
weeks. It is also believed that the transcripts are stored in a particulate form and lack the
poly(A) portion, although the latter detail remains the subject of debate. It has been
reported that shortening the poly(A) tail to less than 50 nucleotides stabilizes the mRNA
molecule and keeps it from being either degraded or translated [18].
So far, little is known about the molecular mechanisms underlying the steps that occur
during this transcriptional silencing period. Early development is characterized by major
fluctuations in the abundance of total and messenger RNA [2, 19], with specific waves of
maternal RNA degradation [14, 20]. These observations have led to the belief that
measurement of messenger abundance provides little useful information about cells that are
storing RNA, since it does not distinguish between mRNA that is 1) stabilized and stored
and thus not contributing to any cellular function; 2) recruited and on its way to
degradation, not contributing to the translation process and 3) recruited and being translated
in de novo protein synthesis. In order to avoid the contribution of the stored or decaying
molecules to the mRNA abundance measurements, we seek to provide a mean to isolate the
mRNA population bound to the translation apparatus. Messenger RNAs engaged in
translation are found to be bound by ribosomes throughout the cytosol either freely or
attached to the cytoskeleton while dormant or stored transcripts are accumulated in diverse
forms of ribonucleoprotein complexes and particles [21]. It is also well known that actively
74
translated messengers are bound by multiple ribosomal units [22-25]. The composition of
these different particles makes it possible to fractionate them by density gradient. Profiling
of polyribosomal mRNA through standard sucrose gradient fractionation procedure
requires considerable starting material (e.g. 200 μg of total RNA [26]). A recent publication
reports the development of a method suitable for input material not fewer than five
Xenopus laevis oocyte, eggs or early embryos [27]. Considering the Xenopus oocyte
contains about 15,000 times more total RNA comparatively to the bovine counterpart
(respectively 6 μg [28] and 340 pg [19], the method still requires too much input for work
on mammalian early development. The relative scarcity of mammalian oocytes, egg and
embryonic tissues is another impediment to increasing understanding of mammalian
gametogenesis and early development, since the choice of methods suitable for handling
such minute quantities of material is severely limited. Pre-amplifying the entire
transcriptome offers the possibility of studying the fluctuations in transcript abundance in
these tissues. Minute amounts of initial RNA can be amplified with success [29-31] and
provide sufficient output for high throughput approaches such as microarrays [32, 33] or
systematic deep sequencing (RNAseq) [34, 35]. To our knowledge, the isolation of
polyribosomes from mammalian oocytes or early embryos has been reported only twice
and resulted in limited success [36, 37]. The methodology used by De Leon and colleagues
[36, 37] involves spiking a small sample with a large amount of genetically homologous
material to confirm the polyribosomal nature of the RNA molecules being studied.
However, the inability to distinguish between the spike and the sample prevented
identification of oocyte/embryo mRNA molecules. In contrast, the approach used by
Potireddy and colleagues [36, 37] allowed mRNA identification but could not confirm the
polyribosomal nature of the isolated fraction nor exclude the presence of nonpolyribosomal contaminants. We therefore sought to combine the advantages of each
method by devising means of confirming the polyribosomal nature of the extracted mRNAs
while maintaining the possibility of identifying them and determining their relative
abundance.
75
2.4 Results
Preparation of the inert carrier
In order to develop a polyribosomal isolation method that could be performed with very
small quantities of sample material, we used an RNA carrier fraction. Spiking the bovine
sample with polyribosomes from a non homologous organism (i.e. Drosophila) is helpful as
long as there is a way to prevent interference with downstream transcript identification.
Formaldehyde was used to cross-link RNA and proteins from the drosophila SL2 cell
extracts in order to produce a range of materials that might function as carriers. To
determine the optimal concentration of formaldehyde that would provide a useful carrier
and minimize downstream interference, a dose-response experiment was done. At lower
concentrations (i.e. 0.2% and 0.37%), cross-linking was slight, as indicated by the recovery
of almost all of the initial RNA in sucrose density gradient fractions. At a concentration of
1% formaldehyde, approximately 10% of the RNA could be recovered while at the highest
concentration tested (3.37%), less than 1% of the initial RNA input could be recovered
(Figure 2-1A). The micro-electrophoretic profile confirmed the extremely low level of
RNA recovered following the 3.37% formaldehyde treatment (Figure 2-1B-C). This latter
treatment was used and an additional step was included to neutralize excess formaldehyde
prior to adding the SL2 cell carrier polysome preparation to the experimental samples.
Glycine, used routinely to titrate free formaldehyde and used in this study at the commonly
used concentration of 0.1 M [38] was not entirely effective at neutralizing this cross-linking
agent (Figure 2-2A). Since tris-hydroxymethylaminomethane molecule (THAM or Tris)
has been suggested for this purpose [39], tests were conducted to determine the conditions
under which it would efficiently inactivate residual formaldehyde in SL2 cell extract. The
impact of pH was also tested since polyribosome extraction was done at a higher pH than in
the Sutherland study. The impact of pH was found not significant (Figure 2-2B). At a
concentration of 0.5 M, Tris was found comparable to 0.1 M glycine and thus could not be
considered more efficient. At concentrations of 1 M and 1.5 M, Tris did neutralize the
residual formaldehyde completely (Figures 2-2B and 2-2C). Figure 2-3 shows the effect of
the RNA carrier preparation protocol on the distribution of polyribosomes in the sucrose
density gradient fractions of the Drosophila SL2 cell extract. The crosslinking treatment did
76
not interfere with polyribosome profiling as both treated and control samples show very
similar profiles (Figure 2-3).
Validation of the polyribosomal nature of the isolated RNA
Since polyribosomes are stabilized by Mg2+ ions, addition of EDTA causes their
dissociation into ribosomal subunits and the release of messenger RNA. Cytoplasmic
extracts were therefore fractionated in the presence or absence of EDTA. In order to
observe this in the absence of the Drosophila polyribosome preparation, a suitable quantity
of granulosa cells was processed. Standard RT-PCR of genes ACTB (for granulose cells)
and CDK1 (for oocytes) was used as means of comparing RNA abundance in the collected
fractions. For the two cell types, the presence of EDTA caused a shift in RNA abundance
towards the fractions containing low sedimentation coefficient materials, thus confirming
the polyribosomal nature of the higher sedimenting fractions (Figure 2-4).
Interference of Drosophila polyribosome RNA with microarray hybridization signals
Interference by the exogenous carrier RNA with the density-gradient fractionation of the
oocyte RNA was minimal. We decided to determine if this was true for microarray
hybridization signals. Samples prepared from purified bovine oocyte RNA and from
purified Drosophila SL2 RNA were labelled with different fluorophores and hybridized on
the same microarray. Table 2-1 summarizes the proportion of microarray features that
generated positive fluorescent signals above the background threshold. In spite of its
phylogenetic distance from cattle, Drosophila RNA generated one third of positive spots
that bovine RNA did at 55°C. Increasing the hybridization temperature by 5°C resulted in a
significant loss in Drosophila positive signals and at 65°C, no Drosophila signal above
background was detected. However, at 65°C, almost half of the bovine signals were also
lost. The intermediate temperature seemed to be an acceptable compromise since only 6%
of the spots generated positive, but very weak signals from Drosophila samples, while the
fluorescence values from the bovine samples were still clearly above background. By
comparison to the least stringent condition (55°C), 77% (47/61) of the bovine signals were
kept when microarrays were hybridized at 60°C (Table 2-1).
77
Reproducibility of the polyribosome RNA extraction method
We tested the reproducibility of the entire method by comparing the results obtained from
biological replicates. Three oocyte pools were thus fractionated and analyzed separately
using the density gradient method and microarray hybridization. The mean correlation
value was found to be 0.95 ± 0.01, which clearly indicates that the procedure is robust
(Figure 2-5).
Validation of the method under different physiological conditions
The polyribosome fractionation protocol was tested with oocytes at different stages of
maturation using microarray hybridization to measure the abundance of RNA sequences
representing known key factors in the control of oocyte maturation. Quantitative RT-PCR
was used since probes for some of the chosen factors were absent on our microarray. The
selected sequences correspond to components of maturation promoting factor, namely
cyclin B1 (CCNB1), cyclin-dependant kinase 1 (CDK1) and Moloney sarcoma oncogne
(MOS), which is part of the cytostatic factor required at the MII stage. Total RNA (targeted
using random primers during the RT reaction), poly(A) (targeted using an oligo-dT during
RT) and polyribosomal sub-fractions were measured.The abundance of these RNA types
varied significantly between the different tissue types (Figure 2-6), indicating clearly that
the stage of maturation of the oocyte sample has an impact on the distribution of the RNA.
Potential implications for protein levels
Since mRNA associated with polyribosomes is presumed actively translated, levels of
protein corresponding to the selected factors were measured. Microarray gene entries
corresponding to polypeptide sequences for which commercial antibodies were available
were selected. Standard housekeeping candidates ACTB and TUBA were used as internal
standards. Due to the requirement of oocyte maturation for extensive reorganization of the
cytoskeleton, these standard housekeeping candidates were found to be unstable and were
therefore considered solely as a control of sample loading and not used for data
normalization. The fluctuations in polyribosomal mRNA levels observed between
maturation stages closely matched protein levels for all candidates, as shown in Figure 2-7.
78
2.5 Discussion
The need to develop a procedure for isolating and studying polyribosomal mRNAs from
mammalian gametes and early embryos arose from the peculiarity of these cells. The
collection of mammalian oocytes and early stage embryos is challenging and resourceintensive. Therefore, samples rarely contain more than 100 oocytes/embryos. Their scarcity
imposes a method suited to handling minute quantities of material. For instance, protein
profiling and identification of differentially expressed candidates requires several hundreds
to thousands of mammalian oocytes or early embryos [40, 41]. Similarly, these tissues do
not provide a much better source of RNA considering for example that a single Xenopus
oocyte contains about 6 μg of total RNA [28] comparatively to only 340 pg in the bovine
[19]. Nonetheless, the wide array of amplification procedures now available has made it
possible to focus on the transcriptome rather than the proteome. Study of the transcriptome
generally assumes that mRNA levels are indicative of cellular status and reflect
corresponding protein levels. However, this assumption does not apply to cells containing
large amounts of stored mRNA, such as mammalian oocytes and early blastomeres. In
these cases, mRNA bound to polyribosomes and therefore likely being translated is
considered a better indicator of gene activity and developmental stage. The first important
step for polyribosomal RNA extraction is thorough lysis of the cells. The greatest difficulty
encountered when working with oocytes or prehatching embryos is the challenge of
breaking down the zona pellucida. This porous glycoprotein coat is composed of a dense
net of fibril bundles that evolves during oocyte maturation and fertilization [42]. The
bovine zona pellucida is particularly resistant, with a thickness averaging 26.9 μm
compared to 14.5 μm for ovine and 11.4 μm for murine oocytes [43]. Since the lysis buffer
used in the polyribosome isolation procedure is relatively mild to disrupt the cytoplasmic
membrane and liberate intact polyribosomes, an additional treatment was required to
efficiently disrupt the sturdy zona pellucid to liberate the cellular contents. We found that
freeze/thaw cycles, effective for mouse oocytes [37], are ineffective against the bovine zona
pellucida and that digestion with pronase produced irreproducible results due to residual
protease activity. The previously used acidic (pH 2.1 to 2.5) Tyrode buffer [36] was also
tested, but changes in the granular appearance of the oocyte cytoplasm suggested disruption
of the cytoskeleton, to which polyribosomes are believed to be bound [44]. Moreover,
79
removal of the zona pellucida by acidic treatment has been reported to lead to embryo death
and increased frequency of abnormalities in surviving embryos [45], suggesting damage to
the embryo development program in which polyribosomes are involved. The only
acceptable option appeared to be mechanical breakage of the zona with zirconia-silica
beads in the presence of passive lysis buffer (Data not shown). This approach seemed to
work since the zona and its contents were completely dissolved within a few minutes. To
our knowledge, extraction of polyribosomes from oocytes and early embryos has been
reported only twice [36, 37]. In the first case, mouse liver polyribosomes acted as a carrier
of polyribosomal mRNA extracted from [3H]- uridine-labelled mouse oocytes. This
attractive method allows confirmation of the presence of oocyte polyribosomes, but does
not allow any identification or even relative quantification of the associated mRNA, since it
cannot be distinguished from that of the liver polyribosomes. The second study involved a
method that allowed identification of the transcripts but could not confirm their
polyribosomal nature nor exclude the presence of non-polyribosomal contaminants. We
have developed a method in which a heterologous carrier is used and which allows
identification of extracted mRNA and confirmation of its polysomal nature. This involved
determining optimal conditions for cross-linking the exogeneous polyribosomes. UV
crosslinking was incomplete and prolonging the exposure led to RNA fragmentation (Data
not shown). Formaldehyde cross-linking, which binds more specifically via free amino
groups [46] was found more effective than UV. Before adding the carrier preparation to the
biological sample, it was necessary to neutralize the excess formaldehyde, which is
normally done with glycine. A recent study of the efficiency of glycine suggests using
stronger nucleophiles such as Tris or lowering the solution pH as quick and efficient means
of quenching residual formaldehyde [39]. Tris was the preferred option, since it was not
clear that lowering the pH would neutralize the formaldehyde without damaging the
polyribosomes. Using the method described here, the polyribosomal nature of the isolated
bovine RNA can be inferred from its position in the sucrose gradient. Further validation
was obtained using EDTA to disrupt the polyribosomes by sequestering Mg2+. The shift
observed in the abundance of the amplified CDK1 fragment towards lower density
fractions following this disruption is indicative of the polyribosomal nature of the bovine
mRNA in the higher density fractions. The strength of the approach used here was assessed
80
by quantifying the abundance of selected mRNA of genes known to be involved in oocyte
maturation. Following the luteinizing hormone surge, the oocyte resumes meiosis and
undergoes a sequence of events involving germinal vesicle breakdown (GVBD), first polar
body extrusion and a second arrest at the metaphase of the second meiosis (MII) in
preparation for fertilization. It is known that maturation promoting factor (MPF), a
heterodimer composed of cyclin B1 (CCNB1) and cyclin-dependant kinase 1 (CDK1,
formerly known as p34cdc2), must be activated for meiosis to resume. Once meiosis
reaches the MII stage, the role of the CSF is to halt cell cycle until the ovule is fertilized
(For reviews, see [47, 48]). We previously observed that in cattle, the GV-stage oocyte
lacks the CCNB1 component but contains the CDK1 protein [49]. For activation of MPF,
CCNB1 must be translated immediately after meiosis resumes but before germinal vesicle
breakdown. Consistent with these observations, CCNB1 mRNA was found in the
polyribosomal fraction at the GV stage, in addition to CDK1 mRNA. CSF is activated
during a later stage of oocyte maturation prior to its involvement in arresting the cell cycle.
However, it has been found that MOS is expressed readily during early stages of oocyte
maturation, since it is involved in CCNB1 accumulation and displays an MPF stabilizing
activity at the MII stage [50]. Following fertilization, both the MPF and CSF are rapidly
degraded. Consistent with the activation of MPF, our results showed that levels of CDK1
mRNA and CCNB1 mRNA present on polyribosomes increased during the initial step of
maturation while MOS, known to be involved throughout oocyte maturation, was equally
present at all stages. This physiologically relevant profile was not observed when targeting
total or poly(A)-bearing RNA. This is a strong confirmation that transcript abundance
measured as total maternal mRNA pool need to be interpreted with care due to the
contribution of the large contents of stored thus physiologically inert mRNAs. Finally, we
also investigated the proportionality between specific polyribosomal mRNAs and their
corresponding protein products. By definition, polyribosomal RNA encodes protein to be
newly synthesized. In contrast, the protein content of a candidate results from both its
synthesis and turnover rates. Nevertheless, of the three mRNA sequences studied in parallel
by Western blot, all showed a shift in total protein that matched the shift in their
polyribosomal status, confirming the added value of polyribosome-bound mRNA studies in
terms of physiological information.
81
2.6 Conclusions
The study of oocyte maturation and early development faces a major challenge regarding
the physiological relevance of the abundance of total RNA or even poly(A) RNA. The
presence of stored and hence inactive maternal RNA that marks developmental stages prior
to embryonic genome activation can bias the subsequent interpretation of these
measurements. We provide evidence that the study of polyribosomal mRNA offers a better
option for studying the physiology underlying gametes and embryonic development
especially when the cells are bearing large amounts of stored RNA. The procedure
developed in the present study was shown to be robust and efficient for isolating
polyribosomal mRNA from small amounts of cells. This polyribosomal mRNA can then be
used for downstream transcriptomic studies.
2.7 Methods
All chemicals were from Sigma-Aldrich (St-Louis, MO) unless specified otherwise.
Oocyte recovery and selection
Germinal vesicle (GV) oocytes were produced as described previously [51] from bovine
ovaries collected at a commercial slaughterhouse and transported to the laboratory in a
saline solution containing antimycotic agent. Cumulus oocyte complexes (COC) selected
on the basis of having at least five layers of cumulus were washed three times in HEPESbuffered Tyrode’s medium supplemented with 0.3% bovine serum albumin, 0.2 mM
pyruvic acid and 50 μg/ml gentamycin. Groups of approximately 50 COCs were placed in
four-well Petri dishes containing 0.5 ml of maturation medium (composed of modified
synthetic oviductal fluid medium with 0.8% bovine serum albumin, modified Eagle’s
medium non essential amino acids, modified Eagle’s medium essential amino acids, 1 mM
glutamine, 0.5 μg/ml follicle-stimulating hormone, 5 μg/ml luteinizing hormone and 1
μg/ml 17b-estradiol) under 0.5 ml of mineral oil. Germinal vesicle breakdown (GVBD) and
metaphase II (MII) oocytes were obtained by incubating COCs at 38.5°C with 5% CO2 for
6 and 24 hours respectively. Maturation was stopped upon transfer to PBS-cycloheximide.
Cumulus cells were removed by vortexing the tissue in PBS containing 100 μg/ml of
cycloheximide to prevent translation and ribosome run off. The denuded oocytes were
82
washed at least three times with PBS cycloheximide to remove any remaining cumulus
cells. Groups of 75 GV, GVBD or MII oocytes collected for polyribosomal extraction were
separated from the PBScycloheximide by centrifugation at low speed.
Carrier preparation
Since a single bovine GV oocyte, even though enriched with stored RNA, may contain as
little as 340 pg of total RNA [19] and polyribosomal mRNA represents only a small
fraction of this total, conventional extraction methods for obtaining a UV-distribution
profile on sucrose density gradient would require an unobtainable number of oocytes. We
therefore devised an inert polyribosome support to serve as a marker and carrier in the
sucrose gradient, allowing us to observe the distribution of single ribosomes and
polyribosomes. RNA extracted from drosophila SL2 cells was used as a carrier because of
its phylogenetic distance from cattle. SL2 cells were cultured at 28°C in complete
Schneider’s Drosophila Medium (Invitrogen, Carlsbad, CA) containing 10% heatinactivated foetal calf serum (Hyclone, Logan, UT), 50 U/ml penicillin G and 50 μg/ml
streptomycin sulphate (Invitrogen). To enhance translation and therefore increase the
number of polyribosomes, these cells were starved for 3 hours in serum-free medium then
stimulated for at least 150 min by adding 33% of fresh medium and 6.25% of heatinactivated foetal calf serum to the medium. Cells were harvested by centrifugation at 1,200
× g for 3 min at 4°C in the presence of 100 μg/ml cycloheximide and lysed in polyribosome
lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.7, 150 mM KCl, 1.25 mM MgCl2, 1% IGEPAL, 0.5%
deoxycholate, 200 μg/ml cycloheximide, 1000 U/ml Protector™ RNase inhibitor (Roche,
Indianapolis, IN) supplemented with complete mini EDTA-free protease inhibitor cocktail
tablets (Roche, Indianapolis, IN) followed by triturating. The homogenate was then
clarified by centrifugation at 12,000 × g for 20 min at 4°C and the absorbance of the
supernatant was measured at 260 nm using a Nanodrop ND-1000 spectrophotometer
(Nanodrop, Wilmington, DE, USA). For each cross-linking test described below, clarified
cytoplasmic extract was prepared from 8 × 106 cells.
83
Chemical cross-linking of Drosophila polyribosomes
Formaldehyde was added to clarified cytoplasmic extract to give final concentrations of
0.2% to 3.37%. All crosslinking was done on ice for 45 min. Residual formaldehyde was
neutralized by adding 0.1 M glycine [38]or Tris-HCl at concentrations of 0.15 M to 1.5 M
with the pH adjusted to 8.7 or 10.9, followed by 20 min on ice. Each cross-linked and
neutralized extract was then processed through the steps designed for isolation of
polyribosomes from the gradient fractions. Cytoplasmic samples were mixed with
guanidium isothiocyanate solution and the RNA fraction was ethanol precipitated
overnight. The pellet was further purified by column chromatography (PicoPure, Molecular
Devices, Sunnyvale, CA). Cross-linking efficiency was based on the yield of total RNA
thus recovered. It was expected that with increased cross-linkage, more RNA would be
covalently bound to and eluted with the protein fraction. The RNA-containing fraction
eluted from the column was analyzed using a 2100 BioAnalyzer (Agilent, Santa Clara,
CA). To determine if the formaldehyde-treated material retained the potential to generate a
normal polyribosomal fractionation profile, it was subjected to isokinetic sedimentation in
sucrose density gradient as described below and the generated UV profile distribution was
compared to one from an untreated sample.
Oocyte sample preparation
Since the polyribosome lysis buffer is unable to dissolve the bovine zona pellucida, oocytes
were strongly vortexed with 1.0 mm zirconia-silica beads (BioSpec, Bartlesville, OK) in 50
μl of passive lysis buffer. The lysis product was transferred to a clean Eppendorf tube and
the beads were discarded. Cell debris were removed by centrifuging at 12,000 × g for 20
min. The clarified solution was added to 100 μl of drosophila carrier. Each sample was
loaded on a 4 ml linear sucrose gradient.
Sucrose gradient preparation and centrifugation
The linear sucrose gradient was generated using a SG-15 gradient maker (Hoefer,
Holliston, MA, USA) following the manufacturer’s instructions with 10% and 60%
solutions of sucrose in isotonic buffer made of 150 mM KCl, 1.25 mM MgCl2 and 50 mM
84
Tris adjusted to pH 8.7. The linear gradients were kept at 4°C until use. Cytoplasmic
extracts were analyzed by sedimentation velocity in the sucrose gradients for 3 h at 34,000
rpm using a SW 60 Ti rotor (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). The gradients were
processed using a BR-188 Density Gradient Fractionation System (Brandel, Gaithersburg,
MD, USA). Fractions of 350 μl were collected with continuous monitoring of absorbance at
254 nm using an Isco UA-6 detector (Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA). The RNAcontaining fractions were collected directly in 428 μl of 5.25 M guanidinium thiocyanate
(pH 5.5) and 3 μl (5 μg/μl) of linear polyacrylamide (Ambion, Austin, Texas, USA) were
added to each as an RNA co-precipitant. Isopropanol was then added and the samples were
left overnight at -20°C. The polyribosome-containing RNA precipitate thus obtained was
then re-suspended in the extraction buffer provided with the RNA extraction PicoPure kit
(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) and RNA content was assayed using the
NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. The polyribosomal nature of the isolated fractions
was verified by adding 100 mM of EDTA to the lysis buffer and the sucrose gradient
solutions to sequester Mg2+ and thereby disrupt any polyribosomes.
Microarrays
The hybridizations were performed on the custom-made BlueChip v1.3 cDNA microarray.
This microarray contains 1153 expressed sequence tags collected from four subtracted
libraries made from oocytes and early embryos [52]. For the determination of the optimal
microarray hybridization temperature to avoid potential contamination from the carrier
(Table 2-1) two technical replicates were performed for each tested temperature. To test the
reproducibility of the polyribosomal isolation, six hybridization samples were prepared
representing three biological replicates each performed in dye swap (two technical
replicates). To test the method in a biological context (Figures 2-6 and 2-7), for each
maturation stage, two biological replicates each containing 75 oocytes were used to
generate hybridization samples. A total of 12 microarrays were hybridized including a
technical replicate for each sample. RNA samples were amplified through two rounds of in
vitro transcription using the RiboAmp kit (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).
Yields of antisense RNA were assayed on the NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. For
each microarray hybridization sample, 10 μg of antisense RNA was labelled using the ULS
85
aRNA labelling kit (Kreatech, Amsterdam, The Netherlands). To obtain more concentrated
and cleaner output, Pico-Pure columns (Molecular Devices) were used for aRNA
purification. The resulting labelled purified probes were heat-denatured at 90°C for 5 min
and 50 μl of SlideHyb buffer #1 (Ambion) was immediately added. The slides were
hybridized in the SlideBooster hybridization chamber (Advalytix, San Francisco, CA,
USA) at the tested temperature for 18 h. Slides were washed twice in lowstringency buffer
(2× standard saline citrate (SSC)/0.5% sodium dodecyl sulphate) for 15 min at 60°C.
Washes were repeated with high-stringency buffer (0.5× SSC/ 0.5% sodium dodecyl
sulphate) in the same conditions. Slides were then dipped three times in SSC 1× followed
by three more dips in H2O, spun for 5 min at 1,200 × g at room temperature and scanned
using a VersArray ChipReader (Virtek, Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada) supported by
VersArray software (Bio-Rad). Signal intensity and local background were determined with
Array-Pro Analyzer Ver4.5 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, USA). Pearson’s
correlation coefficients were calculated based on net signal intensities of probes on the
microarray that generated positive signals. The same approach was used to determine the
optimal microarray hybridization temperature (Table 2-1). Positive signal threshold values
were determined based on a net intensity cut-off value calculated from the background
values + 2 standard deviations. For microarrays, data was pre-processed: 1) background
was subtracted; 2) intra-array normalization was performed using Loess; 3) inter-array
normalization was performed using Quantile. RT-PCR Total RNA was extracted using
PicoPure columns (Molecular Devices). An on-column DNase 1 treatment was performed.
The resulting RNA samples were reverse transcribed using the qScript Flex cDNA
synthesis kit (Quanta, Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). The reaction was primed
using either an oligo dT (for poly (A) and polyribosomal RNA) or with random primers to
target all mRNAs regardless of poly(A) length, in a total reaction volume of 20 μl. For
PCR, primer sequences and details are listed in Table 2-2. For standard PCR (Figure 2-4),
the distribution was repeated twice from biologically independent samples. The NovaTaq
DNA Polymerase (EMD Biosciences, Gibbstown, NJ, USA) was used and the
amplification conditions were as follows: Hot start cycle, 10 min at 95°C; 30 PCR cycles
(denaturing: 94°C for 30 sec; annealing: 60°C for 30 sec; extension: 72°C for 1 min)
followed by a last 10 min extension at 72°C. The PCR products were loaded onto 1.5%
86
agarose gel for migration. For quantitative PCR, four biologically independent replicates
were processed for all treatments and time points. A standard curve was generated using the
template from a PCR product purified using the QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen,
Mississauga, ON, Canada) and quantified with a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer.
The standard curve consisted of five serial dilutions of the purified PCR products ranging
from 0.1 pg to 0.01 fg. Quantification was achieved using the Light- Cycler FastStart DNA
Master SYBR Green I kit (Roche Diagnostics, Laval, QC, Canada) following the
manufacturer’s recommendations. All reactions were conducted in a LightCycler 1.5
(Roche Diagnostics). Primer annealing and fluorescence acquisition temperatures are listed
in Table 2-2. Specificity of amplification was determined by sequencing the amplicon for
each target and by the presence of a single peak on the melting curve. Data normalization
could only be accounted by using samples containing the same amount of oocytes. Since
quantifications were performed on different RNA populations (i.e. total RNA, poly(A)
bearing and polyribosomal mRNA), data normalization could not be performed across
these groups. Furthermore, usual housekeeping gene candidates could not be used for data
normalization across oocyte maturation stages since their respective transcript abundance
been reported to be fluctuating [53, 54]. As a consequence, absolute transcript
measurements were considered where total variance includes both technical and biological
variances.
Western blot analysis Oocytes were frozen in groups of 25 in a minimal volume (1-3 μl) of
PBS and stored at -80°C. Three pools of each maturation stage were re-suspended in 2×
sodium dodecyl sulphate gel loading buffer (100 mM Tris-Cl, 4% w/v sodium dodecyl
sulphate, 0,2% w/v bromophenol blue, 20% v/v glycerol, 10% b-mercaptoethanol) and
heated to 95°C prior to loading. The samples were separated by SDS-PAGE (12%
acrylamide). Proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane (NitroBind Cast)
using the wet transfer method and transferred proteins stained with Ponceau S red. The
membranes were processed for immunoreactions with the primary antibody overnight at
4°C then with secondary antibody under the following conditions: STAT3 (no. 9132, Cell
Signaling Technology, Danvers, MA, USA) diluted 1/1,000 - goat anti-rabbit IgG
horseradish peroxidase diluted 1/200,000; DTX2 (no. 101938, Santa Cruz biotechnology,
87
Santa Cruz, CA) diluted 1/100,000 - anti-rabbit diluted 1/100,000; PTTG1 (no. 3305,
Abcam) diluted 1/ 2,500 - anti-mouse diluted 1/40,000. Each candidate was immunoblotted
in parallel with the usual housekeeping genes: b-actin (no. 4967, Cell Signaling
Technology) diluted 1/10,000 - anti-rabbit diluted 1/200,000 or a-tubulin (Santa Cruz
biotechnology 33999, diluted 1/ 250) - rabbit anti-goat IgG horseradish peroxidise (diluted
1/200,000)). Determination of the housekeeping gene products was done according to the
molecular weight of the protein of interest to avoid overlapping signals. All secondary
antibodies came from Invitrogen. Protein expression levels were quantified using GeneTools software (Syngene, Frederick, MD, USA).
Statistical analysis and microarray data processing
Significant differences were calculated using SAS software (SAS-Institute inc., Cary, NC).
One-way ANOVA with Dunnett tests were conducted for all cross-linking tests by using
standard extraction as control. Differences were considered statistically significant (*) at
the 95% confidence level (P < 0.05) and highly significant (**) at the 99% confidence level
(P < 0.01). For Figure 2-6, RNA abundance data were analyzed with one-way ANOVA
using Tukey’s multiple comparison test. For Figure 2-7, protein and polyribosomal RNA
levels were analysed with two-way ANOVA since interrelation between both are expected.
Data with different letters are significantly different (P < 0.05). When ANOVA criteria
were not met (normality and homogeneity of variance), data were transformed to
logarithms. For microarrays, statistical testing was conducted using the statistical
significance
test
from
Limma
using
a
Web-based
tool,
WebArray
DB
(http://www.webarraydb. org/webarray/index.html). Only candidates with statistically
significantly different signal (p < 0.05) and with at least a twofold change were selected.
2.8 Authors' contributions
SS carried out most of the experiments including the development of the carrier’s
preparation, the method’s robustness assessment and all of its testing in biological contexts.
She also drafted the manuscript. JPG carried out the preliminary conditions for carrier and
oocyte preparation, assessed the linearity of the sucrose gradient, determined the optimal
microarray hybridization conditions and initiated the method’s repeatability testing. MHD
88
performed some of the immunoblots. MAS supported the stipend of JPG and directed his
academic program. EWK provided the expertise on polyribosomal and help to draft the
manuscript. CR conceived the study, participated in its design and coordination, supervised
the graduates and helped to draft the manuscript. All authors read and approved the final
manuscript.
2.9 Acknowledgements
The authors thank Dr. Julie Nieminen (Université Laval, Canada) for critical review of the
manuscript and language correction. This work received support from the Natural Sciences
and Engineering Research Council of Canada (grant numbers 300712-04). SS received
support in the form of a Graduate Scholarship from the Natural Sciences and Engineering
Research Council of Canada.
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Figure 2-1 Effect of cross-linking on recovery of RNA extracted from Drosophila SL2 cells.
A) Total RNA recoverable from cell extracts (the clarified supernatant) after cross-linking with
various concentrations of formaldehyde; Micro-electrophoretic profile of the total RNA recovered
from B) untreated cell extract; C) cell extract treated with 3.37% formaldehyde.
93
Figure 2-2 Neutralization of formaldehyde in Drosophila SL2 cell extract.
Total RNA recovered from cell extracts (the clarified supernatant) treated with 3.37%
formaldehyde, quenching the reaction using A) Glycine at pH 8.7; B) Tris at different
concentrations and pH; C) Tris at a broad range of concentrations at pH 8.7
94
Figure 2-3 Distribution of Drosophila SL2 polyribosomes in sucrose density gradient fractions
as detected by UV absorbance. A) Untreated cytoplasmic extract; B) Cytoplasmic extract treated
with 3.37% formaldehyde and quenched with 1 M Tris. Ribosomal subunits (40S and 60S),
monoribosomes (80S), polyribosomes and corresponding fraction numbers are indicated. Top of
gradient corresponds to fraction 1.
95
)LJXUH&RQILUPDWLRQWKDWWKHKLJKVHGLPHQWLQJPDWHULDOVFRQWDLQSRO\ULERVRPHV
&HOOV ZHUH O\VHG DQG IUDFWLRQDWHG LQ WKH SUHVHQFH RU DEVHQFH RI ('7$ 573&5 ZDV XVHG WR
DPSOLI\WKH$&7%DQG&'.VHTXHQFHVIURP51$LVRODWHGUHVSHFWLYHO\$IURPJUDQXORVDFHOOV
DQG%IURP*9VWDJHRRF\WHV7RSRIJUDGLHQWFRUUHVSRQGVWRIUDFWLRQ
96
Figure 2-5 Reproducibility of the polyribosome mRNA extraction method.
Distribution of microarray signal intensities obtained from two independent biological replicates.
The mean correlation value of all three replicates is indicated.
97
Figure 2-6 Determination of total, poly(A) and polyribosomal RNA in oocytes at different stages
of physiological maturation. Quantitative RT-PCR was used to amplify the following sequences:
A) CDK1; B) CCNB1; and C) MOS. GV = germinal vesicle; GVBD = germinal vesicle breakdown;
MII = metaphase II. For each RNA population different superscript indicate statistically significant
difference (p < 0.05).
98
Figure 2-7 Relative abundance of selected polyribosomal mRNA sequences and corresponding
proteins.
Immunoblots were prepared from oocytes at the GV, GVBD and MII stages. The three candidates
were selected based on microarray data. A) Deltex 2 (DTX2); B) Signal transducer and activator of
transcription 3 (STAT3); C) Pituitary tumour-transforming gene 1 (PTTG1). b-actin (ACTB) and atubulin (TUBA) were used as indicators of protein loading. For each component different
superscript indicate statistically significant difference (p < 0.05).
99
Table 2-1 Proportion of detected microarray signals above threshold
Species
Bos taurus
Drosophila melanogaster
100
Hybridization temperature (°C)
55°C
60°C
65°C
61%
47%
36%
20%
6%
0%
Table 2-2 Description of RT-PCR or PCR primers for examined genes
Gene name
Gene
symbol
Cyclin B1
CCNB1
Cyclin
Dependant
kinase 1
Primer sequences 5'-3'
Amplicon
size (bp)
Annealing/
melting
temp. (°C)
Accession
number
F: ACC TGG CAA AGA ATG TGG TC
R: GCT GTG CTA GAG TGC TGA TCT TAG
108
60/80
NM_001045872
CDK1
F: GAT CCT GCC AAA CGA ATT TCT GGC
R: TCT GCT CTT GAC ACA ACA CAG GGA
121
60/78
NM_174016
Oocyte
maturation
factor MOS
MOS
F: CAA AGC ATT GTG CAC TTG GAC CTC
R: TGG GTG TAA CAG GCT CTC CTT TGA
190
60/89
XM_590874
Actin beta
ACTB
F: CGC CAT GGA TGA TGA TAT TG
R: GGT CAT CTT CTC ACG GTT GG
363
60/N/A
NM_173979
101
3. Chapitre 3 : L’analyse des ARNm polyribosomaux
révèle l’acquisition de la quiescence énergétique
durant la maturation ovocytaire chez le bovin
Sara Scantland, Gaël Cagnone, Éric Fournier, Carolina H. Macabelli, Dominic Gagné,
Claude Robert
Cet article n’a pas encore été soumis pour publication.
102
3.1 Résumé
Contexte : Chez le bovin, la maturation ovocytaire, la fécondation et le développement
embryonnaire précoce sont caractérisés par un silence transcriptionnel. Toutes les étapes
menant à la maturation et au développement précoce dépendent exclusivement de l'usage
d'ARNm maternels accumulés pendant la croissance de l'ovocyte. Ces ARNm maternels
sont présents sous différentes formes: alors que certains entreprendront le processus de
traduction (ARNm actifs), la plupart seront stockés dans le cytoplasme pour un usage futur
ou tout simplement pour être dégradé. Ainsi, les profils transcriptomiques représentant la
physiologie cellullaire des ovocytes et des embryons précoces sont difficiles à obtenir vu
les difficultés techniques impliquées dans la séparation des ARNm actifs et des ARNm
stockés. Puisque les ARNm actifs doivent être associés avec des polyribosomes pour
permettre la traduction, la seule façon connue de distinguer des ARNm actifs des ARNm
inactifs est l'isolation des polyribosomes. Cette méthode a été utilisée pour comparer le
transcriptome actif des ovocytes en arrêt méiotique et celui d'ovocytes en métaphase II.
Résultats : Les ARNm polyribosomaux d’ovocytes au stade de vésicules germinales et au
stade de métaphase II ont été isolés. Des ARNm exogènes "crosslinkés" ont été ajoutés aux
échantillons pour agir comme porteur afin d'obtenir des profiles UV de distribution
polysomale. Les ARNm isolés ont été amplifiés linéairement et hybridés à des biopuces à
ADN. L'analyse des biopuces a révélé une dysfonction mitochondriale aïgue et une
diminution de la phosphorylation oxydative durant la maturation. Ceci est corroboré par des
mesures du ratio ADP:ATP qui mènent à l'hypothèse d'un ovocyte MII "quiescent". La
synthèse protéique est aussi grandement affectée: bien que moins d'ARNm polyribosomaux
sont extraits dans les ovocytes MII en comparaison aux vésicules germinales, plusieurs
fonctions cellulaires associées à la synthèse des protéines et à la voie de signalisation
d'EIF2 sont réduites. Conclusion : L'effondrement de la production énergétique, la
réduction de la synthèse protéique et les ratios ADP:ATP supportant l'hypothèse d'un stade
MII quiescent pourraient être expliqués par l'importance de diminuer le métabolisme
pendant la maturation. Ce métabolisme diminué pourrait aider l'ovocyte à survivre jusqu'à
la fécondation et l'activation du génome embryonnaire. Ceci suggère que l'hypothèse de
l'embryon quiescent pourrait entrer en jeu avant même la fécondation, pendant la
maturation ovocytaire.
103
3.2 Abstract
Background: In the bovine, oocyte maturation, fertilization and early embryo development
are characterized by transcriptional silence. All of the steps leading to maturation and early
development rely exclusively on the use of maternal mRNAs accumulated during the
growth of the oocyte. These maternal mRNAs are present in different forms: while some of
them undergo the process of translation (active mRNAs), most are stored in the cytoplasm
for future use or are simply destined to be decayed. Thus, transcriptome profiles
representing the underlying cell physiology of oocytes and early embryos are arduous to
obtain due to the technical difficulties involved in separating active and stored mRNAs.
Since active mRNAs must be associated with polyribosomes to allow their translation, the
only known way to distinguish active from inactive mRNAs is polyribosomal isolation.
This method was used to compare the active transcriptome profile of germinal vesicle and
metaphase II oocytes. Results: Polyribosomal mRNAs from germinal vesicle and
metaphase II oocytes were isolated. Samples were spiked with exogeneous crosslinked
mRNAs as a carrier to obtain UV polysomal distribution profiles. The isolated mRNAs
were linearly amplified and hybridized to microarrays. Analysis of the microarray data
revealed acute mitochondrial dysfunction and oxidative phosphorylation breakdown during
maturation. This is corroborated by ADP:ATP ratio measures which lead to the hypothesis
of
the «quiet» MII oocytes. Protein synthesis is also greatly affected: while fewer
polysomal mRNAs are extracted in MII oocytes compared to GV oocytes, many cellular
functions associated with protein synthesis and the EIF2 signaling pathway are reduced.
Conclusion: The breakdown in energy production, the reduction in protein synthesis and
the ADP:ATP ratio supporting the hypothesis of a quiet MII stage could be explained by
the importance of lowering the oocyte metabolism during maturation. This lowered
metabolism could help the oocyte survive until fertilization and activation of the embryonic
genome. This suggests that the quiet embryo hypothesis is applicable even before
fertilization, during oocyte maturation.
104
3.3 Introduction
Growing oocytes accumulate large amounts of maternal mRNAs in their cytoplasm. In
bovines, this crucial accumulation allows the oocyte and the future embryo to survive for
many days without transcription. De novo RNA synthesis is undetectable during meiotic
resumption [1, 2] and this transcriptional silence is maintained until embryonic genome
activation (EGA) which occurs during the fourth cell cycle [3, 4]. Thus, when including the
time needed for follicles to grow from 3 mm to their preovulatory size, maternal mRNAs
can be stored for more than 2 weeks before entering translation or degradation (reviewed in
[5]). In mice, the transcriptional silence period is much shorter since active transcription is
still detected until the GVBD stage [6, 7] and a minor genome activation is initiated at the
end of the zygotic stage [8]. Despite this, the half-lives of mice maternal mRNAs are also
quite long, up to 28 days [9]. Therefore, developmental steps in the mouse can rely on de
novo transcription, translation and post-transcriptional modifications whereas from the
beginning of oocyte maturation, bovine development relies exclusively on translation and
post-transcriptional modifications until EGA (reviewed in [10]). This process requires
previously synthesized mRNAs to be recruited for translation in a time-specific and well
orchestrated program. This recruitment for translation passes through ribosomal association
on mRNAs to form polyribosomal mRNAs [11, 12].
Oocyte maturation and early embryo development are mostly studied through strategies
involving the analysis of the transcriptome [13-15]. This approach can be useful to acquire
a general view of changes in mRNA levels but provides very little information on protein
synthesis since most maternal mRNAs are not translated. In this way, these studies bias the
analysis of oocyte physiology. Proteomic approaches have been used to study protein
synthesis but the scarcity of oocytes makes it difficult to obtain a satisfying resolution to
provide insight on maturation, especially for low abundance proteins [16-18]. To remedy
the issues of low information obtained by total RNA study and low resolution obtained by
proteomic approaches, we decided to focus on the study of polyribosomal mRNAs to get a
clearer picture of the active transcriptome and get closer to the proteome. Our team recently
proposed a method to isolate polyribosomal mRNAs starting with as little as 75 oocytes
using a sucrose density gradient [19]. This method is combined with polyribosomal mRNA
amplification in order to get enough material to hybridize the samples on microarrays. To
105
our knowledge, only one other study used polyribosomal analysis in oocytes [20]. In this
study, they also isolated polyribosomal mRNAs through sucrose gradient fractionation, but
concentrated their efforts on mechanisms of translational regulation during oocyte
maturation in the mouse.
Many findings support the hypothesis that protein synthesis is highly limited during oocyte
maturation and early embryo development. First of all, it was previously reported that
oocytes and early embryos present atypically low 28S ribosomal RNA content, pointing out
a limited translational potential and low ribosomal turnover [21]. Moreover, many studies
found that the number of synthesized protein is lowered during maturation [18] and that a
general reduction in the rate of synthesis of proteins occurs [22]. From an energy point of
view, many authors have described the immature structure of mitochondria during oocyte
maturation and concluded that they suffer from low efficiency in energy production [23,
24]. In this situation of low mitochondrial efficiency, the secret to the survival of the oocyte
seems based on tightly coupled supply and demand of ATP [25]. Many processes during
oocyte maturation have high energy demands but specific spatial redistribution of
mitochondria may help meet this local demand [25-27].
Here, we show that less mRNAs are associated with polyribosomes within MII than there
are in GV oocytes, and that many canonical pathways involved in translation show lower
activity during maturation. With our polyribosomal study, we demonstrate that
mitochondrial functions are impaired and that the oxidative phosphorylation pathway is
highly disturbed during maturation. We speculate that mitochondrial dysfunction lead to
the acquisition of a quiet metabolism during maturation. This quiet metabolism occurs by
lowering energy production with mitochondria impairment and by lowering energy
consumption with translational dismiss. Protein synthesis is a very costly process
demanding large quantities of ATP, [28, 29] and lowering translation could help ensure a
lower metabolism. Thus, the acquisition of a quiet metabolism could be vital for oocyte
competence and further embryo development.
106
3.4 Results
Polyribosomal extraction
Drosophila cross-linked mRNAs were mixed to bovine oocyte samples to obtain
polyribosomal profiles (Figure 3-1). These profiles allow us to extract polyribosomal
mRNAs, which contain mRNAs that are being actively transcribed as well as potential noncoding RNAs (ncRNAs) which are associated to active polysomes as cofactors, all while
discarding stored mRNAs. Polyribosomal fractions corresponded to the 6th to 12th tubes that
were collected from the gradient.
Since usual housekeeping candidates fluctuate during the stages of oocyte maturation, they
cannot be used for data normalization [30]. As it was demonstrated in the previously
published method [19], most of the drosophila cross-linked mRNAs are discarded during
RNA extraction and less than 0,5% of the remaining drosophila contaminants (not crosslinked) are still present after extraction [19]. As the drosophila mRNAs escort the bovine
mRNAs throughout the whole experimental process and have stable concentrations in all
samples regardless of the oocyte maturation stage, they represent the most appropriate
candidates for data normalization. Within the thirteen drosophila transcripts present on the
microarray slides, the one presenting the smallest variation coefficient in microarray data
was used to normalize bovine candidates. The RpS3 (Ribosomal protein S3) transcript was
selected for data normalization due to its variation coefficient of 0,06 and its great stability
in relative expression measured by RT-PCR (Data not shown).
Microarrays
Out of over 37,000 probes, 4032 targeted gene transcripts were presents in GV and 2791 in
MII. 3295 are exclusively present in GV oocytes and 2004 in MII oocytes. 730 gene
transcripts were shared by the two groups. Statistical analysis comparison revealed that
1926 genes were differentially expressed (P < 0,05; fold change > 2), the great majority
being downregulated in MII (1621 gene transcripts, 85%). Only 248 gene transcripts were
upregulated in MII (Figure 3-2).
107
Functional analysis
The Ingenuity software allows the analysis of thousands of transcripts simultaneously and
the building of schematic representations of important pathways in oocyte maturation. By
determining which polyribosomal mRNAs are enriched within each condition, the
Ingenuity software allows us to understand which cellular functions and canonical
pathways are most affected during maturation. Thus, we found that protein synthesis, RNA
post-transcriptional modification, gene expression, post-translational modifications and
protein folding are all lowered in MII oocytes compared to GV oocytes. Another important
function underrepresented in MII oocyte is energy production, which seems absent. Cell
cycle related functions are some of the only ones to be higher in MII oocytes, an
unsurprising result given that oocyte maturation is characterized by cell cycle progression
(Figure 3-3).
Amongst canonical pathways, polyribosomal mRNAs associated with EIF2 signaling,
oxidative phosphorylation and mitochondrial function are highly enriched in GV compared
to MII oocytes (Figure 3-4). EIF2 signaling is related to protein synthesis while oxidative
phosphorylation and mitochondrial function are associated with energy production.
Table 3-1 presents the log-ratios and the enrichment p-values of molecules associated with
mitochondrial function that are downregulated during maturation as well as a representation
of oxidative phosphorylation pathways associated with the different mitochondrial
complexes that are impaired during maturation. As mitochondria are the organelles
responsible for cellular respiration, a downregulation of the oxidative phosphorylation
pathway can be associated with mitochondrial dysfunction. Table 3-2 presents the logratios and the enrichment p-values associated with different molecules in EIF2 signaling.
RT-PCR validation
To allow confident interpretation of the results obtained through microarray hybridizations,
we performed several QPCR validations. Seven differentially expressed candidates in the
oxidative phosphorylation (all except EIF3M and RPL18) and mitochondrial function
108
(ATP5A1, ATP5C1, NDUFB2, NDUFA8) pathways as well as protein synthesis pathway
(EIF3M and RPL18) were quantified in three biological replicates of each oocyte stages.
All results demonstrated positive validation of differential expression, 45% (4/9) with a pvalue < 0,05, 45% (4/9) with a p-value < 0,01 (Figure 3-5) and one with a tendency value
(p<0,10). These validations attest the microarray results and their interpretation.
ATP level, ADP level and ADP:ATP ratio in the oocyte
The ADP:ATP ratio is an interesting tool to evaluate cellular metabolism (proliferation,
growth arrest, apoptosis or necrosis). In a general way, cells in growth arrest show slightly
elevated ATP level with little or no change in ADP levels compared to control. Thus, cells
in quiescence are accumulating low level of ATP without using it. The ADP:ATP ratio
decreases. In contrast, cell in apoptosis show low ATP level and increased ADP level,
revealing a high used of ATP without capacity to produce de novo ATP. The ADP:ATP
ratio increases. When we compared matured oocytes (MII) to immature oocytes, our results
demonstrate a slightly increased in ATP level with no change in ADP level; ADP:ATP
ratio tend to lower but it is not significant (Figure 3-6).
3.5 Discussion
Polyribosomal mRNA
This study provides a general picture of polyribosomal transcripts during oocyte
maturation. The method used to specifically isolate polyribosomal mRNAs allows for
greater insight in active transcriptome analysis by discarding the noise inherent in stored
mRNAs. Thus, we get closer to proteomics.
Oocyte and embryo scarcity represents an important challenge in transcriptomic and
proteomic studies. The method used here requires a significantly larger number of oocytes
(groups of 75 oocytes) than the study total mRNA (where 5 to 10 oocytes are usually
sufficient), but allows us to accumulate far more and especially much more accurate
information. Since association of an mRNA with ribosomes correlates with active
translation, the specific isolation of polyribosomal mRNA brings us one step closer to the
proteome and gives us a better view of oocyte physiology. In 2011, the team of Marco
109
Conti used a similar method based on sucrose gradient fractionation to obtain information
on translational control during oocyte maturation and fertilization in the mouse [20]. Their
method doesn’t use exogenous RNA, and thus more than 500 oocytes and embryo had to be
pooled for each replicates. While this herculean effort was greatly rewarded by the
discovery of a novel mechanism that controls a late wave of translation in mouse oocytes,
the sheer amount of oocytes and embryos needed to get this information is not within the
reach of most teams, especially given that production costs of embryonic material rises
continually.
By using only 75 oocytes, the method presented herein is much more
accessible and could reach much wider usage.
Reduction in protein synthesis
According to our microarray analysis, over 6,000 transcripts are associated to
polyribosomes during bovine oocyte maturation. This result is very similar to the one
obtained by [20], where around 7,600 polyribosomal transcripts were identified in mouse
oocytes during maturation. According to our results, many evidences support an important
translation reduction during maturation. We observed 32% less transcripts associated with
polyribosomes in MII oocytes compared to GV oocytes (2791 transcripts in MII compared
to 4082 transcripts in GV) (Figure 3-2). Furthermore, many new transcripts appear during
maturation but are generally weakly translated. Thus, only 248 transcripts over 2791 are
significantly overexpressed in MII compared to GV (Fold change >2.0 and p-value < 0,05)
(Figure 3-2). On the contrary, almost half the transcripts present in GV are significantly
overexpressed compared with MII oocytes, suggesting a high expression of GV transcripts.
The low number of transcripts present on polyribosomes in MII and their weak expression
suppose a wide-ranging reduction of translation during oocyte maturation.
The reduction in protein synthesis inferred through the low number and low expression of
polyribosomal transcripts in MII compared to GV is also substantiated by the changes
observed in molecules enrichment in cellular functions and canonical pathways during
maturation. Analysis by Ingenuity reveals a marked impoverishment in molecules
associated with cellular functions related to translation such as protein synthesis, RNA
post-transcriptional modification and in general gene expression. General post-translational
modifications and protein folding also seem to be lowered during maturation. Amongst
110
canonical pathway, the EIF2 pathway is the most impoverished in molecules associated.
mRNAs as important as PABP, PAIP1, many EIFs (eukaryotic initiation factors) and
mRNAs associated with 40S and 60S ribosomal subunit are impoverished on
polyribosomes in MII. All these molecules are highly important in translation initiation.
Therefore, their downregulated expression certainly impairs translation (Table 3-2, Figure
3-7).
The reduction in translation rate during oocyte maturation and early embryo development
has already been observed by others [18, 21, 22]. The number of synthesized protein is
lowered during maturation [18] and a general reduction in the rate of synthesis of each
protein occurs [22]. These results are confirmed by our study. Furthermore, atypically low
28S ribosomal RNA content points out a limited translational potential and a restrained
ribosomal turnover during oocyte maturation and early embryo development [21]. In the
mouse early embryo, most of the ribosomes are not associated with the translating
fractions; once again suggesting limited protein synthesis ability [31]. Thus, decrease in
protein synthesis has been observed in many ways by others but ours results reveal for the
first time that in mature oocytes: fewer mRNA are associated with polyribosomes,
polyribosomal mRNA are weakly expressed compared to the ones in GV oocytes and fewer
polyribosomal mRNA promote translation initiation and protein synthesis pathways.
Of course, translation remains absolutely vital for oocyte maturation [32-35]. Among other
things, protein synthesis is essential for GVBD, MI and MII progression and to maintain
MII before fertilization. Spatio-temporally expression of protein allows the progression of
oocyte maturation [35, 36]. Nevertheless, the oocyte decreases translation during oocyte
maturation and this low translation rate seems to persist throughout early embryo
development [21, 37]. Well-orchestrated translation mechanisms could probably ensure the
synthesis of essential proteins while inhibiting the synthesis of non-essential ones [20, 38].
One of the really few functions that seem to be higher in MII oocytes than in GV oocytes is
the function of cell cycle. This rise in cell cycle function is logical since progression from
GV to MII oocytes is a progression in meiosis cell cycle. This specific rise of protein
synthesis could support the idea that only a range of proteins favourable to survival are
produced while the others are inhibited.
111
Mitochondrial dysfunction
Another cell function affected during oocyte maturation is energy production. During maturation,
the form of mitochondria changes to become more triangular with a hooded end. They present a
dense matrix with relatively few cristae which are retracted at the periphery. This structure is
indicative that mitochondria are immature and have a low efficiency in energy production [23, 24].
This is reflected in our results, as we found that most of the respiratory complexes subunits are less
expressed during maturation, increasing mitochondrial dysfunction. Oxidative phosphorylation is
also seriously affected, supporting the observed mitochondrial phenotype (Figure 3-8).
Some could argue that oxidative phosphorylation could not be downregulated during
maturation since ATP production is absolutely necessary for oocyte survival. Many authors
have already discussed the importance of this unique phenotype in oocytes and its impact
on metabolism [39-41]. All agree that immature mitochondria cannot be associated with a
complete cessation of energy production which will inevitably provoke cell death. It seems
that the low respiratory chain efficiency is counteracted by the high number of
mitochondria in oocytes. At least in mice, despite the low ATP production of each
individual mitochondrion, the large number of mitochondria allows the production of most
of the ATP used by the oocyte [42]. Large-scale ATP quantity variations are observed in
MII oocytes [39]. Oocytes containing few mitochondria (between 20 000 and 60 000
mitochondrial genome copies) are associated to low metabolic capacity and a higher rate of
fertilization failure [40]. Thus, if the number of mitochondria in the oocyte is not sufficient
to counterbalance their weak efficiency, essential processes in the cell will be prevented
and oocyte competence will be compromised.
Nevertheless, low efficiency of mitochondria could have an important role in oocyte
competence. Oocytes containing a very high number of mitochondria or containing
mitochondria highly competent for oxidative metabolism could be unable to regulate their
production of reactive oxygen species (ROS), which could lead to an irreversible toxicity
during maturation or later during development. A premature failure in embryo development
in mutant mice has been linked to high levels of oxidative phosphorylation and ATP
production [43]. A high concentration of ROS could provoke cytoplasm deterioration and
induce apoptosis [41]. By lowering oxidative phosphorylation, mitochondrial dysfunction
112
causes a reduction in the production of ROS. Therefore, immature mitochondria in the
oocyte and in the early embryo could be vital for developmental competence. In this way,
our results support the hypothesis of many others: for the first time, oxidative
phosphorylation downregulation during maturation is supported at what is nearly the
proteomic level. Mitochondria could not be efficient if essential mRNAs were no longer
translated.
The secret for oocyte survival seems to rely on tightly coupled supply and demand of ATP [25].
Many processes during oocyte maturation have high energy requirements, but a specific spatial
redistribution of mitochondria may help meet such local demands. Indeed, such a continual
redistribution of mitochondria occurs during oocyte maturation, and proceeds in accordance with
differential ATP requirements [25-27]. This balance between energy production and energy
consumption keeps intracellular ATP levels stable while avoiding superfluous ROS production.
Moreover, it has been demonstrated that localised mitochondrial activity could be stimulated by
molecular mechanisms. For example, at fertilization, spermatozoid entry in the oocyte could
stimulate local mitochondrial respiration in order to provide the surging ATP needs associated with
fertilization (cortical granules exocytosis, polar body extrusion, calcium homeostasis) [25].
It is interesting that mitochondrial preparation in the oocyte seems to have an important impact in
later development. Blastocysts produced from immature oocytes aspirated post-mortem appeared to
carry mitochondrial dysfunctions that are not present in blastocysts produced from immature
oocytes collected from FSH-stimulated follicles (obtained by transvaginal ovum pick-up).
Moreover, while the transcriptomes of these two kinds of blastocysts are very similar, the blastocyst
yields on day 7 are highly superior (55% vs 30%) with FSH-stimulated follicles. Thus, it seems that
some mitochondrial preparation is necessary before oocyte maturation and that the absence of this
preparation phase could impact on blastocyst quality later in development.
Oocyte metabolism
ADP:ATP ratio is a useful tool to evaluate cell status according to proliferation, growth
arrest, apoptosis or necrosis in cell. Our results support the idea that the matured oocytes
are more quiescent than GV oocytes. The slightly increased level of ATP in MII compared
to GV without change in ADP level are signs of growth arrest. This means that the oocyte
lower its metabolism, leading to lower ATP consumption and slightly ATP accumulation in
113
the cytoplasm. The slight decrease observed in ADP:ATP ratio is yet not significant. In this
case, growth arrest could represent the entry in a static stage where the oocyte is awaiting
fertilization.
It could seem contradictory that ATP level increases in matured oocyte despite the shift to
potentially less efficient ATP production due to mitochondrial dysfunction. Nevertheless,
this situation has already been observed in cells suffering from less efficient ATP
production. In response to hypoxia, cardiomyocyte cells tend to decrease ADP:ATP ratio
despite a shift from oxidative phosphorylation to less efficient anaerobic respiration [44].
Just as we conclude that matured oocytes reduced their metabolism, the authors conclude
that cells reduced ATP utilization by reducing contractility therefore, reducing their
metabolism. They supposed that cells tend to conserve ATP as a temporary measure to
maintain viability during transient hypoxic episodes. In the oocyte, ATP could be
conserved to maintain viability until EGA since it is at this moment that mitochondria
recover their usual form and should recover their full ability to produce ATP.
3.6 The Quiet Oocyte
The quiet embryo hypothesis is well known. It posits that the embryo viability benefits
more from a quiet metabolism than from an active metabolism [45]. It is based among
others things on the observation that embryos with a lower amino acid turnover are more
likely to survive compared to embryos that have a higher amino acid turnover, which fail to
develop [46]. The major use of amino acid in embryo is protein synthesis. The less
metabolically active embryos lower their amino acid turnover, thus lower their protein
synthesis, and are more apt at surviving until the blastocyst stage and implantation [45, 47,
48].
Our results tend to show that the quiet hypothesis could be applied even earlier, during
oocyte maturation. It is well known that the fully grown oocyte is transcriptionally silent
but our results point out that the oocyte also undergoes a translational reduction. This
reduction could be associated to limited ribosomal turnover and inhibition of translation
initiation mechanisms. A minimal translation, concomitantly to a well orchestrated protein
synthesis program, could allow the synthesis of specific essential proteins for oocyte
114
maturation and, later, for early development. Furthermore, lowering translation ensures that
energy demand is reduced significantly since translation is a process which demands large
amounts of energy. Indeed, protein synthesis is the costliest process according to energy
ATP demand [28, 29]. It is well known that hypoxia induces rapid inhibition of mRNA
translation to favour energy conservation in the face of reduced capacity for oxidative
metabolism [49, 50]. This corresponds well to the situation observed in oocytes since
mitochondria are highly dysfunctional and oxidative phosphorylation is greatly reduced.
Therefore, the reduction in mRNA translation may be crucial to answer to the new situation
of low energy production in the oocyte and favour the quietness of the oocyte.
The low energy production caused by mitochondrial dysfunction could be necessary for
oocyte survival. Lowering ATP production could be a good mechanism to ensure that the
oocyte lowered its metabolism by reducing the highest energy consuming process like
translation. Evidently, minimal energy needs are necessary for oocyte maturation. But
lowering energy turnover (need/production) seems to allow the oocyte to enter in a quiet
mode that could be essential for survival. Moreover, a high ATP production by oxidative
phosphorylation is harmful to the oocyte since the ROS production induces a cellular stress
response and prevents the oocyte from maintaining quietness. Indeed, the reduction in
protein synthesis and in energy production could underline an entry in latency.
3.7 Methods
All chemicals were purchased from Sigma, Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) unless
otherwise indicated.
Oocyte preparation
Oocyte collection and maturation were performed as described previously [19]. Briefly,
cumulus oocytes complexes (COC) having a minimum of five layers of cumulus were
washed in HEPES-buffered Tyrode’s medium supplemented with bovine serum albumine,
pyruvic acid and gentamycin. Oocytes at germinal vesicle (GV) stage were collected,
pipetted up and down to remove cumulus cells then washed in PBS containing 100 μg/ml
of cycloheximide (CHX) to stop translation and to prevent ribosomal run-off. To obtain
metaphase II oocytes (MII), groups of 50 COC were placed in four-well petri dishes in
115
maturation medium under mineral oil and incubated during 24 hours at 38.5°C with 5%
CO2. MII oocytes were denuded the same way as GV oocytes. Denuded oocytes (DOs)
were produced by denuding COC at the GV stage and allow DO to mature for 24 hours in
the same way as MII oocyte. Cocultured DOs (coDOs) were obtained by coculturing DOs
with COC in a 1:1 ratio for 24 hours. Groups of 75 GV or MII oocytes were collected for
polyribosomal fractionation. For ATP/ADP ratio assays, groups of 5 oocytes were obtained
in the same way.
Carrier preparation, crosslinking and neutralization
Fractionation methods using UV-distribution profiles on sucrose density gradients require
micrograms of RNA. Unfortunately, since each oocyte contains as little as 340 pg of total
RNA [21], it is practically impossible to obtain enough oocytes to produce a visible
polyribosome specific UV-distribution profile. To counter this problem, exogenous RNA
from drosophila SL2 cells was used as a carrier. Drosophila cells were chosen due to their
phylogenetic distance from cattle and their easy and rapid production. Drosophila RNAs
were extracted as previously described [19]. Briefly, drosophila SL2 cells were cultured at
28°C, starved for 3 hours in serum-free medium then stimulated for 150 minutes by adding
33% fresh medium and 6,25% of heat-inactivated fœtal calf serum. Cells were harvested by
centrifugation and lysed in polyribosome lysis buffer by triturating. The homogenate was
clarified by centrifugation. Formaldehyde was added to the supernatant at a final
concentration of 3,37% for 45 minutes on ice. Residual formaldehyde was neutralized by
adding 1,5 M of Tris-HCL pH 8,7 for 20 minutes on ice then conserved at -80°C until
processing.
Polyribosomal sample preparation
Oocytes used for polyribosomal fractionation were strongly vortexed with 1,0 mm zirconiasilica beads in 50 μl of polyribosome lysis buffer to break the bovine zona pellucida. After
lysis, 50 μl of drosophila carrier sample was mixed to the dissolved oocytes and was then
transferred in a new tube to discard the beads. Cell debris were removed by centrifuging at
12,000 x g for 20 minutes at 4°C. Each sample was loaded on a 4 ml linear 15%-45%
sucrose gradient generated using a SG-15 gradient maker (Hoefer, Holliston, MA, USA).
116
Sucrose solutions were prepared in isotonic buffer made of 150 mM KCl, 1,25 mM MgCl2
and 50 mM Tris adjusted to a pH of 8,7. The linear gradients were kept at 4°C until use.
Once the bovine-drosophila mixed RNA was drop off on the top of the sucrose gradient, it
was ultracentrifugated for 3 hours at 34,000 rpm using a SW 60 Ti rotor (Beckman Coulter,
Brea, CA, USA). The gradients were processed using a BR-188 Density Gradient
Fractionation System (Brandel, Gaithersburg, MD, USA). Fractions of 350 μl were
collected with continuous monitoring of absorbance at 254 nm using an Isco UA-6 detector
(Teledyne Isco, Lincoln, NE, USA). Each fraction was collected directly in 12 tubes
containing 428 μl of 5.25 M guanidinium thiocyanate (pH 5.5) and 2 μl (5 μg/μl) of linear
polyacrylamide (Ambion, Austin, Texas, USA) that acts as an RNA co-precipitant.
Fractions corresponding to polyribosomal RNA were defined according to the UVdistribution profile and pooled in 30 ml Corex tubes. To allow additional normalization, 1
μl of 1/10,000 ERCC spikes was added to the polyribosomal sample. NaOAC 3M ph 5,5
and 100% ethanol were added to allow RNA precipitation. Samples were left overnight at 20°C. RNA precipitates were then re-suspended in the extraction buffer provided in the
PicoPure RNA extraction kit (Life Science) and extracted with this kit. This step allows the
discarding of most of the drosophila mRNA since the cross linked RNAs are not retained
on the column [19].
Microarrays
Polyribosomal mRNA samples were amplified by in vitro transcription using RiboAmp HS
plus RNA amplification kit (Life Science) to obtain antisense RNA. 825 ng of antisense
RNA was labelled using ULS Fluorescent Labeling Kit (Kreatech) and hybridized on a
microarray slide. The microarray slides were Agilent-manufactured EmbryoGENE slides
[51] modified to include 208 probes corresponding to 13 drosophila genes with 2 different
sequences repeated 8 times for each drosophila candidate. These probes were used for data
normalisation. Slides were hybridized for 17 hours at 65°C then washed for 1 minute in
gene expression wash buffer 1, 3 minute in gene expression buffer 2 then 10 seconds in
100% acetonitrile and 30 seconds in stabilization and drying solution (Agilent).
Immediately after the washing step, the hybridized slides were scanned using
PowerScanner (Tecan) and analysed with Array-pro 6.3 (MediaCybernetics).
117
Microarray normalization and analysis
Intensities within each array were normalized using a method inspired by [52] using the
drosophila probes as controls. First, a loess curve was fitted over the differences in intensity
between the drosophila probes on each array and their inter-array means. These loess
curves were then subtracted from the intensity distribution of each array. Intensities were
further subjected to scale normalization using the normalizeBetweenArrays method from
the Limma package [53] to yield the final normalized data.
To determine which transcripts are present within each maturation stage, we calculated the
average intensity of each probe across all arrays representing the same condition.
Background signal was estimated in a similar way, using Agilent negative control probes.
To increase the stringency, we labeled a transcript as "present" if its average intensity
minus 2 standard deviations (SD) was above the average intensity of negative control
probes plus 4 SD. Fold-changes were then calculated using the linear model provided by
the lmFit and ebayes_fit methods of the Limma package. Genes were considered
differentially expressed if they showed an absolute log ratio above one and had a p-value
below 0.01.
All raw data and analysis scripts for this analysis are available at http://embbioinfo.fsaa.ulaval.ca/bioinfo/html/Scantland2013/.
Enrichment analysis
Ingenuity Pathway Analysis (IPA, Ingenuity Systems, www.ingenuity.com) was used for
data analysis. The software allows identifying functions and canonical pathways that are
the most significant in the data set. The p-value is calculated with the right-tailed Fisher’s
Exact Test. This test allows asking if the dataset is significantly enriched in molecules with
a particular annotation. The significance value is a measure of the risk that the association
between a dataset and a function or a canonical pathway is due to random chance. In
canonical pathway analysis, moreover than the p-value, the software allows getting a ratio
of the number of molecules from de dataset that map to the canonical pathway displayed.
Visual representations are also obtained with this system. Each molecule is presented in a
118
color code. Green and red symbol represented genes respectively down- and up- regulated
in MII compared to GV. Gray symbols represented genes with significant but not different
expression between conditions and white symbols represented genes that are not present on
the microarray. A fold-change cut-off of 2.0 and a P value < 0.05 were used to identify
significantly differentially regulated transcripts in each dataset.
Real Time-PCR
To validate candidates identified during microarrays analysis, an aliquot of the amplified
RNA sample was reverse transcribed using qScript Flex cDNA synthesis kit (Quanta). The
use of random primers instead of oligo dT primers was necessary since the amplification
produced antisens RNA. For real-time PCR, primer sequences were designed in order to
obtain short amplicons (less than 120 nuceotides) near the poly(A) tail to account for the
short products obtained after 2 rounds of mRNA amplification. The PCR products were
purified with QIAquick PCR purification kit (Qiagen) and were sequenced to demonstrate
specificity. A standard curve from 0,1 pg to 0,01 fg was produced to allow relative
quantification. Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche) was used to
quantify the sample with Light Cycler 2.0. The acquisition temperature of each product was
determined according to the single melting peak on the melting curve (Table 3-3). Data
normalisation could not be performed across oocyte maturation stages using usual
housekeeping genes since their relative abundance fluctuates between stages [30, 54]. Thus,
the most stable remaining drosophila genes were used to normalize the candidates.
ADP:ATP ratio
The ATP and ADP content of GV and MII oocytes was measured using the commercial
EnzylightTM ADP:ATP ratio assay kit (Bioassay systems, Hayward, CA) based on the
luciferin-luciferase reaction. Briefly, groups of 5 oocytes were collected. All oocytes were
snap-frozen by liquid nitrogen in a maximum of 10 μl of PBS. Just after thawing, around 10
zirconia-silica beads were added to the sample and vigorously vortexed to blow up the
oocytes and allow the release of oocyte component. The 10 μl were then transferred in a
96-wells plate and 90 μl of ATP reagent was added to each sample. ATP levels were
measured after 1 min (Relative luminescence unit, RLU A). To measure ADP levels, the
119
samples were read again after 10 min (RLU B) then 5 μl of ADP reagent was added. The
samples were read again after 1 minutes (RLU C). ADP levels were calculated by RLU C –
RLU B.
ATP and ADP were measured using a luminometer (BMG Labtech, FLUOstar Omega,
Cary, NC). A mixed seven-point standard curve (64 pmol ADP with 64 pmol ATP, 0 pmol
ADP with 32 pmol ATP, 2 pmol ADP with 16 pmol ADP, 4 pmol ADP with 8 pmol ADP,
8 pmol ADP with 4 pmol ATP, 16 pmol ADP with 2 pmol ATP and 32 pmol ADP with 0
pmol ATP) was included in each assay. The quantitative ATP and ADP content were
determined according to the linear regression of their respective standard curve. ADP:ATP
ratios were determined according to the linear regression of the standard curve obtained
with the different non-negative ratios.
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43.
44.
45.
46.
47.
48.
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51.
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123
Figure 3-1 Polyribosomal profiles.
Polyribosomal profiles obtained with drosophila exogenous mRNA combined to either A) 75 GV
oocytes or B) 75 MII oocytes.
124
Figure 3-2 Venn diagram of expressed and differentially expressed genes between GV or MII
oocytes.
125
Figure 3-3 Comparison analysis of cellular functions.
Comparison analysis of cellular functions affected by oocyte maturation. Protein synthesis and
energy production are greatly diminished while cell cycle functions are upregulated in MII. The xaxis displays the -log of p-value which is calculated by Fisher's exact test right-tailed. The
significance threshold correspond to –log(p-value at 0,05).
126
Figure 3-4 Comparison analysis of canonical pathways.
Comparison analysis of canonical pathways affected during oocyte maturation.EIF2 signaling,
oxydative phosphorylation and mitochondrial function are greatly diminished in MII oocytes. The
x-axis displays the -log of p-value which is calculated by Fisher's exact test right-tailed. The
significance threshold correspond to –log(p-value at 0,05).
127
Figure 3-5 RT-PCR validations.
Differentially expressed candidate genes associated with mitochondrial function (ATP5A1,
ATP5C1, NDUFA8, NDUFB2), oxidative phosphorylation (The precedents + ATP5G1,
ATP6V0D1, TCIRG1 ) and EIF2 signaling (EIF3M, RPL18). * is significant, ** is highly
significant, T is tendency. EIF3M: eukaryotic translation initiation factor 3, subunit M; ATP5A1:
ATP synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, alpha subunit 1; ATP5C1: ATP
synthase, H+ transporting, mitochondrial F1 complex, gamma polypeptide 1; ATP5G1: ATP
synthase, H+ transporting, mitochondrial Fo complex, subunit C1 (subunit 9); ATP6V0D1:
ATPase, H+ transporting, lysosomal 38kDa, V0 subunit ; NDUFA8: NADH dehydrogenase
(ubiquinone) 1 alpha subcomplex, 8; NDUFB2: NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 beta
subcomplex, 2; RPL18: Ribosomal protein L18 ; TCIRG1: T cell, immune regulator 1, ATPase, H+
transporting, lysosomal V0 protein A3
128
Figure 3-6 ATP and ADP:ATP ratios during oocyte maturation.
Comparison of ATP and ADP:ATP ratio between GV oocyte and MII oocyte.
129
Figure 3-7 Reduction of EIF2 signaling during oocyte maturation.
Different molecules associated with translation initiation down-regulated in MII oocytes compared
to GV oocytes. Schematic representation of mRNA expression. Color intensity represents fold
change intensity. Red color represents downregulated gene while green color represents
upregulated gene. White color is for non differentially expressed gene. EIF2: eukaryotic translation
initiation factor 2; EIF3: eukaryotic initiation factor3; EIF4A: eukaryotic initiation factor 4a;
EIF4E: eukaryotic translation initiation factor 4E; EIF4G: eukaryotic translation initiation factor
4G ; EIF5: eukaryotic translation initiation factor 5; PABPC1: poly(A) binding protein, cytoplasmic
1 ; PAIP1: poly(A) binding protein interacting protein 1 ; 40S: eukaryotic small ribosomal subunit ;
60S: eukaryotic large ribosomal subunit; 80S: eukaryotic ribosome.
130
Figure 3-8 Reduction of oxidative phosphorylation during oocyte maturation.
Schematic representation of reduction in translation of the 5 oxydative phosphorylation complexes
during oocyte maturation. Color intensity represents fold change intensity. No gene are upregulated.
131
Table 3-1 Log-ratios and p-values associated with molecules related to mitochondrial function
with schematic representation of the associated mitochondrial respiratory complexes.
Complex 1 : NADH deshydrogenase
Complex 3: Cytochrome bc1 complex
Gene symbol
Gene symbol
Log-ratio
p-value
-1,037
-2,251
-4,128
-2,770
-1,370
-2,015
-3,760
-1,260
-1,381
0,018
0,032
0,008
0,011
0,009
0,011
0,022
0,006
0,003
CYC1
-1,042
0,020
UQCR11
-1,899
0,022
Complex 4: Cytochrome oxydase
NDUFB8
-1,636
0,009
NDUFB9
-2,458
0,016
NDUFS2
-2,728
0,007
NDUFS3
-2,200
0,035
NDUFS5
-3,862
0,012
NDUFS7
-2,189
0,003
NDUFV2
-3,645
0,013
Complex 2 : Fumarate reductase
COX5A
-3,542
0,006
COX5B
-3,124
0,010
COX6B1
-1,933
0,008
COX6C
-1,525
0,020
COX7A1
-1,541
0,016
COX7A2
-2,544
0,022
COX7A2L
-1,568
0,013
COX6A1
-3,343
0,015
SURF1
-2,713
0,005
Complex 5: ATP synthase
NDUFA11
NDUFA5
NDUFA8
NDUFA9
NDUFAB1
NDUFB11
NDUFB2
NDUFB4
NDUFB5
Gene symbol
SDHA
SDHB
SDHC
132
Log-ratio
-1,939
p-value
0,006
-2,874
-1,619
0,005
0,012
Gene symbol
COX4
Log-ratio
Log-ratio
-1,313
p-value
p-value
0,004
Gene symbol
Log-ratio
p-value
ATP5A1
ATP5B
ATP5C1
ATP5G1
ATP6V0D1
TCIRG1
-1,670
-1,223
-2,195
-3,892
-3,860
-3,996
0,009
0,010
0,006
0,018
0,018
0,008
Table 3-2 Log-ratios and the p-value associated with different molecules in EIF2 signaling pathway
Eukaryotic initiation factor
Gene symbol
Log-ratio
EIF3B
1,514
EIF5
-1,647
EIF2S1
-1,193
EIF3C
-3,874
EIF3D
-1,156
EIF3F
-3,236
EIF3I
-2,006
EIF3J
-1,233
EIF3K
-1,854
EIF3M
-4,37
EIF4E
-1,477
p-value
6,39E-03
6,62E-03
3,97E-03
1,28E-02
3,33E-02
4,73E-03
8,65E-03
1,83E-02
2,40E-03
2,15E-02
1,44E-02
Poly(A) binding protein related
Gene symbol
Log-ratio
p-value
PABPC1
-1,347
9,31E-03
PAIP1
-1,216
6,80E-03
40S ribosomal subunit
Gene symbol
Log-ratio
RPS5
-2,696
RPS6
-2,774
RPS7
-1,046
RPS8
-1,301
RPS11
-1,209
RPS13
-2,062
RPS15
-1,797
RPS24
-2,383
RPS15A
-1,17
RPS27L
-1,736
RPS3A
-1,962
RPS4Y1
-3,808
p-value
7,06E-03
9,67E-03
4,76E-03
8,70E-03
1,65E-02
2,08E-03
6,03E-03
2,62E-02
4,89E-02
2,24E-02
3,06E-02
9,55E-03
60s ribosomal subunit
Gene symbol
Log-ratio
RPL3
-1,774
RPL4
-1,974
RPL6
-1,768
RPL7
-2,584
RPL8
-1,489
RPL12
-2,608
RPL13
-2,851
RPL15
-2,76
RPL18
-3,023
RPL23
-1,185
RPL24
-2,286
RPL26
-2,896
RPL28
-1,837
RPL31
-1,188
RPL34
-2,977
RPL36
-1,721
RPL37
-1,988
RPL13A
-1,074
RPL18A
-1,153
RPL23A
-2,491
RPL27A
-1,351
RPL37A
-1,109
RPL38
-2,952
RPL7L1
-3,365
RPLP1
-1,856
RPLP2
-1,559
p-value
1,15E-02
9,14E-03
4,48E-03
7,77E-03
4,60E-03
1,48E-02
9,76E-03
2,61E-02
1,75E-02
2,04E-02
1,74E-02
1,16E-02
1,58E-02
4,19E-03
1,24E-02
1,21E-03
1,57E-02
2,72E-02
2,88E-02
8,90E-03
1,79E-03
1,78E-03
9,11E-03
6,14E-03
9,33E-03
4,36E-03
133
Table 3-3 Primer sequences for QPCR
Gene symbol
ATP5A1
ATP5C1
NDUFA8
NDUFB2
ATP5G1
ATP6V0D1
TCIRG1
RPS3
Primer sequence 5' - 3'
F: TCACGTTATCAGCCAACATCAGGC
R: CAGCTTTGCATCTGACTCTTCTGAG
F : TGACTCTGACATTCAATCGCACCC
R : TTTCATTAGTCCAGAGCCGCAGCA
F : GTTTGACGAGTGTGTGCTGGACAA
R : GCCTTGCTCTTGAGTGATAGGGAT
F : TGCTGTGCTGGGTCACTTTCCTTA
R : TTGGCAAGAGCTGAGCCTCTGTTT
F : TGGCAGCTTGATCATTGGCTATGC
R : AAGGCGACCATCAAACAGAAGAGC
F : CTCCCACACCAAGAATGGACCAAG
R : AGTGACCACATGCTTCTCAGACAC
F : AGCAGGAAACAAATTCTGAGGCGG
R : AAACTGTATCGGAAGCACCATCCC
F: TCGTCGATGGCCTGATGATCCATT
R: TGAGGGCAACTCTTTCAGCTAGTC
Amplicon
Annealing/
Accession number
size (bp) melting temp. (°C)
82
57/76
NM_174684.2
91
58/81
NM_001075136.1
125
58/84
NM_175826.3
109
59/82
NM_175828.2
120
58/83
NM_176649.2
102
58/85
NM_174505.2
96
57/83
NM_001075634.1
333
60/87
NM_057284.5
Gene names : ATP5A1, ATP synthase alpha subunit 1; ATP5C1, ATP synthase subunit C1 (subunit 9);
NDUFA8, NADH dehydrogenase 1 alpha subcomplex 8; NDUFB2, NADH dehydrogenase 1 beta
subcomplex 2; ATP5G1, ATP synthase gamma polypeptide 1; ATP6V0D1, ATPaseV0 subunit d1; TCIRG1,
T-cell, immune regulator 1; RPS3, Ribosomal protein S3 (Drosophila melanogaster)
134
4. Chapitre 4. Source alternative d’ATP durant la
maturation ovocytaire bovine.
Sara Scantland, Éric Fournier, Dominic Gagné, Claude Robert
Cet article n’a pas encore été soumis pour publication.
135
4.1 Résumé
Introduction : L’ovocyte a besoin de quantités importantes d’ATP afin de permettre la
maturation, la fécondation et, plus tard, le développement précoce. Toutefois, la production
énergétique dans l’ovocyte fait face à de nombreuses contraintes : les mitochondries y
prennent une forme immature peu encline à la phosphorylation oxydative et la glycolyse y
est quasi-absente, l’ovocyte devant en obtenir les substrats à partir des cellules de cumulus.
Pour élucider la façon dont l’ovocyte comble ce déficit énergétique apparent durant cette
période cruciale de son développement, nous nous sommes penchés sur la voie de
récupération des adénosines afin de déterminer si celle-ci pourrait représenter un
mécanisme alternatif de production d’énergie. Résultats : Plusieurs enzymes de la voie de
récupération des adénosines (les adénylates kinases et les créatines kinases) sont présentes
et actives durant la maturation ovocytaire. Lorsque l’on inhibe leur fonction, l’ovocyte
présente un phénotype énergétique d’apoptose, ce qui supporte l’hypothèse que cette voie a
un rôle important dans la production d’énergie. Afin de stimuler la voie de récupération des
adénosines, des sources considérables d’AMP doivent être disponibles. Lorsque les
ovocytes sont cultivés sous forme dénudée ou lorsque l’enzyme responsable de la
dégradation de la queue poly(A) est inhibée, les quantités d’ATP disponible pour la
maturation ovocytaire chutent drastiquement. Ces résultats soutiennent l’idée que les
cellules de cumulus peuvent transférer des molécules menant à l’accumulation d’AMP et
d’ATP dans l’ovocyte et que la dégradation de la queue poly(A) représente une source
importante d’AMP. Lorsqu’un déficit énergétique est provoqué dans la cellule, l’ajout
d’AMP au milieu de culture permet de ramener les niveaux d’ATP au dessus de la normale
et d’obtenir un phénotype de sauvetage. Conclusion : L’adénylate kinase et la créatine
kinase sont deux enzymes qui conduisent à la formation de novo d’ATP dans l’ovocyte.
Pour y arriver, les cellules de cumulus transfèrent des molécules menant à l’accumulation
d’AMP dans l’ovocyte. Les molécules d’AMP libérées suite à la dégradation de la queue
poly(A) des ARNm durant la maturation jouent également un rôle important dans ce
processus.
136
4.2 Abstract
Background : Oocytes need large amounts of ATP to allow maturation, fertilization and,
later on, early embryonic development. However, energy production within the oocyte
faces many obstacles: mitochondria take on an immature form with limited oxidative
phosphorylation potential, and glycolysis is almost absent, with oocytes having to obtain its
sub-products from the cumulus. To figure out how the oocyte paliates this energetic deficit
during this crucial stage of its development, we turned ourselves toward the adenosine
salvage pathway to determine if it might represent an alternative mechanism for energy
production. Results : Many enzymes from the adenosine salvage pathway (adenylate
kinases and creatine kinases) are present and active during oocyte maturation. When they
are inhibited, oocytes show an energetic phenotype of apoptosis. This supports the
hypothesis that this pathway plays an important role in energy production. To stimulate the
adenosine salvage pathway, considerable sources of AMP must be available. When oocytes
are cultured under denuded form or when the enzyme responsible for degradation of the
poly(A) tail is inhibited, available quantities of ATP fall drastically. These results support
our hypothesis that cumulus cells can transfer molecules which can lead to the
accumulation of AMP and ATP within the oocyte and that degradation of the poly(A) tail
represents an important source of AMP. When an energetic deficit is induced within the
cell, addition of AMP to the culture media allows the restoration of ATP levels above the
normal and creates a rescue phenotype. Conclusion : Adenylate kinases and creatine
kinases are both enzymes which lead to the de novo formation of ATP within the oocyte.
To achieve this, cumulus cells must transfer molecules leading to the accumulation of AMP
within the oocyte. AMP molecules released by the degradation of the poly(A) tail of
mRNAs during maturation also play an important role in this process.
137
4.3 Introduction
Mitochondria are essential organelles that act as the principal energy source of eukaryotic
cells through oxidative phosphorylation (OXPHOS). However, just as the oocyte is in
many ways a peculiar cell, it also is peculiar cell at the mitochondrial level. During
maturation, oocytal mitochondria are transforming, passing from an orthodox form to a
hooded one characterized by an increased electron density within its matrix and containing
a reduced number of cristae which are retracted at the periphery of the mitochondria [1-4].
Since the cristae are the principal site of OXPHOS, energy production by the mitochondria
is reduced in this immature form [2, 5, 6]. These hypotheses are also supported by the
results obtained through polyribosomal mRNA analysis presented in Chapter 3 where
polyribosomal mRNA analysis reveals mitochondrial dysfunction and a great reduction of
OXPHOS. This immature mitochondrial phenotype persists at least up to the 8 to 16 cells
stage embryo in the bovine [2] and up to the late morula stage in humans [5]. These
observations intrigued many authors, who then sought to evaluate ATP production within
mitochondria during oocyte maturation and early embryo development [2, 5-7]. However,
their conclusions are often contradictory. According to [8], mitochondrial OXPHOS is
responsible for up to 96% of ATP synthesis in the precompaction stages of embryo
development, considering that all the oxygen uptake is use for OXPHOS. According to [9],
around 63% of mitochondrial respiration was coupled to ATP synthesis in GV oocyte
whereas this percentage drops to 43% during maturation. This percentage seems to
continue to drop after fertilization since [6] evaluates at 30% the oxygen uptake consumed
through OXPHOS-dependant processes in cleaved embryos.
Generally, only two ATP synthesis pathways are taken into consideration when thinking
about energy production within a cell: OXPHOS, directly associated with the respiratory
chain of the inner mitochondrial membrane , and glycolysis, a cytoplasmic pathway that
produces smaller but nevertheless important levels of ATP [8]. Yet, it is well known that
both glycolysis and mitochondrial OXPHOS are impaired within oocytes and during early
embryo development (for review, [10]). How then do oocytes and early embryos fulfill the
high energetic needs associated with maturation and early development?
138
To answer this question, we investigate here a previously unexplored potential driver of
ATP synthesis, the adenosine salvage pathway. This mechanism drives the phosphorylation
of AMP to ADP and then to ATP. Two important AMP sources are available during oocyte
maturation: the degradation of cAMP transferred by cumulus cells during the onset of
maturation [11, 12] and mRNA deadenylation which occurs concomitantly with the
reduction in protein synthesis [13, 14]. Two enzymes could play a key role in alternative
ATP production. The first one, adenylate kinase (AK), catalyzes reaction (1):
AMP + ATP ↔ 2 ADP (1)
The second one, creatine kinase, take the products of reaction (1) and transform them into
ATP concomitantly with the transformation of phosphocreatine (PCr) into creatine (Cr)
(reaction 2):
ADP + PCr ↔ ATP + Cr (2)
We present here evidence that AKs and CKs should be considered as important enzymes in
the process of ATP production during oocyte maturation and that the large quantities of
AMP provided through cumulus cells transfer and mRNA deadenylation act as drivers of
this same process (Figure 4-1). We postulate that while adenosine salvage uses one ATP in
its first reaction, the two ATP molecules created by the second one lead to de novo ATP
synthesis and an increased combined ADP:ATP pool which is essential to sustain the
oocyte in its peak energetic needs. This AMP driven mechanism could be very active in
oocytes and could supplement mitochondria ATP production.
4.4 Results
Experiment 1. Impact of OXPHOS inhibitor on ATP production in metaphase II
oocyte
To determine the importance of mitochondrial ATP production during oocyte maturation, a
mitochondrial inhibitor was added to COC (cumulus-oocyte complexes) and DO (denuded
oocytes). Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) reduces the ability of ATP
synthase to function optimally by uncoupling the proton gradient that is established in the
electron transport chain. Thus, the link between the respiratory chain and the
139
phosphorylation system is cut and ATP production is impaired [15]. Following 24 hours of
culture with CCCP, ATP production in COC and in DO is highly impaired (Figure 4-2 A, B
respectively). The OXPHOS inhibitor also provokes a higher ADP:ATP ratios in COC and
in DO, indicating that the oocyte is near apoptosis (Figure 4-2C, D).
Experiment 2. Evaluation of the presence of adenylate kinase, creatine kinase and
creatine transporter mRNA on polyribosomal fraction
The presence of AK, CK and creatine transporter (SLC6A8) mRNAs on polyribosomal
fraction during oocyte maturation was evaluated after polyribosomal extraction,
amplification and hybridization on microarrays. To increase the stringency, we labeled a
transcript as "present" in an array if its average intensity minus 2 standard deviations (SD)
was above the average intensity of negative control probes plus 4 SD. The transcript was
considered as present in the oocyte stage only when it met this threshold in at least 3 arrays
out of 4. According to these criteria, 5 AKs (AK2, AK3L1, AK5, AK6 and AK7), the 3
CKs (CKB, CKMT1, CKMT2) and SLC6A8, the creatine transporter, are present during
oocyte maturation (data not shown). Three QPCR validations (AK6, CKB and CKMT1)
were performed to confirm these results (Figure 4-3). The presence of all evaluated
candidates was validated in GV and MII oocytes.
Experiment 3. Evaluation of adenylate kinase and creatine kinase activity during
oocyte maturation
Since mRNA translation is not proof of enzyme activity, we sought to demonstrate the
activity of AK and CK during oocyte maturation by adding inhibitors of those enzymes in
the culture media and measuring their impact on ATP production. Either sodium fluoride
(NaF, an AK inhibitor) or iodoacetamide (IAN, a CK inhibitor), were added for 24 hours
during oocyte maturation. The addition of these inhibitors reduced the levels of ATP
available during oocyte maturation drastically, both in COC and DO culture (Figure 4-4 A,
B). ADP:ATP ratio elevation similar to the one observed for OXPHOS inhibition is also
observed with the adenosine salvage pathway inhibitors, once again implying that apoptotic
processes have been engaged (Figure 4-4 C, D). Moreover, creatine kinase activity was
confirmed by creatine kinase assay during oocyte maturation (Figure 4-5). The results
140
clearly show an increase in creatine kinase activity during maturation despite the
translational decrease of the creatine kinase mRNAs evaluated by QPCR.
Experiment 4. Phosphocreatine impact during oocyte maturation
Since creatine kinase is present and active during oocyte maturation, we speculate that
addition of phosphocreatine in the culture media could enhance ATP production in
situation where the oocyte is lacking energy (DO). As expected, the addition of
phosphocreatine significantly enhances ATP production (Figure 4-6). The ADP:ATP ratio
is also improved and is lower than the control, DO.
Experiment 5. Cumulus cells impact during oocyte maturation
To have a significant impact on ATP production, the adenosine salvage pathway must have
important sources of AMP. It is well known that cumulus cells transfer cAMP to the oocyte
through gap junctions that are present at the end of cumulus cell projection. Thus, we
measured the impact on ATP production of cultured oocytes in a denuded form. Without
surprise, ATP levels are highly decreased in DO compared to oocytes cultivated under
COC form (Figure 4-7 A). Interestingly, DO cocultured with COC (CoDO) improved their
ATP productions even if the DOs did not make any contact with cumulus cells (s-coDO)
(Figure 4-7 A). To determine if the important drop in ATP production observed in DO was
due to the lack of AMP production from AMPc transfer by the cumulus cell, a rescue
protocol was carried out 1 mM AMP was added to the culture media of DO. The impact of
adding AMP to the culture media was so important that ATP production exceeded ATP
production observed within COCs (Figure 4-7 C). The culture media already contains
some AMP (0.000576 mM) but in concentration much lower than the concentration added.
All the ADP:ATP ratio were in harmony with ATP level, that is when ATP production is
higher, ADP:ATP ratio decrease (Figure 4-7 B, D).
141
Experiment 6. mRNA deadenylation impact during oocyte maturation
Since mRNA deadenylation is important during oocyte maturation and given that mRNA
degradation is constitutively present, the release of adenosines in the form of AMP should
be important within the oocyte. To evaluate the impact of mRNA deadenylation on energy
production during oocyte maturation, poly(A) ribonuclease (PARN), the enzyme
responsible for mRNA deadenylation, was inhibited with 4 mM GTP. An important drop in
available ATP in oocytes cultured under COC form after PARN inhibition was observed.
To prove that this important drop was due to the decrease in the release of AMP, a rescue
protocol was carried out. Twenty minutes after PARN inhibition with GTP, 1 mM AMP
was added to the culture media. Once again, this AMP addition allows for the recovery of
the initial ATP availability within COCs (Figure 4-8 A). ADP:ATP ratio get higher with
PARN inhibition and the rescue allows a partial restore of energy ratio (Figure 4-8 C).
However, when the same experiments were conducted with DO oocytes, the impact of
PARN inhibition on ATP production was not observed (Figure 4-8 B) and no significant
difference was observed in ADP:ATP ratios (Figure 4-8 D).
4.5 Discussion
It is well known that maturing oocytes and early embryos have low capacities for glucose
uptake [16, 17] and that they are missing an important enzyme involved in glucose
catabolism (phosphofructokinase) [18]. Oocyte must therefore rely on cumulus cells to
directly transfer glycolytic products such as pyruvate to the oocyte (for review, see [10]),
losing the ATP generating reactions which would happen upstream of this process.
Moreover, the well established immature phenotype of mitochondria acquired during
oocyte maturation limits ATP production through the OXPHOS process. Nevertheless, this
limited ATP production remains an important energy source for the oocyte [6-8]. One
important hypothesis is that low OXPHOS capacity could be compensated by the enormous
number of mitochondria present in the oocyte, which is estimated to be between 300 000 to
400 000 when measured by transmission electron microscopy [19]. To ensure OXPHOS
elevated ATP production in some localisation where high energy is needed in the oocyte,
the clustering pattern of mitochondria could be highly important [20]. The importance of
142
ATP production by mitochondria is also apparent in our results. The important reduction in
ATP production observed after mitochondrial respiration inhibition (Figure 4-2 A, B)
confirms that OXPHOS is still an important source of energy during oocyte maturation and
this, despite immature mitochondrial phenotype. However, the levels of ATP measured
after OXPHOS inhibition should not be used to estimate the percentage of ATP which is
produced by OXPHOS. In situations where the cell cannot use OXPHOS, one of its first
reactions will be to reduce its ATP usage to survive the initial stress [21, 22]. Nevertheless,
prolonged exposure to the stress, here over 24 hours long, will provoke cell death and is
associated to a major decrease in ATP levels [23]. This explains the higher ADP: ATP ratio
observed when OXPHOS is inhibited: during apoptosis, ATP is consumed without a
concomitant de novo production.
Since ATP levels increase in matured oocytes despite mitochondrial dysfunctions (see
results in chapter 3), we posit that alternative mechanisms are used by the oocyte to fulfill
its ATP requirements without relying on OXPHOS or glycolysis. The adenosine salvage
pathway is one such mechanism, as it could be used to transform the high levels of AMP
and ADP available in the oocyte into ATP. The phosphorylation of AMP into ADP is
known to be performed by adenylate kinases (AK) (reaction 1) while the phosphorylation
of ADP into ATP is usually achieved by pyruvate kinases (purine metabolism, KEGG
pathway, 2.7.4.3 and 2.7.1.40 respectively) [24]. However, pyruvate kinases are glycolytic
enzymes that produce ATP by transforming phosphoenol-pyruvate into pyruvate, an
activity mostly absent in the oocyte [25]. Fortunately, another enzyme which can produce
ATP from ADP while concomitantly transforming phosphocreatine (PCr) into creatine (Cr)
is creatine kinase (CK), an enzyme well known in muscle and brain to sustain high and
local ATP demand. Its presence has been noted in embryos [26] (reaction 2). The first step
in proving the impact of the adenosine salvage pathway on energy production during
oocyte maturation was to show the presence and activity of its two key enzymes.
The presence of AKs and CKs on polyribosomal mRNAs indicates that they are translated
during oocyte maturation. A reduction in translation levels for two of the three QPCR
candidates was observed in microarrays and confirmed in RT-QPCR validations (Figure
4-3). This reduction is unsurprising given the general reduction in protein synthesis
143
observed during oocyte maturation (see chapter 3). However, this reduction in translation
did not correlate with a reduction in enzyme activity, indicating that the protein could be
stored in the cytoplasm and activated later by protein folding or phosphorylation, according
to the needs of the oocyte. The creatine kinase assays confirm these results, as we observed
an important increase in creatine activity during maturation.
Interestingly, our
measurements of CK presence (microarrays and QPCR results) are analog to the results
obtained in early embryos for CKB, CKM and CKMT1 by [26]. In both oocytes and early
embryos, CKB is the most strongly expressed isoform while CKM is not detected. CKMT1
is highly present in GV oocytes but decreases drastically in MII oocyte (Figure 4.3 C) and
is completely absent in zygote and 2 cell embryos. Thereafter, it is newly synthesized from
4 cell stage and onward [26]. CKB therefore seems to be the most important CK during
oocyte maturation and early embryo development.
AK inhibition using NaF results in an important decrease in the ATP levels available to the
oocyte, proving that this enzyme is active during oocyte maturation and that it could have a
role in energy production. Similarly, CK inhibition by IAN greatly limits ATP production
(Figure 4-4). This result, in addition to the increase in CK activity during oocyte maturation
and the increase in ATP level when phosphocreatine is added to the culture media of DO,
supports the hypothesis of CK activity and involvement in energy production. CK activity
during embryo development has also been studied by [26]. In this study, the authors
showed that the biochemical activity of CKs was constant from the 2- to 8-cell stages
before being significantly reduced at the blastocyst stage, when an high OXPHOS capacity
has been reacquired by the embryo. Like us, they conclude that CKs could represent
important enzymes in embryonic ATP production. Moreover, they discovered that CKs
were associated with the mitotic spindle and could act as creatine shuttles that play a key
role in the local delivery of ATP. There is no reason to believe that this could not also apply
to oocyte maturation.
Once the importance of AKs and CKs on ATP production levels is proven, it is interesting
to determine the AMP sources that allows for the adenosine salvage pathway to function. It
is well known that cAMP is highly transferred from the cumulus cells to the oocyte through
the junctions that persist for the first hours of maturation, and that meiotic arrest relies on
144
this high level of cAMP [27-30]. Conversely, the degradation of cAMP has an important
role in meiotic resumption. This degradation is performed by phosphodiesterases, which
convert cAMP into plain AMP [11, 31, 32](for review, see [12]). During the 12 first hours
of oocyte maturation, projections between the oocyte and its surrounding cumulus cells are
broken and cAMP is no longer transferred to the oocyte, provoking a drastic drop in cAMP
levels but an increase in AMP levels [27, 33]. Moreover, it seems that the cumulus cell
could directly transfer ATP or other nucleotides. Inside cumulus cell projections, many
mRNAs associated with purine, nucleotide and ATP binding are present and could facilitate
their transport to the oocyte (MacAulay, 2013, under submission).
To evaluate the importance of ATP production drived by molecules transferred from
cumulus cells, we cultivated oocytes under denuded form (without cumulus cells). The
results clearly show that the supply of ATP decreases when oocytes are cultured without
cumulus cells. Moreover, coculture of denuded oocytes with cumulus-oocyte complexes
seems to partially (associated coDO) or completely (separated coDO) restore the supplies
of ATP (Figure 4-7). This result is highly interesting. First, it hints that molecules (cAMP
or AMP) can be sent over to the oocyte without a direct transfer through cumulus
projections. Secondly, we can see in Figure 4-7 (E, F) that when DO are allowed to make
contact with COCs, they seem to "share" cumulus cells with the COCs during maturation.
Making contact with cumulus cells is probably a costly process explaining why the energy
available is not as high in coDOs with contacts as in separated coDO. Nevertheless, the
DOs should have an interest in making these contacts, since they facilitate the transfer of
many molecules [34, 35] by new cumulus to oocyte projections. According to these results,
molecules transferred directly or indirectly from cumulus cells to oocytes seem to be a part
of ATP production during oocyte maturation. To be sure that DOs decrease their ATP
production due to the lack of transfer of cAMP and its degradation into AMP through
phosphodiesterases, we added AMP to the culture media to perform a rescue protocol. This
AMP addition completely restores the ability of DOs to produce ATP, confirming the
importance of the adenosine salvage pathway for ATP production (Figure 4-7). All
ADP:ATP ratios obtained during these experiments are in agreement with the available
energy and associated cell metabolism. Low ADP: ATP ratio when ATP is highly available
145
and allows for a good metabolism (COC and coDOs), and high ADP:ATP ratio when the
cell, in an energy deficit, is entering apoptosis (DO).
The mechanism used by AMP to enter DOs is not perfectly understood. It is usually
thought that cell membranes are impermeable to nucleotides. However, the high impact of
adding AMP to the culture media induces us to think that some mechanism may allow the
direct transport of AMP through the zona pellucida and oocyte membrane, as it is known to
occur in some bacteria and cell types [36-38]. Moreover, the media commonly used for cell
culture, medium 199 (Invitrogen, Carlsbad, USA) contains low level of AMP and ATP.
This fact also supports the idea that these molecules can be uptake by cells, otherwise the
addition of these compounds would be of no use. It is also well known that ectoenzymes
present on the surface of the oocyte can cleave nucleotides into nucleosides [39-42]. Once
in nucleoside form, they can be taken up and accumulated inside the cytoplasm, where they
can be retransformed into their nucleotide form. Some enzymes also transform AMP into
ZMP, a nucleotide that can be taken up by the oocyte and converted into IMP, which serves
as a precursor of purine compounds such as AMP (Richard, F.J, personal communication).
Finally, it is also possible that denuding oocytes leaves holes in the oocyte membrane
where projections used to be, facilitating AMP entry.
We also present the possibility that maternal mRNA deadenylation, which releases AMP in
the cytoplasm, could be an important driver of ATP production using the adenosine salvage
pathway. Indeed, mRNA polyadenylation is an important step of mRNA recruitment for
translation and poly(A) tail length has a close relationship with the rate of translation [43].
In general, poly(A) mRNAs containing more than 200 nt are translated while mRNAs
bearing less than 50 nt are dormants [44]. We ([45] [46]) and others [47-49]) have already
determined that oocyte maturation is characterized by an important reduction in protein
synthesis. In agreement to this reduction in protein synthesis, poly(A) tails are highly
reduced during oocyte maturation in many species [14, 50, 51], releasing adenosine under
AMP form. To evaluate this possibility, we inhibited mRNA deadenylation with GTP, a
purine which affects PARN activity. The effect on COCs clearly shows that deadenylation
inhibition highly decreases ATP supplies within the oocyte. The rescue obtained by adding
AMP in the media confirms that AMP could be transformed into ATP in the oocyte.
146
However, no decrease in ATP production was observed in DO. This result could be due to
the same ectoenzymes discussed above. When the oocyte membrane is exposed, as is the
case in DOs, the enzymatic sites are exposed and could cleave GTP, limiting its action. In
COCs, the cumulus cell layer could act as a barrier limiting the access of GTP to the oocyte
ectoenzymes. GTP could then enter cumulus cells and be transferred to the oocyte through
the projections.
4.6 Conclusion
The findings of our study support the hypothesis that alternative mechanisms are used to
drive de novo production of ATP from AMP sources during oocyte maturation. Two
enzymes allowing adenosine salvage pathway, the adenylate kinase and the creatine kinase,
are active during maturation and appear to have an important role in energy production.
While the oocyte is lacking important enzyme allowing ATP production through glycolysis
and is presenting immature mitochondria phenotype less prone to OXPHOS, its seem that it
turn toward adenosine salvage pathway to fulfil its need in ATP. Many AMP molecules are
freed from mRNA poly(A) tail during maturation and large amount of AMP is produced by
phosphodiesterase after cAMP cumulus cell transfer. Our results show that these AMP
sources could drive ATP production through the adenosine salvage pathway.
In
conclusion, we believe that adenylate kinase and creatine kinase can be added as potential
drivers of ATP production from AMP during oocyte maturation.
4.7 Methods
Unless otherwise indicated, all chemicals were purchased from Sigma, Chemical Co. (StLouis, MO).
Oocyte preparation
Oocyte collection and maturation were performed as described previously (see chapter 2
and 3). Briefly, COC having a minimum of five layers of cumulus were washed in HEPESbuffered Tyrode’s medium supplemented with bovine serum albumin (BSA), pyruvic acid
and gentamycin. To obtain metaphase II oocytes (MII), groups of 20 COC were placed in
four-well petri dishes in maturation medium under mineral oil and incubated during 24
hours at 38.5°C with 5% CO2. MII oocytes were denuded before freezing. Denuded oocytes
147
(DOs) were produced by denuding COC at the GV stage and allowing maturation for 24
hours in the same way as MII oocyte. Cocultured DOs (coDOs) were obtained by
coculturing DOs with COC in a 1:1 ratio for 24 hours. In associated coDO (a-coDO), DO
and COC were allowed to make close contact while in separated coDO (s-coDO), DOs
were placed in small holes which were punctured in the dish to help keep them far from
COCs. For ADP:ATP ratio assays, groups of 5 oocytes were snap frozen in liquid nitrogen
then kept at -80°C.
Polyribosomal sample preparation
The polyribosomal mRNAs samples used in these experiments are the same as those used
in Chapter 3 of the present thesis. Therefore, their preparation including ‘Carrier
preparation, crosslinking and neutralization’ will not be described again. The same is true
for microarray.
Real Time-PCR
The same samples of reverse transcribed RNA used for QPCR validation in chapter 3 were
used here (see chapter 3 for details sample preparation). Primer sequences were designed
with the same criteria, namely to obtain short amplicons near the poly(A) tail to account for
the short products obtained after amplification. Relative quantification was allowed through
a standard curve from 0,1 pg to 0,01 fg produced from purified PCR product. Light-Cycler
FastStart DNA Master SYBR Green I kit (Roche) was used to quantify the sample using
Light Cycler 2.0. The acquisition temperature of each product was determined according to
the single melting peak on the melting curve (Table 1). Since the relative abundance of
usual housekeeping genes fluctuates between oocyte maturation stages, these could not be
used for data normalization [52, 53]. Thus, exogenous RNA (drosophila polyribosomal
mRNA) was used to normalize the candidates (for details, see Chapter 3).
Pharmacology
To uncouple mitochondria respiration, 100 nM carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone
(CCCP) was added to the cultured media. This concentration was used according to
previous experiments achieved in our lab to optimize the treatment effect (Baldoceda,
148
unpublished). Sodium fluoride (NaF, 25 mM) was used to inhibit adenylate kinases without
important inhibition of creatine kinase activity [54, 55]. To inhibit creatine kinase activity,
iodoacetamide (IAN) was used at a concentration of 2 mM [56]. In order to inhibit the
polyA ribonuclease, PARN, 4 mM of GTP was added to the cultured media. According to
the results obtained in [57], this concentration inhibits almost 90% of PARN activity. All
rescues with AMP were conducted with a 1 mM concentration. When used to rescue PARN
inhibition, AMP was added 20 minutes after PARN inhibition with GTP.
ATP measure and ADP:ATP ratio
The ATP content and the ADP:ATP ratio of GV and MII oocytes were measured using the
commercial EnzylightTM ADP:ATP ratio assay kit (Bioassay systems, Hayward, CA)
following the assay protocol. Briefly, 90 μl of ATP reagent was added to each oocyte
sample (freezed in a maximum of 10 μl of PBS) previously homogenized by vortexing the
sample with around 10 zirconia-silica beads. ATP levels were measured after 1 min
(Relative luminescence unit, RLU A) in a luminometer (BMG Labtech, FLUOstar Omega,
Cary, NC). To obtain ADP levels and further ADP:ATP ratio, the samples were read again
after 10 min (RLU B-background) then 5 μl of ADP reagent was added. The samples were
read again after 1 minutes (RLU C). A mixed seven-point standard curve (64 pmol ADP
with 64 pmol ATP, 0 pmol ADP with 32 pmol ATP, 2 pmol ADP with 16 pmol ADP, 4
pmol ADP with 8 pmol ADP, 8 pmol ADP with 4 pmol ATP, 16 pmol ADP with 2 pmol
ATP and 32 pmol ADP with 0 pmol ATP) was included in each assay. The quantitative
ATP and ADP content were determined according to the linear regression of their
respective standard curve. ADP:ATP ratios were calculated by (RLU C – RLU B) / RLU A
then normalized according to the linear regression of the standard curve obtained with the
different non-negative ratios.
Creatine kinase assays
The creatine kinase assays were realised using the EnzyChromTM Creatine Kinase Assay
Kit (BioAssay Systems), which allows colorimetric determination of creatine kinase
activity at 340 nm. This kit has a detection range from 5 U/L to 300 U/L. Pools of 25
oocytes were thawed, homogenized by vortexing with zirconia-silica beads then transferred
149
in one of the 96-wells before adding 100 μl of reconstituted reagent (composed of 10 µL
Substrate Solution, 100 µL Assay Buffer and 1 µL Enzyme Mix). The plate is incubated for
20 minutes at room temperature before absorbance was read at OD340nm in the FluoStar
Omega multi-mode microplate reader. Samples were read again after 40 minutes and CK
activity was calculated using this equation: CK (U/L) = (OD40min – OD20min) / (ODCalibrator –
ODH2O) x 150
Statistics
Significant differences were calculated using the Graphpad prism IV software. One-way
ANOVA with Tukey's Multiple Comparison Test were conducted for all the ATP and
ADP:ATP ratios tests when 3 and more comparisons were present. When only two groups
were compared, a T-test was applied to evaluate the difference between the two groups.
Differences were considered statistically significant (*) at the 95% confidence level (P <
0.05), highly significant (**) at the 99% confidence level (P < 0.01) and very highly
significant (***) at the 99,9% confidence level (P<0,001).
4.8 Authors' contributions
SS carried out most of the experiments including samples preparation and pharmacology,
microarray analysis, QPCR and ADP:ATP ratio measure. She also drafted the manuscript.
EF carried out the data normalization, acted as advisor and helped with language
revision.CR supervised and directed SS academic program. The authors read and approved
the final manuscript.
150
4.9 References
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Figure 4-1 Alternative ATP production mechanisms during oocyte maturation.
cAMP is transferred from cumulus cell, transformed in AMP by phosphodiesterase and
phosphorylated by adenylate kinase than creatine kinase to form ATP. mRNA
deadenylation can also freed AMP that can enter the same process.
155
Figure 4-2 Impact of OXPHOS inhibitor (CCCP)
on ATP production (A, B) and ADP:ATP ratio (C, D) during oocyte maturation. (A, C)
Impact on COC (B, D) Impact on DO. * significant at p<0,05 ; ** highly significant at
p<0,01. COC: cumulus oocyte complexe. DO: denuded oocyte. CCCP: Carbonyl cyanide mchlorophenyl hydrazone.
156
Figure 4-3 QPCR validation for 3 candidates in the adenosine salvage pathway
* significant at p<0,05. AK6: adenylate kinase 6. CKB: creatine kinase brain. CKMT1:
creatine kinase mitochondrial 1.
157
Figure 4-4 Impact of AK and CK inhibitor
on ATP production (A, B) and ADP:ATP ratios (C, D). Impact on COC (A, C). Impact on
DO (B, D). COC: cumulus oocyte complex. DO: denuded oocyte. NaF: Sodium fluoride.
IAN: iodoacetamide. Different letters represent means that are significantly different.
158
Figure 4-5 Creatine kinase assay.
*** highly significant at p<0,001.
159
Figure 4-6 Impact of adding phosphocreatine (PCr) to the culture media
when oocytes are cultured under denuded form (DO) on ATP production (A) and
ADP:ATP ratio (B). * significant at p<0,05. ** highly significant at p<0,01.
160
Figure 4-7 Impact of culture under different form
on ATP production (A) and ADP:ATP ratio (B). Impact of AMP rescue on oocyte cultured
under denuded form (DO) on ATP production (C) and ADP:ATP ratio (D). Picture of the
two different coculture process. associate coculture before maturation (E), after maturation
(F), separated coculture before maturation (G). The arrow in represents a little depression in
the dish that helps to separate COC from DO. COC: Cumulus-oocyte complex, DO:
Denuded oocyte, a-coDO: associated coculture where COC and DO are in close contact; scoDO: separated coculture where COC and DO are not allowed to make contacts. Different
letters represent means that are significantly different. ** highly significant at p<0,01.
161
Figure 4-8 Impact of PARN inhibitor and AMP rescue
on ATP production (A, B) and ADP:ATP ratio (C, D) in COC (A, D) and DO (B, D).
Different letters represent means that are significantly different
162
5. Chapitre 5. Conclusion
L’objectif de cette thèse était d’étudier les transcrits polyribosomaux impliqués dans la
maturation ovocytaire afin d’identifier des mécanismes moléculaires importants durant
cette période et ainsi mieux comprendre la physiologie sous-jascente.
Le premier article était dédié à la mise au point d’une méthode permettant d’extraire
spécifiquement les ARN polyribosomaux à partir d’un nombre limité d’ovocytes. Les outils
moléculaires disponibles actuellement permettent d’extraire efficacement des quantités
minimales d’ARNm, de les amplifier et de les marquer afin de les hybrider sur des
biopuces à ARN. Ces méthodes permettent d’obtenir une vision globale du transcriptome
cellulaire. Cependant, même si ces méthodes ont permis d’en apprendre beaucoup sur les
ovocytes et les embryons précoces, il demeure que ce sont des cellules particulières dont le
silence transcriptionnel force la présence d’une multitude de transcrits qui ne participent
pas à la physiologie cellulaire. Ainsi, en utilisant les méthodes transcriptomiques
habituelles sans se limiter à l’étude des ARN polyribosomaux, les résultats obtenus
demeurent noyés dans un bassin de transcrits inactifs. La présence des transcrits
emmagasinés peuvent limiter mais également biaiser la vision globale de la physiologie
cellulaire.
Une méthode de fractionnement cellulaire sur gradient de sucrose permet d’isoler les ARN
polyribosomaux des ARNm emmagasinés [1-3]. Cependant, cette méthode est adaptée à
l’étude des tissus et requiert des quantités non négligeables d’ARN. Dans la situation où la
disponibilité du spécimen étudié est limitée, de nombreuses modifications doivent être
apportées afin de l’adapter à de faibles quantités d’ARN. Quelques équipes de recherches
[4-6] ont déjà tenté d’adapter cette méthode à l’ovocyte sans jamais réussir à combiner les
deux objectifs de notre méthode; c’est-à-dire d’obtenir une preuve de la nature
polyribosomale des échantillons grâce à l’obtention d’un profil de fractionnement tout en
permettant d’étudier individuellement les transcrits afin d’en mesurer l’abondance.
Le premier article a représenté la plus grande difficulté de la thèse ainsi que de nombreuses
années d’efforts et d’embûches. Cependant, une fois mise au point, cette méthode est
particulièrement novatrice. Les résultats obtenus (article 2 et 3) en utilisant cette méthode
163
ont permis d’obtenir une vision plus précise de la physiologie de la maturation ovocytaire
et de déceler l’acquisition d’une certaine quiescence durant cette période.
Le deuxième article se base sur la méthode mise au point dans le premier article afin de
comparer les ARN polyribosomaux provenant d’ovocytes immatures du stade de vésicules
germinales aux ARN polyribosomaux provenant d’ovocytes matures du stade de métaphase
II. L’analyse des transcrits polyribosomaux durant cette période souligne une diminution
importante de la synthèse protéique et de la phosphorylation oxydative durant la maturation
ovocytaire.
La diminution de la synthèse protéique est observée à la fois par une
diminution importante du nombre de transcrits présents sur les polyribosomes ainsi que par
une diminution de la traduction des gènes responsables de l’initiation de la traduction. La
littérature soutient également de différentes façons ces observations [4, 7-9]. La diminution
de la phosphorylation oxydative, accompagnée par une augmentation des dysfonctions
mitochondriales et d’une réduction de la production énergétique, semble associée à une
forte diminution de la traduction des protéines faisant partie de la chaîne respiratoire
mitochondriale. De fait, les 5 complexes mitochondriaux subissent une réduction accrue de
la synthèse de leurs protéines. Encore une fois, la littérature vient fortement appuyer nos
résultats et plusieurs auteurs décrivent l’acquisition d’un phénotype mitochondrial
immature (mitochondries «à capuchon») [10, 11] ainsi que la diminution de la respiration
mitochondriale [12, 13]. Puisque la phosphorylation oxidative représente la principale voie
de production d’énergie dans la cellule, je me suis intéressée aux quantités d’ATP
disponibles dans l’ovocyte durant la maturation ovocytaire. De façon un peu surprenante,
j’ai déterminé que les quantités d’ATP augmentent durant la maturation. Cette
augmentation de l’énergie disponible malgré la diminution de la respiration mitochondriale,
couplée avec la forte diminution de la traduction durant la maturation, m’a permis
d’émettre une nouvelle hypothèse. Il est bien connu que l’embryon doit ralentir son
métabolisme afin de survivre jusqu’à l’activation du génome embryonnaire (The Quiet
embryo hypothesis, [14]). Nos résultats mènent à penser que l’acquisition de cette
quiescence métabolique se produit encore plus tôt, durant la maturation ovocytaire. En
diminuant fortement la traduction, mécanisme hautement demandant énergétiquement,
l’ovocyte acquière une certaine quiescence tout en conservant un maximum d’énergie lui
permettant de survivre jusqu’à la fécondation puis, par la suite, jusqu’à l’AGE.
164
La phosphorylation oxidative ainsi que la glycolyse sont généralement considérées comme
les deux seuls mécanismes permettant la production d’énergie dans la cellule. Cependant,
l’augmentation des quantités d’ATP disponibles durant la maturation ovocytaire et ce,
malgré la diminution de la respiration mitochondriale et la quasi-absence de la glycolyse,
mène à se questionner sur la présence de mécanismes alternatifs de production énergétique
dans l’ovocyte. Sachant que des quantités importantes d’AMP sont disponibles durant cette
période, je me suis penchée, dans le troisième article, sur le mécanisme de récupération des
adénosines (adenosine salvage pathway) et je me suis demandé si ce mécanisme pouvait
fournir des quantités importantes d’ATP à l’ovocyte. Deux enzymes sont nécessaires à cette
voie : l’adénylate kinase qui permet la transformation de l’AMP en ADP et la créatine
kinase qui permet la transformation de l’ADP en ATP. Après avoir déterminé la présence
de ces enzymes sur les polyribosomes, j’ai évalué l’impact de leur inhibition sur les
quantités d’ATP disponible dans l’ovocyte. Les résultats confirment que la voie de
récupération des adénosines peut représenter un mécanisme important de production d’ATP
durant la maturation ovocytaire.
J’ai ensuite évalué l’importance de différentes sources d’AMP dans l’ovocyte. La source la
plus importante est sans aucun doute la dégradation de l’AMPc transféré vers l’ovocyte par
les cellules de cumulus. J’ai donc évalué l’impact de différentes cultures ovocytaires : la
culture des ovocytes sous forme dénudée (DO), sous forme de complexe avec les cellules
de cumulus (COC) ou la coculture DO et COC (coDO). Sans grand étonnement, j’ai
observé une diminution drastique de l’ATP disponible dans les ovocytes dénudés en
comparaison aux ovocytes cultivés sous forme de COC, soutenant l’importance des cellules
de cumulus dans la production énergétique. Lorsque cultivés en concomitance avec des
COC, les quantités d’ATP disponibles pour les DO augmentent et atteignent presque les
quantités obtenues lorsque cultivés sous forme de COC. Ce résultat supporte l’idée que les
cellules de cumulus peuvent transférer directement, ou indirectement, des molécules qui
faciliteront la production énergétique dans l’ovocyte.
J’ai également émis l’hypothèse que la dégradation de l’ARN ainsi que la déadénylation de
la queue poly(A) pouvaient représenter des sources non-négligeables d’AMP. J’ai donc
inhibé la dégradation de la queue poly(A) en utilisant un inhibiteur de la poly(A)
165
ribonucléase (PARN) et mesuré l’impact sur l’énergie disponible. Les résultats ont
démontrés que cette source d’AMP pouvait être ajoutée à la liste des sources d’énergie
potentielles durant la maturation ovocytaire.
Dans cette thèse, l’identification de transcrits polyribomaux durant la maturation ovocytaire
m’a permis de mieux comprendre certains aspects de la physiologie de la maturation
ovocytaire. La diminution de la phosphorylation oxidative et la diminution de la synthèse
protéique ont mis en lumière l’acquisition d’une certaine quiescence durant la maturation
ovocytaire et cette découverte a mené à l’identification d’un nouveau mécanisme de
production d’énergie impliquant la voie de récupération des adénosines.
166
5.2 Références
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