/. Embryol. exp. Morph. Vol. 27, 3, pp. 603-614, 1972 603 Printed in Great Britain Localisation et duree des potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales chez Fembryon de Poulet Par ALAIN CHEVALLIER 1 Laboratoire de Zoologie de V Universite Scientifique et Medicale de Grenoble (Directeur: Professeur P. Sengel) SUMMARY The localization and duration of the capacity of neural crest cells to differentiate into medullary cells of the adrenal gland The capacity of the neural crest cells to differentiate into medullary cells of the adrenal gland has been tested for different levels of the cephalo-caudal axis of the chick embryo and at different stages. The procedure consisted in associating a fragment of neural crest cells containing spinal cord with a section of an embryo containing the prospective cortical territory. The latter was previously deprived in ovo of presumptive medullar adrenal cells by localized X-irradiation of its spinal cord. The portion of the spinal cord which has the capacity to give off medulloblasts is located not only within the prospective adrenal area (somite levels 18-22), but also within a region extending over a length of six somites in front and seven somites behind the presumptive zone. This capacity, which is restricted in space, is also limited in time. It is possessed by the portion of spinal cord defined above from 6 h before the migration of the first neural crest cells and lasts roughly for 24 h after the beginning of migration. Furthermore, the experiments indicate that the differentiation of neural crest cells into medullocytes requires the inductive influence of the cortical cells. INTRODUCTION L'origine des cellules chromaiflnes de la glande medullo-surrenale a etc demontree chez les Oiseaux a Faide de techniques experimentales variees. Les experiences d'ablations chirurgicales in ovo de Hammond & Yntema (1947) ou de Strudel (1953) ont montre que l'excision d'un troncon de tube neural, au niveau de la region presomptive des glandes surrenales et a un stade precedant l'emigration des cretes neurales, est suivi d'un moindre developpement ou d'une absence complete de la partie medullo-surrenalienne de la glande. L'implantation d'une portion de tube neural marque a la thymidine tritiee dans un embryon hote non marque a permis a Weston (1963) de mettre en evidence la destination des cellules de la crete neurale, notamment au 1 Adresse deVauteur: Laboratoire de Zoologie de l'Universite Scientifique et Medicale de Grenoble, 38-Saint-Martin-d'Heres, France. 604 A. CHEVALLIER niveau de la future glande surrenale. Enfin, la methode des greffes heterospecifiques entre la Caille et le Poulet utilisee par Le Douarin & Teillet (1970, 1971) a precise que les cellules medullaires sont issues normalement des cretes neurales dont le niveau correspond a celui des somites 18 a 24 de l'embryon de Poulet. Cette origine localisee de la glande surrenale du Poulet est un facteur favorable pour l'etude de la regionalisation et, de facon generate, de la determination des cretes neurales. Les questions que Ton peut se poser sont les suivantes: (1) Toutes les cellules des cretes neurales sont-elles capables de se differencier en cellules surrenales medullaires, quel que soit le niveau dont elles proviennent ? (2) Toutes les cellules, issues d'un meme niveau, sont-elles capables de donner des medulloblastes pendant les quelques 24 h que dure, selon Weston & Butler (1966), l'emigration? Autrement dit, les cellules qui sont les dernieres a quitter le tube neural possedent-elles lesmemes potentialites de differenciation que celles qui emigrent les premieres ? L'etude systematique de cette capacite et de sa duree a ete rendue possible par la mise au point d'une technique d'irradiation et d'explantation combinees dont les resultats sont rapportes ici. MATERIEL ET METHODES Les experiences ont ete faites sur des embryons de Poulet de race Leghorn blanche, dont l'age s'echelonne de 30 h a 4 jours d'incubation (du stade 10 au stade 24 de Hamburger & Hamilton, 1951). Les operations consistent a preparer, d'un cote, le troncon d'embryon contenant le futur territoire cortical recepteur, prive de cellules a potentialites surrenales medullaires et, de l'autre, le troncon de tube neural donneur dont on veut tester la capacite a fournir des medulloblastes; enfin a associer ces deux fragments sur la membrane chorio-allantoidienne. (A) Preparation du territoire cortical recepteur La realisation de ce territoire exige tout d'abord la connaissance du moment exact ou les premieres cellules des cretes neurales quittent le tube neural et migrent en direction du futur territoire cortical. Ce territoire doit en effet etre preleve avant que ces cellules n'arrivent a destination. Ce moment, qui marque le debut de la migration, a ete appele le stade t0 et correspond a une duree d'incubation de plus en plus longue au fur et a mesure que Ton passe de la region cephalique a la region caudale de l'embryon. Pour un niveau transversal donne, le debut de cette migration suit de peu la formation des somites (Fig. 1). Au niveau de la zone surrenalienne presomptive (niveau des somites 18 a 22), les cellules de la crete neurale commencent leur migration au stade de 20 paires de somites (Fig. 1). En consequence, pour obtenir un territoire Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales 605 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 Stade en paires de somites Fig. 1. Graphique indiquant a quel stade (/„) commence, pour un niveau donne, la migration des cretes neurales. Le stade est indique en abcisses par le nombre de paires de somites; le niveau transversal ou debute, a un stade donne, la migration, est defini en ordonnees par le numero du somite correspondant. La courbe (t0) montre que la migration des cretes neurales commence, a un niveau donne, lorsque les somites de ce niveau achevent leur individualisation. La droite en pointille indique le niveau du dernier somite forme en fonction du stade. (A) Zone dans laquelle les cretes neurales ont commence a migrer. (B) Zone dans laquelle les cretes neurales sont encore entierement contenues dans le tube neural. (ZP) Zone presomptive des glandes surrenales. * Chaque cercle represente le resultat de l'examen histologique d'un embryon. cortical pur (prive de medulloblastes), il faut Fisoler du tube neural avant ce stade. Le plus simple parait etre l'excision du tube neural in ovo sur des embryons ayant moins de 20 paires de somites. Cependant, si Ton pratique cette excision du tube neural au niveau de la zone surrenalienne presomptive, la glande medullo-surrenale se developpe tout de meme, au moins en partie, dans 20 % des cas environ. Cette regulation des deficiences est vraisemblablement due a la migration oblique des medulloblastes en provenance des niveaux anterieurs et posterieurs a la lacune neurale (cf. Le Douarin & Teillet, 1970). Pour eviter cette colonisation regulatrice du territoire cortical par les cellules des cretes neurales d'un autre niveau, l'excision du tube neural n'est plus pratiquee in ovo, mais sur une portion de tronc comprenant les somites 18 a 22 et la zone surrenalienne presomptive. Cette portion de tronc est explantee, avant le stade de 20 paires de somites, sur la membrane chorio-allantoidienne 606 A. CHEVALLIER d'un embryon de 8 jours d'incubation. Malheureusement, cet explant est trop jeune pour effectuer une differenciation correcte de son territoire cortical. Par contre, le developpement complet et harmonieux de ce dernier a etc obtenu dans environ 60 % des cas, a partir d'explants preleves sur des embryons de 72 h d'incubation. C'est done seulement a partir de ce stade que le troncon d'embryon devra etre explante sur la membrane chorio-allantoidienne. Mais la destruction du tube neural devant etre effectuee 24 h auparavant (avant le debut de la migration des cellules des cretes neurales au niveau considere), il a fallu recourir a sa destruction in ovo par une irradiation localisee aux rayons X. En fin de compte, le territoire cortical recepteur a ete prepare en deux temps: (a) Un ecran de tantale perce d'une fente est depose sur un embryon de 16 a 19 paires de somites. II permet de localiser Firradiation sur le tube neural, sur une longueur de 15 somites environ entre le niveau du somite 13 et le niveau presomptif du somite 27 ou 30 suivant le stade de l'embryon (Fig. 2 A). Cette irradiation de 15000 rad a pour effet de rendre le tube neural completement necrotique au bout de 24 h, comme on peut l'observer sur des coupes histologiques de controle. (b) Vingt-quatre heures apres l'irradiation, l'embryon irradie est opere sur un fond de paraffine dans du liquide physiologique de Tyrode. Les vestiges du tube neural necrose sont elimines, puis le troncon d'embryon contenant le territoire cortical presomptif est detache du reste de l'embryon, par deux incisions longitudinales effectuees a la limite entre les somites et les lames laterales et par deux sections transversales, faites aux niveaux des somites 17-18 et 22-23 (Fig. 2B). (B) Preparation du tube neural donneur Les embryons ages de 36 a 96 h d'incubation ont ete places sur un fond de paraffine dans du liquide physiologique de Tyiode. Le troncon de tube neural a ete excise a des niveaux differents pour chacune des series experimentales (Fig. 2C). Dans une premiere serie d'experiences, le troncon, d'une longueur correspondant a celle de six somites, a ete preleve au stade t0 (moment precis ou commence la migration des cellules des cretes neurales) a divers niveaux, qui s'echelonnent le long de l'axe cephalo-caudal de l'embryon des somites 2-7 aux somites 30-35 inclus. Le troncon preleve au niveau des somites 18-22, niveau de la zone presomptive des glandes surrenales, constitue, avec le recepteur cortical, une association temoin. Le troncon preleve en avant ou en arriere de cette zone permet de tester la capacite du tube neural heterotopique a fournir des medulloblastes. Dans une deuxieme serie d'experiences, le tube neural a toujours ete preleve au niveau de la zone presomptive, mais a des moments variables par rapport au debut de la migration des cretes neurales (stade tQ), s'echelonnant de 6 h avant a 32 h apres le stade t0. Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales 607 + 24 heures D Fig. 2. Schema operatoire. (A) Embryon de Poulet de 17 paires de somites, protege par un ecran de tantale (e) dont la fente (/) localise I'irradiation aux rayons X sur le tube neural depuis le niveau du 13eme somite jusqu'au voisinage du niveau du 27eme somite presomptif. (B) Portion de tronc contenant le futur territoire cortical, preleve 24 h apres I'irradiation et dont le tube neural necrose a ete excise. (C) Embryon de 25 paires de somites sur lequel a ete preleve un troncon de tube neural (a) compris entre le niveau du 17eme et celui du 24eme somite. (D) Association, en greffe sur la membrane chorio-allantoiidienne (mca), du territoire cortical presomptif et du troncon de tube neural. On teste ainsi la capacite du tube neural a fournir des medulloblastes. Dans une troisieme serie d'experiences, on a combine les deux variables etudiees precedemment (niveau et stade) en prelevant le troncon de tube neural a quatre niveaux (celui des somites 6-11, 12-17, 25-30, 30-35), entre 6 h avant et 32 h apres le stade t0, pour chaque niveau considere. 608 A. CHEVALLIER (C) Association sur la membrane chorio-allantoidienne Le territoire cortical recepteur et le tube neural donneur ainsi prepares sont transplants sur la membrane chorio-allantoidienne d'un embryon de 8 jours d'incubation. Une fente, pratiquee dans cette membrane, et dans laquelle on glisse les deux explants jusqu'a mi-longueur, permet de les maintenir associes de telle sorte que le tube neural reste loge a l'emplacement de Tancien tube neural irradie (Fig. 2D). Histologie Les associations ont ete fixees soit au melange de Bouin soit au formol neutre a 4 %, au bout d'un temps total d'incubation de 10 a 12 jours, coupees a 10 /on et colorees a l'argent selon la methode de Bodian modifi.ee par Ungewiter (1951), qui permet de detecter aisement les cellules chromaffines medullo-surrenaliennes. RESULTATS (1) Explantations temoins Dans la premiere serie d'experiences, l'irradiation prealable du tube neural n'a pas ete effectuee. Le troncon d'embryon explante sur la membrane chorioallantoidienne conserve son propre tube neural intact. Ce temoin permet de controler la qualite de la methode et de tester la capacite des tissus a s'autodifferencier en greffe chorio-allantoidienne. Les resultats obtenus (Tableau 1) montrent que, parmi les cas ou Ton a pu observer la differenciation d'une glande surrenale et qui s'elevent a 35 sur 65, la plupart (soit 33 cas, 94 %), presente une differenciation complete avec cellules corticales et cellules medullaires. Dans la deuxieme serie d'experiences, le tube neural a ete irradie. Le troncon d'embryon, dont on a laisse en place le tube neural necrose, a ensuite ete explante sur la membrane chorio-allantoidienne, sans addition de tube neural sain. Dans ces conditions, la composante corticale de la glande est capable de s'autodifferencier a partir d'un stade tres precoce (des 72 h d'incubation et dans certains cas des le stade de 14 paires de somites). La composante medullaire cependant n'a ete observee dans aucun des 31 explants de ce type (Tableau 1). Dans la troisieme serie d'experiences, l'adjonction d'un troncon de tube neural sain, homologue du tube neural irradie elimine a abouti a la differenciation d'une glande surrenale complete (32 cas sur 35) (Tableau 1). (2) Capacite du tube neural a fournir des medulloblastes au stade t0 en fonction des differents niveaux de prelevement Ces niveaux s'echelonnent pratiquement de somite en somite, de celui des somites 2-7 a celui des somites 30-35, comme le montre la Fig. 3. L'examen histologique montre que seules les associations dont le tube neural a ete preleve entre les somites 11 et 30 ont differencie cordons corticaux et cellules Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales 609 4 6 8 3 10 1 »2 Z 14 6 1' v | 18 | 20 - Z P s ^2 « 24 5 26 28 30 32 34 i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i I I i i I i i I i i I i i I i i I 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 Stadc en paires dc somites Fig. 3. Differentiation de l'association d'un territoire cortical presomptif recepteur et d'un troncon de tube neural, en fonction du stade et du niveau de prelevement du tube neural. Le stade du tube neural est indique en abcisses par le nombre de paires de somites de l'embryon donneur. Le niveau de prelevement du tube neural est defini en ordonnees par le numero du somite correspondant. La droite S indique le niveau du dernier somite forme, en fonction du stade. La courbe t0 marque le debut de la migration des cellules des cretes neurales pour un stade donne (v. Fig. 1). Chaque trait vertical represente ainsi le resultat d'une association entre un territoire cortical recepteur et un troncon de tube neural d'une longueur equivalente a 5 ou 6 somites (longueur du trait). Ce trait est en pointille s'il s'est developpe une glande surrenale incomplete sans cellules medullaires, en trait plein si Ton a obtenu le developpement d'une glande complete, avec cordons corticaux et cellules medullaires. L'examen du graphique montre que les associations ont abouti au developpement d'une glande surrenale complete lorsque le tube neural a ete preleve a un niveau correspondant a celui des somites 12 a 29 inclus et qu'a I'interieur de ces limites le tube neural a ete capable de fournir des cellules medullaires depuis environ 6 h avant le stade t0 jusqu'a 24 h apres ce stade. medullaires (Figs. 4-6). Au-dela de ces limites, les associations n'ont pas differencie de cellules medullaires, mais seulement des cordons corticaux (Figs. 7-9). II convient de preciser que les associations dont le tube neural a ete preleve, en avant ou en arriere de la zone presomptive, mais a 1'interieur des limites indiquees plus haut (e'est-a-dire niveaux 12 et 29), ont differencie des glandes surrenales completes dans une proportion moindre que celle qui a ete obtenue avec le tube neural preleve au niveau de la zone presomptive elle-meme (Tableau 2). 39 EMB 27 610 A. CHEVALLIER Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales 611 Tableau 1. Developpement de la glande surrenale dans des explants temoins, ou le tube neural a ete soit laisse en place intact (A), soit irradie et laisse en place (B), soit irradie, elimine et remplace par un trongon de tube neural homologue (C). Nombre d'explantations Presentant une glande surrenale Differents types d'explantations realisees A B C Total Suffisamment differenciees pour etre etudiees histologiquement Complete cortex + medulla 65 52 62 35 31 35 33 0 32 Formee uni- Formee uniquement de quement de cordons cellules corticaux medullaires 2 31 3 0 0 0 Tableau 2. Association de territoire cortico-surrenalien et d'un troncon de tube neural d'une longueur correspondant a 5 ou 6 somites, preleve a differents stades et a differents niveaux de Vaxe cephalo-caudal Niveau anterieur et posterieur du troncon de tube neural associe (en numero de somite) Stade de l'embryon donneur de tube neural exprime en heures par rapport au stade t0, qui correspond au debut de la migration des cretes neurales -6ha-2h Stade t0 +2ha+llh + 1 2 h a + 24h + 2 5 h a + 32h 0/10 0/6* 4/6 2/3 0/5 3/7 3/4 30/32 3/7 0/10 2/3 9/14 3/6 0/5 4/9 3/6 0/5 0/7 * Nombre d'associations ayant forme une glande surrenale complete (cortex + medulla) sur nombre total d'associations dans lesquelles des cordons corticaux se sont differencies. 2-7 a 6-11 7-12 a 12-17 18-22 23-28 a 25-30 30-35 Figs. 4 a 6. Resultat de l'association d'un territoire cortical presomptif et d'un troncon de tube neural (A0 preleve a un niveau correspondant aux somites 18 a 22 chez un embryon de 18 paires de somites. La glande surrenale (S) s'est differenciee de facon complete avec cellules corticales (c) et cellules medullaires (ra). Impregnation a l'argent. Fig. 4, x 38; Fig. 5, x 190; Fig. 6, x480. Figs. 7 a 9. Resultat de l'association d'un territoire cortical presomptif et d'un troncon de tube neural (/V) preleve a un niveau correspondant aux somites 5 a 10 chez un embryon de 8 paires de somites. Dans ce cas, seule la portion corticale (c) de la glande (S) s'est differenciee. Impregnation a 1'argent. Fig. 7, x38; Fig. 8, xl90; Fig. 9, x480. 39-2 612 A. CHEVALLIER (3) Capacite du tube neural a fournir des medulloblastes enfonction de son age au moment du prelevement (a) Tube neural preleve au niveau de la zone presomptive des glandes surrenales Le tube neural de la zone presomptive surrenalienne a ete capable de fournir des cellules medullaires lorsqu'il a ete preleve sur des embryons ayant de 14 a 35 paires de somites. Les associations realisees avec un tube neural preleve sur des embryons plus ages, ont toujours ete exemptes de cellules medullaires. La duree de cette capacite, exprimee par rapport au stade t0 pour le niveau considere, a done ete comprise entre 6 h avant et 24 h apres ce stade (Tableau 2). (6) Tube neural preleve en-deca et au-dela de la zone presomptive des glandes surrenales Les associations dont le tube neural a ete preleve a un niveau correspondant a celui des somites 12-17 et 25-30, ont abouti a la differenciation de glandes surrenales completes, possedant cordons corticaux et cellules medullaires. Cette capacite a fournir des medulloblastes a dure environ 30 h, de 6 h avant le stade t0 a 24 h apres ce stade, et ceci dans des proportions sensiblement egales a celles qui ont ete obtenues avec le tube neural de la zone presomptive 18-22. Par contre, le tube neural des zones correspondant au niveau des somites 6-11 et 30-35, n'a jamais fourni de medulloblastes, qu'on le preleve au stade t0 ou 6 h avant ce stade (Tableau 2). CONCLUSION On sait que chez l'embryon de Poulet, les medulloblastes derivent normalement - et cela des un stade tres precoce, comme il ressort des experiences de marquage de Weston (1963) - des cellules issues des cretes neurales dont le niveau correspond a celui de la region presomptive des glandes surrenales (Le Douarin & Teillet, 1970, 1971). Mais on sait aussi maintenant qu'il est possible d'obtenir experimentalement la differenciation de cellules medullaires a partir de troncons de tube neural preleve de part et d'autre de cette zone presomptive des glandes surrenales. En effet, un tube neural preleve jusqu'a 6 somites en avant et 7 somites en arriere de cette region est capable de fournir des medulloblastes, lorsqu'il est associe a un territoire cortical presomptif. Cette capacite peut expliquer la regulation des deficiences observees in ovo par Hammond & Yntema (1947) et par Strudel (1953), apres excision du tube neural de la zone presomptive, avant le stade t0. En dehors de cette zone moyenne, le tube neural est incapable de fournir des cretes neurales a potentialites surrenales medullaires. On peut done affirmer qu'au moment ou les cellules des cretes neurales commencent leur migration, elles n'ont plus toutes des potentialites equivalentes le long de l'axe cephalo-caudal de l'embryon. Cette potentialite medullo-surrenalienne est aussi limitee dans le temps. Elle est Potentialites medullo-surrenaliennes des cretes neurales 613 acquise, pour toute la region du tube neural competent, des 6 h avant le stade t0 et persiste 24 h apres ce stade, sans que Ton puisse savoir de facon precise, si le tube neural ne fournit plus de cellules au-dela de ces 24 h, comme le pensent Weston & Butler (1966), ou si celles-ci ont perdu leur potentialite medulloblastique. La determination des cellules des cretes neurales est done precoce, puisqu'elle est acquise avant meme le debut de la migration des premieres cellules. Mais cette premiere determination n'est cependant pas suffisante pour permettre une differenciation totale et definitive en cellules surrenales medullaires. II faut encore que ces cellules migratrices subissent Faction morphogene du territoire, ou en fin de compte elles aboutissent. C'est ainsi que le tissu cortico-surrenal exerce une action determinante, puisque seules les cellules qui viennent au contact des cordons corticaux, soit dans la morphogenese normale, soit de facon experimentale, ont la possibility effective de se differencier en cellules surrenales medullaires. RESUME La capacite des cellules de la crete neurale a se differencier en cellules medullaires de la glande surrenale a ete testee pour divers niveaux de l'axe cephalo-caudal de l'embryon de Poulet et a differents stades. La technique consiste a associer sur la membrane chorio-allantoidienne un troncon de tube neural contenant les cellules de la crete neurale avecun troncon d'embryon contenant le futur territoire cortical recepteur. Ce dernier est prealablement prive in ovo de cellules a potentialites medullo-surrenales par l'irradiation localisee aux rayons X de son tube neural. La portion de tube neural capable de fournir des medulloblastes se situe non settlement au niveau de la zone presomptive des glandes surrenales (niveau des somite 18-22), mais aussi sur une region s'etendant de six somites en avant a sept somites en arriere de la zone presomptive. Cette capacite, restreinte dans l'espace, Test aussi dans le temps. Elle est acquise, pour toute la region du tube neural capable de donner des medulloblastes, des 6h avant la migration des premieres cellules des cretes neurales et persiste environ 24 h apres le debut de la migration. De plus, Faction inductrice des cordons corticaux semble determinante pour aboutir a la differenciation complete de ces cellules migratrices en cellules medullo-surrenaliennes. Ce memoire correspond a la these de specialite (Biologie animale) qui a ete soutenue par l'auteur le 16 octobre 1970 devant l'Universite Scientifique et Medicale de Grenoble. 614 A. CHEVALLIER TRAVAUX CITES HAMBURGER, V. & HAMILTON, H. L. (1951). A series of normal stages in the development of the chick embryo. /. Morph. 88, 49-92. HAMMOND, W. S. & YNTEMA, C. L. (1947). Depletions in the thoraco-lumbar sympathetic system following removal of neural crest in the chick. /. comp. Neurol. 86, 237-266. LE DOUARIN, N. & TEILLET, M. A. (1970). Sur quelques aspects de la migration des cellules neurales chez Fembryon de Poulet etudiee par la methode des greffes heterospecifiques de tube nerveux. C. r. Seam. Soc. Biol. 164, 390-397. LE DOUARIN, N. & TEILLET, M. A. (1971). Localisation par la methode des greffes interspecifiques, du territoire neural dont derivent les cellules adrenales surrenaliennes chez l'embryon d'Oiseau. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris D 272, 481-484. STRUDEL, G. (1953). Consequences de l'excision de troncons de tube nerveux sur la morphogenese de l'embryon de Poulet et sur la differentiation de ses organes: contribution a la genese de Fortho-sympathique. Annls Sci. nat. (Zool.) 15, 253-329. UNGEWITER, L. H. 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